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VIII Curso de Inverno

Temas Avanados de
Bioqumica e Biologia Molecular
15 a 26 de Julho de

2013
Departamento de Bioqumica
Instituto de Qumica
Universidade de So Paulo

0


ndice


Docentes Participantes .........................................................................1
Monitores ..............................................................................................2
Patrocinadores ......................................................................................3
Docentes Departamento de Bioqumica ..............................................4
Cronograma ..........................................................................................5
Participantes .........................................................................................6
Seminrios / Conferncias ....................................................................7
A- Estrutura de Biomolculas e Sistemas Redox .................................8
B- Estrutura de Protenas e Sinalizao Celular ..................................37
C- Biologia Celular no Cncer ..............................................................76
D- Expresso Gnica .........................................................................118




1













REAS DOCENTES PARTICIPANTES


Estrutura de Biomolculas e Sistemas
Redox

Flvia Carla Meotti
Iolanda Midea Cuccovia
Mauricio da Silva Baptista
Nadja Cristhina de Souza Pinto


Estrutura de Protenas e Sinalizao
Celular

Fbio Lus Forti
Ricardo Jos Giordano
Shaker Chuck Farah
Maria Julia Manso Alves


Biologia Celular no Cncer

Daniela Sanchez Bassres
Letcia Labriola
Katicia B. S. Paiva
Mari Cleide Sogayar


Expresso Gnica

Aline Maria da Silva
Carlos Takeshi Hotta
Eduardo Moraes Rego Reis
Sergio Verjovski-Almeida
Prof. Dr. Sergio Verjovski-Almeida: ..................Chefe do Departamento de Bioqumica

Prof. Dr. Fernando Rei Ornellas:...................... Diretor do Instituto de Qumica

2
Lista de Monitores


Ps- Doutorado Mestrado
Chrislaine Oliveira Soares Ana Paula S. de Souza
Christiane Pavani Edmlson Ozrio dos Santos
Daniela Soltys Ester Riserio Matos Bertoldi
Diorge Paulo de Souza Gabriel Francisco Zaniboni
Joaquim Martins Luiz Henrique Santos Silva
Letcia Ferreira Terra Milton Csar de Almeida Pereira
Paulo Zaini Rosangela A. Wailemann Mansano


Doutorado Iniciao Cientfica
Aline Maia Alyne Procopio
Ancly Ferreira dos Santos Maisa Torres Martins
Camila Leal Lopes da Silva
Carlos de Ocesano Pereira Estagirio
Filipe da Silva Lima Elan S. Fernandes
Gabriel Oka Laura Farhur
Greice Kelle Viegas Saraiva
Gustavo Antnio Teixeira Chaves Pesquisador Associado Qumico
Juliana H. Osaki Gabriel Mares C. Pinto
Larissa A. C. Carvalho
Leila Magalhes Pesquisador Associado Qumico Doutor
Leticia Anderson Divinomar Severino
Maria Catarina F. S. P. Leite
Marina Trombetta Lima Pesquisador Associado Mestre Bilogo
Mateus P. Mori Michelle dos Santos Menezes
Paulo Pierry
Phillipe Pessoa de Santana Treinamento Tcnico - 3
Raphael Dias Teixeira Amanda Padilha Salviatto
Talita C. de Oliveira
Thompson E.P. Torres




Comisso Organizadora: Profs. Drs. Daniela Sanchez Bassres, Eduardo Moraes Rego Reis, Flvia
Carla Meotti, Letcia Labriola.
Secretaria do Departamento de Bioqumica

3

Apoio:
























4
Docentes do Departamento de Bioqumica
Nome E-mail Telefone
Direto
Telefone
Pabx
Ramal do
Professor
Ramal/Telef
one do
Laboratrio
Sala Bloco
Alexander Henning Ulrich henning@iq.usp.br 3091-8512
3091-9622
3091-9745 858 8s
Alicia J. Kowaltowski alicia@iq.usp.br 3091-2922 3091-8556
3091-8508
1059 10s
Aline Maria da Silva almsilva@iq.usp.br 3091-2182 3091-8997 1224 12i
Ana Maria Carmona Ribeiro mcribeir@iq.usp.br 3091-1887 3091-2164 451 4s
Bayardo Baptista Torres bayardo@iq.usp.br 3091-9195 3091-9195 750 7s
Bettina Malnic bmalnic@iq.usp.br 3091-1201 3091-1202 1059 10s
Bianca Zingales zingales@iq.usp.br 3091-2686 3091-2696 916 9i
Carla Columbano Oliveira ccoliv@iq.usp.br 3091-9197 3091-9198 30 0s
Carlos Takeshi Hotta hotta@iq.usp.br 3091-8993 9s
Cllia Ferreira clfterra@iq.usp.br 3091-2180
3091-8996
3091-8953 1212 12i
Daniela Sanchez Bassres basseres@iq.usp.br 3091-9805 3091-2172 926 9i
Deborah Schechtman deborah@iq.usp.br 3091-1765 3091-1769 1011 10i
Eduardo Moraes Rego Reis emreis@iq.usp.br 3091-2173 212 211 1208 12i
Etelvino J.H. Bechara ebechara@iq.usp.br 3091-1224 3091-3869 1074 10s
Fbio Lus Forti flforti@iq.usp.br 3091-9905 3091-2172 9i
Flvia Carla Meotti flaviam@iq.usp.br 3091-9069 3091-1763 1001 10i
Frederico Gueiros Filho fgueiros@iq.usp.br 3091-8520 3091-9101 22 0s
Glaucia Mendes Souza glmsouza@iq.usp.br 3091-8511 3091-8993 954 9s
Guilherme Menegon Arantes garantes@iq.usp.br 3091-3848 915 9i
Hernan Chaimovich hchaimo@usp.br 3726-9324 1003 10i
Hugo Aguirre Armelin haarmeli@iq.usp.br 3726-1024
Iolanda Midea Cuccovia imcuccov@iq.usp.br 3091-2177 3091-1763 1001 10i
Joo Carlos Setubal setubal@iq.usp.br 3091-9804 911 9i
Letcia Labriola labriola@iq.usp.br 3091-9049 976 9s
Manuel Troyano Pueyo matpueyo@iq.usp.br 3091-1078 3091-8340 1054 10s
Mari Cleide Sogayar mcsoga@iq.usp.br 2648-0231

Laboratrio
Pncreas
Sala-Lavagem
2648-0236
Maria Julia Manso Alves mjmalves@iq.usp.br 3091-2155 3091-1769 1013 10i
Maria Tersa M. de Miranda mtmirand@iq.usp.br 3091-3855
3091-9690
3091-3855 850 8s
Mario Jose Politi mjpoliti@usp.br 3091-3814 3091-3877 1258 12s
Marisa H. G. Medeiros mhgdmede@iq.usp.br 3091-9159
3091-2153
3091-2153 361 3s
Mauricio da Silva Baptista baptista@iq.usp.br 3091-8952 3091-8951
3091-8499
1265 12s
Nadja Cristhina de Souza
Pinto
nadja@iq.usp.br 3091-1387 3091-1222 1070 10s
Ohara Augusto oaugusto@iq.usp.br 3091-3873 Laboratrio
EPR
HPLC
3091-9800
3091-9803
3091-9803
902 9i
Paolo Di Mascio pdmascio@iq.usp.br 3091-8498
3091-8515
3091-8497 1223 12i
Pedro Soares de Araujo psdarauj@usp.br 3091-1748 3091-1763 1005 10i
Pio Colepicolo Neto piocolep@iq.usp.br 3091-2170
3091-9148

3091-9048
970 9s
Regina Lcia Baldini baldini@iq.usp.br 3091-8992 3091-8970 1211 12i
Ricardo Jos Giordano giordano@iq.usp.br 3091-1767 3091-1769 1011 10i
Robert Ivan Schumacher rschumac@usp.br 3091-1778 1054 10s
Roberto Kopke Salinas roberto@iq.usp.br 3091-1475 26 0
Ronaldo Bento Quaggio rquaggio@iq.usp.br 3091-2171 05 0i
Sandro Roberto Marana srmarana@iq.usp.br 3091-8339 3091-8340 1054 10s
Sayuri Miyamoto miyamoto@iq.usp.br 3091-9113 3091-9114 955 9s
Sergio Verjovski Almeida verjo@iq.usp.br 3091-2173 3091-2173 203 201 1200 12i
Shaker Chuck Farah chsfarah@iq.usp.br 3091-8519 3091-3312
3091-3713
10 0i
Shirley Schreier schreier@iq.usp.br 3091-2179 3091-8324 1250 12s
Suely Lopes Gomes sulgomes@iq.usp.br 3091-3826 3091-8970 1211 12i
Walter Colli walcolli@usp.br 3091-2175 3091-1769 1015 10i
Walter Ribeiro Terra warterra@iq.usp.br 3091-2180
3091-8953
3091-8953 1212 12i

Laboratrio CATG/CAGE 3091-9042 1100 11i
Laboratrio Microscopia
Confocal/FACS/Odyssey
3091-9043 908 9i

Secretaria do Departamento de Bioqumica
Fbio / Laura / Simone /
Viviane
depqbq@iq.usp.br 3091-3811 Ramais

351 3s

5

Cronograma


Semana 1


SEG TER QUA QUI SEX

15/jul 16/jul 17/jul 18/jul 19/jul
08:30 Abertura Ricardo
Avaliao dos
projetos de
pesquisa dos
alunos
Maurcio Maurcio

Seminrio 1 Leticia Carlos Maria Julia Chuck
10:00 Seminrio 2 CATG (G1 e 2) C. Analtica (G1 e 2) Katiucia Katiucia

Seminrio 3 CATG (G3 e 4) C. Analtica (G3 e 4) Aline Carlos
12:30 Almoo
14:00 Maurcio Nadja Nadja Nadja Conferncia 1
Ricardo Ricardo Maria Julia Maria Julia
Leticia Leticia Leticia Katiucia Conferncia 2
18:00 Carlos Aline/Carlos Aline Aline

Semana 2


SEG TER QUA QUI SEX

22/jul 23/jul 24/jul 25/jul 26/jul
08:30 Conferncia 3 Iolanda/Flavia Iolanda/Flavia Iolanda/Flavia


Confocal/FACS
(G 1 e 2)
Confocal/FACS (G3
e 4)
Chuck Fabio Fabio

Conferncia 4 Daniela Mari Mari

Sergio Eduardo Eduardo
12:30
Almoo Almoo Almoo Almoo Almoo
14:00 Iolanda/Flavia Iolanda/Flavia Iolanda/Flavia Iolanda/Flavia Conferncia 5

Chuck Chuck Fabio Fabio Conferncia 6

Daniela Daniela Daniela Mari Avaliao
18:00 Sergio Sergio Sergio Eduardo Encerramento




Grupo A= Estrutura de Biomolculas e Sistemas Redox
Grupo B= Estrutura de Protenas e Sinalizao Celular
Grupo C= Biologia Celular no Cncer
Grupo D= Expresso Gnica










6
Participantes



Grupo A= Estrutura de Biomolculas e Sistemas Redox
Grupo B= Estrutura de Protenas e Sinalizao Celular
Grupo C= Biologia Celular no Cncer
Grupo D= Expresso Gnica




Grupo A Grupo B
Nayara de Carvalho Leite
Fabula Francisca de Abreu
Jssica Miranda do Nascimento
Leda Maria Ferraz da Silva
Sandro Mascena Gomes Filho
Fernanda da Silva Neves
Jssica Pereira Machado
Paula Marcela Duque Jaramillo
Vanessa Rafaela Milhomem Cruz
Yerson Durn Ramirez
Grupo C Grupo D
Adriana da Silva Andrade Pereira
Juarez Nbrega da Silva
Mariana Bertini Teixeira
Nayanne Larissa Cunha
Victor Regis de Almeida
Karina Talita de Oliveira Santana
Lailah Horcio Sales Pereira
Larissa Melo Bandeira
Pamella Kelly Farias Diniz
Priscila Ausina de Oliveira

7
Seminrios Tcnicos


Seminrio 1 09:00-10:00h
Seminrio 2 10:00-11:00h
Seminrio 3 11:00-12:00h


1- Espectrometria de massas: aplicaes Dra. Sayuri Miyamoto
em anlises de biomolculas
2- Microarranjos e Pirosequenciamento de DNA Dr. Eduardo M. Rego Reis
3- Fluorescncia como informao biolgica Dr. Robert Ivan Schumacker




Conferncias Cientficas:


Conferncia 1 19/7 14:00-15:30h
Conferncia 2 19/7 16:00-17:30h
Conferncia 3 22/7 08:30-10:00h
Conferncia 4 22/7 10:30-12:00h
Conferncia 5 26/7 14:00-15:30h
Conferncia 6 26/7 16:00-17:30h


1-Trypanosoma cruzi: um desafio para o Dra. Bianca Zingales
desenvolvimento de novos frmacos para a doena de Chagas

2- "Estrutura e funo de protenas Dr. Prof Roberto Salinas
por RMN em soluo"

3- O relgio biolgico de plantas Dra. Aline Maria da Silva

4- Mecanismos moleculares de Dr. Carlos Hotta
patogenicidade em Xylella fastidiosa

5- "Os mecanismos moleculares do olfato Dra. Betina Malnic

6- "Estresse oxidativos, danos no Dra. Profa. Nadja Souza Pinto
DNA e seus mecanismos de reparo




8





A

Estrutura de
Biomolculas e
Sistemas
Redox
9
Laboratrio de Processos Fotoinduzidos e Interfaces
Prof. Dr. Maurcio da Silva Baptista (responsvel);
Christiane Pavani, Divinomar Severino, Gabriel Mares C. Pinto, Michelle dos Santos Menezes
(monitores)

Fotobioqumica do cabelo

INTRODUO

Biologicamente o cabelo possui diversas funes, atuando como proteo contra
estresses externos, alm de fazer parte de estruturas sensoriais ou constituir parte importante
das caractersticas que funcionam como atrativo sexual [7].
Alm disso, o cabelo tem uma importante funo sociocultural, j que nos ltimos 25
anos o mercado cosmtico vem crescendo de maneira intensa e mudando cada vez mais de
uma imagem frvola e superficial para um carter de sade e aplicao tecnolgica. No comeo
do ano de 2012 o Brasil chegou posio de terceiro maior consumidor de produtos
cosmticos do mundo, atrs do Japo (segundo lugar) e Estados Unidos com um faturamento
de 43 bilhes de dlares (preos ao consumidor) e um crescimento de 18,9%, (produtos
relacionados a cabelo movimentaram 6,13 bilhes) [6]. Sendo assim, o segmento de produtos
cosmticos e de higiene pessoal se torna cada vez mais uma potncia econmica e um grande
nicho para novas pesquisas, tanto em produtos para aplicao quanto para o entendimento dos
sistemas biolgicos envolvidos.
O cabelo humano um apndice cutneo principalmente constitudo de protenas (-
queratina) enoveladas e organizadas em fibras e cresce a partir de cavidades chamadas
folculos, que se formam na derme. A parte area de um fio de cabelo constituda de trs
estruturas principais (figura 1) [7]:
- Cutcula: camada superficial constituda de placas de queratina em forma de escama que se
sobrepem, circundando e protegendo o crtex, direcionadas da raiz para a ponta dos cabelos
[7];

Estrutura externa do cabelo

- Crtex: a maior parte da fibra, constituda de clulas queratinizadas de formato fusiforme
alinhadas ao longo do eixo da fibra capilar. No interior observam-se estruturas fibrilares,
grnulos de pigmento (melanina) e material intercelular de ligao. responsvel pelas
propriedades mecnicas da fibra [1, 2];

Estrutura interna do cabelo

- Medula: em fios mais espessos pode-se observar uma camada mais interna e porosa
localizada no centro do crtex e ao longo do eixo da fibra. Pode ser contnua ou fragmentada
ou ainda no ocorrer em alguns fios. A medula possui uma estrutura composta por fibrilas
globulares na interface com o crtex as quais junto com a melanina e as cutculas so
responsveis pela cor do cabelo [3].
- Complexo de membrana celular (CMC): une as clulas das diferentes estruturas e,
juntamente com outros componentes no-queratnicos, forma o maior caminho de difuso entre
as fibras e entre as cutculas [7].


10



Figura 1: Ultra-estrutura interna do cabelo (cutculas, melanina e CMCs) e esquema da estrutura do
cabelo.


A pigmentao do cabelo deve-se principalmente s melaninas (presentes nas clulas
do crtex em grnulos de 200 a 800 nm [1, 2]) que interagem no s com a radiao
ultravioleta como tambm com os comprimentos de onda que compem a radiao visvel [3].
Existem dois tipos de melanina: a eumelanina, que mais comum e consiste em um pigmento
castanho escuro enquanto, a feomelanina, menos prevalente, composta por pigmentos
vermelhos [3]. A quantidade e o tipo de melanina formada nos melancitos so geneticamente
determinados, mas podem ser influenciadas por fatores hormonais (sexo e idade) e ambientais
como a exposio ao sol. A melanina tambm conhecida por proporcionar fotoproteo por
meio da sua capacidade de absorver luz e tambm de seqestrar radicais livres e espcies
reativas de oxignio (EROs) [4, 5].
Sabendo que o cabelo constitudo por protenas e pigmentos naturais e que estas
molculas absorvem luz em regies diferentes (protenas absorvem especialmente na faixa da
radiao UVB entre 289 a 320 nm enquanto que as melaninas absorvem luz nas regies UV e
visvel), uma molcula FS qualquer presente no cabelo passa para um estado eletronicamente
excitado chamado singlete (
1
FS*), a partir do qual pode fluorescer (emitir luz), gerar calor, ou
gerar outro estado eletronicamente excitado, de menor energia, chamado triplete (
3
FS*). Neste
estado a molcula pode abstrair ou doar eltrons para outras molculas formando radicais ou
transferir energia para o oxignio adsorvido na superfcie ou difundido no interior do cabelo
gerando oxignio singlete [8]. O oxignio singlete uma molcula muito reativa, podendo
oxidar lipdeos, aminocidos, melanina e outras biomolculas, causando danos aos cabelos.



Figura 2: Diagrama de Jablonski simplificado.


11
Processos fotoqumicos podem levar a uma cascata de reaes que so responsveis
por danos nos cabelos e que transformam os fios em verdadeiros micro-tubos de reaes
fotoqumicas e processos oxidativos. Tais processos podem transformar a natureza fotofsica
dos cabelos afetando tanto a absoro quanto a emisso de luz (fluorescncia) e gerando
oxignio singlete.

OBJETIVOS

Detectar mudanas estruturais e espectroscpicas em amostras de cabelo humano em
funo da exposio radiao ultravioleta.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

- Montagem das amostras: as mechas de cabelo sero separadas e pesadas individualmente
para que estejam com a massa aproximadamente igual a 0,5g. Os fios de cabelo sero unidos
com cola de queratina comercial derretida em um aparelho especfico para este fim. Por fim as
mechas so penteadas e novamente pesadas.

- Lavagem das amostras: as mechas prontas sero previamente molhadas com gua de
torneira a 40oC e ser feita a aplicao de 0,15 g de xampu anti-resduo. Este ento retirado
do cabelo mergulhando as mechas em trs bqueres de 600 mL contendo gua de torneira a
40oC. Cada mecha sofre cinco mergulhos em cada bquer. As amostras secam ao ar (em uma
sala com temperatura e umidade controlados).

- Desafio Foto-oxidativo: as mechas sero submetidas irradiao UVA at promover uma
mudana significativa na cor (que ser medida em espectrofotmetro Ocean Optics USB2000,
com esfera integradora).

- Deteco de
1
O
2
: mechas de cabelos previamente sero introduzidas em cubetas contendo
D2O. O espectro obtido a partir de excitao das mechas com laser (continuum, surelite III, 5
ns de durao do pulso) a 532nm referente a produo de
1
O
2
ser detectado em
espectrofluormetro ultrassensvel com resoluo temporal maior que 5 ns da Edinburgh
(modelo F900, Edinburgh, UK). O mximo de emisso em 1270 nm caracterstico do oxignio
singlete.



Figura 3: A representao esquemtica do mecanismo de fotossensibilizao onde uma molcula
fotossensibilizadora (FS), que pode ser natural ou sinttica, torna-se excitada por absoro de um fton
capaz de induzir a formao de oxignio singlete (
1
O
2
). A figura direita uma foto do equipamento
Edinburgh F900 utilizado para deteco de
1
O
2
do LPFI_IQ_USP.



12

Figura 4: Esquema do espectrofluormetro resolvido no tempo Edinburgh F900 utilizado para deteco
de
1
O
2
.

- Microscopia e Espectroscopia: as mechas de cabelo sero analisadas em microscpio
Nikon Eclipse Ti acoplado a sistema de deteco de imagens de reflexo, transmisso e
emisso (visvel e infravermelho) e de espectros de emisso e excitao (no UV, Visvel e
Infravermelho at 1800 nm).

650 700 750 800
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e

d
e

E
M
I
S
S

O
nm
CONTROLE
FIOCAMOMILApura
674nm
Exc.410nm

A B C

Figura 4: A) Imagem de reflexo de um fio de cabelo. B) Esquema do Micro-espectrofluormetro
Edinburgh F900/Nikon utilizado para deteco de fluorescncia e
1
O
2
. C) Espectro de um fio de cabelo
no tratado e tratado com extrato de camomila.


REFERNCIAS

Barnicot, N. A.; Birbeck, M. S. C. The electron microscopy of human melanocytes and
melanin granules. In Biology of Hair Growth:239-252; 1958.
Hennessy, A.; Oh, C.; Diffey, B.; Wakamatsu, K.; Ito, S.; Rees, J. Eumelanin and
pheomelanin concentrations in human epidermis before and after UVB irradiation. Pigment Cell Res
18:220-223; 2005.
Nogueira, A. C.; Richena, M.; Dicelio, L. E.; Joekes, I. Photo yellowing of human hair. J
Photochem Photobiol B 88:119-125; 2007.
Santos Nogueira, A. C.; Joekes, I. Hair color changes and protein damage caused by
ultraviolet radiation. J Photochem Photobiol B 74:109-117; 2004.
Igarashi, N.; Onoue, S.; Tsuda, Y. Photoreactivity of amino acids: tryptophan-induced
photochemical events via reactive oxygen species generation. Anal Sci 23:943-948; 2007.
Abihipec, institucional. acessado em 13/06/2013 http://www.abihpec.org.br/2012/04/brasil-
tem-maior-taxa-de-crescimento-percentual-entre-os-top-10-mercados-mundiais-de-hppc/
Robbins, C. R. Chemical and Physical Behavior of Human Hair, Fourth Edition.
Chiarelli-Neto, O.; Pavani, C.; Ferreira, A. S.; Uchoa, A. F.; Severino, D.; Baptista, M. S.
Generation and suppression of singlet oxygen in hair by photosensitization of melanin. Free Radical
Biology & Medicine 51: 1195-1202; 2011.
13
Laboratrio de Gentica Mitocondrial
Profa. Dra. Nadja C. de Souza Pinto (responsvel);
Dra. Daniela T. Soltys e Mateus P. Mori (monitores)

EXPERIMENTO: Anlise dos nveis de fragmentao no DNA de clulas deficientes em
reparo de DNA aps tratamento com perxido de hidrognio

1. INTRODUO

1.1. As Espcies Reativas de Oxignio (EROs)
O oxignio molecular o principal aceptor de eltrons em oxi-redues biolgicas.
Entretanto, devido a sua peculiar distribuio eletrnica, o O
2
preferencialmente reduzido em
transferncias de um eltron, gerando espcies altamente reativas, de acordo com o esquema
a seguir:


A grande maioria do O
2
consumido durante o metabolismo normal reduzido a gua no
sitio ativo da enzima citocromo c oxidase, na mitocndria, sem a liberao desses
intermedirios reativos, conhecidos como Espcies Reativas de Oxignio (EROs). Uma parcela
pequena do O
2
utilizado , entretanto, liberado como radical anion superxido (O
2

) livre, ou
como subproduto do transporte de eltrons na mitocndria ou como produto de reaes
enzimticas especificas, como peroxidases e oxidases. Essas EROs, principalmente O
2
-
e
H
2
O
2
, podem desempenhar papis fisiolgicos importantes, como na funo fagocitria ou em
sinalizao celular, mas podem tambm ter efeitos deletrios devido a sua alta reatividade com
biomolculas. Em particular, a reatividade do radical hidroxila (

OH) com molculas biolgicas


limitada apenas por sua taxa de difuso.
Dentre as biomolculas susceptveis ao ataque de EROs, o DNA um alvo bastante
importante, devido a sua funo biolgica de armazenamento de informao, e tambm ao
baixo potencial redox, e portanto fcil oxidao, de seus componentes, como a desoxiribose e
as bases nitrogenadas. De fato, modificaes oxidadas so abundantes em amostras de DNA
de indivduos normais, e esto elevadas em vrias condies patolgicas como cncer,
neurodegeneraes e envelhecimento.

1.2. Mecanismos de Reparo de DNA
O DNA uma molcula complexa que armazena o contedo informacional transmitido
de gerao para gerao. Para que essa funo seja desempenhada com sucesso sua
integridade deve ser mantida, apesar de sua alta instabilidade qumica (FRIEDBERG, 2003).
A exposio do DNA a uma variedade de agentes qumicos e fsicos, incluindo produtos
secundrios do metabolismo normal, pode produzir uma variedade de leses em sua estrutura,
afetando mecanismos celulares essenciais como sua replicao e transcrio (KAINA et al.,
2007).
As leses no DNA podem ser citotxicas e/ou mutagnicas. Apesar das mutaes
serem essenciais para dirigir processos evolutivos, o acmulo de mutaes pode ser bastante
deletrio aos sistemas biolgicos. Nesse sentido, mecanismos de reparo de DNA que removem
leses impedindo sua fixao como mutaes foram selecionados durante a evoluo, o que
14
assegura a transmisso fiel das informaes genticas de gerao para gerao (FRIEDBERG
et al., 2006).
Em decorrncia da grande variedade estrutural e qumica das modificaes do DNA,
vrias estratgias de reparo foram selecionadas nos organismos durante a evoluo.
Basicamente existem duas formas fundamentais de reparo de leses em cidos nuclicos
atravs de: 1) reverso direta do dano e 2) exciso completa da leso.
Uma das vias de reparo conhecida como reparo por exciso de nucleotdeos (NER, do
ingls Nucleotide Excision Repair). O NER capaz de lidar com uma grande variedade de
leses, uma vez que os substratos para esse mecanismo de reparo so danos capazes de
provocar distores na dupla hlice do DNA, ocorrncia comum a uma ampla gama de agentes
genotxicos. Ele pode ser subdividido em duas subvias: o GGR (reparo de genoma global) e o
TCR (reparo acoplado transcrio). Em resumo, os passos sequenciais da via NER so:
reconhecimento da leso, abertura da dupla hlice, inciso da fita danificada, retirada do
oligonucleotdeo contendo a leso, ressntese e ligao (Figura 1). A protena CSB um
componente-chave da subvia TCR. Outras importantes funes dessa protena envolvem
processos de transcrio, alm da cooperao com outra importante via de reparo de DNA: o
reparo por exciso de bases - BER, do ingls Base Excision Repair (Stevnsner et al., 2008).
Mutaes no gene CSB podem levar sndrome de Cockayne (CS), uma sndrome que resulta
em severas deficincias neurolgicas e de desenvolvimento.

.
Figura 1: A via de reparo por exciso de nucleotdeos NER (SOLTYS et al., 2013).

1.3. Vias de Sinalizao Apopttica
O ciclo celular regulado por diversas protenas tais como p53, c-Myc, pRb, Ras, PKA,
PKC, NF, CDK, ciclinas, CKI e Bcl-2. Na presena de estmulo, essas protenas podem
induzir tanto proliferao celular, quanto senescncia ou apoptose (VERMEULEN et al., 2003).
Clulas recm-formadas podem sofrer alteraes em genes envolvidos na regulao do
15
crescimento celular, que podem ser corrigidas por enzimas especializadas, dependendo da
intensidade e gravidade da leso. Na ausncia de reparo, as clulas com alteraes (leso pr-
maligna) e desprovidas de aes pr-apoptticas multiplicam-se de forma descontrolada,
dando origem s clulas malignas.
A apoptose pode ser definida como um mecanismo de morte celular geneticamente
programado e conservado evolutivamente que capacita as clulas a desencadearem um
processo de morte altamente regulado em resposta a estmulos inerentes ao desenvolvimento
normal, ou em situaes de estresse celular (DEGTEREV et al., 2003). Assim sendo, a
apoptose considerada a principal forma de morte celular, desempenhando papel central em
vrios processos fisiolgicos e na manuteno da homeostase tecidual em organismos
multicelulares.
Em geral, a apoptose ocorre em clulas individuais e esparsas de um tecido, induzindo
um conjunto especfico de alteraes morfolgicas, entre as quais, encolhimento citoplasmtico
e perda de contato com clulas vizinhas, aparecimento de vacolos citoplasmticos, fisso
mitocondrial, condensao da cromatina, fragmentao nucleossomal do DNA e exposio da
fosfatidilserina na camada externa da membrana citoplasmtica (GALLUZI et al., 2012).
interessante enfatizar que durante todo o processo no h extravasamento de material
intracelular e os corpos apoptticos so reconhecidos e rapidamente removidos por clulas
fagocticas sem que haja desencadeamento de resposta inflamatria (LISTON et al., 2003).
Estima-se hoje que metade das doenas mdicas esteja relacionada ao descontrole do
processo apopttico (FISCHER, SCHULZE-OSTHOFF, 2005). De fato, assim como os
processos de proliferao e diferenciao, a morte apopttica um evento crtico para a
manuteno da homeostase e falhas em seu processo podem levar ao acmulo de clulas
indesejveis (formao e proliferao de tumores, resistncia quimioterapia), falha na
erradicao de clulas aberrantes (doenas autoimunes) ou desordens levando inapropriada
perda de clulas (choque sptico, destruio do tecido vascular aps processo de isquemia-
reperfuso, AIDS, doenas neurodegenerativas, injrias hepticas) (KAUFMANN,
HENGARTNER, 2001).
O mecanismo de morte celular apopttica pode ser desencadeado por uma srie de
estmulos intra e extracelulares que levam ativao de cascatas de enzimas proteolticas
especficas denominadas caspases, as quais so responsveis pela iniciao, execuo e
regulao do processo apopttico. Atravs da clivagem especfica de protenas alvo, as
caspases levam ao colapso da infra-estrutura celular atravs da desintegrao do
citoesqueleto, desarranjo metablico e fragmentao genmica. Entre os principais alvos de
caspases encontram-se protenas estruturais e de funes essenciais como protenas
requeridas no reparo do DNA (DNA-PK, PARP), protenas reguladoras do ciclo celular (Cdc27,
Rb), protenas envolvidas em patologias humanas e diretamente envolvidas na regulao da
apoptose (ICAD, Bid), assim como reguladoras/mediadoras da sinalizao apopttica
(PI3K/AKT, RIP quinase) (SCHMITT et al., 1999).
O desencadeamento do processo de morte celular apopttica pode ocorrer atravs de
duas vias principais, dependendo da natureza do estmulo, como demonstrado na figura 2. A
via extrnseca desencadeada pela ativao de receptores de morte localizados na membrana
plasmtica. Na via intrnseca, a mitocndria mediadora chave do processo de morte celular
(ASSUNO, LINDEN, 2004).
A via extrnseca desencadeada pela ligao de fatores especficos receptores de
membrana como o Fas e TNF-R1, formando um complexo que ativa a pr-caspase-8,
iniciadora, que por sua vez ativa a pr-caspase-3, efetora, responsvel pelas alteraes
celulares associadas ao processo. Alternativamente, a pr-caspase-8 cliva Bid, induzindo a
translocao, oligomerizao e insero de Bax e/ou Bak na MME (Bak constitutivamente
mitocondrial, enquanto Bax translocado do citosol para a mitocndria em resposta a
estresse), com consequente liberao de protenas do espao intermembrana da mitocndria
para o citosol, principalmente o citocromo c integrante da cadeia respiratria. O citocromo c
liberado complexa-se com Apaf-1 e pr-caspase-9 em presena de dATP, formando o
apoptosoma que ativa a pr-capase-9, que por sua vez ativa pr-caspase-3, alm de outras
caspases efetoras (GOTTLIEB, 2000).
A via intrnseca desencadeia apoptose em resposta a danos no material gentico,
defeitos nos pontos de checagem do ciclo celular, mitose catastrfica, hipxia, ausncia de
fatores de crescimento, agentes quimioterpicos, radiao, drogas citotxicas e outros tipos
16
severos de estresse intracelulares (GOTTLIEB, 2000). Esta via envolve a ativao de protenas
pr-apoptticas da famlia Bcl-2 que agem na mitocndria, afetando sua permeabilidade
seletiva atravs da formao de poros por onde extravasam fatores apoptognicos como
citocromo c, AIF, Omi/HtrA2, SMAC/DIABLO e endo G, entre outras (KAUFMANN,
HENGARTNER, 2001).
Adicionalmente ativao de caspases, a liberao do citocromo c leva a perda de
funo mitocondrial e decrscimo de respirao com diminuio nos nveis intracelulares de
ATP. Desta forma, a ativao da via apopttica mitocondrial considerada um evento que
compromete irreversivelmente a clula morte (point of no return) (LISTON et al., 2003).



Figura 2: Vias extrnseca e intrnseca de apoptose e seus pontos de comunicao.

Uma abordagem experimental para detectar e quantificar leses oxidadas no DNA
avaliar seu efeito celular, ou seja, medir a integridade do DNA de clulas expostas s
condies oxidantes. Sob condies oxidantes fortes, clulas de mamferos podem morrer
devido ao acmulo das modificaes oxidadas em biomolculas induzidas pelas EROs. A
morte celular pode proceder atravs de alguns tipos de mecanismos moleculares, incluindo
necrose, apoptose ou autofagia, dependendo dos alvos celulares e da quantidade de leses
formadas. O acmulo de leses no DNA um forte sinal para a induo de vias apoptticas,
que resultam na ativao de enzimas degradativas, incluindo proteases e endonucleases. A
ativao dessas endonucleases de execuo resulta na clivagem do DNA em pontos
especficos, em regies localizadas entre os nucleossomos. Isso resulta em fragmentos de
tamanho especifico, que quando separados em um gel de agarose, migram em um padro
tpico de "escada". Esse tipo de fragmentao enzimtica do DNA caracterstico do processo
de apoptose, e utilizado como um evento identificador desse processo (WANG, EL-DEIRY,
2003).
Por outro lado, a fragmentao de DNA induzida diretamente pelo estresse oxidativo
resulta do ataque direto do

OH desoxiribose, como discutido anteriormente. Esses eventos


so independentes da sequncia das bases do DNA, e, portanto sua localizao aleatria,
dependendo basicamente da exposio do nucleotdeo ao solvente no meio intracelular. Com
Membrana
Plasmtica
Ncleo
APOPTOSE
Caspase-9
Receptores
morte celular
Caspase-8
Bax Ca
++
Citoc c
Apoptossoma
Apaf-1
AIF Endo G
Ca
++
IP3R
APOPTOSE
UV, radiao, Ca
2+
,
hipxia, ERO
Via Intrnseca
Via Extrnseca
Bcl-2/
Bcl-x
L
Mitocndria
Retculo
endoplasmtico
ATP
Membrana
Plasmtica
Ncleo
APOPTOSE
Caspase-9
Receptores
morte celular
Caspase-8
Bax Ca
++
Citoc c
Apoptossoma
Apaf-1
AIF Endo G
Ca
++
IP3R
APOPTOSE
UV, radiao, Ca
2+
,
hipxia, ERO
Via Intrnseca
Via Extrnseca
Bcl-2/
Bcl-x
L
Mitocndria
Retculo
endoplasmtico
ATP
17
isso, a fragmentao do DNA induzida pelo ataque direto de EROs no resulta em nenhum
padro especifico de tamanhos de fragmentos, e consequentemente quando esses so
separados em um gel de agarose, a migrao observada do tipo "arraste". Dessa forma,
resolvendo DNA genmico isolado em gis de agarose podemos distinguir se as clulas esto
comprometidas em uma via de morte celular apopttica ou uma via necrtica, em que a
fragmentao do DNA aleatria.

2. OBJETIVOS
O objetivo desse experimento avaliar se a ausncia da protena CSB influencia na
susceptibilidade morte celular aps uma alterao no estado redox celular e detectar que tipo
de morte celular est sendo induzida nesse contexto.

3. PROCEDIMENTO

Tratamento das culturas celulares
1. Prepare 1 placa de 10 cm semi-confluente (cerca de 80% confluncia) para cada ponto
experimental. Para isso, as clulas devem ser contadas e plaqueadas no dia anterior, na
densidade adequada (que varia com a linhagem celular, porm para essas linhagens sero
01 x 10
7
clulas por placa).
2. A linhagem celular que ser utilizada so fibroblastos obtidos da bipsia de pele de um
paciente CS-B (linhagem CS1AN, transformada por SV40). Usaremos, como controle
isognico, a mesma linhagem com superexpresso constitutiva do gene CSB selvagem
(CS1ANCSBwt)
3. Nesse experimento, utilizaremos 5 pontos experimentais, como na tabela a seguir:


Condio H
2
O
2
(500 M)
Tempo de
Exposio
(minutos)
Recuperao das
Clulas
(horas)
1 - 30 0
2 + 30 0
3 + 30 12
4 + 30 24
5 -
(A23187)
24 (hrs) 24


4. No fluxo laminar, remover o meio de cultura das placas e lavar 1x com 5 ml de PBS cada.
5. Adicionar H
2
O
2
diludo em PBS, o volume necessrio para uma concentrao final de
500M, como descrito na tabela. Retornar as placas para a estufa (37C, 5% CO
2
) e
incubar por 30 minutos.
6. Na condio 6, adicionar 10 M de A23187, ser o controle positivo para a induo de
apoptose.
7. Remover o meio de tratamento (com exceo da placa com A23187, que ser tratada por
24 hrs) e lavar as culturas 2x com 5 ml de PBS. Adicionar 10 ml de meio de cultura DMEM
+ 10% SFB e incubar as placas em estufa por 12 e 24 hr. As clulas das placas
correspondentes ao tempo 0hr sero imediatamente processadas para o isolamento de
DNA.
8. Ao final, remover o meio de cultura, lavar 1 x com 5 ml de PBS e proceder para o
isolamento de DNA.

18
Isolamento de DNA (com o kit DNeasy Blood & Tissue - QIAGEN)

1. Com o auxlio de um raspador de borracha, transfira o contedo da placa (clula + meio)
para um tubo cnico de 15 mL.
2. Centrifugue os tubos a 300 x g por 5 min (todas as centrifugaes sero realizadas a
temperatura ambiente).
3. Ressuspenda o precipitado em 200 L de PBS. Adicione 20 L de Proteinase K.
4. Adicione 200 L de tampo AL e agite imediatamente com o auxlio do vortex.
5. Incube as amostras a 56C por 10 min.
6. Adicione 200 L de etanol (100%) e agite com o auxlio do vortex.
7. Transfira a amostra para o conjunto coluna + tubo coletor.
8. Centrifugue o conjunto coluna (c/ amostra) + tubo coletor a 6.000 x g por 1 min. Descarte o
tubo coletor + eludo.
9. Coloque a coluna em um novo tubo coletor, e adicione 500 L de tampo AW1.
10. Centrifugue o conjunto coluna (c/ amostra) + tubo coletor a 6.000 x g por 1 min. Descarte o
tubo coletor + eludo.
11. Coloque a coluna em um novo tubo coletor, e adicione 500 L de tampo AW1.
12. Centrifugue o conjunto coluna (c/ amostra) + tubo coletor a 20.000 x g por 3 min. Descarte
o tubo coletor + eludo.
13. Coloque a coluna em um novo tubo de 1,5 mL, e adicione 200 L de gua deionizada na
membrana da coluna.
14. Incube por 1 min a temperatura ambiente.
15. Centrifugue o conjunto coluna (c/ amostra) + tubo a 6.000 x g por 1 min.
16. Descarte a coluna. O eludo a sua amostra final.

Quantificao e diluio do DNA

1. Usando o NanoDrop (microespectrofotmetro), mea a concentrao da soluo de DNA
atravs da A
260
. Avalie tambm a qualidade do DNA observando o espectro de absoro
no UV (230-310 nm). As razes A
260nm
/A
280nm
e A
260nm
/A
230nm
devem ser 1,8 para garantir
que o DNA esteja livre de protenas e resduos orgnicos do processo de isolamento. O
espectro no UV de uma soluo de DNA de boa qualidade deve ter o espectro similar ao
encontrado na Figura 3.


Figura 3: Exemplo de um espectro de uma soluo de DNA de boa qualidade obtida no equipamento
NanoDrop. Notem que as razes 260/280 e 260/230 so superiores a 2.

2. Dilua uma alquota da sua amostra para 1 g/ul, em gua deionizada autoclavada. Essa
amostra ser utilizada no ensaio de fragmentao.
19

Resoluo do DNA genmico em gel de agarose

a. Prepare um gel de agarose (molecular biology grade) a 1,0%, em tampo TAE (40 mM de
Tris pH 7.6, 20 mM de cido actico, 1 mM de EDTA), dissolvendo 1,0 g de agarose em
100 ml de tampo, no microondas. Espere a soluo gelificar no recipiente e dissolva
novamente no microondas (esse mtodo de duplo aquecimento garante uma completa
dissoluo dos grnulos de agarose).
b. Despeje a soluo de agarose no suporte do gel, devidamente selado; espere at a
completa gelificao.
c. Transfira o gel para a cuba de eletroforese e acrescente o volume necessrio de tampo
TAE para que o gel fique completamente submerso.
d. Prepare as amostras adicionando em cada tudo 10 l de DNA isolado (10 g de DNA), 2 l
de tampo de amostra , e 8 l de dH
2
O.
e. Carregue as amostras no gel, tomando cuidado para colocar todo o contedo preparado.
f. Proceda a separao eletrofortica a 100V, por cerca de 2 hr, at que a frente de migrao
(corante azul) esteja bem prxima ao final do gel (Figura 4).
g. Remova o gel da cuba de eletroforese e core com uma soluo de brometo de etdeo (2
mg/mL) por 10 minutos. Aps lave 1x em dH
2
O por 10 minutos.
h. Verifique em um transiluminador (UV).
i. Visualize os produtos no scanner Typhoon Trio.
j. Discuta os resultados com o grupo.



Figura 4: Gel de agarose horizontal mostrando as amostras carregadas no poos de amostra. Nesse
caso, o tampo de amostra tem cor amarelada.

20
4. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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death styles. Eur. J. Biochem. n. 271, p. 1638-1650, 2004.
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8543-8567, 2003.
EL-DEIRY, W.S.; KERN, S.E.; PIETENPOL, J.A.; KINZLER, K.W.; VOGELSTEIN, B.
Definition of a consensus binding site for p53. Nat Genet. v.1, n.1: p.45-9, 1992.
FISCHER, U.; SCHULZE-OSTHOFF, K. New approaches and therapeutics targeting:
apoptosis in disease. Pharmacol. Rev. n. 57, p. 187-215, 2005.
FRIEDBERG, E.C. DNA damage and repair. Nature. v.421, n.6921: p.436-40, 2003.
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LIPTON, S.A.; LU, X.; MADEO, F.; MALORNI, W.; MEHLEN, P.; NUEZ, G.; PETER, M.E.;
PIACENTINI, M.; RUBINSZTEIN, D.C.;, SHI, Y.; SIMON, H.U.; VANDENABEELE, P.; WHITE,
E.; YUAN, J.; ZHIVOTOVSKY, B.; MELINO, G.; KROEMER, G. Molecular definitions of cell
death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell
Death Differ. v.19, n.1: p.107-20, 2012.
GOTTLIEB, R.A. Mitochondria: execution central. FEBS Lett. n.482, p.6-12, 2000.
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battle against genotoxicity, carcinogenicity and apoptosis induced by alkylating agents. DNA
Repair (Amst). v.6, n.8: p.1079-99, 2007.
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new millenium. Trends Cell. Biol. n.12, p. 526-534, 2001.
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SCHMITT, E.; SAN, A. T.; BERTTRAND, R. Activation and role of caspases in
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Chammas; Vicente Odone Filho; Yana Sarkis Novis. (Org.). Tratado de Oncologia. 1ed. So
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STEVNSNER, T.; MUFTUOGLU, M.; AAMANN, M.D.; BOHR, V.A. The role of Cockayne
Syndrome group B (CSB) protein in base excision repair and aging. Mech Ageing Dev. v. 129,
n.7-8: p.441-8. 2008.
VERMEULEN, K.; BERNEMAN, Z. N.; VAN BOCKSTAELE, D. R. Cell cycle and
apoptosis. Cell Prolif. n. 36, p. 165-175, 2003.
WANG, S.; EL-DEIRY, W. TRAIL and apoptosis induction by TNF-family death
receptors. Oncogene. n. 22, p. 8628-8633, 2003.
21
Laboratrio de Pesquisa em Processos Oxidativos na Resposta Inflamatria
Prof Flvia Carla Meotti (responsvel);
Larissa A. C. Carvalho e Elan S. Fernandes (monitores)

SUMRIO TERICO
A inflamao uma resposta essencial do organismo para eliminar patgenos. A
resposta inicial depende do reconhecimento destes patgenos por clulas da defesa inata que
visam fagocitar este agente estranho para destru-lo e apresent-lo s clulas de resposta
imune adquirida. Aps um contato entre o receptor de superfcie celular dos neutrfilos e
macrfagos e o agente invasor desencadeia-se uma cascata de sinalizao intracelular que
culmina com ativao de enzimas envolvidas na gerao de substncias oxidantes. Estas
substncias incluem o nion radical superxido (O
2
-
), o perxido de hidrognio (H
2
O
2
), o
cido hipocloroso (HOCl), o radical xido ntrico (NO ), o radical dixido de nitrognio
( NO
2
) e o peroxinitrito (ONOO
-
), as quais tm atividade microbicida (Drummond et al., 2011;
Hampton et al., 1998; Vaz et al., 2009).





A produo de substncias oxidantes acontece atravs do aumento no consumo de
oxignio durante a fagocitose, o burst oxidativo. O oxignio ser utilizado principalmente pela
enzima nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato (NADPH) oxidase, a Nox, um sistema
multi-componente, que quando ativada por migra para a membrana plasmtica ou fagossomal,
para reduzir o oxignio a nion radical superxido (O
2
-
) a partir do NADPH. Este ltimo
participa da gerao de outras espcies derivadas do oxignio ( OH, H
2
O
2
) (Imlay, 2003;
Hampton et al., 1998), como exemplificado na reao:
2O
2
-
+ 2H
+
H
2
O
2
+ O
2
A gua oxigenada (H
2
O
2
)

que gerada a partir da dismutao do O
2
-
serve como
substrato para as peroxidases, um grupo de enzimas que reduz o H
2
O
2
gua e em
sequncia oxida outros substratos a fim de regenerar o seu estado nativo. Esta reao pode
gerar como produto final o cido hipocloso ou radicais livres.





22
Dentre as peroxidases relacionadas ao sistema imune destacam-se a mieloperoxidase
(MPO, liberada pelos neutrfilos) e a peroxidase eosinfilica (EPO, liberadas pelos
eosinfilos). A importncia do estudo da MPO reside na associao desta com a defesa dos
mamferos contra bactrias, vrus e fungos (Hampton et al., 1998). Como mostrado no
esquema acima, o intermedirio composto I da MPO pode oxidar o cloreto a cido hipocloroso,
ou oxidar outros substratos formando radicais livres. Os substratos para a MPO alm do cloreto
incluem a tirosina, o triptofano, o ascorbato, o cido rico, os flavonides, o xido ntrico e o
nitrito (Abu-Soud & Hazen, 2000; Podrez et al., 2000; Kettle & Winterbourn, 1997; Marquez et
al., 1990; Furtmller et al., 2000; Meotti et al., 2008; 2011).
Apesar do papel fundamental na sinalizao redox e na defesa contra microrganismos
patognicos invasores, a gerao de espcies reativas de oxignio pode causar danos clula
quando feita de maneira exacerbada, acometendo as principais biomolculas necessrias
sobrevivncia, como os lipdeos, as protenas e o DNA. A peroxidao de lipdeos um
mecanismo bem estabelecido de injuria celular e afeta principalmente a membrana plasmtica,
sendo muito utilizado como indicador de estresse oxidativo em clulas e tecidos (Esterbauer et
al., 1991; Nielsen et al., 1997). Trata-se de uma reao em cadeia, em que, uma vez iniciada,
propaga-se gerando cada vez mais produtos txicos s clulas, como endoperxidos e
aldedos. Perxidos de cidos graxos polinsaturados so muito instveis e geram
malondialdedo (MDA) e 4-hidroxialqueno (HAE) quando decompostos. A quantifio de MDA
tem sido bastante utilizada como indicador de peroxidao lipdica. O mtodo mais comum
para determinao dos nveis de MDA em amostras biolgicas a reao com o cido 2-
tiobarbitrico (TBA). Nesta reao, uma molcula de MDA reage com duas molculas de TBA
em meio cido, formando um aduto colorido (MDA-TBA
2
), que pode ser detectado por
espectrofotometria (Grotto et al., 2009).





Alm de espcies reativas, clulas de defesa secretam tambm certas protenas em
resposta aos patgenos, chamadas de citocinas. As citocinas so protenas solveis
intermedirias em muitas reaes celulares imunolgicas e inflamatrias. Assim, elas so
responsveis pela comunicao entre leuccitos e entre leuccitos e outras clulas. A maioria
das citocinas cuja estrutura molecular est definida chamada, por conveno, de interleucina
(IL). Todas as citocinas so produzidas em pequenas quantidades em resposta a um estmulo
externo, como um microrganismo. Elas se ligam aos seus receptores de alta afinidade e
desencadeiam uma cascata de sinalizao celular (Abbas e Lichtman, 2007). Dessa maneira,
uma forma de monitorar a resposta inflamatria avaliar a liberao de citocinas pelas clulas
de defesa na presena de microrganismos invasores.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

PROCESSOS OXIDATIVOS NA RESPOSTA INFLAMATRIA

1. Cultura de clula e diferenciao: A produo de espcies reativas de oxignio em
resposta ao sinal inflamatrio ser avaliada em clulas leucmicas promielocticas humanas
(HL-60). Estas clulas (1 x 10
6
/mL) podem ser diferenciadas para neutrfilos maduros com o
uso de 1,3% dimetilsulfxido (DMSO) em RPMI 1640, incubadas a 37C em atmosfera
23

umidificada e com 5% CO
2
por 3 dias (Jacob et al., 2002). Primeiramente as clulas sero
contadas a fim de saber qual o volume de suspenso necessrio ao experimento:
1.1. Montar a cmara de Neubauer com a lamnula apropriada;
1.2. Retirar aproximadamente 1 mL do meio de cultura da garrafa contendo as clulas
diferenciadas e transferir para um microtubo de 1,5 mL;
1.3. Transferir 10 L de azul de tripan (0,2%) para um microtubo de 0,6 mL;
1.4. Transferir 10 L da suspenso celular para o microtubo onde est o azul de tripan;
1.5. Homogeneizar gentilmente;
1.6. Pipetar 10 L dessa suspenso na cmara, para isso, deve-se encostar a ponta
da pipeta na borda da lamnula e preencher cuidadosamente a cmara de contagem. O lquido
deve preencher apenas um lado da cmara e no deve chegar aos canais de cada lado da
rea de contagem;
1.7. Focalizar a rea demarcada da cmara de contagem com a objetiva de menor aumento e
ento trocar para objetiva de 40X.
1.8. Contar as clulas viveis (que no apresentam colorao azul) presentes nos quatro
campos A e dividir o valor por 4 para obter a mdia;
1.9. Como a suspenso foi inicialmente diluda 1:1, o nmero de clulas contadas ser igual
mdia multiplicada pelo fator de diluio, neste caso 2;
1.10. Na cmara de Neubauer obtemos o nmero de clulas por 0,1 mm
3
. Para obter o nmero
de clulas por mL, deve-se multiplicar o valor obtido por 10.000 (fator de correo), pois1 mL =
1 cm
3
= 1.000 mm
3

Assim temos:

n de clulas/mL = (n total de clulas/ n de quadrantes) x fator de diluio x 10.000

1.11. Lavagem das clulas: as clulas sero centrifugadas para remoo do meio de cultura,
lavadas duas vezes em salina estril e ressuspensas em PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10
mM Na
2
HPO
4
; 2 mM KH
2
PO
4
; pH 7,4), glicose (1g/L), pH 7,4

2. Medida da produo de superxido atravs da reduo do citocromo c: o superxido
pode ser medido pela reduo de citocromo c na presena ou ausncia de DPI (iodnio de
difenila, inibidor da Nox) e com as clulas ativadas com PMA.
2.1. Adicionar taurina (15 mM) na suspenso de neutrfilos e preparar os poos como indicado
na tabela:

Neutrfilos
(1x10
6
cl/poo)
PMA
(100
ng/mL)
Citocromo
c (40 M)
DPI
(100 M)
01 --- ---
02 ---
03

2.2. A reduo do citocromo c ser acompanhada a 550 nm durante 30 min a 37C ( =
21.000 M
-1
s
-1
) (Pick e Mizel, 1981), atravs de um leitor de microplaca.
2.3. Quantificar a produo de superxido como especificado:

Concentrao molar de O
2
-
= (absorbncia final - absorbncia inicial)/21.000 M
-1
s
-1








24
3. Medida da produo de perxido de hidrognio atravs da oxidao do Amplex Red
(resorufina): A produo de perxido de hidrognio ser medida pela oxidao do Amplex Red
na presena ou ausncia de catalase e com as clulas ativadas por PMA ou bactrias.
3.1. Adicionar taurina (15 mM) na suspenso de neutrfilos e preparar os poos como indicado
na tabela:

Neutrfilos
(1x10
6
cl/poo)
PMA
(100
ng/mL)
Amplex
Red (50M)
HRP*
(10 M)
Catalase
(5 U/mL)
01 --- ---
02 ---
03
*horseradish peroxidase.

3.2. A oxidao de amplex red dependente do H
2
O
2
ser acompanhada a 550 nm por 30 min a
37C ( = 54.000 M
-1
s
-1
) (adaptado de Zhou et al., 1997);
3.3. Quantificar a produo de perxido de hidrognio como especificado:

Concentrao molar de H
2
O
2
= (absorbncia final - absorbncia inicial)/54.000 M
-1
s
-1


4. Formao do cido hipocloroso: A formao de HOCl pela MPO pode ser avaliado pela
medida da clorinao da taurina (Winterbourn e Kettle, 1994). Este ensaio baseado na
reao do oxidante com taurina para produzir taurina cloramina que capaz de oxidar o TNB a
DTNB (
412
= 13.600 M
-1
cm
-1
). A medio ser feita na presena ou ausncia de ABAH (cido
aminobenzico, inibidor da MPO) e com as clulas ativadas por PMA ou bactrias.
4.1. Adicionar taurina (15 mM) na suspenso de neutrfilos e preparar os microtubos como
indicado na tabela:

Neutrfilos
(1x10
6
cl/tubo)
PMA
(100 ng/mL)
ABAH
(10 M)
01 --- ---
02 ---
03

4.2. Incubar a 37C por 30 min;
4.3. Interromper a reao adicionando catalase (5U/mL);
4.4. Centrifugar os microtubos por 5 min a 800 g;
4.5. Recolher o sobrenadante e dilu-lo 5 vezes em 80 M de de TNB;
4.6. Obter a concentrao residual de TNB aps 5 min.

5. Deteco de citocinas por Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA): o ensaio de
ELISA sanduche utilizado para detectar protenas, como as citocinas. Ele consiste
basicamente na ligao do seu antgeno de interesse em um anticorpo preso a placa e
amplificao do sinal com ligao de anticorpos secundrios capazes de colorir a soluo,
como mostra a figura a seguir.




25
Assim, para detectar a formao de citocinas liberadas por neutrfilos infectados por bactrias,
ser feito ensaio de ELISA. Para isso:
5.1. Preparar os microtubos como indicado na tabela e incubar por 3 h a 37C:

Neutrfilos
(2x10
6
cl/ tubo)
Bactria
(2x10
7
cl/ tubo)
PMA
(100 ng/mL)
01 --- ---
02 ---
03 ---

5.2. Em uma placa de ELISA, adicionar 50 L de Anticorpo de Captura e deixar a temperatura
ambiente overnight;
5.3. No dia seguinte, descartar o contedo da placa e lav-la com Wash Buffer trs vezes;
5.4. Adicionar 150 L de Reagente Diluente e incubar a temperatura ambiente por 1 h;
5.5. Descartar o contedo e lavar a placa com Wash Buffer;
5.6. Adicionar 50 L de cada amostra a ser analisada e fazer na mesma placa uma curva de
calibrao com o anticorpo padro da citocina;
5.7. Incubar a temperatura ambiente por 2 h;
5.8. Descartar o contedo e lavar a placa com Wash Buffer;
5.9. Adicionar 50 L de Anticorpo de Deteco e incubar a temperatura ambiente por 2 h;
5.10. Descartar o contedo e lavar a placa com Wash Buffer;
5.11. Adicionar 50 L de Streptavidina-HRP e incubar a temperatura ambiente por 20 min,
protegendo a placa da luz;
5.12. Descartar o contedo e lavar a placa com Wash Buffer;
5.13. Adicionar 50 L de Soluo de Substrato e incubar a temperatura ambiente por 20 min,
protegendo a placa da luz;
5.14. No descartar o contedo e adicionar 25 L de Soluo Stop;
5.15. Determinar a absorbncia em 450 nm;
5.16. Calcular a concentrao de citocinas liberadas.
LEGENDA: Wash Buffer (100 mL PBS, 900 mL H
2
O e 500 L Tween); Reagente Diluente (1%
BSA em PBS), Soluo de Substrato (H
2
O
2
e tetrametilbenzidina, 1:1) e Soluo Stop (H
2
SO
4

2N). Os anticorpos de captura, padro e deteco esto inclusos no kit de ELISA e so
prprios para cada protena.

6. Avaliao da peroxidao de lipdeos: Como descrito anteriormente, as espcies reativas
de oxignio podem causar danos s biomolculas como os lipdeos da membrana plasmtica.
A peroxidao de lipdeos ser avaliada pela formao do aduto colorido com MDA. Para isso:
6.1. Preparar o filme lipdico (composio 100% PC) com concentrao final de 25 mM (ver
seo 1.1 do Laboratrio de Sistemas Biomimticos);
6.2. Preparar MLVs do filme ressuspendendo-o em 500 L em tampo acetato de amnio
10mM pH 7,4;
6.3. Agitar no vrtex;
6.4. Colocar em banho de ultrassom por alguns minutos para garantir que todo filme seja
removido da parede do tubo de ensaio;
6.5. Adicionar 100 M de H
2
O
2
, 200 M de cido rico e 1 M de HRP;
6.6. Incubar a temperatura ambiente por 30 min;
6.7. Aps este perodo, interromper a reao colocando os tubos no gelo;
6.8. Adicionar igual volume de TBA ao tubo a fim de dobrar o volume inicial;
6.9. Incubar a reao a 90C por 45 min;
6.10. Adicionar isobutanol para separar o aduto colorido (MDA-TBA
2
);
6.11. Vortexar e centrifugar a 1400 rpm por 2 min ou at que se perceba o aparecimento de
duas fases lmpidas no tubo;
6.12. Retirar o sobrenadante (fase aquosa) e fazer a leitura em placa de 96 poos. Absorbncia
(530 nm) e Fluorescncia (515 nm
Exc
553 nm
Emi
).

26
REFERNCIAS
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27
Laboratrio de Modelos Biomimticos
Prof Iolanda Midea Cuccovia (responsvel);
Filipe da Silva Lima, Greice Kelle Viegas Saraiva, Maria Catarina Figueiral da Silva Pereira Leite, Phillipe
Pessoa de Santana, Laura Farhur, Maisa Torres Martins e Alyne Procopio (monitores)


INTRODUO

Os fosfolipdios so lipdios que possuem em sua estrutura cido graxo, glicerol e cido
fosfrico (fosfato). Os fosfolipdios contm dois cidos graxos (saturados ou insaturados)
unidos a uma molcula de glicerol por uma ligao ster. O terceiro grupo hidroxila do glicerol
se esterifica ao cido fosfrico. Este fosfato est unido tambm a uma segunda molcula de
lcool, que pode ser colina, etonolamina, inositol ou serina, de acordo com o tipo de
fosfolipdio.
Os fosfolipdios apresentam duas grandes caudas hidrofbicas os dois cidos graxos
e uma cabea hidroflica (polar) o grupo que contm o fosfato. Portanto, os fosfolipdios
so molculas anfipticas: possuem afinidade por molculas hidrofbicas e por molculas
hidroflicas em regies distintas da molcula.
Os fosfolipdios so os principais componentes das membranas celulares, e tanto sua
anfipatia como as caractersticas de seus cidos graxos (nmero de carbonos, presena de
duplas ligaes) lhes conferem muitas de suas propriedades, como por exemplo, a sua
capacidade de formar bicamadas lipdicas. A disperso dos fosfolipdios em gua leva
formao espontnea de uma organizao similar das membranas celulares, em bicamada.
Esta configurao confere s membranas biolgicas muitas de suas propriedades, como por
exemplo, manter opotencial eltrico da clula, controlar o que entra e sai da clula
(permeabilidade seletiva). Em membranas, os fosfolipdios expem suas cabeas hidroflicas
para a gua, formando assim a interface membrana/gua, e suas caudas hidrofbicas,
dispostas no interior, de forma a evitar o contato entre as caudas e a gua. Este princpio de
autoassociao, na qual a unio de estruturas complexas depende exclusivamente de
propriedades fsico-qumicas de seus componentes moleculares, caracterstico dos sistemas
vivos. Outras molculas anfiflicas tambm podem assumir esta organizao ou similares.
Molculas anfiflicas apresentam uma grande variedade de estruturas, podendo ser
neutros, zwitterinicos, com carga positiva ou negativa, possuir uma, duas ou at trs caudas
hidrofbicas (Figura 1). Dependendo destas propriedades estruturais, os anfiflicos se associam
espontaneamente em gua formando monocamadas, bicamadas, micelas, vesculas e outros
agregados (Figura 2).







Figura 1: SDS (DodecilSulfao de Sdio) e PG (Fosfatidilglicerol)


Figura 2: Organizao dos agregados anfiflicos em soluo aquosa
28
Estes sistemas apresentam interesse cientfico e amplo campo de aplicaes, j que
essencialmente as reaes biolgicas ocorrem em interfaces. Na indstria, anfiflicos so
largamente usados, entre outros, em produtos alimentcios, cosmticos, transportadores de
frmacos, adjuvantes de vacinas, extrao de petrleo (Fendler, 1982, Farn, 2006).
Micelas, vesculas e monocamadas, quando usadas para estudar aspectos especficos
da biologia, podem ser consideradas como sistemas biomimticos. Uma forma de se estudar
sistemas biomimticos (membranas biolgicas, monocamadas de surfactantes, micelas, etc.)
atravs da Dinmica Molecular (DM). A DM um mtodo computacional que simula os
movimentos de tomos e molculas em funo do tempo, baseado na equao de movimento
de Newton (F=m.a) (Haile, 1997).
A DM fornece a possibilidade de se visualizar sistemas no nvel molecular. A partir da
trajetria gerada, podem-se calcular diversas propriedades. Em bicamadas lipdicas, por
exemplo, pode-se determinar organizao das cadeias lipdicas em diferentes condies
temperatura, pH, sais adicionados, etc. A hidratao das superfcies e da regio hidrofbica
pode ser analisada, determinando-se a distncia entre tomos e molculas de gua. A
interao de molculas de interesse inseridas na membrana (protenas, por exemplo) pode ser
investigada. Energias de interao membrana-protena e protena-solvente podem ser
calculadas, bem como a orientao e localizao destas molculas na membrana. Estudos
sobre a especificidade inica a diferena de afinidade entre diferentes sais e superfcies
podem ser realizados em sistemas de bicamadas, micelas ou mesmo na interface gua/ar
(Hyvnen, 2001).


PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

OBJETIVO

Como se caracterizam modelos biomimticos? Qual atividade de uma molcula sobre
a membrana?

MATERIAIS E MTODOS

Para responder essas perguntas sero empregadas LUV (large unilamellar vesicles
vesculas unilamelares grandes) e micelas como sistema de membranas modelo. A molcula
que ter sua atividade avaliada ser o peptdeo Melitina.

MATERIAIS

1. Peptdeo

Melitina: peptdeo hemoltico da abelha (Apis mellifera)
Sequncia peptdica = GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ

2. Lipdios e surfactante

Fosfatidilglicerol (PG) Fosfatidilcolina (PC)





Dodecilsulfato de sdio (SDS)

29
3. Molcula fluorescente ou fluorforo
5(6)-Carboxifluorescena (CF)



MTODOS

1. Membranas modelo
A membrana citoplasmtica atua como uma barreira seletiva entre o interior e o exterior de
uma clula. A membrana formada por uma bicamada lipdica contendo diversas protenas. A
sua alta complexidade (composio lipdica e contedo proteico) juntamente com as
dificuldades no uso de sistemas celulares em estudos biofsicos torna o uso de membranas
modelo (micelas, monocamadas lipdicas, bicamadas lipdicas) uma alternativa interessante
para estudos da interao de uma molcula com membranas.

1.1 Preparo de Lipossomos

1.1.1. Filme lipdico
1 Calcule as massas dos lipdios que sero pesados para obter as molaridades desejadas de
(a) PC 100%, (b) PC 70%/PG 30% e (c) DMPC 100%;
2 Pese as quantidades adequadas dos lipdios em um tubo de ensaio;
3 Adicione 0,5 mL de diclorometano;
4 Evapore o solvente dos tubos de ensaio com um fluxo baixo de N
2
de modo a formar um
filme lipdico no fundo do tubo;
5 Remova o restante do solvente deixando os tubos sob vcuo por 1 hora.

Vesculas multilamelares (multilamellar vesicles; MLV)
Um tipo de membrana modelo so as vesculas multilamelares (MLV), as quais so
vesculas lipdicas formadas por bicamadas fosfolipdicas concntricas intercaladas por
compartimentos aquosos, cujos dimetros variam de 400 a 3.500 nm (Figura 3).

1.1.2. Encapsulamento da CF
1 Prepare os filmes lipdicos com concentrao final desejada (veja seo 1.1.1.).
2 Prepare MLV de um desses filmes ressuspendendo-o em 500 L de uma soluo de 50 mM
de CF. Os outros filmes sero armazenados a -20
0
C.
3 Agite no vrtex por 1 minuto.
4 Coloque em banho de ultrassom por alguns minutos, para garantir que todo filme seja
removido do tubo de ensaio.
Obs.: As LUVs preparadas dessa maneira contero CF tanto dentro quanto fora das
vesculas. Porm, para realizar os ensaios de atividade ser necessrio retirar as
molculas de CF livres em soluo (veja seo 2.2).

Vesculas unilamelares grandes (LUV)
Vesculas unilamelares grandes (LUV) so formas vesiculares constitudas por apenas
uma bicamada fosfolipdica. Neste caso sero preparadas vesculas com 100nm de dimetro.
Para o preparo das LUV utiliza-se um extrusor. (Figura 3).

30

Figura 3: Esquema das estruturas vesiculares: Vesculas unilamelares pequenas (small unilamellar
vesicles, SUV), vesculas unilamelares grandes (large unilamellar vesicles, LUV) e vesculas
multilamelares (multilamellar vesicles, MLV).

1.1.3. Extruso
1 Monte o extrusor conforme a figura abaixo:


Figura 4: Montagem do extrusor.

2 Coloque as vesculas com CF preparadas no item 1.1.2. na seringa marcada e realize 11
ciclos de extruso (pressione a seringa 11 vezes).

1.1.4. Cromatografia por excluso de tamanho
1 Utilize uma coluna de Sephadex G-25 (mdio) (Figura 4).
2 Adicione tampo Tris HCl 10 mM (com NaCl 300 mM) sob fluxo contnuo pela coluna.
Obs.: o tampo deve sempre estar cobrindo a Sephadex G-25.
3 Deixe o tampo eluir at o menisco da coluna, ento aplique toda amostra extrusada. No
deixe a coluna secar, complete o volume com tampo. Conectar a coluna a um erlenmeyer
contendo tampo e observe a separao das vesculas contendo CF da CF livre.
4 Recolha a primeira frao da coluna (frao de cor alaranjada).

Figura 4: Esquema da Cromatografia de Excluso
31
2. Fluorescncia
O fenmeno de fluorescncia caracterizado pela emisso de ftons com energia na
regio do ultravioleta (UV), visvel ou infravermelho de uma espcie eletronicamente excitada.
Uma molcula capaz de absorver energia passando para um estado eletrnico excitado (S2),
porm ela pode, de forma no radiativa, ir para um estado menos energtico (relaxar) (S1) e
ento retornar ao seu estado fundamental (S0) emitindo a energia remanescente na forma de
radiao eltrica (ftons) (Figura 5).


Figura 5. Diagrama de Jablonski adaptado
demonstrando os estados energticos de uma
molcula: o diagrama de Jablonski mostra os
processos de absoro e relaxao de um tomo ou
molcula quando submetidos radiao
eletromagntica. A absoro no UV ou visvel induz
uma transio eletrnica do estado fundamental, S0,
at algum nvel vibracional dos estados eletrnicos
excitados, S1 ou S2.

A fluorescncia sofre uma forte influncia do microambiente ao redor da molcula
fluorescente, podendo assim ser utilizada para investigaes fsico-qumicas, bioqumicas e em
sistemas biolgicos. A 5(6)-carboxifluorescena (CF) uma sonda fluorescente aquossolvel
caracterizada por apresentar o fenmeno conhecido como auto-supresso da fluorescncia
quando se encontra em alta concentrao. Isto significa que quando preparada a uma
concentrao alta, na ordem de 50 mM neste caso, a CF no fluoresce. Mas se preparada em
baixas concentraes apresentar fluorescncia. Este fenmeno nos auxilia no estudo da
permeabilizao de vesculas. Vesculas preparadas com CF em seu interior numa
concentrao alta no apresentam fluorescncia; a sada da CF para o meio extravesicular, a
favor do gradiente de concentrao, atravs da leso originada na vescula por qualquer
agente que destrua a sua barreira de permeabilidade, conduz diluio da CF no meio externo
e, portanto, ao aumento da fluorescncia. Este aumento pode ser medido em funo do tempo
e da concentrao do agente ltico (agente responsvel pela leso na membrana) e assim
obter o curso temporal e a dose dependncia da permeabilizao.

2.1 Experimento de fluorescncia
1 Adicione em uma cubeta de quartzo 400 L de tampo Tris HCl 10 mM (com NaCl 300 mM)
2 Adicione 25 L da soluo de vesculas preparadas no item 1.4. Coloque a cubeta no
fluormetro;
3 Digite os parmetros (tempo, Ex, Em) no programa do Fluormetro;
4 Mea a fluorescncia por 100 segundos;
5 Adicione 25 L do peptdeo. Mea a fluorescncia at 1300 segundos;
6 Adicione 20 L de Polidocanol (10%). Mea a fluorescncia at 1500 segundos;
7 Pare a medida de fluorescncia;

RESULTADOS
Processamento dos dados
1 - Monte uma tabela no Excel e calcule eficincia de vazamento, E(%), utilizando a equao:

Onde F
p
(Intensidade de fluorescncia aps 10 min), F
T
(Intensidade de fluorescncia total) e F
0

(Intensidade de fluorescncia inicial).
2 - Abra o programa Origin 8.0.
3 - Plote E% em funo da concentrao do peptdeo ( M).

DISCUSSO
1. Qual a atividade da Melitina sobre a membrana?
2. Como a tcnica de cromatografia utilizada separa as vesculas de 100 nm?
3. Como funciona o processo de extruso?
(relaxao)
EN
ER
GI
A
32
3. Espalhamento dinmico (Dynamic light-scattering; DLS)
O espalhamento dinmico de diferentes radiaes como microondas, infravermelho
prximo, visvel ou UV ou raio X permite investigar a estrutura e dinmica de diferentes
materiais dispersos em meio lquido. Ao incidir um feixe de luz sobre uma disperso coloidal,
parte dessa luz pode ser absorvida, espalhada ou transmitida. A turbidez frequentemente
associada ao aspecto leitoso de diversas disperses coloidais definida pela expresso I
t
/I
o
=
exp[-TI], onde Io a intensidade da luz incidente, I
t
a intensidade da luz transmitida, T a
turbidez e I o caminho percorrido pela luz atravs da disperso, e pode ser determinada por
espectrofotmetros comuns (Figura 6). Entretanto, frequentemente necessrio caracterizaras
disperses quanto ao tamanho das partculas individuais ou distribuio de tamanho dessas
partculas.

Figura 6: Espalhamento de luz ao incidir sobre uma disperso coloidal.
Para medir o tamanho de partculas assim como a distribuio, a tcnica de DLS
muito verstil e til. Essa tcnica baseia-se na flutuao de intensidade de luz espalhada pela
disperso ao longo de tempo que decorreu do movimento browniano de suas partculas. O
decaimento da funo de auto correlao temporal dessas flutuaes de intensidade de luz
espalhada usado para medir diretamente o coeficiente de difuso translacional, D, o qual, por
sua vez, est inversamente relacionado ao raio hidrodinmico da partcula, R. Desta forma
podemos medir o raio hidrodinmico de partculas esfricas em uma disperso diluda.

3.1. Determinao do raio hidrodinmico de LUV
1 - Adicione em uma cubeta 1 mL da soluo de vesculas preparadas no item 1.1;
2 - Coloque a cubeta no DLS;
3 - Digite os parmetros (cubeta, solventes, temperatura) no programa do DLS;
4 - Mea o raio hidrodinmico da vescula;
5 - Observe os parmetros da medida.

DISCUSSO
1. Qual o raio hidrodinmico da vescula?
2. Como a tcnica DLS pode ser utilizada em ensaios biolgicos?
3. Quais parmetros devem ser observados para um bom resultado no DLS?


4. Titulao calorimtrica isotrmica (ITC)
Titulao Calorimtrica Isotrmica (ITC) uma tcnica que permite o estudo de
interaes entre duas espcies. Quando estas espcies interagem, calor gerado ou
absorvido. Pela medida desses calores de interao, constantes de ligao (K), estequiometria
da reao (n) e parmetros termodinmicos incluindo entalpia ( H) e entropia ( S) podem ser
determinados com preciso. Alm disso, variando a temperatura do experimento possvel
determinar a capacidade calorfica ( Cp) da reao. Portanto, em um nico experimento de ITC
possvel realizar uma rpida determinao do perfil termodinmico completo de uma grande
variedade de sistemas.
Uma vez que, o sinal de calor uma propriedade quase universal das reaes, o ITC
pode ser usado para monitorar as ligaes de ligantes com (macro)molculas tanto como
interaes entre macromolculas. Uma variedade de experimentos tem sido desenvolvida, que
podem ser incorporados ao programa de laboratrio de bioqumica e biologia molecular.

33
Aplicaes:
a) Interaes de protenas/protenas, lipdeos, carboidratos, DNA, ligantes, etc.
b) Interaes de enzimas com co-enzimas, inibidores, substratos, drogas, etc.
c) Interaes entre biopolmeros, drogas ligantes, etc.
d) Anlise de atividade de enzimas.
e) Estudos de anticorpos
f) Metabolismo celular
g) Interaes droga-receptor
h) Polimerizaes, surfactantes, quelao de metais, etc.
i) Interaes antgeno-anticorpo
j) Interaes DNA-droga
k) Micelizao de detergentes.

O aparelho constitudo por dois compartimentos adiabticos isolados, um situado
dentro do outro, e um par de celas idntica (amostra e referncia) dentro do compartimento
interno (Figura 5). Um dispositivo termoeltrico mede a diferena de temperatura entre as duas
celas, enquanto outro mede a diferena de temperatura entre as celas e o compartimento
adiabtico. O sistema opera isotermicamente na temperatura escolhida, usando um mecanismo
de aquecimento resistivo interno que aplica uma potencia eltrica necessria para que a
diferena de temperatura entre as celas e o compartimento adiabtico seja igual a zero.
Durante o experimento, monitorada a diferena da temperatura entre a cela de referncia e a
cela de amostra, calibrada em unidades de potencia ( Watts ou cal/s). Portanto, o sinal
medido pelo aparelho a diferena de potncia (DP) entre as duas celas.
O princpio de operao deste aparelho consiste em manter constante este valor de DP,
escolhido pelo usurio no princpio do experimento. Valores positivos de DP significam que a
cela de referncia mais quente que a cela de amostra, enquanto que um valor negativo
significa o oposto. Uma injeo que resulte em uma liberao de calor (exotrmica) causa um
desvio negativo do sinal, uma vez que o calor envolvido na reao fornece uma quantidade de
calor que no fornecida pelo aparelho. O oposto ocorre em uma reao endotrmica que
provoca um desvio positivo no sinal. Uma vez que DP dado em unidade de potncia, a
integral em relao ao tempo de cada pico obtido fornece a medida do calor envolvido em cada
injeo.

A B

Figura 7: (A) Fotografia do microcalormetro Microcal modelo VP-ITC. (B) Diagrama das celas e da
seringa de injeo.

4.1 Determinao da concentrao micelar crtica (cmc) de SDS
1 Prepare 5 mL de uma soluo de SDS 0,16 M;
2 Ajuste os parmetros do experimento;
3 Coloque gua pura na cela de amostra do ITC;
4 Adicione a soluo de SDS no ITC;
5 Inicie a titulao.

34
DISCUSSO

1. Qual o fenmeno observado no experimento e como este experimento se relaciona com a
formao de micelas?
2. Por que a curva possui a forma de uma sigmoide?
3. Qual foi a cmc do SDS no experimento? Qual seria o valor de cmc esperado para o mesmo
surfactante com 16 carbonos?

5. Calorimetria diferencial de varredura (DSC)
Calorimetria diferencial de varredura (Differential Scanning Calorimetry - DSC)
utilizada para compreenso da estabilidade de sistemas biolgicos. DSC mede diretamente
mudanas de calor que ocorrem em biomolculas durante aumento ou diminuio controlados
da temperatura, o que torna este mtodo possvel para estudo de materiais em sua forma
nativa. DSC pode elucidar os fatores que contribuem para a estabilidade de biomolculas
nativas, incluindo interaes hidrofbicas, ligao de hidrognio, entropia conformacional e o
ambiente fsico.

Aplicaes:
a) Estabilidade de protena.
b) Formulaes biofarmacuticas lquidas.
c) Desenvolvimento de processo.
d) Engenharia de protena.
e) Ordem de ligao.
f) Estudos de domnios de anticorpos.
g) Caracterizao de membranas, lipdios, cidos nuclicos e sistemas micelares.
h) Avaliao dos efeitos das mudanas estruturais na estabilidade de uma molcula.
i) Avaliao de biocompatibilidade durante produo.
j) Ideal para estudos de estabilidade.
k) Permite visualizar mecanismos de desnaturao e renaturao.
l) Monitora reversibilidade de processos trmicos.
m) Estuda molculas no seu estado nativo sem acrescentar marcadores. Pode ser usado
com solues que interferem em mtodos pticos incluindo solues turvas ou coloridas
ou suspenses particuladas.
n) Monitora energia conformacional de protenas e biopolmeros.
o) Continuamente mede excesso de capacidade calorfica.

As bicamadas lipdicas podem apresentar diferentes estados fsicos de acordo a razo
gua/lipdio, com o tipo de lipdios que as constituem e ainda com a temperatura, entre outros.
DSC uma tcnica termodinmica que mede as trocas de calor associadas s transies de
fase que ocorrem em modelos de membrana ou membranas biolgicas. Esta tcnica pode ser
utilizada para estudar as transies de fase de lipdios em funo do tipo de fosfolipdio, do
comprimento da cadeia hidrofbica, do contedo em colesterol e da interao de frmacos com
membranas. Um experimento de DSC permite obter informao acurada sobre a temperatura,
a entalpia e a cooperatividade das transies de fase de lipdios. Trs parmetros so
particularmente importantes na descrio da interao de frmacos com membranas: (a) a
alterao da temperatura de transio de fase principal (T
m
), que se relaciona com alteraes
da fluidez da bicamada lipdica; (b) a entalpia calorimtrica (H); e (c) largura a meia-altura do
pico de transio de fase, que se relaciona com cooperatividade da transio de fase.










35





Figura 8: Curva de DSC tpica das transies de fase de bicamadas de fosfolipdios em funo do
aumento de temperatura. Fosfolipdios adotam diferentes estados fsicos: fase gel (L

), fase ripple (P

) e
fase fluda (L

)


5.1 Curva de DSC de bicamas lipdicas de dimiristoiltoilfosfatidilcolina (DMPC)
1 Prepare LUV de DMPC (2 ml, 2 mM) tal como descrito na seo 1.1, tendo em ateno as
seguintes notas:
a) Na preparao do filme lipdico, adicionar 0,5 ml de uma mistura de
diclorometano:metanol (3:2);
b) Para a ressuspenso do filme lipdico, adicionar o tampo e colocar em banho de gua
a 40 C durante 30 minutos e agitar no vrtex de 10 em 10 minutos;
c) Fazer a extruso tambm a 40 C, utilizando uma placa de aquecimento, o extrusor e
respetivo suporte para aquecimento.
2 Preencha a cela da amostra do DSC com a suspenso de LUVs (a cela de referncia foi
previamente preenchida com tampo)
3 Selecione os parmetros no programa do DSC (velocidade de varredura, temperatura inicial
e final)
4 Obtenha a curva de DSC da bicamada de DMPC.


DISCUSSO
1. Quais as fases lipdicas e transies de fase presentes na curva de DSC?
2. Como seria uma curva de DSC de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC)? E de PC?
3. Considerando a curva de DSC fornecida de DMPC na presena de um frmaco, quais
parmetros so alterados pela interao do frmaco com a membrana?

36
REFERNCIAS:
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37




B
Estrutura de
Protenas e
Sinalizao Celular

38
Laboratrio de Biologia Vascular
Prof. Ricardo Jos Giordano (responsvel);
Leila da Silva Magalhes (monitora)


Phage Display

Phage display uma tcnica combinatorial que permite a expresso de peptdeos
aleatrios na superfcie de partculas virais (bacterifagos). Essa metodologia bastante
verstil, permitindo ensaios de seleo de peptdeos contra diferentes alvos em diferentes
situaes, como em ensaios de seleo de peptdeos (chamados biopanning) realizados in vivo
injetando os fagos na circulao do animal, retirando os rgos de interesse e selecionando
aqueles fagos que expressam peptdeos que interagem com a vasculatura de diferentes rgos
do organismo, bem como ensaios in vitro contra molculas alvo aderidas em superfcie; tecidos
dissecados; ou clulas que podem ou no ser estimuladas para alterar a expresso de
receptores - neste ltimo caso combinamos o Phage Display com a tcnica BRASIL
(Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands), que utiliza um sistema
bifsico para separar clulas e fagos numa nica etapa de centrifugao (Giordano et al.,
2001). Esse mtodo permite o isolamento e caracterizao em uma nica etapa de ligantes
especficos para receptores de superfcie celular. Esta metodologia combinatorial permite
identificar molculas que potencialmente podem servir para o desenvolvimento de frmacos,
vacinas, mtodos diagnsticos e de outros insumos (Smith, 1985; Scott e Smith, 1990;
Giordano et al., 2009).
A tcnica de phage display baseia-se na construo de bibliotecas de bacterifagos
filamentosos de tal forma que pequenos peptdeos (entre 5 e 15 aminocidos) so
apresentados numa das protenas do capsdeo viral (Figura 1). Uma biblioteca de phage
display pode conter mais de 10
8
diferentes peptdeos o que resulta em ligantes para
virtualmente qualquer alvo biolgico.































Figura 1: Esquema
representativo da construo
de uma biblioteca de Phage
Display. Sequncias aleatrias
de oligonucleotdeos sintticos
so clonadas em fase com o
gene que codifica uma das
protenas do capsseo viral,
localizada numa das
extremidades do vrus e
chamada de pIII. Dessa forma,
cada partcula viral, passa a
apresentar em sua superfcie um
peptdeo de sequncia diferente
(entre 6 a 12 aminocidos, por
exemplo), formando uma
biblioteca de phage display que
pode ser usada em varreduras
contra alvos biolgicos.
39

Uma caracterstica importante do phage display que os peptdeos selecionados
frequentemente apresentam atividade biolgica relacionada com a natureza da molcula em
estudo. Por exemplo, no caso de enzimas, o peptdeo frequentemente mimetiza o substrato,
ligando-se ao stio ativo ou alostrico, inibindo ou ativando a enzima (Koivunen et al., 1999;
Giordano et al., 2001; Cloutier et al., 2004; Giordano et al., 2005); no caso de receptores de
superfcie, o peptdeo se assemelha a uma protena ligante do receptor (Koivunen et al., 1993;
Giordano et al., 2001), competindo pela ativao do mesmo. Essa caracterstica do phage
display permite identificar alvos teraputicos e diagnsticos relevantes aos diversos processos
biolgicos de um organismo e, ao mesmo tempo, isolar e caracterizar peptdeos antagonistas
ou agonistas dos alvos identificados. Esses peptdeos podem ser ento explorados para o
desenvolvimento de agentes teraputicos. Portanto, phage display uma tcnica que encontra
mltiplas aplicaes, tais como, desenho racional de frmacos, terapias direcionadas, terapias
gnicas, produo de vacinas, mtodos diagnsticos, entre outras aplicaes (Sergeeva et al.,
2006; Giordano et al., 2009).


EXPERIMENTO 1

Phage Display contra protena imobilizada

Este protocolo descreve o procedimento de varredura para seleo de fagos in vitro contra
protenas imobilizadas em placa de poliestireno pelo mtodo de Phage Display.
1. Adsoro da protena: dilua 1ug da protena de interesse em 50 l de PBS estril e aplique
em um poo de placa de 96 poos de fundo reto e incube a 4C, overnight. No dia seguinte,
remova a soluo e lave o poo com 200 l de PBS.
2. Bloqueio: preencha o poo com Albumina Bovina (BSA 3%) e incube por 2 horas a
temperatura ambiente.
3. Incubao: Misture cuidadosamente 10 l dos fagos da biblioteca (10
10
partculas virais) com
40 l de BSA 3% e incube por 2 horas a temperatura ambiente. No nosso caso, utilizaremos os
fagos RGD ou Fd. Ateno: a biblioteca de fagos utilizada apenas no primeiro ciclo de
seleo; nos ciclos subsequentes, os fagos utilizados so aqueles recuperados no ciclo
anterior.
4. Lavagem: Remover a soluo e lavar o poo com 200 l de PBS, up and down 3 vezes.
Repetir este procedimento 9 vezes, trocando o tip entre uma lavagem e outra.
5. Infeco em K91(OD
600
: 1,5 2,00): Adicionar 200 ul da bactria K91 no poo e incubar por
30 minutos a temperatura ambiente. Observao: titular o fago Fd como controle de infeco
da K91.
6.Amplificao do Fago: lavar o poo com LB e transferir a soluo para falcon com 20 mL de
LB (Kanamicina 20ul/Tetraciclina 20ul) e homogeinize bem. Reservar cerca de 400 ul desta
soluo para plaqueamento. Manter o falcon com a tampa semi-aberta e incubar a 37C por
18-20 horas sob agitao de 250-300 RPM.
7. Diluies da bactria para plaqueamento: 100/ 10/ 1 em meio LB. Plaquear as bactrias em
placas LB Kan/Tet.
8. No dia seguinte, precipite o fago com PEG/NaCl (dupla-precipitao) como descrito no
protocolo Precipitao do Fago, e posteriormente titule-o (protocolo Titulao do Fago) .
9. Colete as colnias das placas em um placa de 96 poos. Cada poo deve conter 100l da
soluo PBS+ 5% glicerol. Pegue as colnias com um palito de madeira estril. No esquecer:
1 colnia para 1 poo.
10. Repita a varredura (panning) comeando com um novo coating do alvo de interesse.







40
EXPERIMENTO 2
Precipitao de fagos com PEG/NaCl


1. Centrifugar a cultura saturada overnight de bactria K91Kan a 8000 X g por 20 minutos;
2. Coletar o sobrenadante (fagos) e acrescentar 15%PEG/NaCl (para 100ml de cultura
usar 15 ml de PEG/NaCl). Incubar no gelo por duas horas.
3. Centrifugar a soluo com PEG/NaCl a 8000 X g por 30 minutos, 4
o
C;
4. Desprezar sobrenadante;
5. Centrifugar o precipitado (pellet) de fagos a 8000 X g por 5 minutos a 4
o
C;
6. Ressuspender o precipitado (pellet) de fagos em 1 ml de 1X PBS estril,
7. Incubar no shaker, 250 RPM, a 37
o
C por 15;
8. Transferir para tubo de 1,5ml e centrifugar a 8000 X g por 15minutos;
9. Coletar o sobrenadante e transferir para um novo tubo de 1,5ml contendo 15%
PEG/NaCl. Incubar no gelo por 30 minutos;
10. Centrifugar a 8000 X g por 30 minutos;
11. Descartar o sobrenadante e centrifugar por 5 minutos;
12. Ressuspender o precipitado (pellet) de fagos em 50-100 l 1X PBS estril;
13. Incubar sob agitao, 250 RPM, a 37
o
C por 15 minutos;
14. Centrifugar 8000 X g por 15minutos;
15. Transferir o sobrenadante (fagos) para um novo tubo de 1,5ml e armazenar na
geladeira (4C).
16. Titular a soluo de fagos.

EXPERIMENTO 3
Titulao dos Fagos

1. Inocular K91Kan da placa LB Kan em 10 ml de meio lquido TB fosfato Kanamicina (50
g/ml) e incubar a 37
o
C, sob agitao (250RPM) at a DO
600nm
= 1,85 2,00;
2. Infectar 200l de bactria, seguindo o esquema abaixo, com as seguintes diluies do
fago Fd:


41
3. Incubar por 30 minutos e plaquear, em triplicatas de 50l, em placas LB
kanamicina(100g/ml) e tetraciclina (40ug/ml).
4. Deixar na estufa a 37
o
C overnight e, no dia seguinte, contar as colnias e determinar o
ttulo de fagos.

EXPERIMENTO 4
Phage-PCR

A regio que flanqueia a sequncia que codifica os peptdeos inseridos no gene da
protena pIII amplificada por reao em cadeia da polimerase (PCR) utilizando como alvo
colnias de bactrias que produzem fagos. Utilizando este produto de PCR como alvo em
reaes de sequenciamento de DNA, podemos obter a sequncia de peptdeo expressa em
determinado fago.
Para cada colnia (TU) coletada na placa, feita uma reao de PCR, que chamamos
Phage-PCR.
A tabela descreve o volume para 1 reao.

Conc. inicial Conc. Final volume
gua ultra-pura 11,5 l
Tampo com (NH
4
)
2
SO
4
10X 1X 2,5 l
dNTP 2,5mM 2,5uM 2,5 l
MgCl
2
25 mM 2mM 2,0 l
Primer phage foward 10 pmol/ l 0,8pmol/ l 2,0 l
Primer phage reverse new 10 pmol/ l 0,8pmol/ l 2,0 l
Taq DNA polymerase 5U/ul 1U/ul 0,5ul
Template (1colnia/100ul
PBS)
2,0 ul
Total volume 25ul


Montar a reao abaixo para cada amostra e incubar no termociclador nas seguintes condies
de ciclagem:
1) 94
0
C 5 minutos
2) 94
0
C 15 segundos
3) 60
0
C 20 segundos
4) 72
0
C 45 segundos
5) Step 2 to 4 35 ciclos
6) 72
0
C 7 minutos
7) 4
0
C hold

O tamanho do produto de PCR amplificado de 250pb.
Realizar uma eletroforese em gel de agarose de 2% para verificar se a reao ocorreu
corretamente.
Gel de 2% agarose: pesar 2 g de agarose em 100ml de tampo 1X TAE. Aps fundir a agarose
no microondas, acrescentar 0,5g/ml de brometo de etdeo. Verter o gel de agarose no sistema
de gel. Aps o gel ter solidificado, aplicar em cada canaleta:
1 ul de peso molecular 1kb (Fermentas)
5l das amostras de Phage-PCR
Ligar a fonte e ajustar a voltagem em 90Volts para a corrida.

42
REFERNCIAS:
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43
Laboratrio de Bioqumica De Parasitas
Prof. Maria Julia Manso Alves (responsvel);
Chrislaine Oliveira Soares e Milton Csar de Almeida Pereira (monitores)

1. INTRODUO
1.1. Trypanosoma cruzi

Kinetoplastida uma ordem de protozorios nomeada desta forma devido presena
do cinetoplasmo, uma regio distinta de sua mitocndria nica e alongada contendo grande
quantidade de DNA condensado, e associado ao corpo basal do flagelo. Alguns grupos desta
ordem assumem diferentes formas em situaes diferentes, como amastigota, promastigota,
coanomastigota, epimastigota, tripomastigota e opimastigota. A figura ao lado, retirada do
trabalho original publicado por Carlos Chagas (Chagas, 1909), ilustra a diversidade morfolgica
destes micro-organismos.














Figura 1: Diversidade morfolgica em Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909)


Dentro desta ordem, a famlia Trypanosomatidae caracteriza-se por conter apenas
parasitas e um nico flagelo. Estes micro-organismos so capazes de parasitar uma grande
variedade de hospedeiros, como rotferos, nematides, aneldeos, moluscos, artrpodes,
mamferos, etc., variando de espcie para espcie. Apesar de poucas espcies de protozorios
da famlia Trypanosomatidae serem capazes de parasitar o homem, esta famlia possui um
grande interesse mdico e veterinrio, devido aos impactos econmicos e em sade pblica,
este o caso de Trypanosoma cruzi, protozorio de interesse estudado no laboratrio de
parasitas do Instituto de Qumica da USP.
44
Trypanosoma cruzi o agente etiolgico causador da doena de Chagas,que atinge
cerca de 5 a 6 milhes de pessoas na Amrica do Sul, e destas, de 30 a 40% tem ou
desenvolvero cardiomiopatia, megasndromes digestivas ou ambas, desenvolvidas pela
doena. Esse organismo tem sido estudado devido sua grande importncia para a sade
pblica, visto que ainda existem cerca de 25 milhes de pessoas situadas em reas com risco
de contrair a doena s na Amrica Latina (RASSI, 2010; WHO, 2000).
Em nosso laboratrio, observou-se que diferentes cepas de T. cruzi possuem
infectividade diferente, possivelmente devido a presena de diferentes glicoprotenas de
membrana (ALVES & COLLI, 2007). Dentre essas glicoprotenas, uma famlia de particular
interesse a gp85/Trans-sialidases, nomeadas dessa forma por apresentarem 85 kDa, e de
particular importncia para o processo de infeco, como evidenciado por estudos de inibio
de infeco utilizando anticorpos monoclonais (ALVES, 1986), e por apresentar tropismo por
peptdeos encontrados no endotlio (TONELLI, 2010). Mais recentemente, nosso laboratrio
voltou sua ateno para a modulao de alteraes ps-traducionais, como fosforilao de
protenas, em Trypanosoma cruzi quando em contato com diferentes molculas do hospedeiro
(MATTOS, 2012).

1.2. Crithidia fasciculata
O tripanosomatdeo C. fasciculata um parasita de diversas espcies de insetos, por
exemplos do gnero Anopheles, e so incapazes de infectar seres humanos.
Apesar de no haver interesse mdico, este parasita uma ferramenta interessante em
pesquisa, devido, dentre outros motivos, ao seu fcil cultivo, segurana, e proximidade
filogentica com diversos patgenos humanos.











Figura 2: Crithidia fasciculata. Azul: Ncleo e kinetoplasto. Verde: Tubulina.


2. OBJETIVOS
- Verificar, por eletroforese bidimensional, o perfil de protenas expressas aps estresse
de temperatura em Crithidia fasciculata em cultura.



45
3. ABORDAGEM EXPERIMENTAL
3.1. Dosagem de protenas: Mtodo de Bradford
O mtodo de Bradford (BRADFORD, 1976) muito popular por ser rpido, com durao
de cerca de 5 minutos, e por envolver apenas um corante na reao. uma tcnica para a
determinao de protenas totais que utiliza o corante de Coomassie brilliant blue G-250. O
corante reage principalmente com resduos de arginina, o qual tem um lado da cadeia
carregado positivamente, porm interaes leves tambm podem ser observadas com resduos
de lisina e aminocidos aromticos. Na ausncia de protena o corante um vermelho plido,
j na presena da protena apresenta colorao azul e apresenta absorbncia, geralmente, em
590 nm (MIKKELSEN E CORTN, 2004).



Figura 3: Frmula estrutural do corante Coomassie brilliant blue G-250

3.2. Eletroforese Bidimensional
A eletroforese uma tcnica de separao que se baseia na migrao de ons
submetidos corrente eltrica, onde a taxa de migrao (mobilidade eletrofortica)
influenciada pela carga proteica no meio eletrofortico, pela sua forma, tamanho e ainda pela
associao com outros compostos ionizveis.
A eletroforese conduzida com a fixao de um parmetro, tais como corrente eltrica,
diferena de potencial eltrico ou potncia, e o suporte deve ser um composto qumica e
fisicamente inerte, para que no haja interferncia na migrao das molculas, sendo
comumente utilizados os gis de poliacrilamida.
Nessa tcnica, originalmente descrita em 1975 (OFARRELL, 1975), as protenas so
primeiramente submetidas a uma focalizao isoeltrica (IEF, primeira dimenso) e, em
seguida, a uma eletroforese em presena de SDS (dodecilsulfato de sdio, um detergente), por
um mtodo convencional, consistindo na segunda dimenso.
Focalizao Isoeltrica: o procedimento empregado para determinar o ponto isoeltrico (pI) -
valor de pH em que o somatrio de todas as cargas da molcula igual a zero - de uma
determinada protena, onde um gradiente de pH estabelecido em gel sob ao de um campo
eltrico e a protena migra at atingir o pH que coincide com o seu pI (SILVA, 2002).
As protenas so aplicadas a tiras de gel contendo um gradiente imobilizado de
anfteros, o qual submetido a uma alta voltagem . As tiras contm grupos tamponantes
cidos e bsicos, que garantem um gradiente de pH especfico que se estende de uma
extremidade a outra da tira.

46




Figura 4: A esquerda uma soluo de anflito incorporada ao gel e um gradiente estvel do pH
estabelecido no gel atravs da aplicao de campo eltrico. Ao centro, aps adio da soluo proteica
aplicado novo campo eltrico. direita pode-se observar bandas representativas de protenas
distribudas ao longo do gradietne de pH (Lehninger et al. 2008).



Eletroforese em Gel de Poliacrilamida: Separao de protenas por SDS PAGE (sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) levando em considerao, exclusivamente,
suas massas moleculares uma tcnica uma tcnica clssica em bioqumica, utilizada desde
os anos 70 (LAEMMLI, 1970). Para tal o detergente aninico interage com as protenas por
interaes hidrofbicas, aumentando a carga bruta negativa e tornando insignificativa a carga
intrnsica da protena, proporcionando a mesma quantidade de carga por rea e conferindo
uma carga final negativa as protenas. Dessa forma as protenas, carregadas negativamente,
migram do polo negativo para o positivo, sob a atuao de um campo eltrico sendo que as
protenas de maior massa molecular migraro menos pela malha criada pela poliacrilamida, e
as protenas menores passaro com mais facilidade por essa malha, separando-se.
Aps a separao ocorre a visualizao das protenas as quais aparecem como pontos
ou spots. Existem vrios mtodos de deteco das protenas baseados na colorao do gel
com reagentes especficos de acordo com o objetivo do experimento. A colorao de gis com
o corante Coomassie Blue coloidal permite a identificao das protenas totais da amostra.

47

Figura 5: Separao de protenas por massa molecular, atravs de eletroforese em SDS-PAGE, neste
caso para anlise unidimensional. Amostras diferentes so colocadas nos poos ou depresses no topo
do gel de poliacrilamida, onde as protenas movem-se para o interior do gel quando um campo eltrico
aplicado (Lehninger et al. 2008).

Figura 6: Esquema da eletroforese bidimensional: Aps focalizao isoeltrica (primeira dimenso),
onde protenas so separadas por ponto isoeltrico, a fita submetida a SDS-PAGE, separando as
protenas por massa molecular (segunda dimenso).
48

4. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS

4.1 Cultivo de Crithidia fasciculata (realizao prvia)
C. fasciculata foi cultivado em meio LIT (Liver Infusion Tryptose)
suplementado com 10% soro fetal bovino, a 28C, sem agitao e monitorado
diariamente, atravs de microscopia ptica, at uma concentrao
aproximada de 10
8
clulas por mL.

4.2 Incubao dos parasitas
C. fasciculata (1.10
9
) ser incubado em meio LIT suplementado com 10% soro fetal bovino,
sendo a condio controle incubada a 28C e a induo de estresse de temperatura ser
obtida incubando os parasitas a 37C por 15 min.


Tabela 1: Ensaio de Incubao de C. fasciculata em diferentes temperaturas
Ensaio Parasitas Volume de Meio LIT Temperatura de Incubao
(1) Controle 1.10
8
/mL 10 mL 28 C
(2) Tratado 1.10
8
/mL 10 mL 37C


4.3 Lavagem dos parasitas
Aps a incubao, os parasitas sero centrifugados a 5000 rpm por 10 min, o
sobrenadante ser descartado e o pellet ressuspendido em 1 mL de PBS (Phosphate buffered
saline) e transferido para tubos eppendorf de capacidade de 2 mL, em seguida centrifugue as
amostras a 10.000 rpm, durante 5 minutos.
Aps centrifugao, remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet
em 1 mL de PBS. Centrifugue novamente a 10.000 rpm, por 5 minutos.


Figura 7: Esquema do tubo aps centrifugao dos parasitas.

49


4.4 Preparo do extrato proteico
Aps a terceira e ltima centrifugao, ressuspenda o pellet em 200 L de tampo
Destreak com inibidores de protease e fosfatase, homogeneizando bem com a micropipeta.


Tabela 2: Volumes de inibidores de protease e fosfatase no tampo Destreak:
Soluo Destreak + Inibidores Protease e
fosfatase
Amostra Quantidade
Destreak qsp 1 mL
NaF 30 mM
NaVO4 1 mM
PMSF 1 mM
Coquetel Inibidor Protease (Sigma) 50 L
-glicerofosfato de sdio 25 mM


Os tubos devero ser vedados, para evitar a entrada de gua, e colocados em banho
frio, contendo gua e gelo. As amostras devero ser sonicadas por 20 minutos.
Aps sonicao, os tubos sero centrifugados a 12.000 rpm, por 10 minutos, sendo que
a centrifuga deve estar em 4 C.
O sobrenadante a frao de interesse, pois contm extrato proteico, que ser ento
cuidadosamente recolhido, com micropipeta, e transferido para outro tubo.

NOTA: As amostras devero ser sempre mentidas em banho de gelo, de forma a evitar degradao de
protenas.


4.4 Dosagem de protenas pelo mtodo de Bradford
Em tubos com capacidade de 2 mL, pipete 600 L de padro de protena albumina de
soro bovino (bovine srum albumin, BSA) mais 200 L de reagente de Bradford. Homogeneize
bem utilizando a pipeta. Isto deve ser realizado para cada uma das oito concentraes de
albumina.
Em uma placa de 96 poos, pipete 100 L de cada padro de BSA, distribudos em
poos diferentes. Cada padro deve ser pipetado trs vezes na placa (triplicata).
Pipete em um tubo: 2 L das amostras de extrato proteico, preparadas na etapa
anterior, mais 18 L de gua. Fazendo o mesmo, em tubo diferente, sendo essa a amostra
BRANCO, contendo Destreak com inibidores de protease e fosfatase.
Na placa de 96 poos, pipete, em poos diferentes:
- 159 L de gua
- 1 L de amostra diluda 10 vezes
- 40 L de reagente de Bradford
Homogenize bem com a pipeta.

50
Deve-se fazer isso trs vezes para cada amostra. O layout da placa dever ficar desta
forma:


Tabela 3: Layout da placa de 96 poos:
1 2 3 4 5 6 7 8
A BSA 0 BSA 0 BSA 0

Destreak Destreak Destreak
B
BSA 0,59
g
BSA 0,59
g
BSA 0,59
g


C
BSA 1,2
g
BSA 1,2
g
BSA 1,2
g

Extrato Extrato Extrato
D
BSA 1,8
g
BSA 1,8
g
BSA 1,8
g


E
BSA 2,4
g
BSA 2,4
g
BSA 2,4
g


F
BSA 2,9
g
BSA 2,9
g
BSA 2,9
g


G
BSA 3,5
g
BSA 3,5
g
BSA 3,5
g


H
BSA 4,1
g
BSA 4,1
g
BSA 4,1
g


A absorbncia da placa ento lida em 595 nm.
Utilize o software Microsoft

Excel

para os clculos necessrios.


Abaixo, um modelo de curva padro construda utilizando este programa. importante
fazer uma curva padro a cada dosagem de protenas, para se evitar erros.



Figura 8: Exemplo de grfico para clculo das massa de protenas presente na amostra. Onde y =
absorbncia, coeficiente linear = 0,0133, coeficiente angular = 0,095, x = massa de protenas.


Absorbncia = (0,095 x massa de protenas) + 0,0133
R = 0,9916
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
A
b
s
o
r
b

n
c
i
a

5
9
5

n
m

Massa protenas (g / L)
Dosagem de protenas por Bradford
51

Rearranjando-se os termos da equao, temos:


Massa de protenas (g de protena . L
-1
de soluo) = (Absorbncia a 595 nm -
coeficiente linear) / coeficiente angular


O valor obtido deve ser multiplicado pelo fator de diluio, nesse caso, dez vezes.

4.5 Rehidratao das fitas com gradiente de pH
Uma vez conhecida a concentrao do extrato, deve-se calcular a quantidade de cada
amostra a ser incubada com as fitas de gradiente de pH. A massa desejada de protena de
600 g por fita. Pipete a quantia adequada em um tubo.
No mesmo tubo, pipete 2,5 L de IPG Buffer.
O volume final do tubo deve ser de 250 L. Completar o volume restante com Destreak.
No equipamento adequado, pipete os 250 L de nossa amostra, e coloque lentamente a
fita (pH de 4 a 7, 13 cm) em cima do lquido. A fita deve ser posta de maneira a ficar com sua
matriz em contato com o lquido, permitindo que a hidratao ocorra durante a noite.
Vede a canaleta com leo mineral.



Figura 9: Deposio das fitas nas canaletas para hidratao


4.6 Focalizao isoeltrica
No incio do dia, a fita reidratada deve ser colocada no equipamento para focalizao
isoeltrica, desta vez com a matriz para cima. Pequenos papis de filtro molhados so
colocados nos extremos da fita, de modo a permitir a passagem de corrente eltrica.
Em seguida, leo mineral adicionado em todas as canaletas do equipamento e os
eletrodos inseridos imediatamente acima do papel de filtro.
A focalizao isoeltrica um processo demorado, sendo assim, por motivos didticos,
nas etapas seguintes sero utilizadas fitas previamente focalizadas.


52

Figura 10: Focalizao isoeltrica: a) posicionamento do equipamento de focalizao; b)
colocao das fitas no equipamento com a matriz para cima; c) posicionamento das fitas em
canaletas individuais; d) colocao de papis de filtro midos no fim de cada fita; e) montagem
do eletrodo; f) ajuste dos parmetros e do programa de corrida. (Imagens retirados de 2-D
Eletrophoresis Handbook from GE Healthcare)

4.7 Preparo do gel de poliacrilamida (realizado anteriormente)
Preparou-se um gel contendo um gradiente de poliacrilamida, ou seja, o topo do gel
est a 7% e a base a 14%, com concentraes intermedirios no centro do gel.
Em um vaso comunicante, como ilustrado abaixo, adicionou-se a um lado a soluo A
(7%), e a outro lado a soluo B (14%). A soluo B mantida sob agitao e uma bomba
peristltica faz com o que o lquido flua lentamente at o aparato de montagem do gel.


Figura 11: Vaso comunicante utilizado para montagem de gel gradiente.


53
Tabela 4: Volumes dos reagentes utilizados na preparao do gel gradiente:

Soluo 7% (A)
Soluo 14 %
(B)
gua 11,17 6,5
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 3,9 3,9
Acrilamida 30% 4,67 9,34
SDS 10% 0,195 0,195
Persulfato de amnio
10%
0,065 0,065
Sacarose ------ 2,9 g
TEMED 15 L 15 L

4.8 Segunda dimenso
A fita, j focalizada, deve ser lavada delicadamente em gua destilada e incubada por
20 minutos em tampo de equilbrio, apresentando a seguinte composio:

Tabela 5: Componente do tampo de equilbrio.
Tampo de equilbrio
Reagentes Concentrao final
Tris-HCl 1,5 M pH
8,8 50 mM
Uria 6 M
Glicerol 30%
SDS 2%
Azul de bromofenol 0,002%

Em seguida, a fita colocada cuidadosamente no topo do gel de poliacrilamida.
Em um pequeno pedao de papel de filtro (cerca de 1x1 cm), goteje 12 L de padro de
peso molecular. Coloque esse papel ao lado da fita, no topo do gel.
Vede o gel com agarose 0,5%. Aps resfriamento da agarose, a eletroforese deve ser
realizada a 30 mA, por cerca de 2 horas.

4.9 Colorao do gel
Aps a eletroforese, o gel deve ser removido cuidadosamente do aparato e colocado
em uma cuba contendo Coomasie coloidal, para ser corado.
A soluo de Coomasie Brilliant Blue G250 foi previamente preparada e contm 0,3%
de Coomasie Blue G250, 45% de cido actico, 10% de metanol e 44,7% de gua.

NOTA: Lembre-se de manipular o gel SEMPRE pela parte de baixo, por conter uma densidade maior de
poliacrilamida, desta maneira menos provvel se quebrar o gel.

4.10 Discusso e anlise dos resultados
Diversos softwares podem ser utilizados para se realizar anlises quantitativas desses
gis. Um bom exemplo de software simples e gratuito utilizado para este fim o Image J


(http://rsb.info.nih.gov/ij). Outros softwares mais refinados existem, como, por exemplo, o Image
Master

2D Platinum, embora seja necessrio obter uma licena de uso.


A figura abaixo um tpico gel bidimensional aps colorao por Coomasie blue
coloidal. Nesse caso, comparou-se a expresso de protenas em Trypanosoma cruzi aps dois
tratamentos distintos, e utilizou-se o software Image Master

2D Platinum para se realizar a


anlise de spots que diferem de maneira estatisticamente significativa nos dois tratamentos.
(Reproduzido de Mattos et al, 2012)
Por questes prticas, esta etapa no ser realizada durante o curso.
54



Figura 12: Anlise de gel bidimensional aps dois tratamentos distintos. Spots circulados apresentaram
diferenas estatisticamente significativas entre os dois grupos, e a protenas presentes em cada spot foi
posteriormente identificada por espectrometria de massas. (Adaptado de Mattos et al, 2012)

55
5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

2-D Eletrophoresis Handbook from GE Healthcare
ALVES, M.J.M. and COLLI W. Trypanosoma cruzi: Adhesion to the Host Cell and
Intracellular Survival. IUBMB Life. 59(4 5): 274 279. 2007
ALVES, M.J.M.; ABUIN, G.; KUWAJIMA, V.J. and COLLI, W. Partial inhibition of
trypomastigote entry into cultured mammalian cells by monoclonal antibodies against a surface
glycoprotein of Trypanosoma cruzi. Mol. Biochem.Parasitol. 21, 7582. 1986
BRADFORD, M.M., Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72 (1976) 248
254.
CHAGAS, C.; Nova tripanozomiase humana. Estudos sobre a morfolojia e o ciclo
evolutivo do Schizotrypanum cruzi n gen n sp, ajente etiolojico de nova entidade mrbida do
homem; Mem Inst Oswaldo Cruz 1: 159-218 (1909)
LAEMMLI, U.K.; Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bactheriophage T4. Nature, 227: 680-685. 1970
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L. & COX, M. M. Princpios de bioqumica. Editora
Sarvier. 2008.
MATTOS, E.C., SCHUMACHER, R.I., COLLI, W., ALVES, M.J., Adhesion of
Trypanosoma cruzi Trypomastigotes to Fibronectin or Laminin Modifies Tubulin and
Paraflagellar Rod Protein Phosphorylation, Plos One (10.1371/journal.pone.0046767) 2012
MIKKELSEN, S.R.; CORTN, E. Bioanalytical chemistry. USA. 375p. 2004
O'FARRELL, P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol
Chem. 250(10):4007-21. 1975
RASSI JR A., RASSI A., MARIN-NETO J.A., Chagas disease, Lancet 375: 1388402
(2010)
SILVA, C.L.S.P. 2002. Eletroforese bidimensional: Princpios e aplicaes. Cin. Agr.
Sade. 2 (1): 74-78.
TONELLI, R.R., GIORDANO, R.J., BARBU, E.M., TORRECILHAS, A.C., KOBAYASHI,
G.S., LANGLEY, R.R., ARAP, W., PASQUALINI, R., COLLI, W., ALVES, M.J., Role of the
gp85/trans-sialidases in Trypanosoma cruzi tissue tropism: preferential binding of a conserved
peptide motif to the vasculature in vivo, Plos Negl Trop Dis 4(11), e864, 2010
WHO, Expert Committee on the Control of Chagas Disease (2000 : Brasilia, Brazil)
ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C.T. B.V.; LICHTIG, J. Determinao de protenas totais via
espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes. Qumica Nova. 21(6):
787-793.


56
Anlise Funcional e Estrutural de Sistemas Multiproticos Importantes para a
Patogenicidade de Xanthomonas axonopodis pv. citri.
Prof. Shaker Chuck Farah (responsvel); Profa. Cristiane Guzzo,
Diorge Paulo de Souza, Gabriel Oka e Raphael Dias Teixeira (monitores)

Cristalografia de Protenas


Protenas executam a maioria das funes especficas dentro de uma clula no nvel
molecular, incluindo o reconhecimento de substratos, catlise de reaes qumicas, transporte
de molculas atravs de membranas, controle de fluxo de informao gnica codificado por
cidos nuclicos e a montagem de complexos mutiproticos importantes para a construo e
manuteno de estruturas celulares.
A estrutura tridimensional de uma protena determinada por sua seqncia de
aminocidos. H milhes de seqncias de protenas em bancos de dados pblicos (ex:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) derivados de projetos de seqenciamento de genomas que
podem ser agrupadas em famlias de domnios que so relacionados por descendncia
evolucionaria (ex: http://pfam.wustl.edu/). Nesta descendncia, pequenas modificaes em
seqncia normalmente no afetam a estrutura tridimensional e logo a funo especfica
mantida. Portanto, diferenas maiores entre as seqncias dentro de uma famlia protica
podem refletir diferenas significativas em suas estruturas e conseqentemente em suas
funes. s vezes, a divergncia evolucionaria to grande que no existe mais semelhana
significativa em suas seqncias apesar de manuteno de estruturas e funes comuns.
Estimativas do numero de famlias de estruturas ou topologias proticas na biosfera variam de
entre 1000 e 4000.
A funo de uma protena est diretamente relacionada com sua estrutura. A nossa
capacidade de entender esta relao nos seus maiores detalhes o fator limitante da nossa
capacidade de entender processos biolgicos e a base molecular da vida. Esta relao a
chave para realizar o potencial de poder manipular o mundo orgnico em benefcio sade
humana, por exemplo o desenho racional de novas drogas e vacinas, o desenho de
intervenes moleculares para combater deficincias hereditrias e a produo de animais e
plantas transgnicas com propriedades que aumentam rendimento e valor nutricional sem
introduzir riscos aos delicados equilbrios ecolgicos.
Existem duas maneiras de obter informao detalhada (resoluo atmica) sobre
estruturas proticas: cristalografia e ressonncia magntica nuclear (RMN). As duas
tcnicas so complementares: Enquanto a cristalografia em geral permite uma maior resoluo
e determinao de estruturas maiores, RMN fornece, alm de informao estrutural, detalhes
sobre processos dinmicos relacionados ao intercmbio entre conformaes em soluo,
algumas das quais podem ser transitrias e resistentes cristalizao.
Nos prximos dois dias, ns vamos contemplar os vrios procedimentos envolvidos na
determinao da estrutura tridimensional de uma protena. Devido s limitaes de espao e
de tempo, os detalhes da maioria dos procedimentos sero omitidos. Aos que esto
interessados em tratamentos mais profundos sobre o assunto, recomendamos consultar o
Material Bibliogrfico.


Teoria

Cristais de Protenas. Em condies especficas, macromolculas podem formar
cristais. Cristalgrafos produzem cristais de protenas por um processo lento e controlado em
condies no desnaturantes. Por definio, cada cristal um arranjo peridico e
tridimensional das molculas, ons ou tomos que o compe. Contudo, pode-se imaginar um
cristal como sendo formado por unidades bsicas (paraleleppedos), denominadas de clulas
unitrias, que se repetem no espao por simples translaes ao longo de trs eixos. Esta
definio facilita o estudo cristalogrfico j que o contedo de uma clula unitria o mesmo
57
para qualquer outra clula unitria. Alm disto, a determinao da configurao de uma clula
unitria possibilita determinar a estrutura de todo o cristal. A clula unitria tem uma origem e
trs eixos a partir dos quais as posies de cada tomo podem ser definidas. A clula unitria
de um cristal pode ser descrita por 3 vetores (a, b, c) e 3 ngulos .



Se desconsiderarmos, por hora, o contedo de cada clula unitria, o cristal pode ser
visto como uma rede de pontos derivados dos vrtices das clulas unitrias.




Dentro de cada clula unitria, podem existir um ou mais conjuntos de molculas
equivalentes que so relacionados entre si por operaes de simetria (combinaes de
rotaes de 60, 90, 120, ou 180 e translaes de 1/6, 1/4, 1/3 ou 1/2 do eixo). Estas
operaes possibilitam subdividir cada clula unitria em regies menores e equivalentes
denominadas de unidades assimtricas. Assim, o contedo de uma unidade assimtrica
estar relacionado com o contedo de outra unidade assimtrica por uma determinada
operao de simetria. Note que a estrutura de um cristal pode ser determinada com base na
estrutura presente em uma nica unidade assimtrica e na simetria da clula unitria.
A simetria dentro de uma clula unitria descrita por seu grupo espacial,
representado por um smbolo, por exemplo P2
1
, P2
1
2
1
2
1
etc. Voc pode descrever as unidades
assimtricas da figura abaixo? Elas so relacionadas por quais operaes de simetria?



Fontes de Raios X. Raios X so um forma de radiao eletromagntica com
comprimento de onda ( ) entre 0,1 e 100 (0,01 e 10 nm). Eles podem ser produzidos de
vrias maneiras, duas das quais so relevantes para cristalografia: (i) Bombardeamento de um
metal (normalmente Cu ou Mb) com eltrons. Um eltron de alta energia colide com um eltron
58
de um orbital de baixa energia do metal resultando na sua ionizao. Um eltron de um orbital
de alta energia do metal ento cai para o orbital vazio, emitindo energia na forma de um fton
de raio X. ii) Emisso de radiao sncrotron. Eltrons so acelerados at quase a velocidade
de luz em anis com circunferncias de dezenas de metros at quilmetros denominados
sncrotrons. A desacelerao dos eltrons nas regies de curvatura do anel resulta na emisso
de radiao sncrotron. Essa radiao eletromagntica tem espectro amplo que inclui os raios
X. O nico sncrotron na Amrica Latina se encontra em Campinas, no Laboratrio Nacional de
Luz Sncrotron.
















Difrao de raios X por cristais: ndices de Miller e a Lei de Bragg. Quando um feixe de
raios X passam por um cristal, uma parte sofre difrao. Esta difrao pode ser interpretada
(simplificado) pela Lei do Bragg, que trata os raios de luz como se tivessem sido refletidos por
planos cristalinos imaginrios que cortam os eixos das clulas unitrias (a, b e c) por nmeros
inteiros h, k, e l respectivamente. Os nmeros h, k, l so chamados de ndices de Miller.
Famlias de planos paralelos podem ser descritas por combinaes de ndices hkl onde as
letras h, k e l so nmeros inteiros (vide figuras abaixo). De fato, para qualquer cristal existe um
nmero infinito de ndices, cada um que corta os trs eixos da clula unitria em um nmero
inteiro de fatias paralelas. Quanto maior o nmero do ndice, as fatias naquela dimenso ficam
mais finas. (Normalmente tratamos de ndices com mdulo menor do que 100.)



59




Imagine, portanto, um cristal sendo bombardeado por um feixe monocromtico de raios-
X. Nesta condio, possvel imaginar um conjunto de planos cristalinos imaginrios
orientados com um ngulo em relao aos feixes incidente e refletido, como mostra a figura
abaixo. A Lei de Bragg diz que quando a diferena de caminho dos raios que atingem dois ou
mais planos (2BC = 2d sin ) for igual a um mltiplo inteiro (n = 1, 2, 3, 4 ...) do comprimento de
onda da radiao incidente (n , teremos uma condio que resulta em interferncia construtiva
para a onda difratada (raio-X refledito).




Diferena de caminho entre raios R
1
e R
2
= 2BC = 2AB sin = 2d sin
Condio de Bragg: ocorre interferncia construtiva somente quando n = 2d sin

Cada conjunto de planos hkl tem uma distncia (d) entre os planos e um ngulo ( ) em
relao radiao incidente/refletida especficos. Logo, cada conjunto de planos produz uma
nica reflexo somente quando o cristal est orientado de uma maneira que satisfaa
condio de Bragg. Isto gera um padro de reflexes em trs dimenses cujas intensidades
podem ser medidas por detectores.

Obs.: Note que a Lei de Bragg apenas prev onde e sob quais condies uma reflexo (ponto
de difrao) ser vista. Contudo, uma teoria mais quantitativa necessria para descrever em
detalhes a intensidade de cada um dos pontos de difrao (reflexes).


60



Espao real vs espao recproco. Notar que as consideraes acima implicam que as
famlias de planos com distncias (d) pequenas so representadas por ndices (hkl) grandes e
possuem ngulos de reflexo ( ) tambm grandes. Logo, reflexes derivadas de planos com
ndices grandes se encontram na periferia do padro de difrao. Tambm, reflexes derivadas
de um determinado plano hkl em clulas unitrias grandes tero ngulos menores que clulas
unitrias pequenas.
Desta relao entre distncias dentro do cristal e dentro do padro de difrao
derivamos a relao entre espao real (do cristal com coordenadas x, y, z) e espao
recproco (do padro de difrao com coordenadas h, k, l). Pode ser demonstrado que cada
ponto no espao recproco (cada reflexo hkl) se localiza no final de um vetor com
comprimento 1/d
hkl
, que parte da origem e perpendicular famlia de planos com ndices hkl
(cujos planos so separados pela distncia d
hkl
). Tambm, para cada clula unitria com eixos
a, b e c, existe uma clula unitria recproca cujos eixos tem comprimentos proporcionais a
1/a, 1/b e 1/c. Logo quando um cristal (rede real) rodado no espao real, podemos associar a
rede recproca rodando no espao recproco e sendo medida no detector.
Equaes de ondas e funes peridicas. At agora, nossa considerao sobre o
padro de difrao ignorou o contedo da clula unitria (de fato, as posies das reflexes
so independentes do contedo da clula unitria e somente dependem das dimenses da
clula unitria e outras variveis geomtricas da coleta dos dados). Para entender como a
informao do padro de difrao pode ser utilizada para determinar as estruturas das
molculas dentro da clula unitria (mais precisamente da unidade assimtrica), precisamos
considerar a natureza das ondas eletromagnticas.

Ondas simples podem ser descritas por funes peridicas simples, por exemplo:

f(x) = F cos 2 (hx+ ) ou
f(x) = F cos 2 (hx) + i sin 2 ou
f(x) = F e
2 i(hx)


onde f(x) = amplitude da onda na posio x, F = amplitude mxima da onda, h = freqncia,
= fase ou posio da onda em relao origem. Inspecionar o diagrama 1 (a), (b), (c) e (d)
abaixo e determinar os valores de F, h e em cada caso.

61


1 2


Cristais so funes peridicas complexas em trs dimenses. Imagine-se andando numa linha
reta dentro de um cristal. A cada passo voc encontrar conjuntos de tomos diferentes em
posies diferentes em relao a voc. Contudo, depois de andar um pouco voc comear a
sentir um pouco de deja vu ... ... eu j vi aquela histidina e aquela serina antes! Daria para
perceber que um padro complexo est se repetindo. O que voc realmente iria perceber so
flutuaes nas densidades das nvens eletrnicas! Caminhando agora numa outra direo
constataria que um outro padro tambm est se repetindo. Isso ilustra que cada caminhada
numa direo diferente produz uma funo (padro) peridica complexa de flutuaes de
densidade eletrnica. Logo, um cristal pode ser visto como uma funo peridica
complexa em trs dimenses. O objetivo da cristalografia de obter uma funo peridica,
(x, y, z), cujo grfico representa o mapa de densidade eletrnica das molculas na clula
unitria.

Srie de Fourier. O matemtico francs Jean Baptiste Joseph Fourier demonstrou que qualquer
funo peridica, independente de sua complexidade, pode ser descrita como uma soma de
funes peridicas simples (ex: seno ou co-seno) cujos comprimentos de onda so fraes
inteiras do comprimento de onda da funo complexa original (vide parte 2 da figura acima
onde a onda original-alvo (quadrada) pode ser aproximada pela soma de ondas peridicas
simples f
o
- f
6
).

Em uma dimenso: f (x) = F
h
e
2 i (hx)


Em trs dimenses: f (x, y, z) = F
hkl
e
2 i (hx+ky+lz)


Transformao de Fourier. Fourier tambm demonstrou que para qualquer funo f(x)
possvel estabelecer uma outra funo F(h), tal que:
F(h) =

f(x) e
2 i(hx)
dx
62

A funo F(h) conhecida como a Transformada de Fourier (FT) da funo f(x).
Uma das propriedades principais desta funo est relacionada reciprocidade. Se, por
exemplo, f(x) uma funo de tempo, F(h) uma funo de freqncia e se f(x) for uma funo
de distncia (d), F(h) ser uma funo de distncia recproca (1/d).

Desta maneira a FT uma ferramenta extremamente til para descrever a relao entre o
espao real e espao recproco e logo entre um objeto e seu padro de difrao.

Outra propriedade importante da Transformada de Fourier que ela reversvel; ou seja:
Se F(h) =

f(x) e
2 i(hx)
dx, ento f(x) =

F(h) e
-2 i(hx)
dh

Em outras palavras: se F(h) a FT de f(x), ento f(x) a FT inversa (FT
-1
) de F(h).

Em trs dimenses:
F(h,k,l) =

f(x,y,z) e
2 i(hx+ky+lz)
dxdydy e f(x,y,z) =

F(h,k,l) e
-2 i(hx+ky+lz)
dhdkdl
Fatores de Estrutura. Cada reflexo hkl no padro de difrao pode ser considerada
uma onda complexa que foi formada com contribuies de:

(a) todos os tomos:


F
hkl
= f
j
e
2 i(hxj+kyj+lzj)
onde o f
j
o fator de espalhamento do tomo j e
2 ( hx
j
+ky
j
+lx
j
) a contribuio do tomo j para a fase da
reflexo hkl.

ou

(b) todos os elementos de volume da clula unitria:
F
hkl
=

(x,y,z) e
2 i(hx+ky+lz)
dxdydz

Esta onda complexa pode ser descrita como uma srie de Fourier cuja soma chamada
fator de estrutura F
hkl
. A magnitude de F
hkl
proporcional raiz quadrada da intensidade da
reflexo hkl (I
hkl
)
1/2
.

63
A equao anterior mostra que F
hkl
a Transformada de Fourier de (x,y,z). Logo, (x,y,z)
a Transformada de Fourier inversa de F
hkl
.:

(x,y,z) = (1/V)
h

l
F
hkl
e
-2 i(hx+ky+lz)
onde V o volume da clula unitria e
F
hkl
uma srie de Fourier cujo resultado
final pode ser representado por um nmero
complexo de amplitude (|F
hkl
|) e fase (
hkl
).


Pode ser demonstrado que (x,y,z) = (1/V)
h

l
|F
hkl
| e
-2 i(hx+ky+lz + hkl)





Esta equao mostra como podemos obter a densidade eletrnica em qualquer posio
(x,y,z) de uma clula unitria de um cristal a partir do padro de difrao:
As intensidades das reflexes fornecem |F
hkl
|, e os ndices fornecem h, k, l.
Mas, como podemos medir as fases de cada uma das milhares de reflexes?
O problema das fases. O problema que durante o experimento de coletar as imagens
do padro de difrao, as informaes das fases so perdidas. A resoluo deste problema
das fases um dos passos mais difceis na determinao de uma estrutura cristalina.
Existem 3 maneiras principais que podem ser utilizadas para estimar as fases das
reflexes. Aquela que voc utiliza depende de alguns fatores:

i) Substituio molecular. Se dispomos de um modelo estrutural que suficientemente
similar estrutura da protena experimental (cristalizada), pode-se utilizar este modelo para
calcular (x,y,z) que, por sua vez pode ser utilizada para (atravs de sua FT) calcular a padro
de difrao do modelo (amplitudes dos fatores de estrutura |F
hkl
|
calc
, incluindo suas fases
calc
).
Estas fases calculadas podem ser ento utilizadas, em combinao com as intensidades
observadas experimentalmente (|F
hkl
|
obs
), para calcular (x,y,z) na clula unitria da protena
que foi cristalizada:

(x,y,z) = (1/V)
h

l
|F
hkl
|
obs
e
-2 i(hx+ky+lz + calc)


A qualidade das fases calculadas depende da semelhana estrutural entre o modelo e a
estrutura sendo estudada. Tambm existe a questo da orientao e posio das molculas
proticas dentro da clula unitria. Na verdade, a orientao e posio das molculas
proticas do modelo dentro da clula unitria fundamental para os clculos dos mapas de
densidade eletrnica. A orientao do modelo definida por trs ngulos de rotao e sua
posio final ser definida pelas translaes ao longo dos trs eixos da clula unitria. Existem
milhes de milhes de possveis combinaes (pelo menos 100
6
= 10
12
) destes seis variveis,
o que impossibilita testar todas as possibilidades. O que feito : primeiro, determinar a
orientao (somente trs variveis <ngulos eulerianos >) e depois a posio (mais
trs variveis <translaes ao longo dos trs eixos da clula unitria>). Consulte o material
bibliogrfico para informaes mais detalhadas sobre como procurar separadamente as
funes de rotao e translao.
64

Brevemente:
Orientao: Existe uma funo chamada Funo de Patterson que uma srie de
Fourier sem fases e com termos com amplitudes que so quadrados de fatores de estrutura:

P(u,v,w) = (1/V)
h

l
|F
2
hkl
|
obs
e
-2 i(hu+kv+lw)


Devido ausncia das fases, uma Funo de Patterson pode ser calculada para
qualquer conjunto de dados de difrao. O ponto importante que pode ser demonstrado que
o grfico P(u,v,w) da Funo de Patterson (chamado de mapa de Patterson) tem picos
correspondendo aos vetores entre todos os pares de tomos na clula unitria. Pensando
um pouco sobre isso, temos que para uma clula unitria com N tomos, existem N(N-1) ou
quase N
2
vetores quando N for grande. Logo um mapa de Patterson muito mais complexo do
que um mapa de densidade eletrnica. Por exemplo, para uma clula unitria contendo 3
tomos (a), existem seis vetores (b) que produzem o mapa de Patterson mostrado em (c).
Pode tambm ser percebido que o mapa de Patterson independente da posio da
molcula dentro da clula unitria mas sofreria rotaes se a molcula rodada.


Estas consideraes apontam a uma maneira em que podemos encontrar a melhor
orientao do nosso modelo: calcular mapas de Patterson para vrias orientaes do nosso
modelo (definidas pelos ngulos eulerianos) e compar-los com o mapa de Patterson calculado
dos dados experimentais. A melhor sobreposio entre os mapas possibilitar determinar a
correta orientao do modelo dentro da clula unitria

Posio: Utilizaremos o modelo na sua melhor orientao para agora posicion-lo
dentro da clula unitria. Em cada posio do modelo podemos calcular as amplitudes dos
fatores de estrutura e compar-las com as amplitudes atualmente observados no experimento
de difrao. Escolhe-se, dentre todas as opes, aquela em que a soma de todas as diferenas
entre |F
obs
| e |F
calc
| minimizada:

||F
hkl
|
obs
- |F
hkl
|
calc
|
|F
hkl
|
obs


Vrios fatores podem contribuir para o sucesso desta estratgia de calcular as fases; os
mais importantes sendo: a) o nvel de identidade da seqncia primria - normalmente precisa
de identidades >30%, b) a ausncia de inseres ou delees em uma estrutura em relao a
outra e c) o nmero de molculas na unidade assimtrica.

65
ii e iii) Mtodos dependentes de tomos pesados. Se no existe um modelo de boa
qualidade da nossa estrutura para estimar as fases por substituio molecular, precisamos
recorrer a outros mtodos para o clculo das fases dos fatores de estrutura. Estes mtodos
envolvem a adio de sais de metais pesados ao cristal (ie Pb
2+
, Hg
2+
, Au
+
, I
-
) ou a
incorporao de selenometionina na protena durante sua produo heterloga. Alm disso,
algumas protenas naturalmente ligam ons metlicos como cofatores (ex.: Fe
2+
, Zn
2+
, Mn
2+
). A
adio de tomos mais pesados do que C, N, O ao cristal modificar a padro de difrao em
relao ao padro nativo. Uma vez que a contribuio deste novo tomo para cada uma das
reflexes do padro de difrao no se d de forma igual (depende da posio deste tomo
dentro da clula unitria), espera-se que algumas reflexes sejam mais afetadas do que outras
no novo padro de difrao. Logo, esperado que a adio de um metal pesado ir perturbar
algumas reflexes mais do que outras. justamente esta diferena nas intensidades das
reflexes o que possibilita determinar as fases dos fatores de estrutura.

Substituio isomorfa: Comparando os padres de difrao de um cristal nativo (obtido
sem metal pesado) e de cristais derivados (com o metal pesado), as pequenas diferenas
nas intensidades de reflexes especficas podem ser utilizadas para determinar as posies
dos tomos pesados (mas no dos tomos da protena). Isso feito, os fatores de estrutura
(amplitudes e fases), de todas as reflexes obtidos do cristal com metal pesado (|F
PH
| e
PH
)
podem ser separados em contribuies dos tomos pesados (|F
H
| e
H
) e da parte protica (|F
P
|
e
P
). As variveis |F
H
| e
H
podem ser obtidas pelas posies conhecidos dos tomos
pesados, o |F
P
| obtido do padro de difrao do cristal nativo (sem tomos pesados) e a
desejada
P
pode ento ser estimada por procedimentos descritos no Material Bibliogrfico. O
sucesso desta estratgia depende da obteno de cristais que incorporam o metal pesado sem
perturbar a estrutura da protena e as dimenses da clula unitria. Em outras palavras,
necessita de cristais derivados isomorfos. Por isso, esta metodologia chamada
Substituio Isomorfa.

Disperso ou espalhamento anmalo. tomos podem absorver raios X e emiti-los
novamente. Este fenmeno acontece somente em comprimentos de ondas especficos. Neste
processo de absoro e emisso, ocorre uma mudana de intensidade e de fase do raios X
difratados. Este processo chamado disperso ou espalhamento anmalo. Logo, se
conjuntos de dados do mesmo cristal so coletados em dois comprimentos de onda, um dos
quais correspondente ao comprimento de absoro de raios X pelo metal pesado, as
mudanas nos padres de difrao podem ser utilizadas para obter informaes sobre as fases
(ver Material Bibliogrfico). Alm disso, na ausncia de disperso anmala as intensidades e as
fases das reflexes hkl e -h-k-l so iguais. Na presena de disperso anmala esta identidade
desaparea (por razes que tambm so explicados no Material Bibliogrfico). As diferenas
entre as reflexes |F
hkl
| e |F
-h-k-l
| so muito pequenas (normalmente somente alguns % da
intensidade) mas podem ser medidas porque so obtidas com alta preciso do mesmo
conjunto de dados do mesmo cristal. Estas diferenas tambm podem ser utilizadas para obter
estimativas iniciais sobre as fases.

Obteno do mapa de densidade eletrnica e refinamento do modelo molecular.
Independentemente do mtodo que voc utilizou para obter a primeira estimativa das fases,
seu primeiro mapa de densidade eletrnica ser calculado simplesmente a partir da seguinte
equao:

(x,y,z) = (1/V) |F
hkl
|
obs
e
-2 i(hx+ky+lz + calc)


(Obs.: Alguns fatores que expressam pesos de qualidade podem ser adicionados formula
sem alterar o real sentido da mesma.)

66
A inspeo deste mapa deve ento apontar regies que so obviamente derivadas de
protenas em que a cadeia principal (e se tiver sorte algumas cadeias laterais) pode ser
reconhecida. Nestas regies, podemos criar modelos tridimensionais utilizando nossos
conhecimento da seqncia primria da protena especfica e nossos conhecimentos bsicos
de qumica de protenas em geral (ngulos e distncias de ligaes qumicas, modelos
eletrnicos de tomos especficos, principalmente C, N, O e S). Estes modelos podem ser
utilizados para calcular as intensidades e fases das reflexes num processo iterativo em que
procuramos fases calculadas melhores que diminuem as diferenas entre |F
hkl
|
obs
e

|F
hkl
|
calc
.
Cada iterao envolve passos de: a) inspeo e manipulao do modelo para que ela
encaixe melhor no mapa de densidade eletrnica, b) a construo de novas regies da
molcula em regies de densidade eletrnica que eram ausentes no ciclo anterior, c) pequenos
ajustes no modelo que procuram ao mesmo tempo aproximar valores geomtricos das ligaes
qumicas s valores ideais e minimizar a diferena entre |F
hkl
|
obs
e

|F
hkl
|
calc
, d) clculo de novas
fases derivadas do novo modelo e e) clculo de um novo mapa de densidade eletrnica
usando as novas fases.

Notas importantes:

Veja que mapas do tipo

(x,y,z) = (1/V)
h

l
||F
hkl
|
obs
- |F
hkl
|
calc
| e
-2 i(hx+ky+lz + calc)


chamados mapas de diferena ou mapas Fo-Fc enfatizam erros no modelo, com regies
positivas onde est faltando densidade eletrnica (destacando a falta de um tomo ou tomos
no modelo atual) e regies negativas evidenciam um excesso de eltrons no seu modelo
naquela regio. Estes mapas so teis na correo de pequenos erros na estrutura no final do
processo de refinamento.

De maneira similar, mapas do tipo

(x,y,z) = (1/V)
h

l
|2|F
hkl
|
obs
- |F
hkl
|
calc
| e
-2 i(hx+ky+lz + calc)


chamados mapas 2Fo-Fc so utilizados para visualizar a qualidade do encaixe do modelo com
os dados. Estes mapas devem ser sempre positivos e, escolhendo contornos acima de uma
densidade eletrnica especfica, devem revelar uma superfcie molecular.
Note que ao final do refinamento, quando no mais haver diferena entre os dados
experimentais e os dados do modelo, o primeiro mapa tender a zero enquanto o segundo
mapa tender a ser calculado apenas com as amplitudes experimentais
Em cada ciclo de refinamento do modelo, monitoramos quanto o modelo est
consistente com os dados experimentais, calculando o fator residual (R)

R = ||F
hkl
|
obs
- |F
hkl
|
calc
|
|F
hkl
|
obs


A grande maioria das estruturas nos bancos de dados tem valores de R < 0.3 e muitos
tm valores < 0.2.
67


Prtica: Etapas na determinao de estrutura de uma protena por cristalografia:

Cristalizao de lisozima.

1) Preparar uma soluo de lisozima em uma concentrao de 75 mg/mL em tampo 100
mM de acetato de sdio pH 4,8.
2) Adicionar em diferentes poos da placa de sitting drop 5 L, 6 L e 7 L de protena.
Fazer cada adio em duplicata (veja o esquema abaixo).
3) Adicionar no reservatrio 1 mL de soluo A (100 mM de acetato de sdio pH 4,8; 6,5 %
(p/v) NaCl).
4) Nos poos onde foi adicionada a protena, completar com a soluo A para um volume
final de 10 L, conforme o esquema abaixo.
5) Selar a placa com um filme plstico.
6) Observar diariamente, utilizando uma lupa, se ocorreu o aparecimento de cristais.
7) Caso ocorra o aparecimento de potenciais cristais, aplicar 0,3 L do corante IZIT Depois
de 1 hora usar a lupa para observar a incorporao ou no-incorporao do corante no
cristal.


5 L de protena 6 L de protena 7 L de protena
+ + +
5 L de soluo A 4 L de soluo A 3 L de soluo A










Coletando dados de difrao de raios X. Nesta etapa a meta de determinar os ndices
e as intensidades da maior nmero possvel de reflexes. Hoje reflexes so detectadas por
placas de imagens (IP) ou dispositivos do tipo CCD (charge-couple device) que so
semicondutores sensveis radiao que convertem a coliso de um fton na sua superfcie
em uma carga eltrica. Os dados utilizados nestes exerccios j foram coletados por ns no
sncrotron no LNLS para gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase de E. coli. O conjunto de dados
consiste de 180 arquivos do tipo <nomemuitocomprido_###.img>. O nmero ### no final do
nome do arquivo reflete o ngulo da rotao do cristal utilizado na coleta daquela imagem.
Vamos utilizar o programa HKL2000 para analisar as imagens e para ter uma idia de como a
padro de difrao muda em funo do ngulo de rotao do cristal.

1 mL de Soluo A
68
Indexao. Ainda dentro do programa HKL2000, vamos escolher uma imagem para
indexar ou seja, determinar os parmetros geomtricos que qualificam os cristais, a coleta dos
dados e o padro de difrao. Neste processo as dimenses e a rede cristalina da clula
unitria so determinadas. Qual a rede cristalina do cristal? (Detalhes: comprimento de onda
de raio X usado = 1.428 ; beam position (x, y) = (80.825, 80.331)). Alm disto, possvel
determinar neste processo quais so os ndices de Miller que caracterizam cada uma das
reflexes.

Integrao. O prximo passo de medir a intensidade de todas as reflexes de todas
as 180 imagens combinando as reflexes parciais presentes em imagens sucessivas. Para isso
utilizamos tambm o programa HKL2000. Isso pode demorar um certo tempo, mas vale a pena
acompanhar quanto o padro de difrao predito pela rede cristalina bate com o padro de
difrao observado.

Normalizao (Scaling). Finalmente, temos que normalizar as intensidades medidas
das reflexes para que todas estejam na mesma escala. Isto se torna necessrio pois durante
a coleta a dose total da radiao por cada imagem pode variar. Para isso temos que dividir o
conjunto de dados em 10 - 15 camadas de resoluo que contenham o mesmo nmero de
reflexes. Assim vamos determinar o fator de correo para cada camada que deve ser
aplicado para que as intensidades estejam na mesma escala. A variao do tamanho/forma do
cristal e a queda no fluxo de ftons num sncrotron fazem com que a correo de escala
tambm tenha que ser feita para as diferentes imagens. Faremos ento a soma das reflexes
parciais em diferentes imagens, e a mdia das reflexes equivalentes por simetria, Friedel (hkl
e -h-k-l) e idnticas. A sada deste programa vai gerar 3 arquivos: <algo>.sca, <algo>.log e
<algo>.out onde <algo> = nome do grupo espacial escolhido.
Abra o arquivo <algo>.sca e tente adivinhar o significado do seu contedo.
Inspeo do arquivo <algo>.log fornece informaes estatsticas sobre a qualidade do
conjunto de dados. Use este arquivo para preencher a seguinte tabela:

Resoluo (min-max):
Nmero total de reflexes:
R
total
:
R
ltima camada
:
Redundncia
total
:
Redundncia
ultima camada
:
(I/sigma)
total
:
(I/sigma)
ltima camada
:
Completeza
total
:
Completeza
ltima camada
:

No final do arquivo <algo>.log existe uma lista das ausncias sistemticas; ou seja,
reflexes que devem apresentar um valor de intensidade com base no grupo espacial para
aquele cristal. Procure o grupo espacial do seu conjunto de dados no International Tables for
Crystallography e analise suas caractersticas.

Converso do arquivo .sca para um formato .mtz, converso de intensidades em fatores
de estrutura e separao de 5% das reflexes num grupo teste. No conjunto de programas
ccp4i (Collaborative Computational Project Number 4 in Protein Crystallography)
(http://www.ccp4.ac.uk/ccp4i_main.php) usar import merged data (programas scalepack2mtz,
truncate, cad, etc.) para converter o arquivo <algo>.sca em <algo>.mtz. Neste processo
tambm vamos converter as intensidades das reflexes em fatores de estrutura (amplitudes).
Finalmente, vamos tambm separar (etiquetar = flag) 5% das relexes para uso no
futuro como um grupo teste. Analisar o contedo deste novo arquivo .mtz.
Ele agora deve ter as seguintes colunas:
H, K, L, F, SIGF, I, SIGI, FreeR_flag
O que o contedo de cada uma destas colunas?

69
Resoluo das fases por Substituio Molecular.
a) Escolher um modelo. Procurar no site do Protein Data Bank ou no NCBI todas as
gliceraldeido-3-fostato desidrogenases (GAPDHs) cujas estruturas j foram determinadas.
GAPDHs de quais organismos j foram cristalizadas? Vamos escolher uma destas (que no
GAPDH de E. coli) para usar como nosso modelo para substituio molecular. Para isso,
vamos utilizar o programa ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) para alinhar alguns destas
seqncias com a seqncia da GAPDH de E. coli. As seqncias podem ser obtidos do site
de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Vamos escolher como nosso modelo aquela estrutura
que apresenta o melhor alinhamento com GAPDH de E. coli. Repeta o alinhamento agora
somente com as duas protenas (de E. coli e do modelo).
Agora, baixe o arquivo .pdb de GAPDH modelo escolhido do site do Protein Data Bank
(http://www.rcsb.org/pdb/). Visualise o modelo utilizando uma interface grfica como Pymol,
SwissPDBViewer, WebLabViewer, WinCoot ou Rasmol ou aquele disponvel no CCP4. Depois
abra o arquivo .pdb usando um editor de texto simples e inspecione o seu contedo. Descreva
o que voc encontra dentro este arquivo no seu comeo, no seu meio e no seu fim. Quantas
molculas de GAPDH esto descritas neste arquivo? Se tiver mais de uma molcula, fique
somente com uma e remova as outras. Tambm delete tomos de outras molculas como
cofatores e guas e quaisquer comentrios no final do arquivo. Salvar este arquivo como
modelo.pdb.
Finalmente, a partir do alinhamento, devemos modificar o arquivo modelo.pdb para que
todos os resduos do nosso modelo diferentes dos da GAPDH de E. coli sejam convertidos em
alaninas e que inseres ou extenses em nosso modelo, no presentes na GAPDH de E. coli,
sejam deletadas. Se a homologia entre o modelo e GAPDH de E. coli so bem diferentes,
devemos converter TODOS os resduos para alaninas. A modificao do arquivo pdb pode ser
feita manualmente ou usando pdbset dentro do pacote ccp4i.

b) Determinar as funes de rotao e translao. Para isso vamos utilizar o mdulo Phaser
(http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/phaser/) dentro do pacote ccp4i.
Os arquivos de entrada para este programa so:
a) nosso arquivo .mtz que lista todas as amplitudes dos fatores de estrutura
b) o arquivo modelo.pdb que descreve nosso modelo.
Os arquivos de sada sero:
a) Um arquivo .sol que lista a(s) soluo(s) de rotao e translao obtida(s),
b) Um arquivo .pdb que descreve o novo modelo agora em sua nova posio, obtida por meio
da aplicao das funes de rotao e translao no modelo original. Compare o modelo
original com o novo modelo usando a interface grfica.
c) Um novo arquivo .mtz que tem agora mais algumas colunas, incluindo: FWT, PHWT
(amplitudes e fases para um mapa 2Fo-Fc) e DELFWT e PHDELWT (amplitudes e fases para
um mapa Fo-Fc) alm de FC e PHIC (amplitudes e fases calculadas somente a partir do
modelo).
d) O programa tambm produz um arquivo .log que descreve todos os passos efetuados na
procura das funes de rotao e translao. Analise este arquivo e discuta seu contedo.

Refinamento do modelo. As fases e amplitudes no arquivo .mtz de saida de Phaser
permite que construimos um mapa de densidade eletronica 2Fo-Fc. Neste mapa podemos
superimpor o novo modelo descrito no arquivo .pdb. Podemos simultaneamente superimpor o
mapa de Fo-Fc para enfatizar regies que tm densidade eletrnica demais ou de menos. Para
isso utilizaremos o programa Coot (http://www.chem.gla.ac.uk/~bernhard/coot/wincoot.html)
[Poderamos tambm empregar o programa O (http://alpha2.bmc.uu.se/alwyn/)].
Alem de permitir visualizao de mapas, o Coot permite que modifiquemos
manualmente a conformao do nosso modelo para melhor encaix-lo na densidade eletrnica.
Assim, podemos inspecionar resduo por resduo dentro de nossa estrutura ajustando a
conformao local da cadeia principal e das cadeias laterais. Ao final deste processo
(trabalhoso) de ajuste salvamos a nova conformao do modelo em um novo arquivo .pdb.
Se os dados coletados apresentam resoluo melhor do que 2.3 , seremos capazes
evidenciar a densidade eletrnica derivada de molculas de gua na primeira camada de
solvatao da protena. Estas molculas esto normalmente fazendo pontes de hidrognio com
70
grupos da protena e/ou outras molculas de gua. Estas molculas podem ser adicionadas ao
modelo e aparecero no novo arquivo .pdb.
O prximo passo consiste em ajustar parmetros geomtricos (ngulos e comprimentos
de ligaes qumicas e contatos van der Waals) no modelo para que no fogem dos princpios
qumicos conhecidos para protenas derivadas de estruturas de alta resoluo de molculas
orgnicas pequenas. Brevemente, queremos efetuar ciclos de mudanas nos parmetros de
posio (x, y, z) e fatores de temperatura de todos os tomos do modelo para melhor aproximar
os fatores de estrutura calculados (a partir do modelo) aos fatores de estrutura observados. Em
adio, parmetros esteroqumicos do modelo como comprimentos de ligaes, ngulos de
ligaes e de torso e contatos de van der Waals so permitidos variar somente em torno de
valores padres determinados com base em nosso conhecimento de estruturas qumicas. Para
incorporar todos estes parmetros, uma equao do seguinte tipo deve ser minimizada:
=

w
hkl
(|F
hkl
|
obs
- |F
hkl
|
calc
)
2

+
bonds
w
i
(d
ideal
-d
model
)
2

+
angulos
w
j
(
ideal
-
model
)
2

+
planos

atomos
w
a,b
(m
b
.
r
ab
d
b
)
2

+
noncov
w
c
(d
ideal
- d
model
)
4

+
Hbond
w
d
(d
ideal
- d
model
)
2

+
torsion
w
t
(
ideal
-
model
)
2


onde a primeira linha define quanto o modelo aproxima dos dados experimentais e em que
|F
hkl
|
calc
uma funo de x, y, z, B e ocupncia definida para cada tomo no arquivo .pdb. As
outras linhas descrevem as penalidades dos desvios de orientaes ideais. Existem vrios
programas para efetuar esta minimizao. Ns utilizaremos o programa Refmac5 dentro do
ccp4i.
Os arquivos de entrada para o programa Refmac so os arquivos .mtz e .pdb do
modelo. Os arquivos de saida so dois novos arquivos: um .mtz (com as fases novas) e um
.pdb (com as novas coordenadas da estrutura). Tambm produzido um .log que apresenta,
alm de muitas outras coisas, alguns parmetros globais que so calculados depois de cada
ciclo e que refletem quanto o modelo consistente com os dados experimentais. Deve-se
prestar ateno especial aos parmetros Rfact e Rfree. Ambos so calculados como o R
descrito anteriormente, mas o Rfree calculado utilizando somente as reflexes do conjunto
teste (5%) que no foram empregadas antes no refinamento.

Validao da Estrutura. Depois de vrios ciclos/iteraes de ajuste manual (refinamento
no espao real) e minimizao do (refinamento no espao recproco) os valores de Rfact e
Rfree param de diminuir. Neste momento entramos na fase final de determinao da estrutura
em que os ltimos desvios de geometria ideal so inspecionados com cuidado. Para isso,
prestamos mais ateno nos seguintes fatores:
a) ngulos de torso da cadeia principal ( ) fora das regies permitidas no diagrama de
Ramachandran.
b) desvios de planaridade das ligaes peptdicas ( ).
c) ligaes peptdicas na conformao cis.
d) ngulos e ligaes com valores muito maior ou muito menor de valores padres para
aquelas ligaes.
e) conformaes raras das cadeias laterais.
f) conformaes mltiplas de cadeias laterais.
g) contatos prximos demais de van der Waals (close contacts).
71
h) a presena de molculas de gua sem contato direto ou indireto com a protena.
i) ocupncias de tomos menores do 1.0.

O programa Procheck dentro do pacote ccp4i analisa alguns destes aspectos do seu
modelo e produz uma lista de possveis problemas que devem ser checados um a um e
corrigidos (se for possvel). O Protein Data Bank tambm providencia um servio online
(http://deposit.pdb.org/validate/) que pode efetuar a mesma anlise.


Material Bibliogrfico

Blundell, T.L. and Johnson, L.N. (1976) Protein Crystallography (Academic Press).
Drenth, J. (1999) Principles of Protein X-Ray Crystallography (Springer).
Hahn T. (1988) International Tables for Crystallography. Volume A: Space Group
Symmetry (Riedel Publishing Company).
Rhodes, G. (1993) Crystallography Made Crystal Clear. A Guide for Users of
Macromolecular Models (Academic Press).
Rossman, M.G. and Eddy, A. editors (2001) International Tables for Crystallography.
Volume F: Crystallography of Biological Molecules (Kluwer Academic Publishers).


72
Laboratrio de Sinalizao em Sistemas Biomoleculares
Prof. Dr. Fbio Luis Forti (responsvel),
Juliana Harumi Osaki e Thompson Eusbio Pavan Torres (monitores)

Sinalizao Celular em Resposta a Danos no DNA Promovidos por Radiao UV


INTRODUO

Clulas de mamferos apresentam respostas biolgicas mltiplas ao stress genotxico,
como pontos de checagem do ciclo celular (checkpoints), reparo de DNA e apoptose (Hamdi
et al, 2005). Qualquer perturbao destas respostas pode resultar em instabilidade genmica e
transformao celular, bem como modificao da sensibilidade teraputica (Lobrich & Jeggo,
2007).
Os diferentes componentes da luz ultravioleta (UV), UVA (320-400nm), UVB (280-
320nm) e UVC (200-280nm, Figure 1), tm diferentes propriedades mutagnicas. A principal
caracterstica da mutagnese promovida por UVB e UVC a alta frequncia de mutaes de
transio (dmeros de pirimidina). Em cncer de pele humano, cerca de 35% de todas as
mutaes no gene p53 so deste tipo, que esto localizadas em diversos hot spots
mutacionais, como 5-TCG e 5-CCG. Ciclobutano pirimidina (CPDs) formam-se
preferencialmente em dmeros de pirimidinas destes locais (5-CG) contendo 5-metil-citosinas
quando as clulas so irradiadas com UVB ou luz solar (Callegari & Kelly, 2007).
Foto-leses no DNA induzidas por UV podem ser removidas pelo sistema de reparo de
remoo de nucleotdeos (NER). Deficincias em NER levam a um aumento exagerado de
danos no DNA, morte celular e mutagnese. NER pode ser dividido em duas subvias distintas:
reparo global do genoma (GGR), que repara os danos do DNA por todo o genoma, e o reparo
acoplada a transcrio (TCR), que repara leses do DNA na fita transcrita de genes ativos.
Defeitos genticos em genes de protenas responsveis pelo NER causam doenas humanas
como Xeroderma pigmentosum (XP) e Sndrome de Cockayne (CS), que apresentam
hipersensibilidade a luz UV, sofrem degenerao progressiva da pele e apresentam um
aumento de 1000x no risco de cncer de pele (Hamdi M et al, 2005; Gorbunova V et al, 2007).
As clulas respondem a luz UV e outros agentes genotxicos pela ativao de vrias
vias sinalizadoras, alm de protenas controladoras do ciclo celular como p53 e p21
Waf1
,
incluindo NF- B, ATR e MAPK (Ver Figura 1 para UVC). Dependendo do tipo celular e do
stress, a ao combinada destas vias de sinalizao pode disparar bloqueio prolongado ou
transiente do ciclo celular ou apoptose (Brancho et al, 2003; Todd et al, 2004). Um dos
membros da famlia de MAPK, a quinase JNK/SAPK, capaz de controlar a apoptose positiva
e negativamente, dependendo do tipo celular, contexto celular e o estmulo do stress.
Substratos pr-apoptticos de JNK compreendem c-Jun e Bcl-2, (Lei et al, 2002; Weston &
Davis, 2002; Lei & Davis, 2003), enquanto que alvos anti-apoptticos de JNK incluem JunD e o
gene cIAP-2 (Lamb et al, 2003). Alm destes, JNK pode ativar e/ou induzir a expresso de
componentes envolvidos em proliferao celular e sobrevivncia, como ATF-2, ATF-3 e c-Fos
(Hai et al, 1999; Shaulian & Karin, 2001; van Dam & Castellazzi, 2001). A atividade de JNK nas
clulas precisamente regulada pela sua fosforilao por quinases de especificidades duais
(MKK4 ou MKK7) e pela sua desfosforilao por fosfatases de serina/treonina, tirosina e
treonina/tirosina, com MKP-1 e VHR (Morrison & Davis, 2003; Wada et al, 2004; Camps et al,
2000; Farooq & Zhou, 2004, Todd et al, 2002; Hamdi Et al, 2005).

73


Figure 1: (Bode & Dong, 2003)

METODOLOGIA
CULTURA CELULAR E IRRADIAO COM LUZ ULTRAVIOLETA

Linhagens celulares de carcinoma de crvix humano parentais, HeLa foram mantidas
em frascos de cultura de poliestireno contendo meio de cultura DMEM (Dulbbecos Modified
Eagles Medium), suplementado com 1,2g/l de Na
2
HCO
3
, 25mg/l de ampicilina e 100mg/l de
sulfato de estreptomicina, adicionado de 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS). As clulas foram
incubadas em estufa com atmosfera de 5% de CO
2
e temperatura de 37C e ento plaqueadas
em lamnulas de 13 mm de dimetro mantidas dentro de placas de 35 mm de dimetro
contendo meio DMEM/10% FBS para posterior fixao e Imunofluorescncia, e para o ensaio
cometa 2,0x10
5
clulas sero plaqueadas em placas de 35 mm contendo meio DMEM/10%
FBS.
O Tratamento das clulas ser realizado da seguinte maneira: as placas contendo as
clulas tiveram seu meio de cultura retirado, foram lavadas 2x com PBS e mantidas em PBS.
Ento foram colocados em local apropriado dentro do fluxo e irradiados com ultravioleta tipo C
(UVC) nas doses 6 J/m
2
(15min) e 12J/m
2
(30min) sem as tampas das placas, alm disso
faremos placas tratadas com H
2
O
2
(50mM e 100mM), como controle positivo, aps os
tratamentos as placas e lamnulas sero processadas para o ensaio cometa e a
imunofluorescncia.

ENSAIO COMETA ALCALINO PARA ANLISE DE DANO NO DNA

1. Lavar as clulas irradiadas por 2X com PBS;
2. Soltar as clulas com 200 L de tripsina e diluir com 200 L de PBS;
3. Transferir para microtbulos 30 L da suspenso de clulas e adicionar 100 l de 0,5%
de LMPA (agarose de baixo ponto de fuso);
4. Pipetar a soluo nas lminas previamente cobertas com agarose (1,5% em PBS).
Colocar a lamnula e proteger da luz (para preveno de danos adicionais ao DNA),
deixar na geladeira por 15min.
74
5. Retirar as lamnulas com delicadeza e mergulhar as lminas na soluo de lise. Manter
em geladeira (4C) por pelo menos 1 hora.
6. Aps o termino da lise, retirar as lminas gentilmente e colocar na cuba horizontal de
eletroforese.
7. Deixar desnaturando o DNA no tampo de eletroforese por 20min.
8. Iniciar a corrida de eletroforese com 25volts e 300mA, por 25min.
9. Aps a eletroforese retirar as lminas gentilmente e mergulh-las em soluo de
neutralizao, 3X de 5min.
10. Secar as lminas na posio inclinada e fixar com etanol por 5min. Armazenar em
geladeira at o momento da anlise.
11. Adicionar 60l de brometo de etdeo em cada lmina cobrir com lamnula.
12. Analisar as lminas em microscpio de fluorescncia em aumento de 20X na objetiva,
utilizando software Komet 6.0.


LOCALIZAO DE FIBRAS DE ESTRESSE E DE FOCO DE DANO DO DNA INDUZIDAS
POR RADIAO ULTRAVIOLETA DO TIPO (UVC) POR MICROSCOPIA CONFOCAL DE
FLUORESCNCIA

1. Lavar as clulas irradiadas por 2x com PBS e fixar em soluo de PBS contendo 3%
paraformaldedo e 2% sacarose por 10 min a temperatura ambiente ou com metanol
gelado por 5 min a temperatura ambiente;
2. Permeabilizar as clulas fixadas com formaldedo em tampo de permeabilizao
(Triton X-100 0,5%, sacarose 6,85% e MgCl
2
3mM em 100ml de PBS) por 5 min no
gelo;
3. Lavar as clulas por 2x de 5min com PBS a temperatura ambiente e deixar as lamnulas
cobertas com PBS at o momento do ensaio;
4. Preparar uma tampa de multiwell de 24wells, marcando as condies de tratamento e
colocando um parafilme bem esticado. Esse parafilme dever ser mudado cada vez que
for necessrio. Sobre o parafilme colocar para cada incubao e em cada local
referente a uma well, 50l da soluo desejada e com uma pina pegar cada lamnula e
colocar sobre a gota com as clulas voltadas para baixo; incubar pelo tempo necessrio
como descrito a seguir;
5. Bloquear em PBS contendo 3% BSA e 10% de soro bovino (BS) a temperatura
ambiente por 30min;
6. Lavar as clulas por 2x de 5min com PBS a temperatura ambiente;
7. Incubar com o anticorpo de pH2AX (coelho) na diluio de 1:300 em PBS/3%BSA por
1h a temperatura ambiente;
8. Voltar s lamnulas para as placas e lavar com PBS por 3x de 5 min cada;
9. Incubar com faloidina conjugado ao fluorforo (Alexa-Fluor 488) e o anticorpo
secundrio anti-rabbit (Alexa-Fluor 555) diludos 1:500 em PBS/3% BSA por 1h a
temperatura ambiente;
10. Voltar s lamnulas para as placas e lavar com PBS por 3x de 5 min cada;
11. Retirar bem, com papel toalha, o excesso de PBS das lamnulas e coloc-las voltadas
com as clulas para baixo sobre uma gotcula (5 l) de Vectashield (que contm DAPI)
numa lmina devidamente limpa e marcadas;
12. Analisar as clulas em microscpio confocal de fluorescncia marca Zeiss (ver principio
de funcionamento ptico na Figura 2), acoplado ao sistema de aquisio de imagens
com cmera digital em objetiva de imerso de 60 ou 100x de magnitude com leo
mineral. O software de microscopia digital LSM Image Browser da Zeiss foi usado para
anlise das imagens e aquisio das fotos.

75

Figure 2: Molecular Expressions Microscopy Primer Anatomy of the Microscope
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/introduction.html




BIBLIOGRAFIA FUNDAMENTAL

Bode AM, Dong Z. Sci STKE. 2003; 2003 (167): RE2.
Brancho D, Tanaka N, Jaeschke A, Ventura JJ, Kelkar N, Tanaka Y, Kyuuma M,
Takeshita T, Flavell RA & Davis RJ, Genes Dev, 2003; 17: 19691978.
Gorbunova V, Seluanov A, Mao Z, Hine C, Nucleic Acids Research, 2007; 10: 1-9.
Hamdi M, Kool J, Carlotti F, Yasui A, Van Dam H et al, Oncogene, 2005; 24: 7135-7144.
Shaulian E & Karin M, Nat Cell Biol, 2002; 4: E131E136.
Todd DE, Densham RM, Molton SA, Balmanno K, Newson C, Weston CR, Garner AP,
Scott L & Cook SJ, Oncogene, 2004; 23: 32843295.
Todd JL, Tanner KG, Denu JM, J Biol Chem, 1999; 274: 13271-80.
Uetani N, Kato K, Ogura H, Mizuno K, Kawano K, Mikoshiba K, Yakura H, Asano M &
Iwakura Y, EMBO J. 2000; 19: 27752785.


76


C
Biologia Celular no
Cncer

77
Mecanismos Moleculares de Citoproteo
Prof. Dra. Letcia Labriola (responsvel);
Ancly Ferreira dos Santos, Letcia F. Terra, Rosangela Aparecida Wailemann Mansano e
Talita C. Oliveira (monitores)

Avaliao de Morte Celular e Migrao em Cultura de Clulas Tumorais


1. Mecanismos de morte celular e cncer

A morte celular um processo comum nos tecidos vivos, tanto em situaes patolgicas
(por exemplo na inflamao), quanto em situaes fisiolgicas (embriognese e metamorfose).
As clulas apresentam um programa elaborado de deteco de sinais extra e intracelulares
que podem levar a morte. A no regulao dessa rede de sinalizao culmina na perda de
viabilidade da clula ou do controle sobre seu crescimento ou funes celulares. A morte
celular pode ser induzida por uma variedade de estmulos como dano ao DNA por raios UV
infeco viral, linfctos citotxicos, drogas antitumorais (ciclosporina A, cicloheximida,
estaurosporina, camptotecina, etc), citocinas (TNF - de , IL-1 , etc), ausncia de fatores de
crescimento, entre outros.
Os mecanismos clssicos pelos quais a clula chega morte so chamados de
apoptose e necrose (figura 1). Porm, estudos com diferentes linhagens celulares, em
diferentes condies, tm demonstrado a existncia de outras vias (como autofagia, piroptose,
necroptose, entre outras) (Grivicich et al., 2007).



Figura 1: caractersticas morfolgica da apoptose e necrose


A necrose, tambm chamada de morte celular "acidental", ocorre quando as clulas so
submetidas a agentes externos ou expostas a uma variao extrema de suas condies
fisiolgicas (por exemplo hipxia), que danificam a membrana plasmtica e provocam
extravasamento do contedo citoplasmticos levando, consequentemente, a morte celular.
Neste tipo de morte as clulas sofrem aumento de volume, agregao da cromatina,
desorganizao do citoplasma, perda da integridade da membrana plasmtica e consequente
ruptura celular, causando dano as clulas vizinhas e disparando uma reao inflamatria. Na
maioria das clulas, receptores de morte ativam a apoptose em vez de necrose como
mecanismo padro de morte celular. No entanto, se a ativao das caspases nesta via
prejudicada, a sinalizao para morte celular pode ser por ativao de um tipo de "necrose
programada", resultado de uma interao estritamente regulada de eventos de sinalizao, que
so iniciados por uma vasta gama de estmulos (figura 2). O mecanismo molecular envolve a
participao de protenas de interao com receptores do tipo serina/treonina cinases (RIP1 e
RIP3) e de mediadores como espcies reativas de oxignio (ROS), clcio (Ca2+), calpainas,
catepsinas, fosfolipases e ceramidas (Duprez et al., 2009).
78



Figura 1: Vias de sinalizao da necrose. Atravs da ativao da protena RIP1, uma srie de
mediadores de necrose so ativados, como ROS, clcio, calpanas, catepsinas e fosfolipases. Esses
mesmos mediadores podem ser ativado por dano ao DNA ou ativao de receptores do tipo toll (TLR-3
ou TLR-4).



infectadas, danificadas ou transformadas. Caracteriza-se por um processo fisiolgico que
envolve uma srie de perturbaes na arquitetura da clula e contribui no somente para a
morte celular, mas tambm prepara as clulas para serem reconhecidas e removidas por
clulas do sistema imune, prevenindo respostas imunes no desejadas. Em clulas de
mamfero, a apoptose segue duas vias distintas, dependendo da origem do estmulo, que
podem ser visualizadas na figura 3. A via intrnseca ativada em resposta a uma variedade de
estmulos de morte gerados dentro da clula, como, por exemplo, o dano ao DNA. A inativao
desta via um dos importantes marcadores do cncer. A via intrnseca mediada pela
mitocndria e, em resposta a estmulos de apoptose, diversas protenas mitocondriais so
liberadas no citoplasma. Estas protenas levam a ativao de caspase-9, uma protease
iniciadora que ativa a caspase-3, uma protease efetora de morte celular que cliva variadas
protenas da clula. A via extrnseca iniciada pela ligao de uma molcula sinalizadora de
morte extracelular a seu receptor na superfcie da membrana plasmtica. Esta ligao leva ao
recrutamento de fatores citoslicos, promove a ativao da caspase-8, a qual por sua vez cliva
e ativa a caspase-3 (Duprez et al., 2009).


79





































-
cncer. O cncer o nome dado a um conjunto de doenas que compartilham a caracterstica
de crescimento celular desordenado. Este crescimento descontrolado leva ao surgimento de
uma massa celular denominada neoplasia ou tumor, cujas clulas podem adquirir a capacidade
de invadir outros tecidos, formando novos tumores em um processo conhecido como
metstase. Este crescimento desordenado resultado de um progressivo acmulo de
mutaes no genoma de uma clula, que levam a alteraes na expresso ou funo de genes
importantes para a manuteno da homeostase celular. Consequentemente, essas alteraes
genticas podem converter uma clula normal em uma clula transformada, que se caracteriza
por no mais responder aos sinais de controle de proliferao, morte e diferenciao que
controla a comunidade celular. Pode-se dizer ento que as principais alteraes que promovem
o crescimento maligno das clulas cancerosas esto relacionadas com a evaso a
mecanismos de morte celular e metstase, sendo esses dois eventos os maiores desafios para
o tratamento de tumores (Bacac et al., 2008). Para o tratamento do cncer existem vrios
procedimentos mdicos como cirurgia, quimioterapia, radioterapia e para alguns tipos a terapia
Figura 3: Vias de sinalizao de apoptose. (1). Via extrnseca de apoptose, com a ligao a receptores
de membrana levando a formao do complexo DISC, no qual a caspase-8 ativada e inicia a ativao
de caspases efetoras. (2). Via intrnseca de apoptose, na qual sinais internos de stress celular levam a
ativao de membros pr-apoptticos da famlia Bcl-2 (Bax e Bak) que so transportados a mitocndria
e levam a formao de poros que permitem a liberao de molculas pr-apoptticas do espao
intermembranar mitocondrial. Ocorre ento a formao do apoptosomo para ativar a caspase-9. A
caspase-9 ativa cliva e ativa a caspase-3, que efetiva a clivagem de substratos que culmina na morte
celular. possvel observar em ambas as vias a presena de protenas anti e pr-apoptticas permitindo
uma regulao fina do processo (adaptado de DUPREZ et al., 2009).
80
hormonal. Porm, essas estratgias nem sempre so eficazes e acabam por comprometer a
qualidade de vida dos pacientes devido alta agressividade das alternativas teraputicas.
Compreender os mecanismos e as alteraes nos componentes das vias de morte
celular e sua correlao com o desenvolvimento do cncer fundamental para a evoluo de
terapias e mtodos de preveno. Quanto mais se conhece sobre os mecanismos de morte
celular e proliferao mais estratgias podem ser desenvolvidas ou aperfeioadas visando
combater as clulas tumorais. Nesse sentido, umas das ferramentas que pode se utilizada para
induo de morte celular a terapia fotodinmica (PDT - do ingls Photodynamic Therapy).
Esta uma uma modalidade promissora de tratamento de tumores e doenas no malignas,
baseada na combinao de um fotossensibilizador (Ps), seletivamente localizado no tecido
alvo, e iluminao da leso com luz visvel, resultando em um efeito fotodinmico que culmina
na morte celular. A PDT representa uma alternativa promissora para o tratamento de tumores
uma vez que sua caracteriza-se pela sua capacidade de induzir a morte do tecido neoplsico
com reduo da massa tumoral sem gerar efeitos citotxicos acumulativos, causando mnimos
efeitos colaterais para o paciente (Vandenabeele et al, 2010).
A combinao de terapias para o tratamento do cncer uma estratgia recorrente
como tentativa de atingir o maior nmero de clulas alteradas possvel. Nesse sentido, uma
alternativa para modificar o curso da doena explorar as bases moleculares envolvidas no
processo de progresso tumoral e conciliar ao tratamento a utilizao de marcadores para
alvos especficos. No modelo de carcinomas mamrios, um dos estudos neste sentido est
relacionado com inibidores de metstase. O glipicano 3 (GPC3) um proteoglicano envolvido
em migrao, proliferao e sobrevivncia celular em diferentes tecidos, e existem registros da
diminuio da sua expresso em alguns tumores humanos, incluindo o cncer de mama
(Buchanan et al., 2010; Stigliano et al., 2008). Portanto, o GPC3 tem sido estudado como
possvel supressor de metstase nesses modelos tumorais.
Neste curso, o modelo a ser estudado ser a linhagem celular MDA-MB 231, epitelial,
derivada de um adenocarcinoma mamrio humano, negativa para ErbB-2 e para receptores
dos hormnios esterides estrgeno e progesterona, invasiva e metasttica (Cailleau et al,
1978). Ser avaliado o comportamento dessa linhagem frente superexpresso do gene
GPC3 atravs de um ensaio de migrao celular e a susceptibilidade dessas clulas morte
celular induzida por PDT.

2. Aula prtica
Objetivo:
Analisar o resultado de superexpresso do gene GPC3 em uma linhagem tumoral de mama
frente ao comportamento invasivo e avaliar a resposta dessas clulas PDT.

Cronograma de atividades:

Seg 15/jul Ter 16/jul Qua 17/jul
8:30 Abertura
Tratamento das
clulas
(B9S, sala 976)
Avaliao dos
projetos
10:00 Seminrios CATG CATG
12:30 Almoo
14:00
Observao das
clulas e wound
healing
(B9S, sala 976)
Irradiao e anlise
da migrao
(B9S, sala 976)
Avaliao de morte
celular
(B9S, sala 976)


81
3. Protocolos a serem Realizados Durante o Curso


3.1 Ensaio de migrao celular (wound healing in vitro)
A migrao de clulas tumorais para novos tecidos, processo conhecido como
metstase, uma das principais causas de morte em pacientes acometidos com cncer.
Estudos de migrao e invaso celular possuem papel importante para identificar clulas
invasivas e com potencial metasttico ou analisar a eficcia de tratamentos que visam controlar
essas caractersticas neste tipo de clulas. O ensaio de wound healing um mtodo simples
desenvolvido para anlise qualitativa da migrao celular in vitro, que consiste na criao de
uma ferida na monocamada celular e captura de imagens no comeo do experimento e em
tempos posteriores durante o processo de migrao at a total cicatrizao.
No caso do experimento a ser realizado neste curso, nosso objetivo comparar a
eficincia de migrao celular entre as clulas parentais MDA-MB231 e as clulas que
superexpressam o GPC3, a fim de avaliar se esta modificao gentica tem algum efeito na
propriedade invasiva desta linhagem tumoral.

Procedimento:
1. Plaquear clulas em placas de 60cm
2
de rea e deixar crescer at a confluncia de
aproximadamente 100% (etapa realizada pelas monitoras);
2. Riscar a monocamada de clulas aderidas na placa com o auxilio de uma ponteira
descartvel;
3. Trocar o meio de cultura para remover as clulas que se soltaram na etapa 2;
4. Acompanhar o crescimento em microscpio e comparar o comportamento invasivo dos
dois tipos de clulas analisadas.

3.2 Fotossensibilizao e irradiao

A PDT caracterizada pela administrao por via tpica, sistmica ou local da
substncia fotossensibilizadora e posterior irradiao do tecido ou leso com luz visvel na
regio espectral com maior penetrao em tecido vivo, compreendida entre 600 e 900nm (Kunz
et al, 2007). A energia luminosa absorvida pelo Fs e transferida para o oxignio presente no
tecido, gerando espcies reativas de oxignio (ROS), incluindo oxignio singlete (
1
O
2
) e
radicais livres, que causam danos s biomolculas (Agostines et al, 2011).

Procedimento:
1. As clulas sero subcultivadas em placas de 24 poos;
2. Aps um perodo de incubao de 96h, as clulas sero submetidas ao tratamento com
o fotossensibilizador na concentrao final de 20M em cada poo;
3. Aps o tratamento as clulas sero incubadas a 37C durante 2 horas e posteriormente
sero irradiadas por 16 minutos com um laser vermelho (=650nm) a uma altura de 10
cm das placas (5 J/cm
2
).

3.3 Anlise de morte celular marcao diferencial de ncleos

Procedimento:
1. Preparar o volume necessrio de uma soluo de 10g/ml de Hoechst e Iodeto de
propdeo diludos em meio de trabalho.
2. Retirar metade do volume do meio das clulas e adicionar o mesmo volume do meio de
marcao;
3. Incubar em estufa a 37C por 15 minutos;
4. Inativar a marcao por diluio (remover metade do volume do meio de incubao e
adicionar o mesmo volume de meio sem o fluorforo)
5. Analisar em microscpio de fluorescncia os ncleos marcados com Hoeschst
(=350nm), que corresponde ao nmero de clulas total, e os ncleos marcados com
Iodeto de propdeo (=535nm), que correspondem ao nmero de clulas mortas.
82
4. Discusso
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________
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83
Imunolocalizao de Marcadores Tumorais em Tecido Parafinado e em Clulas
Cultivadas
Profa. Katicia Batista da Silva Paiva (responsvel);
Luiz Henrique Santos Silva (monitor).

1. Importncia dos Marcadores Tumorais para o Diagnstico e Acompanhamento

A imuno-histoqumica (IHQ) surgiu com as pesquisas em imunopatologia que
comearam na dcada de 1940, unindo conhecimentos de imunologia, histologia e qumica. S
a partir de 1974, quando foi possvel demonstrar alguns antgenos teciduais por esta tcnica
em tecidos fixados em formalina e includos em parafina, que a IHQ foi aceita como um
mtodo simples e prtico na rotina diagnstica de patologia cirurgica. A IHQ amplamente
utilizada no diagnstico de clulas anormais, tais como aquelas encontradas no cncer, bem
como no acompanhamento da progresso e do tratamento desta doena, j que marcadores
moleculares especficos so caractersticos de eventos celulares particulares, tais como
proliferao ou morte celular, encontrados em tumores.
A IHQ tambm amplamente utilizada na pesquisa bsica para compreender a
distribuio e localizao de biomarcadores e protenas diferentemente expressas em diversos
tecidos biolgicos.

2. Tcnicas de Imuno-histoqumica, Imunocitoqumica e Imunofluorescncia

A IHQ em tecidos parafinados (IHC-P Immunohistochemistry-Paraffin Sections) ou
congelados (IHC-Fr Immunohistochemistry Frozen Sections) e a imunocitoqumica so
tcnicas para demonstrar a presena e a localizao de uma protena no tecido ou clula,
respectivamente, por meio de uma reao antgeno/anticorpo associado a um marcador visvel
(um cromgeno ou fluorocromo neste ltimo caso chamamos de imunofluorescncia). Estas
tcnicas so qualitativas, ou seja, descritivas, sendo imunoensaios quantitativos o western blot
e o ELISA.
O anticorpo a uma protena produzida pelo sistema imune para localizar e se ligar a
um antgeno especfico. Um antgeno composto de muitos segmentos denominados
eptopos, onde ocorrer a ligao do anticorpo. No nosso caso, o antgeno ser a protena-alvo
a ser localizada no tecido ou clulas. Esta reao pode ser visualizada de diversas maneiras:

1) Direta: o mtodo mais antigo, caracterizado por um nico passo no qual o anticorpo
conjugado com uma enzima e a visualizao observada pela reao com um cromgeno.
uma tcnica rpida, porm inespecfica, limitada e de baixo sinal.
2) Indireta: mtodo de dois ou trs passos no qual utilizado um anticorpo especfico
(primrio) para o reconhecimento do antgeno e um ou dois anticorpos secundrios (conjugado
a enzima) e a visualizao observada pela reao com um cromgeno. mais sensvel e
verstil que o mtodo direto.
3) PAP/APAAP: mtodo de trs passos no qual utilizado um anticorpo especfico (primrio)
para o reconhecimento do antgeno, um anticorpo secundrio, um anticorpo tercirio
(conjugado a enzima) e a visualizao observada pela reao com um cromgeno. No caso
da PAP a enzima utilizada a peroxidase e na APAP, fosfatase alcalina.
4) Tecnologia da Streptoavidina-Biotina: a maioria dos mtodos de deteco em IHQ
utilizados atualmente so baseados na alta afinidade da streptoavidina (originria do
Streptomyces avidinii)/avidina (originria de ovos de galinha) pela biotina, que apresenta quatro
stios de ligao pela biotina. Utiliza-se um anticorpo especfico (primrio) para o
reconhecimento do antgeno, um anticorpo secundrio biotinilado, complexo streptoavidina-
84
biotina (conjugado a peroxidase ABC Avidin-biotin Complex) ou streptoavidina (conjugada a
peroxidase LSAB Labelled Streptoavidin-Biotin), e a visualizao observada pela reao
com um cromgeno. No primeiro caso (ABC), a streptoavidina est associada a trs molculas
de biotina e, cada biotina, conjugada a uma peroxidase. J no segundo caso (LSAB) a
streptoavidina est conjugada a peroxidase, tendo os seus quatro stios de ligao a biotina
livres. Em ambos os casos, os stios livres existentes na streptoavidina vo se ligar a biotina do
anticorpo secundrio. Desta forma, o LSAB amplifica o sinal de quatro a oito vezes mais do que
o ABC. Existe ainda o mtodo CSA (Catalyzed Signal Amplification) que amplifica o sinal obtido
pelo protocolo ABC pela utilizao de um reagente de amplificao contendo um substrato
fenlico (biotinyl-tyramide) que catalizado pela peroxidase, resultando em um produto
insolvel fenlico biotinilado. Ento, as biotinas depositadas reagem com a peroxidase
conjugada a streptoavidina-biotina, o que leva ao aumento do sinal.

5) Tecnologia de cadeia polimrica conjugada: mtodo baseado em um polmero de
dextrana que possui tanto anticorpos secundrios quanto molculas de peroxidase conjugados
a ela. Utiliza-se um anticorpo especfico (primrio) para o reconhecimento do antgeno, o
polmero (conjugado ao anticorpo secundrio e proxidase) e a visualizao observada pela
reao com um cromgeno. Pela ausncia da biotina, este mtodo altamente especfico
(baixo background) e maior amplificao do sinal em relao ao mtodos anteriores.

Um dos principais desafios desta tcnica associar a integridade dos componentes do
tecido ou clulas (promovido pelos agentes fixadores) a preservao dos eptopos, o que leva
a problemas de reconhecimento pelo anticorpo.



Representao esquemtica dos mtodos empregados em IHQ: (1) direto, (2) indireto (com dois ou trs
anticorpos secundrios, respectivamente), (3) PAP/APAP, (4) tecnologia da Streptoavidina-biotina (ABC,
LSAB e CSA, respectivamente) e (5) tecnologia de cadeia polimrica conjugada (identificao de um ou
dois antgenos diferentes, respectivamente).
85
2.1. Imuno-histoqumica

2.2.1. Tecidos Parafinados (IHC-P)

Tradicionalmente, as bipsias de pacientes so rotineiramente fixadas em formoldedo e
processadas em parafina, podendo assim, ser realizado o exame histopatolgico por
coloraes histoqumicas convencionais (hematoxilina e eosina, por exemplo) e pelo material
ser preservado e armazenado por longos perodos.
A IHC-P o mtodo mais comumente utilizado em laboratrios de patologia para
complementar ou definir o diagnstico pelo localizao de biomarcadores, por ser muita mais
especfico do que coloraes histoqumicas convencionais e devido a facilidade de utilizao
do tecido que j est armazenado. A IHC-P compreende etapas bem definidas, tais como
fixao, incluso em parafina, corte e colocao em lminas histolgicas apropriadas,
desparafinizao, reidratao, bloqueio de enzimas endgenas, recuperao antignica,
bloqueio de biotina ou ligaes inespecficas, localizao do antgeno pelo anticorpo-primrio,
reconhecimento do anticorpo-primrio pelo anticorpo-secundrio (conjugado a streptoavidina-
biotina ou cadeia polimrica), revelao com cromgeno, contra-colorao e montagem das
lminas.

A) Fixao - Formaldedo (formalina 4% tamponada, pH 7,2): promove a preservao do tecido
por estabelecer ligaes cruzadas (cross-links) mltiplas entre os grupos aminos e a formao
de pontes de metileno entre os vrios aminocidos presentes nos peptdeos de uma
determinada protena e desta com as protenas adjacentes. Apesar de ser um excelente agente
fixador preservando a morfologia tecidual, existem problemas decorrentes de sua utilizao em
imuno-histoqumica. Estas mltiplas ligaes bloqueiam o acesso de anticorpos aos eptopos-
alvo, mascarando o antgeno. Este fenmeno revertido pela recuperao antignica
(desmascaramento dos eptopos). Isto est diretamente relacionado ao tempo de fixao, ou
seja, quanto maior o tempo de fixao mais difcil ser a recuperao dos antgenos (acima de
48h), sendo ideal entre 18-24h. Alm disso, o processo de incluso em parafina pode destruir
determinados eptopos, pois ocorre a 60 C. Desta forma, os tecidos parafinados fixados em
formaldedo devem ser cuidadosamente fixados e includos em parafina (formalina-fixed
paraffin-embedded FFPE) para que a reao imuno-histoqumica no seja prejudicada.

B) Corte (seco) e Lminas Histolgicas apropriadas: a espessura do corte parafinado
importante para a que a visualizao da arquitetura tecidual no seja comprometida pela
sobreposio de clulas, com cerca de 3 a 5 micrometros em micrtomo. Estes cortes so
colocados sobre lminas de vidro para histologia previamente tratadas com substncias que
promovem uma camada adesiva entre o corte parafinado e a lmina, j que toda a reao
imuno-histoqumica ocorre em meio aquoso e, por veze, em altas temperaturas, o que leva ao
descolamento do corte parafinado. Dentre eles, podemos destacar a poli-lisina (poly-L-lisin) e o
silano (amino-propyl-tri-ethoxy-silane). Em ambos os casos, as lminas podem ser adquiridas
prontas ou serem preparadas no prprio laboratrio.

C) Desparafinizao e reidratao: a primeira etapa propriamente dita da IHC a remoo
da parafina e reidratao do tecido. A parafina removida por solventes orgnicos (mais
utilizado o xilol) e a reidratao por solues decrescentes de etanol (100%, 70% e 50%) e,
finalmente, com o tampo que ser utilizado durante toda a reao (PBS, Tris, etc). Esta etapa
fundamental para o sucesso da reao, j que traos de parafina impedem tanto a
recuperao antignica quanto o acesso dos anticorpos.

86
D) Recuperao Antignica (Antigen Retrieval): este processo pode ser realizado,
classicamente, de duas maneiras: por calor e por digesto enzimtica. O desmascaramento
dos eptopos por calor (a temperaturas prximas a de ebulio da gua - heat-induced epitope
retrieval HIER) tem sido considerado o mtodo mais eficiente e reprodutvel. Para tal, o calor
gerado por micro ondas, panelas a vapor (steamers), autoclave, panela de presso e banho-
maria, no qual o tecido est imerso em um tampo (fosfato-citrato a pH 6,0, Tris/EDTA a pH 9,0
ou EDTA 1mM a pH 8,0 - os mais comuns) de 5 a 20 min. H a necessidade de resfriamento
lento do tecido (20-30 min) aps a recuperao antignica. J a utilizao de enzimas
proteolticas (tripsina e proteinase K, as mais utilizadas) para a recuperao antignica pode
levar a destruio do tecido e o seu uso bastante restrito. Estas devem ser utilizadas a 37 C.
Determinados eptopos requerem a utilizao combinada tanto do calor como de digesto
enzimtica para serem restaurados no tecido.

E) Bloqueio de Enzimas Endgenas: devido a utilizao de mtodos de imunomarcao
baseados na utilizao da peroxidase ou fosfatase alcalina como enzima que reagir com o
cromgeno e de serem enzimas naturalmente presentes nos tecidos, h a necessidade de
bloqueio da peroxidase endgena ou fosfatase alcalina endgena antes da utilizao do
mtodo de imunomarcao escolhido (soluo de perxido de hidrognio e levamisole na
soluo substrato da enzima, respectivamente).

F) Bloqueio da Biotina Endgena: a biotina uma vitamina (B7) e coenzima e presente na
maioria dos tecidos, especialmente em fgado, rim, pulmo, bao, tecido adiposo, glndula
mamria e crebro. Tcnicas baseadas na utilizao de biotina requer sua neutralizao
tecidual antes da utilizao do mtodo de imunomarcao escolhido com uma soluo de leite
desnatado e tampes alcalinos.

G) Bloqueio de Stios Inespecficos: conjugados de peroxidase so protenas bsicas e
podem se ligar de modo inespecfico a stios aninicos teciduais. A utilizao de detergentes
no aninicos (Triton X-100, por exemplo) ou de protenas inertes, tais como soro fetal bovino,
soro albumina bovina ao competir com os stios de ligao reduz a absoro inespecfica. As
ligaes inespecficas devidas a interaes hidrofbicas e inicas so mais frequentemente
observadas em tecido conjuntivo pela presena de colgeno, elastina, laminina e
proteoglicanos, epitlio e adipcitos. As ligaes hidrofbicas entre as protenas teciduais e
anticorpos so influenciadas pela fixao, fixadores aldedicos, pelo anticorpo primrio. O
mtodo mais eficiente de bloquear as interaes hidrofbicas o uso de protena bloqueadora
em separado ou junto ao diluente do anticorpo primrio.

H) Substratos e Cromgenos: a escolha do cromgeno esta diretamente relacionada ao tipo
de enzima empregada (peroxidase HRP ou fosfatase alcalina ALP).
HRP: DAB (marrom, insolvel em lcool); AEC (rosa-vermelho, solvel em lcool), CN
(azul, solvel em lcool e outros solventes orgnicos tende a difuso), Hanker-Yates
reagente (azul-preto, insolvel em lcool e em outros solventes orgnicos);
ALP: Fast Red TR ou Fast Blue BB (vermelho e azul, respectivamente, ambos solveis em
lcool e outros solventes orgnicos meio de montagem aquoso), Nova fucsina (vermelho,
insolvel em lcool e outros solventes orgnicos).

I) Lavagens: o uso de Triton X-100 no tampo de lavagem (PBS, TBS, etc) auxilia na reduo
da tenso superficial, facilitando o recobrimento do tecido com os reagentes. Alm disso,
acredita-se que este reduz as ligaes inespecficas por atuar nos receptores Fc dos
anticorpos.
87

J) Controles: utiliza-se, ao menos, dois controles na reao, o positivo e o negativo. O
positivo, trata-se de um tecido que sabidamente o anticorpo de interesse estar expresso. J o
negativo, aquela lmina em que substitui-se o anticorpo primrio pelo diluente do anticorpo
ou incuba-se com o soro normal no-imune do animal onde o anticorpo foi produzido (cabra,
coelho, camundongo, etc), resultando na ausncia de imunomarcao. H ainda os controles
internos que consistem em tecido (ou clulas) da mesma seco, ou de seco separada do
mesmo espcime da paciente, como seco-teste. A situao ideal seria colocar no mesmo
bloco o tecido a ser analisado (suspeito) e o tecido de controle.

2.1.2. Tecidos Congelados (IHC-Fr)

Alguns eptopos, tais como da superfcie de leuccitos, no resistem a fixao por
formoldedo, assim, alguns biomarcadores devem ser detectados em tecidos congelados.
Similarmente a IHQ-P, a IHC-Fr compreende etapas bem definidas, tais como escolha do
fixador, corte e colocao em lminas histolgicas apropriadas, reidratao, bloqueio de
enzimas endgenas, bloqueio de biotina ou ligaes inespecficas, localizao do antgeno
pelo anticorpo-primrio, reconhecimento do anticorpo-primrio pelo anticorpo-secundrio
(conjugado a streptoavidina-biotina ou cadeia polimrica), revelao com cromgeno, contra-
colorao e montagem das lminas.


A) Preparo do Tecido: os tecidos frescos so embebidos em meio para congelamento
(Tissue-Tek, Sakura), congelados em metilbutano gelado (em gelo seco) e armazenados em
freezer -80 C at a seco.

B) Corte (seco) e Lminas Histolgicas apropriadas: os blocos congelados so
seccionados em criostato a -10 C. Similarmente a IHC-P, as lminas tambm devem ser
tratadas com agentes adesivos. Aps o corte, as lminas so armazenadas a -80 C at o incio
da reao. Quando forem utilizadas, estas lminas devem ser deixadas a temperatura
ambiente antes da fixao.

C) Fixao: a fixao por formaldedo pouco recomendada, caso seja necessria, a
recuperao antignica ser necessria, como descrito anteriormente para IHC-P e tambm
um tampo de bloqueio com glicina a 0.3M antes da incubao com o anticorpo primrio.
Abaixo, esto descritos os principais utilizados, mas existem outros desenvolvidos para
aplicaes especficas. Ambos devem ser utilizados gelados (-20 C) por 5-10 min a
temperatura ambiente.
Etanol: o processo de fixao ocorre por coagulao sem a formao de produtos interferentes
o que favorece a boa penetrao do anticorpo. Apesar de sua baixa penetrao no tecido,
pode ser empregado em pequenas amostras de tecido. A recuperao antignica no
necessria e pode destruir os eptopos do tecido.
Acetona: muito bom fixador de stios imunorreativos, mas com muito baixa penetrao tecidual.
Utilizado somente para tecidos criopreservados e esfregaos. Pode resultar na perda de
componentes de membrana.

Os procedimentos de bloqueio da peroxidase endgena, bloqueio de biotina ou ligaes
inespecficas, localizao do antgeno pelo anticorpo-primrio, reconhecimento do anticorpo-
primrio pelo anticorpo-secundrio (conjugado a streptoavidina-biotina ou cadeia polimrica),
88
revelao com cromgeno, contra-colorao e montagem das lminas so similares as
descritas para IHC-P.

2.2. Imunocitoqumica (ICC)


Esta tcnica pode ser aplicada em esfregaos celulares (muito utilizada em hematologia
por poder ser fixada rapidamente e verificar alteraes nucleares) ou em linhagens clulas
cultivadas para se analisar mais a fundo estruturas celulares. As clulas so cultivadas sobre
lamnulas de vidro so tratadas com agente adesivo em condies estreis.

A) Fixadores: a escolha do fixador determina o sucesso desta tcnica, j que interfere na
preservao seletiva de componentes celulares (citoplasma, membrana plasmtica ou ncleo).
Metanol e acetona devem ser utilizados gelados (-20 C) por 1-10 min a temperatura ambiente.
Etanol: etanol a 95% e cido actico glacial a 5% gelados (-20 C) de 5-10 min de fixao.
Metanol: utilizado para componentes de citoesqueleto. Bastante empregado, porm causa a
solubilizao e remoo de antgenos da membrana. Ser utilizado gelado (-20 C) por 10 min de
fixao. Tambm permeabiliza a clulas, porm muitos utilizam a acetona ao invs do metanol.
Acetona: Ser utilizado gelado (-20 C) por 10 min de fixao.
Paraformaldedo a 4%: utilizado para componentes associados a membrana e a maioria de
protenas citoplasmticas. A sua preparao requer cuidados, deve ser filtrado e utilizado
fresco ou estocado a -20 C. Fixao cerca de 10-15 min a temperatura ambiente (caso este
tempo seja maior, haver a necessidade de recuperao antignica). Utilizar um tampo de
bloqueio com glicina a 0.3M antes da incubao com o anticorpo primrio.
Paraformaldedo/glutaraldedo: indicado em duplas marcaes de componentes de membrana
e de citoesqueleto. Utilizar um tampo de bloqueio com glicina a 0.3M antes da incubao com
o anticorpo primrio.
EGS: componentes de membrana e microtbulos.

B) Permeabilizao: principalmente necessrio quando a protena-alvo intracelular, uma
protena transmembrane com uma cauda citoplasmtica ou do ncleo (soluo PBS com Triton
X-100 ou NP-40 de 0,1 a 0,2% por 10 min ou ainda Tween 20, saponina, digitonina ou
leucoperme de 0,2 a 0,5% de 10 a 30 min). Quando h fixao com acetona este processo no
necessrio, poia a acetona alm de fixador tambm permeabiliza as clulas. No deve utilizar
esta etapa quando haver marcao de protenas da membrana celular (o Triton destri as
membranas).

2.3. Imunofluorescnica (IF)

Pode ser aplicada tanto em tecidos parafinados e congelados bem como em clulas
cultivadas. Diferentemente dos mtodos utilizando enzimas, sistemas de amplificao e
cromgenos para a revelao da reao, a IF utiliza anticorpos conjugados a partculas
fluorescentes para visualizar a interao antgeno-anticorpo. Sua grande vantagem a
possibilidade de co-localizao de protenas diferentes na mesma amostra pela utilizao de
fluorforos com cores distintas. Esta tcnica pode ser realizada de duas maneiras:

A) Direta: aquela que requer somente um passo no qual o anticorpo especfico conjugado
diretamente a um fluorforo.
B) Indireta: mtodo de dois passos no qual utilizado um anticorpo especfico para o antgeno
e um anticorpo secundrio conjugado ao fluorforo. Esta tcnica mais empregada, no
89
somente pela sua praticidade bem como pela sua maior eficincia devido ao efeito amplificador
da fluorescncia do segundo anticorpo (conjugado covalentemente ao fluorocromo). J a
mltipla marcao (tambm chamada dupla o tripla marcao, etc.) refere-se a localizao
simultnea de dois ou mais alvos diferentes. Neste caso devem ser utilizados diferentes
fluorforos para cada anticorpo (por exemplo, FITC, APC e PE).





Representao esquemtica de imunofluorescncia direta (A) e indireta (B).





3. Protocolos e Desenhos Experimentais a serem Realizados Durante o Curso

3.1. Imunoperoxidase em Tecido Parafinado (Bipsia de Paciente)

Procedimento: utilizaremos bipsias de carcinoma epidermide de boca para a deteco de
marcadores de matriz extracelular (laminina), membrana celular (e-caderina), citoplasma (Src)
e ncleo (PCNA).

1 Dia
1- Desparafinizar as laminas em xilol (1, 2 e 3, respectivamente) por 5min cada.

2- Reidratar as lminas em solues decrescentes de lcool (lcool absoluto 1, lcool absoluto
2 e lcool 70%) por 3 min cada.

3- Lavar com PBS, 2 vezes por 5 min.

4- Bloqueio da peroxidase endgena com soluo de perxido de hidrognio 3% por 45 min
temperatura ambiente.

5- Lavar com PBS, 2 vezes por 5 min.

6- Recuperao antignica com tampo citrato-fosfato (pH 6,0 a 96 C) em steamer por 20 min.

7 Deixar as lminas esfriarem fora do steamer por 20 min.

8 Lavar com PBS, 2 vezes por 5 min.
90

9 Enxugar as lminas e passar a caneta hidrofbica em torno dos cortes.

10 Incubar com soluo de bloqueio (DAKO) por 10 min a temperatura ambiente.

11 - Incubar com o anticorpo primrio (utilizar soluo diluente DAKO) a 4 C overnight.

Anticorpo Especificidade Marca Cdigo Animal
Hospedeiro
Tipo do
Anticorpo
Src H, M, R, Mk, Hm, B Cell Signaling 2109 Rabbit Policlonal
PCNA H, M, R, yest Calbiochem NA03 Mouse Monoclonal
Laminina H, M, R Abcam Ab7463 Rabbit Policlonal
E-caderina H Abcam Ab1416 Mouse Monoclonal

2 Dia
12- Lavar com PBS, 2 vezes por 5 min (lembrar de lavar o controle negativo em cuba separada
das lminas reativas e controle positivo).

13- Incubar com o kit EnVision (DAKO) por 30 min a temperatura ambiente.

14- Lavar com PBS, 2 vezes por 5 min.

15- Revelar com soluo de DAB (DAKO) por 7 min em cmara escura.

16- Paralisar o DAB com gua destilada.

17- Contra-corar com hematoxilina de Mayer filtrada por 1 min;

18- Lavar em H
2
O corrente (remoo do excesso).

19- Desidratar em solues crescentes de lcool (lcool 70%, lcool absoluto 1 e lcool
absoluto 2) por 2 min cada.

20 Xilol (1, 2 e 3, respectivamente) por 3min cada.

21 Fechar as lminas com meio de montagem e lamnula.

22 Deixar secar e analisar as lminas em microscpio ptico convencional.

3.2. Imunocitoqumica (Imunofluorescncia) em Clulas Cultivadas (Linhagem Tumoral)

Procedimento: linhagem clulas de cncer de boca (SCC-9) ser cultivada sobre lamnulas de
vidro e marcadas com um marcador de membrana celular (caveolina-1) e corante nuclear
(DAPI).

1. Silanizar as lamnulas previamente e autoclav-las embrulhadas em papel alumnio ou
utilizar lminas Labtek;
2. Distribuir as lamnulas em placas de cultura de clulas (em geral P24), adicionar meio
de cultura e arranjar de modo que fiquem bem aderidas.
3. Plaquear as clulas de interesse.

91
4. Remover o meio e fixar e permeabilizar em soluo Paraformaldedo 4%, Triton-X 100
0,1% em PBSA por 10 min a 37C. Lavar duas vezes por 10 min com tampo PBSA.
5. Para o bloqueio dos stios inespecficos, incubar as clulas por 30 min, temperatura
ambiente, em BSA (albumina de soro bovino) 2% em PBSA.
6. Em um poo de uma placa de 24 poos, aplicar uma gota (30 ul) do anticorpo primrio
diludo na soluo de bloqueio. Incubar em cmara mida por 1h a temperatura ambiente.

Anticorpo Especificidade Marca Cdigo Animal
Hospedeiro
Tipo do
Anticorpo
Caveolina-1 H, M, R, Pig, Hm,
B
Cell
Signaling
3238 Rabbit Policlonal

7. Lavar as lamnulas com PBSA 3 vezes por 10 min a temperatura ambiente. Na ltima
lavagem, acrescentar um pouco da soluo de bloqueio (isto ir facilitar o espalhamento do
anticorpo secundrio).
8. Aplicar o anticorpo secundrio conjugado a FITC (anti-rabbit) (diludo em soluo de
bloqueio) em ambiente mido a 37C por 30 min (deve ser em cmara escura tambm).
9. Lavar as lamnulas com PBSA 3 vezes por 10 min a temperatura ambiente.
10. Pingar uma gota de Vectashield com DAPI (anti-fade, Vector) sobre uma lmina de vidro
e colocar a lamnula, com a face contendo as clulas para baixo. Deixar secar 15 min
temperatura ambiente. J est pronta para ser observada ao micrioscpio de fluorescncia.


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92
Vias moleculares da transformao maligna induzida pelo oncogene K-Ras
Profa. Daniela Sanchez Bassres (responsvel);
Amanda Padilha Salviatto e Edmlson Ozrio dos Santos (monitores)

Avaliao da induo de apoptose celular por um inibidor farmacolgico das quinases
Aurora em clulas pulmonares transformadas pelo oncogene K-Ras


MODELO EXPERIMENTAL E FUNDAMENTOS

Nosso modelo experimental consistir na anlise de morte celular por clivagem de
Caspase-3 em clulas tumorais humanas que expressam a forma induzvel de um
oncogene denominado K-Ras.

Controle Gentico da Apoptose

A apoptose um programa de morte celular extremamente regulado e de grande
eficincia, que requer a interao de inmeros fatores. As alteraes morfolgicas observadas
so conseqncia de uma cascata de eventos moleculares e bioqumicos especficos e
geneticamente regulados.

Caspases como Iniciadores e Executores da Apoptose

As caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases) pertencem famlia das
cistenas proteases (possuem uma cistena no stio ativo) que tm a capacidade de reconhecer
e clivar substratos que possuam resduos de aspartato. As caspases sinalizam para a apoptose
e clivam esses substratos levando condensao e fragmentao nuclear, externalizao de
fosfolipdios de membrana que iro sinalizar para estas clulas serem fagocitadas por
macrfagos. So conhecidas catorze caspases humanas, sendo que seis (caspases -3, -6, -7, -
8, -9, -10) participam da apoptose. As caspases -1, -4, -5, -11, -12, -13, -14 esto envolvidas na
maturao de citoquinas, e sua contribuio na apoptose permanece no esclarecida. As
caspases so sintetizadas como precursores inativos denominados zimognios. Aps um sinal
de morte celular, as caspases so ativadas por clivagem proteoltica. Essas enzimas podem
interagir com receptores de membrana ou molculas adaptadoras que contenham domnios de
morte (death domain), pois esses domnios tambm existem nas caspases e a presena deles
permite essa interao. As caspases podem ser classificadas de acordo com seu pr-domnio e
seu papel na apoptose. Caspases iniciadoras possuem pr-domnios longos, envolvidas na
iniciao da cascata proteoltica. Caspases efetoras apresentam prdomnios curtos ou
inexistentes, responsveis pela clivagem de substratos. Entre os diversos substratos das
caspases pode-se citar a mdm-2 (murine double minute), uma protena que se liga p53,
mantendo-a no citoplasma. Ao ser clivada pelas caspases, essa protena libera a p53 que se
transloca para o ncleo, ativando a transcrio de genes prapoptticos como o Bax.

Vias de Ativao da Apoptose

Diversos so os fatores que podem desencadear a apoptose, entre eles: ligao de
molculas a receptores de membrana, agentes quimioterpicos, radiao ionizante, danos no
DNA, choque trmico, de privao de fatores de crescimento, baixa quantidade de nutrientes e
nveis aumentados de espcies reativas do oxignio. A ativao da apoptose pode ser iniciada
de duas diferentes maneiras: pela via extrnseca (citoplasmtica) ou pela via intrnseca
(mitocondrial).

93
Via Extrnseca

A via extrnseca desencadeada pela ligao de ligantes especficos a um grupo de
receptores de membrana da superfamlia dos receptores de fatores de necrose tumoral (rTNF).
Esta ligao capaz de ativar a cascata das caspases. Todos os membros da famlia rTNF
possuem um subdomnio extracelular rico em cistena, o qual permite que eles reconheam
seus ligantes. Tal fato resulta na trimerizao e conseqente ativao dos receptores de morte
especficos. A sinalizao a seguir mediada pela poro citoplasmtica desses receptores
que contm uma seqncia de 65 aminocidos chamada "domnio de morte" sendo, por isso,
chamados de "receptores de morte celular". Quando os receptores de morte celular
reconhecem um ligante especfico, os seus domnios de morte interagem com molculas
conhecidas como FADD/MORT-1. Essas molculas tm a capacidade de recrutarem a
caspase-8 que ir ativar a caspase-3, executando a morte por apoptose.




Via Intrnseca

A via intrnseca ativada por estresse intracelular ou extracelular como a privao de
fatores de crescimento, danos no DNA, hipxia ou ativao de oncogenes. Os sinais que so
transduzidos em resposta a estes insultos convergem principalmente para a mitocndria.
Inmeros estudos sobre apoptose apontam a mitocndria como o principal mediador desse tipo
de morte. Essa organela integra os estmulos de morte celular, induzindo a permeabilizao
mitocondrial e conseqente liberao de molculas pr-apoptticas nela presentes. Quando
sinais de morte alcanam a mitocndria, levam ao colapso do potencial da membrana
mitocondrial interna, bem como a uma transio da permeabilidade mitocondrial (TPM). Ao
mesmo tempo, a gua do espao entre membranas passa para a matriz mitocondrial, levando
ruptura da organela e conseqente liberao de protenas pr-apoptticas para o citoplasma.
Alm da liberao de molculas pela mitocndria, a induo do TPM levam perda da
homeostasia celular, interrompendo a sntese de ATP e aumentando a produo de espcies
reativas do oxignio (EROS). O aumento nos nveis de EROS leva oxidao de lipdios,
protenas e cidos nuclicos. A resposta da mitocndria ao dano oxidativo uma via
importante no incio da apoptose. Alm disso, sabido que as EROS induzem a ativao das
caspases -9 e -3. Alguns estudos indicam que durante a apoptose ocorre a formao de um
megaporo que contm diversas protenas e abrange as membranas interna e externa da
mitocndria. Atravs desse poro ocorre a liberao do citocromo c para o citoplasma onde
participa da ativao da apoptose. Os diferentes sinais indutores de apoptose so detectados
94
pela mitocndria, fazendo com que ocorra um desacoplamento da cadeia respiratria e
conseqente liberao de citocromo c e protenas ativadoras da apoptose para o citosol.
Quando no citosol, o citocromo c forma um complexo com a APAF-1 e a caspase-9, o chamado
apoptossomo, que promove a clivagem da pr-caspase-9, liberando a caspase-9, ativa. Uma
vez ativada, a caspase-9 ativa a caspase-3 que vai ocasionar a apoptose. Mais recentemente,
foi descrita a participao, na via mitocondrial, de uma flavoprotena conhecida por Fator
Indutor de Apoptose (AIF). A AIF migra da mitocndria para o ncleo aps um estmulo de
apoptose e induz a condensao da cromatina e fragmentao do DNA em fragmentos de
50Kb, independente da ativao das caspases.







MODELO EXPERIMENTAL

Uma vez que a clivagem de caspase-3 (capase executora) um evento comum s vias
intrnseca e extrnseca da apoptose, ns iremos utilizar a tcnica de Western blotting para
investigar o perfil apopttico de clulas pulmonares tumorais H1703 G12V (que expressam
induzivelmente a forma oncognica da K-Ras), frente ao tratamento com Aurora Inhibitor II (um
inibidor das quinases mitticas Aurora A e B, quinases essas que o nosso grupo demonstrou
serem efetores downstream da atividade oncognica de K-Ras e fundamentais para a
oncognese mediada por K-Ras). Como controle experimental, ns utilizaremos clulas H1703
T-RexB controles que no expressam a forma oncognica de K-Ras quando tratadas com o
agente indutor (Doxiciclina). Desse modo, nos nossos experimentos ns esperamos que a
apoptose somente ocorra nas clulas H1703 que expressarem a K-Ras oncognica e forem
tratadas simultaneamente com Aurora Inhibitor II, no ocorrendo nas demais condies
experimentais.
A induo de apoptose ser avaliada pela deteco de clivagem da caspase 3 (caspase
efetora). A clivagem (e portanto ativao) da caspase 3 ser avaliada pela tcnica de Western
blotting.

95
Western Blotting


1. Introduo
A tcnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon
1984) tambm pode ser denominada protein immunoblot e consiste na deteco de protenas
especficas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a elaborao
dessa tcnica pode ser resumida em cinco etapas: (1) extrao e quantificao das protenas;
(2) fracionamento das protenas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3) transferncias
dessas protenas para uma membrana; (4) incubao da membrana com um anticorpo para
detectar a protena especfica a ser analisada; e (5) revelao dessa membrana para anlise
dos dados.

2. Extrao e quantificao de protenas
Para realizao dos experimentos de western blotting necessrio, inicialmente,
realizar a extrao e a quantificao das protenas. Diversos mtodos espectroscpicos so
utilizados para quantificar protenas em uma soluo. O ensaio de Bradford o mais utilizado e
apresenta diversas vantagens em relao aos demais, como rapidez, no exige aquecimento e
alta sensibilidade para baixas concentraes de protenas. O mtodo de Bradford se baseia na
mudana de cor do corante Coomassie Blue G-250 em soluo cida (cor avermelhada) para
cor azulada na presena de protenas. As interaes hidrofbicas e inicas estabilizam o
complexo protena-corante.
Para quantificar a concentrao de protenas na amostra deve-se fazer uma curva de
padronizao com concentraes conhecidas de uma protena (comumente se utiliza
soroalbumina bovina, BSA) versus absorbncia em 595 nm (comprimento de onda que o
complexo protena-corante absorve). A partir dessa curva obtm-se a equao de ajuste linear
na qual possvel substituir os valores mdios de absorbncias das amostras, obtendo-se
assim os valores da concentrao das protenas. importante ressaltar, que para uma maior
confiabilidade dos resultados, o coeficiente de correlao linear deve ser maior que 0,98.


3. Fracionamento de protenas
Para separar as protenas de uma amostra homognea, a tcnica mais utilizada a
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de SDS-
poliacrilamida, que ser uma matriz inerte atravs da qual as protenas podero migrar. O gel
preparado pela polimerizao de monmeros de acrilamida e o tamanho dos poros do gel pode
ser ajustado variando a concentrao da acrilamida adicionada para retardar a migrao da
sua protena de interesse.
As protenas podem possuir cargas positivas ou negativas, dependendo das cargas dos
aminocidos que as compem. utilizado, ento, o SDS (sodium dodecyl sulfate), um
poderoso detergente carregado negativamente, que se liga nas regies hidrofbicas das
molculas de protenas mascarando a carga intrnseca, e permitindo que as protenas migrem
em direo ao polo positivo em um campo eltrico. Alm disso, o SDS quebra as ligaes no
covalentes das protenas, fazendo com que elas voltem a sua estrutura primria, liberadas da
associao com outros monmeros ou outras protenas e molculas de lipdeos. Alm disso,
usa-se, geralmente, um agente redutor tal como o -mercaptoetanol, que quebra as ligaes
dissulfito (S-S) dos resduos de cistena que promovem a ligao de protenas a outros
monmeros, outras protenas ou mesmo a estrutura terciria da mesma protena, mantendo
assim, as protenas separadas e linearizadas (Figura 1a).
A partir dessas condies, protenas de um mesmo tamanho tendem a correr em um gel
de poliacrilamida, na presena de um campo eltrico com as mesmas velocidades, uma vez
que (1) suas estruturas nativas encontram-se completamente desnaturadas devido ao SDS e
ao -mercaptoetanol fazendo com que suas formas sejam as mesmas e, (2) elas se ligam na
mesma quantidade de SDS e portanto tem a mesma quantidade de cargas negativas (Figure
1b, c).
96

Figura 1: Gel SDS-PAGE. A) O detergente SDS e o agente redutor -mercaptoetanol. O SDS est
sendo representado em sua forma ionizada. B) O aparato de eletroforese, indicando o local de aplicao
das amostras no gel, o ctodo, o nodo e o tampo de corrida do gel. C) Cadeias individuais de
polipeptdeos formando um complexo com o SDS carregado negativamente e correndo em um gel de
poliacrilamida. Essa tcnica pode ser usada para estimar o peso molecular dos peptdeos, uma vez que
ocorrer a migrao diferenciada de molculas com tamanhos diferentes.


A tcnica de SDS-PAGE largamente utilizada, pois capaz de separar todos os tipos
de protenas, mesmo aquelas que so normalmente insolveis em gua (como por exemplo
muitas protenas de membranas). Alm disso, como as protenas so separadas por tamanho,
possvel estimar o peso molecular e a composio das subunidades da protena. Essas
protenas podem ser visualizadas diretamente no SDS-PAGE por colorao direta do gel, por
corantes como o Comassie-Blue ou por tratamentos com nitrato de prata. O nitrato de prata
um dos mtodos mais sensveis de deteco, que permite a visualizao de protenas de at
10ng, enquanto que a colorao por Coomassie-Blue detecta protenas de at 300ng. A Figura
2 representa protenas coradas com Coomassie-Blue e com Nitrato de Prata.



Figura 2: Colorao de um gel SDS-PAGE. A) Marcador de massa molecular pr-corado; B) Colorao
por Coomassie-Blue; C) Tratamento com Nitrato de Prata. Nota-se que a sensibilidade de deteco entre
os dois mtodos diferente.

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Tabela 1: Colorao de protenas em gel SDS-PAGE

Mtodo Limite de Deteco
Coomassie Blilliant Blue R 250
Mtodo Padro
300 1000 ng por banda
Coomassie Blilliant Blue R 250
Mtodo de mxima sensibilidade
50 100 ng por banda
Prata 1 10 ng por banda
Ponceau S (Membrana de NC e PVDF) 1000 2000 ng por banda

4) Transferncia para membrana
Embora seja essencialmente uma tcnica analtica, o SDS-PAGE somente no permite
a anlise de protenas individuais e separadas. Para que isso seja possvel necessrio utilizar
anticorpos especficos para a protena desejada, mas antes, preciso que essas protenas
estejam em um suporte slido, como membranas de nitrocelulose, PVDF ou de catinicas de
nylon. Essa transferncia das protenas do gel para a membrana inicialmente era feita por meio
da capilaridade, mas atualmente usa-se a transferncia eletrofortica que muito mais rpida e
eficiente (Figura 3).


Figura 3: Esquema representando a transferncia das protenas do gel de SDS-PAGE para a
membrana. Nota-se que utilizado um tampo de transferncia, e que as protenas migram do ctodo
para o nodo no aparato de transferncia.


Existem trs tipos de membranas usadas para western blotting: de nitrocelulose, nylon
ou PVDF (polyvinylidene fluoride). Diferentes protenas podem se ligar com eficincias
diferentes nessas membranas, e particulares eptopos antignicos podem ser melhor
preservados em um tipo em relao a outro. Os detalhes de cada tipo de membrana podem
ser visualizados na Tabela 2.
98

Tabela 2. Tipos de membranas utilizadas em experimentos de western blotting.

Tipo de Membrana Caractersticas
Nitrocelulose (NC)
Tamanho do poro 0,45m
Membrana mais utilizada em western blotting.
recomendada para protenas pequenas (Mr < 14.000).
As protenas ligam-se na membrana principalmente por
interaes hidrofbicas.
Nylon e membranas
carregadas
positivamente
Ligam as protenas fortemente por interaes eletrostticas.
Vantagem de ligar muitas vezes a diferentes anticorpos.
Desvantagem de no existir um procedimento simples para
manter as protenas imobilizadas na membrana e tambm de
bloquear stios desocupados da membrana fazendo com que
anticorpos liguem-se inespecificamente nessas regies,
resultando num alto background.
PVDF
(polyvinylidene
fluoride)
Forte interao interfacial (hidrofbica) com protenas.
Antes de transferir necessrio umedecer a membrana com
metanol.
Ligam-se com seis vezes mais fora em relao membranas
de nitrocelulose.

Depois de terminado o tempo de aplicao da corrente eltrica, usa-se um corante
denominado Ponceau S para confirmar a transferncia das protenas para a membrana, e
verificar se essa transferncia ocorreu de maneira igual para todas as amostras. Em caso
afirmativo, pode ser dada continuidade ao experimento de western blotting.



Figura 4: Membrana de Nitrocelulose corada com Ponceau S. Aps a transferncia de protenas
possvel visualizar que h menor quantidade de protena na segunda e quarta canaleta.

99

5) Deteco da protena especfica
Para visualizar uma protena de interesse utilizado um anticorpo especfico que vai
reagir com um eptopo da protena, formando um complexo anticorpo-antgeno. Esse anticorpo
denominado anticorpo primrio, pode ser policlonal (reconhece mais de um eptopo) ou
monoclonal (reconhece apenas um eptopo da protena de interesse) e produzido geralmente
em camundongo ou em coelho. Alm disso, esse anticorpo no possui nenhum tipo de
radiomarcao, ou conjugao com alguma enzima. A incubao da membrana com o
anticorpo primrio geralmente ocorre overnight a 4C e, depois disso, a membrana lavada
intensamente com tampo de lavagem para retirar todo o anticorpo que no est
especificamente ligado protena de interesse.
Depois da lavagem, a membrana incubada com um anticorpo secundrio. Esse
anticorpo um anti-IgG, ou seja, um anticorpo que reconhece um anticorpo. Por exemplo, se
foi utilizado um anticorpo primrio anti uma protena de interesse, produzido em camundongo,
ser utilizado um anticorpo secundrio anti-IgG de camundongo, que reconhecer qualquer
anticorpo produzido em camundongo. Esse anticorpo secundrio possui alguma modificao
que permitir a visualizao da protena de interesse. As principais modificaes utilizadas
atualmente so (Figura 4):
Conjugao do anticorpo com uma enzima: tais como peroxidade ou fosfatase alcalina.
Neste caso, no momento da revelao da membrana, adiciona-se um substrato dessa
enzima. Nos locais onde essa enzima est presente (apenas nos locais onde tem o
anticorpo primrio, ou seja, na protena especfica), ocorrer a reao e a formao do
produto dessa reao. utilizado um filme, e aparecer a marcao nas regies em
que ocorreu essa reao, permitindo localizar a protena de interesse.


Figura 5: Deteco da protena atravs da conjugao do anticorpo com enzima. A) Esquema
representativo de quimioluminescncia; B) Filme de western blotting revelado com quimioluminescncia.

Associao do anticorpo com um fluorforo: que ser posteriormente excitado com um
laser de comprimento de onda especfico para esse fluorforo, e ento as regies onde
o anticorpo se ligou sero evidenciadas.

A) B)
100

Figura 6: Deteco da protena atravs da associao do anticorpo com fluorforo. A) Esquema
representativo de fluorescncia; B) Scanning de western blotting revelado com fluorescncia.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

O grupo receber placas de cultura contendo as clulas H1703 G12V e H1703 T-RexB
tratadas ou no com o agente indutor da K-Ras oncognica (Doxiciclina) e/ou tratadas ou no
com o inibidor mittico (AI II), conforme o esquema abaixo.




1. Extrao e Quantificao de protenas

a) Protocolo de extrao de protenas totais

1. O grupo receber as placas de cultura, com clulas j previamente tratadas.
2. Descartar meio de cultura e lavar placa 2X com PBSA gelado para remoo de protenas do
meio.
3. Com um raspador, coletar clulas e transferi-las para um tubo de 1,5mL.
4. Centrifugar por 2 minutos a aproximadamente 3.000g, a 4C e descartar sobrenadante.
5. Ressuspender pellet de clulas em tampo de lise RIPA, com inibidores de fosfatase e
protease;
6. Centrifugar lisado velocidade mxima (aproximadamente 15.000g), por 20 min, a 4C.
7. Coletar o sobrenadante (extrato total de protenas).
8. Fazer pequenas alquotas e estocar a -80C.

b) Protocolo de quantificao de protenas totais pelo mtodo de Bradford.
O ensaio de Bradford ser realizado em placa de ELISA de 96 poos, consistindo num
volume final de 200 ul para cada poo da placa.

A) B)
101
1. Preparar curva padro com as seguintes concentraes de BSA: 0,125 ug/ul; 0,25 ug/ul; 0,5
ug/ul; 1,0ug/ul; 2,0 ug/ul; e 4,0ug/ul.
2. Pipetar 5ul de cada padro por poo, em triplicata.
3. Pipetar tambm 5ul de cada amostra por poo, em triplicata. O ideal diluir amostras
concentradas 10X antes da pipetagem, pois geralmente as mesmas se encontram muito
concentradas.
4. Aps aplicar as amostras de protena na placa, em triplicata, adicionar 195 ul de reagente
Bradford. Lembrar-se de aplicar o branco, no caso o tampo de extrao de protenas (seguir
mesma mistura que as protenas: 5 ul de tampo + 195 ul de reagente Bradford).
5. Incubar as amostras, por 5 minutos.
6. Efetuar leitura da absorbncia no comprimento de onda de 595nm em espectrofotmetro.
7. Construir curva de padronizao, com as concentraes de BSA na abscissa e as
absorbncias mdias na ordenada. Plotar no Excel, obtendo equao de ajuste linear.
8. Medir a absorbncia da amostra do extrato total de protena (mdia das triplicatas) e estimar
o valor da concentrao de protenas na amostra (varivel x) substituindo o valor da
absorbncia na equao linear resultante da curva padro (varivel y).

Para facilitar nosso trabalho, utilizaremos o mapa de placa abaixo para as pipetagens.



A determinao da concentrao de protenas fica muito facilitada com a construo de
planilhas no Excel j moldadas para insero dos dados e clculo dos volumes ideais para
loading em gel.



102
c) Preparo das amostras
Para que possam ser aplicas no gel, as amostras precisam ser previamente tratadas
com agentes redutores (B-mercaptoetanol), que separam as subunidades polipeptdicas das
protenas e denaturantes (SDS), que mascaram a carga total das protenas, tornando
possvel sua separao em virtude de seu peso molecular, exclusivamente, sem levar em
considerao o pI de cada protena.

1. Determinar o volume de amostra a ser pipetado no gel, correspondente quantidade de
protena que se deseja aplicar.
2. Adicionar tampo de amostra 3X (com B-mercaptoetanol e SDS) de modo a obter
concentrao final 1X.
3. Aquecer amostras a 100C por 10 minutos e transferi-las imediatamente para o gelo.


2. GEL SDS-PAGE

a) Preparo das Placas
Lavar com sabo neutro, enxaguar com gua corrente e depois lcool absoluto.
Deixar secar a temperatura ambiente.
Colocar a placa maior e menor juntas, com os espaadores internamente.
Introduzir as placas unidas dentro do suporte (verde), apoiando perpendicularmente sobre
a superfcie da bancada, e apertar as abas de presso.
Colocar o suporte na base apoiando a parte inferior na borracha cinza, e prender com a
presilha.
Marcar sobre a placa menor o limite entre o gel principal e o de empilhamento, 5,5 cm
acima da base.

b) Preparo do Gel de migrao e empilhamento

Solues 12% 15% 20% Empilhamento
gua MilliQ 4,7 mL 3,5 mL 1,5 mL 2,9 mL
Acrilamida 4,8 mL 6,0 mL 8,0 mL 520 l
2M Tris (pH 8,8) 2,24 mL 2,24 mL 2,24 mL ---
1M Tris (pH 6,8) --- --- --- 500 l
SDS 10% 120 l 120 l 120 l 120 l
TEMED 4 l 4 l 4 l 4 l
APS 10% 150 l 150 l 150 l 150 l

Deixar o TEMED e PSA no gelo antes de serem acrescentados. Acrescentar no momento
de montar o gel.

Aps depositar o gel de migrao, adicionar isopropanol utilizando pipeta at completar
altura de aproximadamente 0,5 cm acima da marcao.
Deixar polimerizar por aproximadamente 15 minutos
Eliminar o isopropanol lavando com gua destilada e secar com papel.
Adicionar TEMED e PSA no gel de empilhamento e despejar em cima do gel de
migrao.
Colocar o pente referente ao tamanho do espaador e polimerizar por 15 minutos.
Retirar o pente e transferir as placas para o suporte branco com a face da placa menor
voltada para o interior do suporte. Marcar a base dos pocinhos com caneta.
103
Introduzir o cassete montado dentro do rack e em seguida fechar as abas.
Lavar os pocinhos com tampo de corrida (tampo de corrida 1X e SDS 1%).

c) Corrida

Preencher a cuba com tampo de corrida.
Correr em 85 Volts at a amostra percorrer todo o gel de empilhamento
Passar para 125 Volts para correr pelo gel de migrao durante aproximadamente 60
min (o tempo de migrao relativo podendo variar de acordo com a concentrao do
gel de migrao e tamanho da banda de interesse).


3. Western blotting

a) Montagem do Sandwich
Cortar a Membrana de Nitrocelulose nas dimenses do gel. Cortar 6 papis Whatmann
(3MM) do mesmo tamanho (gerar a fora de capilaridade).
Umedecer a superfcie da plataforma inferior do Aparelho Transferidor com o Tampo
de Transferncia.
Encharcar 3 papis Whatmann em Tampo de Transferncia e acomod-los sobre a
superfcie do Aparelho Transferidor.
Hidratar a membrana em Tampo de Transferncia durante 2 minutos e coloc-la sobre
os papis Whatmann. Rolar levemente uma pipeta de vidro sobre o pr-sandwich para
eliminar possveis bolhas.
Desmontar a cuba de eletroforese e desacoplar as placas de vidro; com o auxlio de
uma esptula, separar as duas placas de vidro para retirar o gel. Molhar as pontas dos
dedos com o Tampo de Transferncia e transferir o gel para o sandwich depositando-o
sobre a membrana. Colocar os 3 papis Whatmann umedecidos sobre o gel e eliminar
as bolhas.
Umedecer a superfcie da plataforma superior do Transferidor e fechar o aparelho.

b) Transferncia
Aplicar uma corrente constante segundo as recomendaes do equipamento usado,
cerca de 120V por 80min.
Aps esse tempo, remover os papis Whatmann sem mover o gel e verificar se a
transferncia funcionou erguendo o canto do gel onde foi carregado o Marcador de
Peso Molecular.
Caso as bandas do Marcador de Peso Molecular no tenham sido transferidas para a
membrana, remontar o sandwich e continuar a transferncia por um perodo maior.
Caso tenha transferido, as bandas do Marcador sero bem visualizadas na membrana.
Transferir a membrana para um recipiente contendo gua destilada.
Enxaguar o excesso de sal e adicionar a Soluo Vermelha de Ponceau. Deixar agir
durante 15 segundos e recuperar a soluo. Enxaguar vrias vezes com gua destilada
at que as amostras em cada canaleta sejam visualizadas.
Enxaguar uma ltima vez com Tampo de Lavagem at que o Ponceau tenha
desaparecido completamente.

c) Bloqueio
Descartar a soluo do Tampo de Lavagem e adicionar um volume de Tampo de
Bloqueio suficiente para deixar o gel imerso.
Deixar a membrana bloqueando sob leve agitao (orbital) durante 30 minutos a 1 hora. O
tempo de bloqueio depende da especificidade de cada anticorpo primrio. Em todos os
casos, 1 hora pode ser o tempo inicial para testar anticorpos novos.
104
d) Incubao com o Anticorpo Primrio
Descartar a soluo do Tampo de Bloqueio e lavar 3X com TBST por 5 minutos cada
lavagem.
Adicionar 10 ml da Soluo do Anticorpo Primrio.
(200mg de BSA + 10mL de tampo de lavagem + Anticorpo)
O Anticorpo primrio deve ser diludo segundo as recomendaes do fabricante, porm
pode ser necessrio padronizar esta diluio.
Vedar o recipiente com veda-filme e incubar a membrana overnight (tempo ideal para
anticorpos novos) sob leve agitao orbital a 4
o
C. (Obs: pode incubar por um tempo
menor, devendo ser ajustado conforme o anticorpo).

e) Incubao com o Anticorpo Secundrio
Recuperar a Soluo do Anticorpo Primrio e lavar a membrana 3X com TBST por 5
minutos cada lavagem.
Adicionar 10mL da Soluo do Anticorpo Secundrio e incubara a membrana por 1h no
escuro.
Recuperar a Soluo do Anticorpo Secundrio e lavar a membrana 3X com TBST por 5
minutos cada lavagem.
Preparar a membrana para revelao.

f) Revelao e quantificao
Scanear a membrana no aparelho Odyssey (Licor) no comprimento de onda que excitar
o fluorforo associado ao anticorpo secundrio utilizado no experimento (700 ou
800nm).
Quantificar as bandas geradas com o software do prprio equipamento.


4. Solues

5X Sample buffer
Mix: 3.75g SDS (Lauryl Sulfate)
15 mL glycerol
2 mL azul de bromofenol 0,1%
2,5 mL Tris 1M pH 6,8
Add gua destilada para volume final 50 mL
Armazenar a 4C (ocorre a precipitao de SDS!!)

Tris 2M pH 8,8
242g Tris base em 700 mL de gua
Ajustar o pH em 8,8 com HCl concentrado e volume final para 1L

Tris 1M pH 6,8
121,14g Tris base em 700 mL de gua
Ajustar o pH em 6,8 com HCl concentrado e volume final para 1L

Tampo de Corrida 10X
Mix: 30,3g Tris base
144,1 Glicina
Volume final de 1L

Tampo Tris-Glicina 10X
Tris-Base (480nM): 29g
Glicina (390nM): 14,5g
gua para 500 mL

105
Tampo de Transferncia
Tampo Tris-glicina 10X: 20 mL
SDS 10%: 74 uL
Metanol: 40 mL
gua para 200 mL

Tampo Fosfato de Sdio 0,5M pH7,4
Soluo A (0,5M): 15,6g NaH
2
PO
4
-2H
2
O em 200 mL de gua
Soluo B (0,5M): 56,8g Na
2
HPO em 800 mL de gua
Ajuste o pH de B para 7,4 com a soluo A

Tampo de Lavagem
Tampo Fosfato 0,5M: 80 mL
NaCl 5M: 24 mL
Tween 20 5%:8 mL
Completar o volume para 800 mL

Tampo de Bloqueio
Leite em p molico: 1,5g
Tampo de Lavagem: ressupender para 30 mL
Este volume suficiente para bloquear 2 membranas.

Ponceau estoque
Ponceau S: 2g
cido tricloroactico: 30g
cido sulfosaliclico: 30g
gua para 100 mL
Diluir a soluo estoque (1 parte para 9 partes de gua) no momento do uso e descartar aps
usar.



106
Laboratrio de Biologia Celular e Molecular e Unidade de Ilhotas Pancreticas Humanas
Mari Cleide Sogayar (responsvel);
Aline Maia, Camila Leal Lopes da Silva, Carlos de Ocesano Pereira e Marina Trombetta Lima
(monitores)


Anlise da expresso relativa do RNA mensageiro CD90 em linhagens tumorignicas de
mama atravs da Tcnica de PCR quantitativo em tempo real


Introduo
O cncer de mama o tipo de cncer mais comumente detectado em mulheres de todo
o Mundo. Na maioria das pacientes, a causa de morte se deve, principalmente, doena
metasttica que pode se desenvolver a partir do tumor primrio (Allred et al., 2001). Uma das
hipteses estudadas atualmente que tenta explicar esta progresso tumoral e a recidiva aps o
regime quimioterpico, a teoria das clulas-tronco tumorais. Esta teoria compartilha
interesses comuns da rea da biologia de clulas-tronco e da biologia do cncer,
principalmente em um especfico tipo de proliferao celular chamada auto-renovao (He et
al., 2009). Por definio, esta populao celular, tambm chamada de clulas iniciadoras de
tumor, so responsveis tanto pelo desenvolvimento como pela manuteno e a
heterogeneidade celular do tecido tumoral (Campbell & Polyak 2007).
Em 2003, Al-Hajj e colaboradores demonstraram que, na maioria dos carcinomas
mamrios, havia uma pequena sub-populao de clulas do tumor, definida como
CD44+/CD24- que era capaz de sustentar o crescimento do tumor mamrio em camundongos
imunocomprometidos NOD/SCID. Tambm observaram que o tumor formado a partir dessa
sub-populao apresentava diversos tipos celulares, que reproduziam a heterogeneidade
fenotpica do tumor inicial (All-Hajj et al., 2003). Embora este estudo vem sugerindo que as
clulas-tronco tumorais de mama podem ser representadas pelo fentipo CD44+/CD24-, outros
trabalhos vem questionando o valor clnico destes marcadores enfatizando que este fentipo
no um padro universal de clulas-tronco tumorais mamrias e outros marcadores precisam
ser identificados (Abraham et al., 2005; Mylona et a., 2008; Ahmed et al., 2011).
Em busca de novos marcadores que possam estar relacionados com o grau de
malignidade, nosso grupo analisou a expresso de diversos marcadores de clulas-tronco em
linhagens de cncer de mama com diferentes graus de malignidade. Atravs deste trabalho,
foram identificados dois marcadores distintos que esto diferencialmente expressos entre as
linhagens analisadas. Foi observado que o CD90 est mais expresso nas linhagens mais
malignas, enquanto o CD14 apresenta uma maior expresso na linhagem no tumorignica
(Lobba et al., 2012).
Com intuito de investigar essa expresso diferencial nas linhagens tumorignicas, esse
curso ir abordar a tcnica de PCR quantitativo em tempo real para analisar a expresso
relativa do RNA mensageiro do marcador CD90 no modelo de cncer de mama.


PCR Quantitativo em Tempo Real (Real Time PCR)
Quantificao Relativa


Conceito
O PCR Quantitativo em Tempo Real resultado do refinamento do mtodo de Reao
em Cadeia da Polimerase (PCR) descrito por Kary Mullis em 1985 (Saiki et al, 1985), pelo qual
Mullis recebeu o Prmio Nobel de Qumica em 1993. A tcnica de PCR tornou possvel a
manipulao de pequenas quantidades de DNA (por exemplo clonagem, engenharia gentica,
sequenciamento). Entretanto, o uso do PCR como mtodo analtico limitado, pois a
quantidade de produto gerado numa reao a mesma a partir de diferentes quantidades
iniciais de molculas de DNA. Essa limitao foi resolvida em 1992 por Russel Higuchi, quando
ele desenvolveu o mtodo de deteco da quantidade gerada de produto simultneo sua
sntese (Higuchi et al, 1992).
107



Aplicaes
Esta tcnica utilizada para diversas aplicaes, incluindo quantificao de partculas
de bactrias, fungos, vrus e identificao de mutaes ou Polimorfismos de Base nica (SNP)
(Valasek, M and Repa, J. 2005). Por outro lado, as aplicaes mais frequentemente utilizadas a
partir dessa tcnica so a quantificao absoluta e a quantificao relativa da expresso
gnica.
A quantificao absoluta visa calcular o nmero exato de molculas de um determinado
transcrito alvo em qualquer situao, inclusive na ausncia de um gene normalizador. Esta
quantificao utiliza como referncia uma curva de calibrao gerada a partir de diluies
seriadas de uma quantidade inicial conhecida da molcula alvo. Essas curvas padres podem
ser construdas a partir de concentraes conhecidas de molculas de DNA, por exemplo, DNA
plasmidial recombinante, DNA genmico, produtos de PCR (RT-PCR ou PCR comum) e
oligonucleotdeos sintetizados comercialmente. As curvas de calibrao so altamente
reprodutveis e permitem a gerao de dados especficos e sensveis.
A quantificao relativa baseia-se na anlise comparativa da expresso gnica de uma
molcula alvo em situaes diferentes (por exemplo, controle e tratado) em relao a um
controle interno de referncia (gene normalizador). Como gene de referncia usa-se um
normalizador de expresso constitutiva (housekeeping gene), para o qual no se espera
mudanas na expresso nas condies experimentais que se deseja testar. Expressamos esta
mudana de expresso do gene de interesse como Fold Change, de uma condio
experimental em relao outra, tomando-se como referncia o gene controle. Um exemplo
a quantificao relativa de um gene supressor de tumor entre clulas normais e tumorais;
depois de analisar os dados, obtm-se a expresso relativa do gene entre essas duas
amostras.

Princpios
A reao de PCR em tempo real semelhante de PCR comum, no qual h vrias
ciclagens de 3 passos bsicos: (1) desnaturao do cido nuclico; (2) anelamento dos
primers; (3) ao da enzima de polimerizao. A diferena que so utilizados na reao de
PCR em tempo real compostos fluorescentes (ver detalhes abaixo) que permitem a deteco
do acmulo de produtos amplificados (alvos) em tempo real.
Nos ciclos iniciais do PCR quantitativo, ocorre pouca mudana no sinal de
fluorescncia. Esse sinal considerado basal (baseline) no grfico de amplificao. Um
aumento na fluorescncia acima desse nvel basal indica a deteco do alvo acumulado. Um
valor fixo de corte para a fluorescncia determinado e chamado de threshold, e est acima
desse valor considerado basal. O parmetro Ct (threshold cycle) definido como o nmero de
ciclos necessrios para que a fluorescncia ultrapasse o threshold, que ser sempre
inversamente proporcional quantidade existente de alvo. Esse valor de Ct est localizado na
faixa de amplificao exponencial da PCR.

108
Mecanismos de Deteco
Atualmente a fluorescncia o mtodo exclusivo de marcao desta tcnica. Tanto
sondas especficas como corantes no especficos esto disponveis no mercado. Inicialmente,
o prprio brometo de etdio era utilizado para quantificao, entretanto, foi visto posteriormente
que ele interferia na reao de PCR. Atualmente os corantes mais utilizados so o SYBR
Green e BOXTO, que se tornaram extremamente populares (Figura 1). Esses corantes
praticamente no possuem fluorescncia quando esto livres em soluo, mas quando na
presena de DNA dupla fita eles se intercalam entre as bases nitrogenadas e emitem alta
fluorescncia.



Figura 1: Estrutura qumica dos corantes mais utilizados em PCR em Tempo Real. O painel a esquerda
mostra a estrutura do SYBR Green, e a direita mostrada a estrutura do BOXTO.



O SYBR Green, por exemplo, um corante que possui afinidade pelo sulco menor da
dupla fita de DNA. Quando no est ligado ao DNA, emite uma pequena fluorescncia no
comprimento de onda de 520nm, entretanto quando se liga dupla fita de DNA, a fluorescncia
aumenta cerca de 100x, permitindo a deteco do produto de PCR em tempo real durante cada
ciclo de amplificao (Figura 2).



Figura 2: Representao esquemtica da deteco de produtos de PCR amplificados com SYBR Green.
As linhas horizontais compostas com traos verticais representam as fitas do DNA com suas bases
nitrogenadas. Losangos em preto representam o corante no ligado ao DNA com baixa emisso de
fluorescncia. Losangos em verde representam o corante intercalado ao DNA dupla fita com mxima
emisso de fluorescncia. Est representado o comportamento do corante durante os ciclos de
amplificao: desnaturao, anelamento e extenso.


109

Uma das vantagens do uso destes corantes o baixo custo; entretanto, este mtodo
detecta qualquer molcula de DNA dupla fita presente em sua amostra, incluindo produtos de
PCR esprios e dmeros de primers. Para confiar nos resultados necessrio analisar a curva
de dissociao dos primers, onde pode-se analisar a Tm do produto de PCR.
Primers e sondas marcadas so sistemas de deteco que conferem maior
especificidade s medidas. O exemplo mais utilizado destes sistemas de deteco so as
sondas do tipo TaqMan. Estas sondas possuem um par de fluorforos, um doador e outro
aceptor, onde o fluorforo doador excitado e transfere esta energia para a molcula aceptora.
Geralmente a molcula aceptora do tipo quencher, que captura a energia no permitindo a
deteco da florescncia quando prxima a molcula doadora. A distncia entre a molcula
doadora e a aceptora/quencher na sonda TaqMan intacta impede a emisso de fluorescncia
pelo fluorforo doador, mesmo quando a sonda est hibridizada com o seu DNA alvo.
Entretanto, durante a amplificao a enzima DNA polimerase degrada a sonda separando o
fluorforo doador do quencher permitindo assim a emisso de sinal (Figura 3).



Figura 3: Mecanismo de deteco baseado na sonda TaqMan. A sonda TaqMan tem 2 marcadores
denominados reprter e quencher, que quando esto juntos no emitem fluorescncia. Quando ocorre a
amplificao da regio da sonda, ela degradada pela atividade exonuclesica 5-3 da DNA Polimerase,
resultando na separao dos marcadores reporter e quencher e na emisso de fluorescncia (o reprter
longe do quencher emite fluorescncia a 520nm).



Este mecanismo de deteco tem como vantagem a especificidade e a possibilidade de
quantificar a expresso de vrios genes ao mesmo tempo, com sondas diferentes (multiplex).
Como desvantagens, esto o alto custo e a padronizao, pois precisa apresentar baixo rudo
de fluorescncia (background), alta fluorescncia quando ligada ao alvo e alta especificidade.

O template
No caso da utilizao dessa tcnica para quantificao da expresso gnica, o template
da reao consiste em cDNA, que sintetizado a partir do RNA atravs da reao de
transcrio reversa. Esta reao converte o RNA, que pouco estvel e muito sensvel a altas
temperaturas presentes na reao, em uma molcula de DNA dupla fita, mais estvel e
permissiva a reao PCR.


110
Os primers
Na reao de PCR em tempo real, os primers utilizados necessitam de uma ateno
especial. Assim como no PCR convencional, eles tambm necessitam ser especficos para a
sua sequncia, o que pode ser verificado por busca de similaridade com o programa Blast
(disponvel no site do NCBI). Porm, esses primers devem seguir alguns parmetros
especficos: (1) no devem formar dmeros; (2) a sequncia amplificada deve ser entre 70-
150pb; (3) devem apresentar temperaturas de anelamento entre 58
o
C e 60
o
C; (4) o contedo
de CG deve ficar entre 30-80% e (5) quando possvel, o par deve estar ancorado em exons
distintos do transcrito a fim de evitar uma eventual co-amplificao de DNA genmico, um
contaminante residual da extrao do RNA. Geralmente utilizam-se programas para o desenho,
como o Primer Express version 3.0 (Applied Biosystems) ou o Primer3
(http://frodo.wi.mit.edu/).
A concentrao dos primers a serem utilizados deve ser determinada
experimentalmente. Para isso, reaes contendo primers variando entre uma concentrao
final mxima de 800nM e mnima de 50nM devem ser realizadas usando como molde uma
mistura de cDNAs provenientes de diversas linhagens e/ou tecidos celulares. Desta forma,
possvel determinar a menor concentrao final de primers que no limite sua PCR e que no
resulte na formao de dmeros, sem que haja variao no valor do Ct e no perfil das curvas de
amplificao do gene em relao s maiores concentraes analisadas. Na figura 4 temos um
exemplo de resultado desse teste.



Figura 4: Padronizao da concentrao final de primers para um determinado gene em uma reao de
PCR em tempo real. A figura mostra que concentraes entre 200 e 400nM so limitantes para a reao,
visto que com 600nM e 800nM os Cts observados so menores. Nos painis menores est representado
individualmente cada resultado obtido com uma determinada concentrao de primers. A linha azul
representa o threshold estabelecido arbitrariamente. A partir da interseco deste com a curva de
amplificao obtido o Ct.


Um outro parmetro a ser testado antes da utilizao de um par de primers em
experimentos de expresso gnica a determinao da eficincia de amplificao do produto.
Nos experimentos de quantificao relativa muito importante que a eficincia de amplificao
do controle endgeno (housekeeping gene) seja semelhante eficincia de amplificao do
gene de interesse que se quer quantificar.

111
Para determinao da eficincia de amplificao dos primers, so realizadas reaes de
amplificao contendo os primers numa concentrao ideal e uma diluio em srie do
template. A anlise de regresso linear dos valores de Cts em funo do logaritmo da
respectiva diluio fornece o coeficiente angular da reta (a, em y = ax+b) que utilizado para o
clculo da eficincia de amplificao do produto pelos primers, utilizando a seguinte frmula:


10
1
angular e coeficient
Ef

100 1 (%) Ef Ef




A quantificao
Como dito anteriormente, a reao de PCR em tempo real semelhante a de um PCR
convencional, apresentado abaixo:



Figura 5: Representao de uma reao de PCR, mostrando a amplificao da sequencia especfica
com os primers nos ciclos iniciais.


A reao composta de uma temperatura inicial de desnaturao, geralmente 95C,
para separar a dupla fita de cido nuclico. Ento se segue repeties de 3 passos, que
consiste de uma temperatura de desnaturao, anelamento dos primers e ao da enzima de
polimerizao. Esses 3 passos so repetidos por 35-45 vezes, com a temperatura e o tempo
variando de acordo com as amostras. Isso proporciona um aumento exponencial da sequencia
desejada, sendo que a partir de uma nica molcula de cido nuclico, no final de uma reao
com eficincia de 100% e de 35 ciclos, teremos 2
35
molculas do mesmo cido nuclico.
Durante a reao de PCR em tempo real, esse acmulo de molculas de DNA dupla fita
proporciona um aumento da fluorescncia emitida pelo composto fluorescente, tanto no caso
do SYBR Green quanto das sondas TaqMan. No incio da reao, a intensidade desta
fluorescncia baixa, pois a quantidade de molculas dupla fita marcadas insuficiente para
superar o limite de deteco, sendo chamada de fluorescncia basal (baseline). Com a
progresso da reao e o aumento da quantidade de molculas dupla fita, o aumento da
fluorescncia chega a um nvel que pode ser detectado de forma confivel e utilizado para
anlise.

112
Em uma reao de PCR em tempo real h um parmetro essencial para sua anlise,
que chamada de Ct (cicle threshold). Esse parmetro consiste na determinao do ciclo de
amplificao em que a fluorescncia emitida pela amostra deixa de ser considerada basal e
passa a ser detectada de forma confivel (Figura 6). Esse dado utilizado para calcular a
expresso relativa de amostras e inversamente proporcional a quantidade inicial de
molculas de DNA alvo, isto , quanto menor o Ct maior a expresso de determinado gene.



Figura 6: Representao de uma reao de PCR em tempo real, na qual esto mostrados os Cts de
diferentes amostras em relao ao threshold.

Outro parmetro essencial e de extrema importncia quando se faz a deteco
utilizando SYBER Green chamada de curva de dissociao, que realizada aps a
amplificao. Para obter esta curva, a temperatura da amostra elevada gradativamente e a
intensidade da fluorescncia medida. Quando a temperatura da amostra atinge a temperatura
de desnaturao (Tm) do produto amplificado, o mesmo se desnatura e o corante se dissocia
do DNA, diminuindo a intensidade da fluorescncia detectada pelo aparelho. A partir da
derivada dos dados de fluorescncia as curvas de dissociao dos produtos so geradas.
Como produtos de diferentes tamanhos e composio de bases apresentam diferentes Tms,
esta curva possibilita a distino entre diferentes produtos amplificados na reao, a presena
de amplificao no controle negativo e a formao de dmeros de primers. A figura 7 ilustra os
resultados que devem ser obtidos nessa anlise.




Figura 7: Curva de dissociao. O painel da esquerda representa uma curva de dissociao que
apresenta um s pico (correspondente ao Tm do produto), podendo-se inferir que houve a deteco de
fluorescncia de somente um fragmento dupla fita. O painel da direita mostra uma curva de dissociao
com 2 picos, inferindo que alm do seu gene alvo houve a deteco de fluorescncia de outra molcula
dupla fita, podendo ser um dmero de primers ou mesmo uma amplificao inespecfica. Nestes grficos,
a fluorescncia (y) dada em unidades arbitrrias e a temperatura (x) em C.

113
Controle endgeno
Como possvel dizer se uma amostra tem uma expresso maior de determinado gene
do que outra, se no utilizarmos um normalizador? Pode ser que a quantidade total de RNA de
dada amostra esteja maior, de forma global, e isso levaria a um resultado falso. Ento
utilizamos a anlise da expresso de genes endgenos, cuja expresso no deve variar entre
as amostras que se quer comparar. Estes genes housekeeping possuem funo essencial e
constante nas clulas, como respirao, metabolismo basal, ou fazem parte do citoesqueleto.
Eles variam pouco de acordo com o tipo, funo, e estado fisiolgico da clula. Antes de iniciar
seu experimento, voc deve testar uma srie de genes endgenos e utilizar os mais estveis.

Anlise quantitativa da expresso relativa
De posse dos valores de Cts, inicialmente calculada a mdia dos Cts das rplicas
tcnicas (normalmente triplicatas). Dado que a expresso de um gene analisada em funo
da expresso de gene controle ( Ct), e tambm em relao a uma amostra que tomada
como referncia (situao controle), calcula-se ento a diferena entre a Mdia dos Cts da
amostra referncia e a Mdia dos Cts da amostra estudada. Essa diferena definida como
Ct. O clculo do CT ser utilizado em uma frmula para o clculo final da diferena de
expresso dos genes entre as amostras analisadas, e representado como Fold-Change.
Esse mtodo foi desenvolvido por Michael Pfaffl, em 2001. Finalmente, os valores obtidos de
diferentes rplicas experimentais ou biolgicas (normalmente 3) so comparados por testes
estatsticos (como o teste student t) para avaliar se as diferenas observadas so ou no
significativas.

Procedimentos experimentais
A tcnica de Real Time PCR uma das metodologias mais sensveis para a deteco
de molculas de RNA, DNA ou cDNA, e atualmente capaz de detectar menos de 10
molculas alvo por reao. Por isso cuidados especiais necessitam ser tomados para evitar
problemas na reao e na deteco dos resultados. Estes cuidados esto listados abaixo.
Utilizar sempre luvas sem talco;
Utilizar placas e tampas ticas, e evitar ao mximo o contato com a superfcie das
tampas (a leitura da fluorescncia realizada de cima para baixo);
Utilizar ponteiras com filtro para minimizar possveis contaminaes cruzadas
provocadas pela pipeta;
Em cada placa colocar sempre amostras controles sem template (NTC non template
control) para cada um dos primers e amostras de RNA no transcritas reversamente (NRT
control) para cada cDNA analisado.

Coleta de clulas (feita previamente pelos monitores)
O grupo receber 3 pellets de clulas (MCF10-A, MCF7 e Hs578-T) e ter o objetivo de
avaliar a expresso do CD90 nestas clulas. Todos os pares de primers utilizados neste
experimento apresentam eficincia de amplificao semelhante (j padronizado).
As clulas foram cultivadas em placas P100, e aps atingirem a confluncia o meio foi
retirado, lavadas 2X com PBSA e descoladas da placa com auxilio de tripsina-EDTA. As clulas
foram centrifugadas a 2000 RPM por 5 minutos, coletadas em eppendors de 1,5mL e
congeladas a -80C.

Extrao de RNA
O pellet celular coletado ter o RNA extrado com TRIZOL (Invitrogen). Por se tratar de
RNA, deve-se tomar muito cuidado com sua manipulao, para evitar contaminao com
RNAse e degradao do RNA, trabalhando sempre com a amostra em gelo e o mais rpido
possvel.

114

Procedimentos:

Todos os procedimentos devem ser realizados com material RNAse free!
Limpar a bancada e pipetas antes de iniciar o procedimento (hipoclorito 1%, H
2
O, etanol 70%).
Ajustar a centrfuga para 0C.

Extrao:
1. Recuperar da cultura at 5x10
6
clulas e lavar com PBS; (j fizemos)
2. Ressuspender o pellet com PBS e centrifugar 2000 rpm por 5 min; (j fizemos)
3. Descartar o sobrenadante e adicionar 1mL de TRIZOL;
4. Incubar por 5 min T.A;
5. Adicionar 200uL de clorofrmio/tubo;
6. Inverter os tubos vigorosamente por 15s (pode usar o vortex). Incubar por 3 min T.A;
7. Centrifugar 12200g por 15 min 0C;
8. Pegar a fase aquosa cuidadosamente (~450uL) e transferir p/ novo tubo 1,5uL;
Nota: prefervel deixar sobrar fase aquosa a chegar muito perto da interfase branca
que se forma nessa etapa, pois nela se encontra o DNA genmico. Assim, para evitar
uma contaminao grande, prefervel deixar sobrar da fase aquosa.

Precipitao:
9. Adicionar 500uL de isopropanol. Misturar por inverso;
10. Incubar por 10 min T.A;
11. Centrifugar 12200g por 10 min 0C;
12. Remover o sobrenadante;

Lavagem e eluio:
13. Adicionar 1mL de etanol 75%. Misturar por inverso;
14. Centrifugar 7500g por 5 min 0C;
15. Remover o sobrenadante, com cuidado, pois o pellet est solto nessa etapa!
16. Deixar os tubos abertos para secar o pellet de 5 10 min, T. A. (cuidado para no
deixar secar totalmente se no o RNA no ir ressuspender);
17. Ressuspender o pellet em 100L de gua RNAse free, pr aquecida a 50C;
18. Deixar no banho por 3 min a 50C para ressuspender totalmente o RNA;
19. Purificar as amostras de RNA com o kit RNAspin mini (GE Healthcare), seguindo as
instrues do fabricante;
20. Quantificar no NanoDrop a 260 e 280nm;
21. Guardar no -80C at a utilizao.

115
Reao de transcrio reversa (Improm Reverse Transcriptase, Promega)


1. Tratar 1g RNA total (volume final mximo de 5,5L) com DNase I:
Reagente Concentrao
Estoque
Volume/Reao
MgCl
2
*
25mM 2L
RNase OUT 40U/L 0,5L
DNase I 1U/uL 2L

2. Incubar a 37 C por 10min e por 75 C por 5min.
3. Para cada amostra de RNA tratada com DNaseI adicionar 3L do seguinte MIX:
Reagente Concentrao
Estoque
Volume/Reao
dNTP 10mM 1L
Oligo dT 500g/mL 1L
gua - 1L

4. Incubar a 65 C por 10min e depois colocar imediatamente as amostras no gelo.


5. Adicionar 6 L do Mix da enzima por amostra:
Reagente Concentrao
Estoque
Volume/Reao
Buffer 5x 5x 4L
DTT 0,1M 1L
RNase OUT 40U/ul 40U/L 0,5L
Enzima ImProm II 1L
H
2
O - 0,5L

6. Incubar:
25 C por 10min
42 C por 2h
75 C por 15min

7. Adicionar 1L de RNase H por tubo.
8. Incubar a 37 C por 30min e a 72 C por 10min.
9. Diluir a amostra em 1:3 adicionando 40L de gua ou TE.


Reao de Real Time PCR:
Aps a sntese de cDNA iremos fazer o PCR em tempo real, cada amostra em triplicata
(rplica tcnica), utilizando o aparelho ABI 7300, e o mtodo de deteco com SYBR Green. O
master mix SYBR Green (Applied Biosystems) j contem a enzima polimerase, o seu tampo e
o fluorfilo para deteco. Alm do transcrito do gene de interesse, ns amplificaremos o
transcrito de um gene housekeeping (controle endgeno, GAPDH). A concentrao de primers
j foi padronizada anteriormente para cada transcrito e ser de 400nM. O protocolo utilizado
ser o seguinte:

Reagente Quantidade
cDNA 3uL
SYBER Green 6uL
Primer (1.6M) 3uL
Total 12ul


116
1. Antes de comear faa um mapa da sua placa, informando a sequncia de amostras e
primers;
2. Primeiro adicione os 3uL de cDNA j diluido no fundo de cada poo da placa;
3. Adicione os 3uL dos primers na lateral do poo, evitando contato com o cDNA do fundo;
4. Adicione os 6uL do master mix SYER Green na outra lateral da placa, evitando
novamente contato com o cDNA e com os primers;
5. Utilize 3 poos para as amostras NTC (para cada par de primers);
6. Vede a placa com o plstico adequado;
7. Centrifugue brevemente a placa;
8. Leve imediatamente a placa ao aparelho de real time PCR;
9. A condio de ciclagem utilizada ser: 50
o
C por 2min (etapa de ativao da enzima
Uracil N-Glicosilase, AmpEraser), 95
o
C por 10min (etapa de ativao da enzima DNA
Polimerase), 40 ciclos de 95
o
C de 15seg (etapa de desnaturao) e 60
o
C por 1min
(etapa de anelamento dos primers e extenso dos produtos).

Anlise dos resultados obtidos das reaes de Real Time PCR
Faa todas as anlises necessrias, com auxilio do monitor para determinar:
Se as amplificaes para cada transcrito foram especificas;
Se existe contaminao residual com DNA genmico em alguma amostra;
Se existe contaminao nos primers ou na mistura de reao;
Determine se houve expresso diferencial do transcrito de interesse entre as amostras
recebidas;
Determine o valor dessa diferena de expresso, em Ct e em fold-change entre as
amostras;
Determine a significncia estatstica das diferenas observadas.

Como calcular o Ct
Ser feita utilizando sistema delta delta Ct, desenvolvido por Michael Pfaffl em 2001, no
qual admite-se que o amplicon tem um tamanho mximo de 150pb e que a eficincia da reao
foi prxima de 100%. Nela se analisa a expresso do gene alvo da amostra 1 em relao a
amostra 2, corrigida pela expresso do gene endgeno.




Onde: Ct,X do gene de interesse de estudo, enquanto Ct,R do gene endgeno utilizado. O
control a amostra utilizada como referencia; e o Test a utilizada para ver a variao na
expresso do gene em questo.

117
Exemplo
Tem-se 2 amostras de cultura primria de tecido heptico murino, de um animal normal
e um tratado com aflatoxina. Deseja-se medir a expresso do gene supresssor de tumor p53 e
do oncogene c-myc, utilizando como controle endgeno GAPDH. Como resultado foi obtido os
valores abaixo:

Animal normal
Gene Ct mdio
53 27,7
c-myc 25,2
GAPDH 30,1

Animal tratado
Gene Ct mdio
53 32,4
c-myc 23,1
GAPDH 31,0

Ento:
Para o p53:
Tratado/Normal: 2
(30,1-27,7)-(31,0-32,4)

Tratado/Normal: 2
(2,4)-(-1,4)
Tratado/Normal: 2
(3,8)
Tratado/Normal: 13,92

Para c-myc:
Tratado/Normal: 2
(30,1-25,2)-(31-23,1)
Tratado/Normal: 2
(4,9)-(7,9)
Tratado/Normal: 2
(-3)
Tratado/Normal: 0,125

Referncias:
Abraham BK, Fritz P, McClellan M, Hauptvogel P, Athelogou M, Brauch H. Prevalence of
CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor
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118



D
Expresso Gnica

119
Laboratrio de Fisiologia molecular de plantas.
Prof. Dr. Carlos Takeshi Hotta (responsvel);
Gustavo Antnio TeixeiraChaves (monitor).

Experimento: Media da atividade promotora usando LUCIFERASE


Introduo

Uma maneira de se estudar alteraes nos nveis de transcrio de um gene atravs
da sua atividade promotora (apesar da concentrao de um trnacrito tambm depender da sua
taxa de degradao). Uma estratgia para se medir a atividade promotora a utilizao de
genes reprteres controlados pelo promotor do gene a ser estudado. Exemplos de reprteres
so a GFP (GREEN FLUORESCENT PROTEIN), o GUS ( -GLUCORONIDASE) e a LUC
(LUCIFERASE).
A GFP uma protena clonada de uma gua-viva (Aequoreavictoria). Esta protena
capaz de emitir uma fluorescncia verde (EM: 509 nm) quando estimulada com luz ultra-violeta
(EX: 395 nm). A GUS uma protena clonada de bactrias (Escherichia coli) com atividade
enzimtica inespecfica que converte um acar solvel em um acar insolvel de cor azul.
Por fim, a LUC a protena responsvel pela luz esverdeada emitida pelos vaga-lumes
(Photinuspyralis). A LUC emite luz ao quebrar luciferina.
Um dos problemas de se utilizar reprteres que a sua observao pode causar danos
ou at destruir o material estudado. Para se detectar a GFP, necessrio submeter a amostra
a luzes que podem estimular o modelo biolgico ou causar fotodano. J o precipitado criado
pela GUS pode matar as clulas e muitas vezes necessrio retirar outros pigmentos, como a
clorofila, para observ-lo. Neste critrio, a LUC se destaca por produzir luz com uma qualidade
e quantidade que causa poucos danos ao modelo biolgico, alm de ter pouco impacto em seu
metabolismo.
A reao qumica catalisada pela LUCIFERASE tem duas etapas:

Luciferina + ATP ->luciferiladenilato + PPi

Luciferiladenilato + O2 ->oxiluciferina + AMP + luz




Tubo fotomultiplicador (Wikipedia)

A luz produzida pela LUCIFERASE geralmente muito fraca para ser vista a olho nu,
por isso utilizamos equipamentos especiais capazes de quantificar quantos ftons so emitidos
pela sua atividade enzimtica. A base parte destes equipamentos um tubo fotomultiplicador
(PMT). Quando um fton atinge o PMT, um eltron produzido. Este eltron percorre o tubo se
colidindo com placas chamadas dinodos. A cada coliso, mais eltrons so liberados,
120
amplificando o sinal at atingir valores mensurveis. Este basicamente o princpio por trs de
equipamentos que detectam luz, como o espectrofotmetro. No caso do espectrofotmetro,
possvel fazer alteraes para que se mea somente a luz emitida pela LUCIFERASE. A este
equipamento chamamos de luminmetro. Atualmente existe uma cmera capaz de contar
ftons. Esta cmera consiste em milhares de PMTs organizados em paralelos a fim de formar
uma imagem.
Um exemplo de uso de LUCIFERASE em pesquisas cientficas a medio de ritmos
circadianos em plantas. Arabidopsis thaliana foram transformadas com o gene da
LUCIFERASE sob o controle de um promotor de CHLOROPHYLL A/B BINDING PROTEIN2
(CAB2). CAB2 uma protena que se liga clorofila, mantendo-a estvel durante o processo
de coleta de luz na fotossntese. CAB2 controlada pelo relgio biolgico, o que pode ser
observado pelos ritmos com perodo de 24 h quando estas plantas so mantidas em luz
constante. Para se medir a luminescncia da LUC, a luz presente na cmara escura onde as
plantas esto sendo medidas se apaga momentaneamente.


Arabidopsis transformada com CAB2:LUC. O ritmo de luminescncia, obtido utilizando uma
cmera contadora de ftons, indica a atividade promotora de CAB2, gene associado
fotossntese.


Proposta Experimental

Arabidopsis thaliana transformadas com CAB2:LUC ou CCA1:LUC com 8 a 10 dias de
idade, sero disponibilizadas para se fazer 2 experimentos associados ao relgio biolgico em
plantas.
O relgio biolgico uma rede de sinalizao que codifica informao temporal[1]. Esta
informao pode ser utilizada pelo organismo para antecipar alteraes peridicas em
condies ambientais ambiente, aumentando o seu valor adaptativo.De forma geral, o relgio
composto de vias de entrada, vias de sada, e de um oscilador central, responsvel pela
manuteno da fase e do perodo do relgio. As principais vias de entrada de informao para
o oscilador central so respondem a luz e temperatura. As informaes geradas sero usadas
para sincronizar o relgio com as variaes rtmicas do ambiente, ajustando a fase de
respostas e mantendo perodos circadianos[1]. O oscilador central exerce controle sobre
processos fisiolgicos de diferentes formas: controle da estrutura da cromatina, mudanas na
estabilidade de mRNAs e protenas, splicing alternativo e regulao no nvel de transcritos.
O relgio biolgico tambm pode aumentar a adaptao das plantas atravs do gating,
um mecanismo que afeta como a planta responder a um estmulo de acordo com o horrio do
dia[1]. Dessa forma, um estmulo de mesma intensidade dado em diferentes horas do dia
provocar respostas de diferentes intensidades ou at mesmo diferentes respostas. O
gatingfavorece as plantas ao permitir que as mesmas respondam a uma grande variedade e
intensidade de sinais ambientais de acordo com o contexto temporal.
121



Arabidopsis thaliana pode ser transformada com diversos reprteres luminescentes diferentes e
uma cmera contadora de ftons pode ser usada para medir a sua luminescncia.

a) O controle do relgio biolgico sobre a expresso de CAB2 e/ou CCA1

O objetivo deste experimento medir o controle do relgio biolgico sobre a atividade
promotora de CCA1 e/ou CAB2. Placas de cultura (meio Murashige&Skoog) contendo
Arabidopsis thaliana CCA1:LUC ou CAB2:LUC sero mantidas por 10 dias em um fotoperodo
de 12 h luz/ 12 h escuro e sero transferidas para luz constante no incio do experimento. Por
dois dias antes do experimento, elas recebero gotas de 100 M luciferina no mesmo horrio
do dia. Isto ir garantir que as clulas tero luciferina o suficiente para o resto do experimento.
As plantas sero transferidas para a cmara escura que contm a cmera contadora de ftons
e a luminescncia ser medida por 25 minutos a cada 2 horas por 72 horas ou mais.

b) O controle do relgio biolgico sobre a resposta de CAB2 e/ou CCA1 a
estmulos externos

O objetivo deste experimento verificar se estmulos ambientais como frio, sal, aumento de
osmolaridade, hormnios ou drogas afetam a atividade promotora de CAB2 e/ou CCA1. Se a
resposta for positiva, tambm verificaremos se o relgio biolgico afeta a intensidade desta
repsosat ou no. Para isso, deixaremos as plantas por pelo menos 12 h em 100 M luciferina
em placas de 96 pocinhos. A placa ser transferida para um luminmetro de placa que injetar
o estmulo desejado automaticamente. Faremos este experimento em dois perodos do dia
para verificar se o horrio do dia interfere na resposta aos estmulos.


Referncias:

Hotta CT, Gardner MJ, Hubbard KE, Baek SJ, Dalchau N, et al. (2007) Modulation of
environmental responses of plants by circadian clocks. Plant, cell & environment 30:
333-349.
122
Laboratrio de Bioqumica, Biologia Molecular e Genmica de Microorganismos
Profa. Dra. Aline Maria da Silva (responsvel),
Paulo A. Zaini, Joaquim M. Junior, Ana Paula S. de Souza, Paulo M. Pierry (monitores)

Experimento: Anlise da abundncia de transcritos por RT-qPCR




1. Introduo

RT-qPCR (PCR quantitativa precedida de transcrio reversa) uma metodologia
robusta e poderosa para quantificao da expresso de um ou mais genes gnica atravs da
quantificao relativa da abundncia de seus respectivos transcritos em amostras de RNA total
extrados de clulas ou tecidos. A tcnica consiste em uma reao de PCR quantitativa
(qPCR) ou PCR em tempo real em que se utiliza como molde cDNA sintetizado a partir da
amostra de RNA total atravs da reao de transcrio reversa.
O experimento de RT-qPCR que ser realizado tem como objetivo avaliar a expresso
do transcrito de um gene que codifica uma adesina de superfcie na bactria Xylella fastidiosa.
Essa bactria se utiliza de diversas protenas de adeso (adesinas) e exopolisacardeos para
se fixar e produzir um biofilme compacto capaz de obstruir vasos do xilema, umas das causas
das doenas que esta bactria causa em diferentes plantas, como videira, laranjeira, cafeeiro e
amexeira. Uma das classes dessas adesinas constituda por autotransportadores trimricos,
que podem estar ancoradas na superfcie das clulas ou serem secretadas. Alguns isolados de
X. fastidiosa possuem apenas um gene para essa adesina, enquanto outras possuem at 3,
como o caso da linhagem que utilizaremos. Iremos avaliar se a expresso de um desses
genes parlogos diferente em clulas presentes no biofilme em relao a clulas planctnicas
(clulas em suspenso na cultura).


2. Fundamentos e aplicaes

A PCR quantitativa (qPCR) ou PCR em Tempo Real (Kubista et al. 2006; VanGuilder et
al., 2008) resulta do refinamento do mtodo de Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
desenvolvido por Kary Mullis em 1985 e que lhe deu o Prmio Nobel de Qumica em 1993
(Saiki et al, 1985). A tcnica de PCR tornou possvel a manipulao de quantidades muito
pequenas de DNA para posterior clonagem, engenharia gentica, sequenciamento, etc.
Entretanto o uso da PCR como mtodo analtico limitado, pois a quantidade de produto que
gerada ao final de uma reao convencional praticamente a mesma, independente de
variaes nas quantidades iniciais do DNA molde presente na amostra, sendo, portanto um
mtodo semi-quantitativo. Essa limitao foi resolvida em 1992 por Russel Higuchi que
desenvolveu um mtodo que possibilita a deteco da quantidade do produto amplificado
(amplicons) simultaneamente a sua sntese (Higuchi et al, 1992).
A tcnica de qPCR tem diversas aplicaes, por exemplo a quantificao de patgenos
em amostras biolgicas e ambientais e a quantificao do nmero de cpias de um gene para
anlises de eventos de deleo ou amplificao gnica (Valasek e Repa, 2005; Espy et al.,
2006). Outra aplicao muito frequente da qPCR na anlise da expresso de um ou mais
genes atravs da quantificao da abundncia de seus respectivos transcritos (RT-qPCR).
Neste caso, o RNA previamente convertido em cDNA fita dupla antes da realizao do ensaio
de qPCR propriamente dito (Bustin, 2000; VanGuilder et al., 2008).

123
Devido a sua preciso e confiabilidade, a tcnica de RT-qPCR frequentemente utilizada
como um mtodo independente para validao da expresso diferencial de genes detectada
atravs da tcnica de DNA microarray (Canales et al., 2006; VanGuilder et al., 2008). Mais
recentemente, foram definidas diretrizes para utilizao desta tcnica de modo a garantir a
interpretao inequvoca de dados gerados por qPCR que so publicados (Bustin et al, 2009).
Na qPCR pode ser realizada quantificao absoluta ou relativa. A quantificao
absoluta usada para determinar a quantidade (desconhecida) de cpias de um gene ou de
seus respectivos transcritos por g de cido nucleico total (DNA ou RNA) tem uma dada
amostra atravs da interpolao da quantificao com uma curva padro. Para isso
necessrio dispor de diluies seriadas de quantidades conhecidas de DNA do gene de
interesse as quais sero utilizadas em reaes de qPCR para obteno da curva padro.
Na quantificao relativa compara-se a quantidade de cpias de um gene ou de seus
respectivos transcritos entre amostras distintas, sendo esta quantidade previamente calibrada
em relao a quantidade de cpias de um gene normalizador que includo no ensaio. O
objetivo do uso do normalizador eliminar a interferncia de variaes na quantidade de
amostra utilizada no ensaio e obter um controle da eficincia da reao (Bustin, 2002).
A quantificao relativa geralmente a opo de escolha para medida da variao da
expresso do gene de interesse (mudana na abundncia de transcritos) entre amostras
distintas. Como normalizadores, geralmente, so utilizados genes com expresso constitutiva
para os quais no se esperam mudanas na expresso nas condies experimentais que se
deseja testar. A variao na expresso do gene de interesse, aps a normalizao, expressa
como razo de expresso (fold change/expression ratio) de uma condio experimental
(teste) em relao condio controle (referncia).
A reao de qPCR semelhante a de PCR convencional, na qual h a repetio, por um
determinado nmero de ciclos, de 3 etapas: (1) desnaturao do cido nucleico; (2)
anelamento do par de primers; (3) ao da enzima de polimerizao (Figura 1). A diferena
que na qPCR so utilizados na reao compostos fluorescentes que permitem a deteco de
acmulo de produto amplificado (alvo, amplicon) em tempo real (ver adiante mtodos de
deteco).




Figura 1. Representao da PCR convencional. Trs ciclos de amplificao da sequncia especfica
esto esquematizados, mostrando o aumento exponencial do produto (amplicon). As fitas moldes iniciais
esto mostradas em cinza e as recm-sintetizadas em verde e rosa. Os primers so mostrados em
vermelho e verde escuro. Aps o terceiro ciclo, o DNA predominante idntico sequncia alvo
delimitada pelos dois primers (oligonucleotdeos iniciadores). Adaptado de Fundamentos da Biologia
Celular, Artmed 2011.


124


Nos ciclos iniciais da qPCR, ocorre pouca mudana no sinal de fluorescncia. Esse
sinal considerado como linha de base (baseline) no grfico de amplificao. Um aumento na
fluorescncia acima da linha de base indica a deteco do alvo acumulado. Em seguida um
valor fixo de corte (limiar, threshold) para a fluorescncia determinado, o qual
intermedirio entre a linha de base e o mximo de fluorescncia.

O parmetro Ct (threshold cycle) definido como o nmero de ciclos necessrios para
que a fluorescncia ultrapasse o threshold, e ser sempre inversamente proporcional
quantidade existente de alvo (Figura 2).



Figura 2. Representao da deteco do sinal de fluorescncia na qPCR. Observe os diferentes Cts
para diferentes amostras. A fluorescncia de fundo (linha de base) de um controle sem DNA molde est
indicada. Adaptado de Biologia Molecular Princpios e Tcnicas Artmed.


2.1. Mtodos de deteco
A deteco e quantificao dos amplicons na qPCR est baseada na emisso de um
sinal de fluorescncia, sendo que tanto sondas fluorescentes especficas como corantes
fluorescentes no especficos podem ser utilizados. Inicialmente, o brometo de etdio era
utilizado na deteco e quantificao em tempo real (Higuchi, et al., 1992) entretanto, foi
observado que este agente intercalante interferia na reao de PCR. Os corantes mais
utilizados atualmente so o SYBR Green Dye e BOXTO (Figura 3). Estes corantes
praticamente no possuem fluorescncia quando esto livres em soluo, mas quando na
presena de DNA dupla fita eles se intercalam entre as bases nitrogenadas e emitem alta
fluorescncia.

S
i
n
a
l
d
e

f
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
(
u
n
i
d
a
d
e
a
r
b
i
t
r

r
i
a
)

Controle
negativo
Sem DNA molde
C
t
125



Figura 3. Estrutura qumica dos corantes mais utilizados em qPCR. esquerda mostrada a
estrutura do SYBR Green Dye e direita mostrada a estrutura do BOXTO


O SYBR Green Dye um corante que possui afinidade pelo minor groove da dupla fita
de DNA (dsDNA) (Zipper, et al., 2004). Quando no est ligado ao DNA, emite uma pequena
fluorescncia no comprimento de onda de 520nm, entretanto quando se liga dupla fita de
DNA, a fluorescncia aumenta cerca de 100x, permitindo ento a deteco, em tempo real, do
produto da PCR durante cada ciclo de amplificao (Figura 4). O BOXTO foi desenvolvido mais
recentemente e tambm tem alta afinidade por dsDNA (Ahmad, 2007).




Figura 4. Representao grfica da deteco de produtos amplificados por SYBRGreen Dye. As
linhas horizontais compostas com traos verticais representam as fitas do DNA com suas bases
nitrogenadas. Losangos em preto representam o corante no ligado ao DNA com baixa emisso de
fluorescncia. Losangos em verde representam o corante ligado ao DNA com mxima emisso de
fluorescncia. Est representado o comportamento do corante durante um dos ciclos de amplificao:
desnaturao, anelamento e extenso. Adaptado de http://www.b2b.invitrogen.com/.


Uma das vantagens do uso destes corantes o baixo custo; entretanto, este mtodo
detecta qualquer molcula de DNA dupla fita existente, incluindo produtos de PCR esprios e
dmeros de primers. Para confiar na aferio necessrio analisar a curva de dissociao
mostrada pelo aparelho, onde podemos analisar a Tm do produto amplificado, e,
consequentemente, seu contedo de bases C+G. Dessa forma, possvel avaliar se ocorreu
amplificao de mais de um produto, alm do desejado.

SYBR Green Dye BOXTO
126
A deteco e quantificao utilizando sondas fluorescentes confere maior especificidade
a qPCR, e dentre estas, as sondas TaqMan so as mais utilizadas. Estas sondas possuem
duas molculas (fluorforo doador e molcula aceptora) ligadas as extremidades 5 e 3 do
oligonucleotdeo. O fluorforo doador quando excitado e transfere esta energia para a molcula
aceptora que est prxima. A molcula aceptora um quencher (supressor) que captura a
energia e no permitindo a deteco da florescncia enquanto est prxima molcula
doadora. Desta forma, a distncia entre a molcula doadora e a aceptora na sonda TaqMan
intacta impede a emisso de fluorescncia pelo fluorforo doador, mesmo quando a sonda est
hibridizada com o seu DNA alvo. Entretanto durante a sntese da fita complementar, a DNA
polimerase hidrolisa a sonda anelada ao alvo, separando o fluorforo doador do grupo
quencher e permitindo, assim, a emisso de sinal fluorescente (Figura 5).



Figura 5. Deteco baseada na sonda TaqMan. A sonda TaqMan est ligada ao fluorforo doador
(R) e quencher (Q) que quando esto juntos no emitem fluorescncia. Quando ocorre a amplificao da
regio em que a sonda TaqMan est anelada, tambm ocorre a degradao da sonda pela atividade
exonuclesica 5-3 da DNA polimerase, resultando na separao fluorforo doador e quencher com
consequente emisso de fluorescncia. Adaptado de http:// http://www.asuragen.com/.


Este mecanismo de deteco tem como vantagem a especifcidade e possibilidade de
quantificar expresso de mais de um gene ao mesmo tempo (qPCR multiplex), com sondas
TaqMan distintas, ligadas a fluorforos reprter (ex: FAM, Vic

, TET, NED) que exibem


diferentes espectros de absoro e emisso de fluorescncia (ex: 525nm, 554nm, 536nm,
575nm). Entre as desvantagens esto o maior custo e a necessidade de padronizao, pois as
sondas precisam apresentar baixa fluorescncia de fundo (background), alta especificidade e
alta fluorescncia quando degradadas e dissociadas do quencher.

Primer direto
(forward)
Primer reverso
(reverse)
127
2.2. DNA molde (template)
O molde para qPCR pode ser DNA total purificado das amostras de interesse ou cDNA
sintetizado a partir de RNA total atravs da reao de transcrio reversa. Esta reao
converte o RNA, que pouco estvel nas condies de reao, em uma molcula de DNA
dupla fita, mais estvel e adequada para amplificao. Neste caso a reao dita qPCR
precedida da reao de transcrio reversa (RT-qPCR). oportuno destacar que a integridade
do RNA total utilizado para sntese do cDNA muito importante nos estudos de quantificao
relativa da expresso gnica (Prez-Novo et al., 2005).


2.3. Primers (oligonucleotdeos iniciadores)
Assim como na PCR convencional, os primers utilizados devem ser especficos para a
sequncia que se deseja amplificar, o que pode ser conferido por buscas com o programa
BLASTn (disponvel no site do NCBI). Alm disso, o planejamento da sequncia dos primers
para qPCR deve seguir rigorosamente alguns parmetros: (1) no devem formar dmeros e
alas (hairpins); (2) devem amplificar um segmento entre 50-150pb; (3) devem apresentar
temperatura de anelamento entre 58
o
C e 60
o
C; (4) o contedo de C+G deve ficar entre 30-
80% e (5) no caso de amostras eucariticas, o par de primers deve estar ancorado em exons
distintos do transcrito a fim de evitar uma eventual co-amplificao de DNA genmico
contaminante na amostra de RNA total. Para facilitar o planejamento dos primers, observando-
se estes parmetros, so utilizados programas como Primer Express version 3.0 (Applied
Biosystems).
A concentrao dos primers a ser utilizada deve ser determinada experimentalmente.
Para tanto, reaes contendo primers variando entre uma concentrao final mxima de
800nM e mnima de 50nM devem ser realizadas utilizando-se como template uma mistura de
cDNAs provenientes de diversas linhagens celulares e/ou tecidos celulares. Desta forma,
possvel determinar a menor concentrao final de primers que resulta na no formao de
dmeros sem que haja variao no valor do Ct e no perfil da curva de amplificao do gene, em
relao s maiores concentraes analisadas. Na figura 6 temos um exemplo de resultado
desse teste.
Outro parmetro a ser testado antes da utilizao de um par de primers em
experimentos de expresso gnica a determinao da eficincia de amplificao do produto.
Nos experimentos de quantificao relativa muito importante que a eficincia de amplificao
do gene utilizado como normalizador seja semelhante eficincia de amplificao do gene de
interesse a ser quantificado.
Para determinao da eficincia de amplificao, so realizadas reaes de
amplificao contendo primers na concentrao ideal e uma diluio em srie do DNA
template. A anlise de regresso linear dos valores de Cts em funo do logaritmo da
respectiva diluio fornece o coeficiente angular da reta (a, em y=ax+b) que utilizado para
clculo da eficincia de amplificao (Ef) do produto pelos primers, utilizando-se a seguinte
frmula:


Ef = 10
-1/coeficiente angular


Ef (%) = (Ef 1) x 100



128

Figura 6. Padronizao da concentrao final de primers para um determinado gene. A figura
mostra que concentraes entre 200 e 400 nM so limitantes para a reao, visto que com 600nM e
800nM os Cts observados so menores. Nos painis menores esto representados individualmente cada
resultado obtido com uma determinada concentrao de primers. A linha azul representa o threshold
estabelecido arbitrariamente. A partir da interseco deste com a curva de amplificao obtido o Ct
(Cycle Threshold).


2.4. Quantificao

Como j mencionado, a PCR em tempo real semelhante a PCR convencional
esquematizada na Figura 1. A reao envolve uma etapa inicial de desnaturao, geralmente
realizada a 95
o
C, para separar a dupla fita do DNA molde. Seguem-se ciclos com 3 etapas, que
consistem na desnaturao do DNA molde em alta temperatura, anelamento dos primers em
temperatura mais baixa e finalmente ao da enzima de polimerizao em temperatura
intermediria (DNA polimerase termoestvel). Essas 3 etapas so repetidas por 35-45 vezes,
sendo que a temperatura e tempo so definidos dependendo da sequncia a ser amplificada.
A PCR proporciona um aumento exponencial da sequncia desejada, sendo que a partir
de uma nica molcula de DNA molde so obtidas, aps 35 ciclos, 2
35
molculas do produto
amplificado, se assumirmos eficincia de 100%. Na PCR convencional, a quantidade de
produto amplificado suficiente para deteco com corantes fluorescentes (ex: brometo de
etdio) aps separao eletrofortica do amplicon obtido.
Na PCR em tempo real, o acmulo de molculas de DNA dupla fita resulta em um
aumento do sinal de fluorescncia emitida pelo composto fluorescente utilizado na reao (Sybr
Green ou sondas TaqMan). No incio da reao, a intensidade desta fluorescncia baixa,
pois a quantidade de molculas dupla fita marcadas est abaixo do limite de deteco
confivel, sendo chamada de fluorescncia basal (baseline). Com a progresso da reao e o
aumento da quantidade de molculas dupla fita, o aumento da fluorescncia chega a um nvel
que pode ser detectado de forma confivel e ento utilizado para a quantificao.
Na qPCR um parmetro essencial para quantificao o Ct (cycle threshold) como j
mostrado na Figura 2. O C
t
consiste na determinao do ciclo de amplificao em que a
fluorescncia emitida pela amostra supera significativamente a fluorescncia basal (Figuras 1 e
7). Esse parmetro utilizado para calcular a expresso relativa de amostras e inversamente
proporcional a quantidade inicial de molculas de cDNA alvo, isto , quanto menor o Ct maior
a expresso do gene de interesse (abundncia do transcrito) na amostra avaliada.

129








Figura 7. Representao de reaes de PCR em tempo real. Diferentes Cts so observados para
diferentes amostras, considerando-se o mesmo limiar (threshold). Note o aumento logartmico do sinal
de fluorescncia em funo do avano dos ciclos de amplificao. Diferentes amostras alcanam o valor
limite (Ct) em diferentes ciclos de amplificao, dependendo da quantidade do alvo nas diferentes
amostras.






Outro parmetro essencial e de extrema importncia quando se faz a deteco
utilizando Sybr Green a curva de dissociao que realizada ao final da amplificao. Para
obter esta curva, a temperatura da amostra elevada gradativamente e a intensidade da
fluorescncia medida. Quando a temperatura da amostra atinge a temperatura de
desnaturao (T
m
) do produto amplificado, o mesmo se desnatura e o corante se dissocia
do DNA, diminuindo a intensidade da fluorescncia detectada pelo aparelho. A partir da
derivada dos dados de fluorescncia so geradas as curvas de dissociao dos amplicons.
Como produtos de diferentes tamanhos e composio de bases apresentam diferentes Tm,
esta curva possibilita a distino entre diferentes produtos amplificados na reao, a presena
de amplificao no controle negativo (contaminao) e a formao de dmeros de primers. A
figura 8 ilustra os resultados obtidos nessa anlise.




130




Figura 8. Curva de dissociao. No topo est a representao de curva de dissociao que apresenta
um s pico (correspondente a Tm do produto amplificado), indicando a deteco de somente um
fragmento dupla fita. No grfico de baixo est mostrado uma uma curva de dissociao com 2 picos,
indicando que alm da sequncia alvo houve a amplificao de outra molcula dupla fita, podendo ser
dmero ou hairpin de primers ou mesmo uma amplificao inespecfica. Nestes grficos, a fluorescncia
(eixo y) dada em unidades arbitrrias e a temperatura (eixo x) em C.


2.5. Gene normalizador
Para quantificao relativa da abundncia de transcritos de interesse entre amostras
biolgicas, necessria a anlise concomitante de genes de expresso constitutiva que so
utilizados como normalizadores da concentrao total de molde nas diferentes amostras (Pfaffl,
2001; Livak & Schmittgen, 2001; Bustin, 2002). Parte-se do pressuposto que a expresso de
tais genes no varia entre as amostras ou condies experimentais que se deseja comparar.
Genes que possuem expresso constitutiva esto geralmente associados a funes celulares
consideradas de manuteno (housekeeping). Porm h vrios exemplos de genes para os
quais foi assumida expresso constitutiva, e que na prtica exibem expresso modulada em
alguma condio fisiolgica ou patolgica ou em diferentes tipos celulares (Pfaffl, 2001). Desta
forma extremamente importante, antes de iniciar seus ensaios de RT-qPCR testar alguns
genes candidatos para ento determinar os normalizadores mais adequados para seus
experimentos.

2.6. Anlise quantitativa da expresso relativa
Uma vez obtidos os valores de Cts, deve ser calculada a mdia dos Cts das rplicas
tcnicas (geralmente triplicatas). Dado que a expresso de um gene analisada em funo da
expresso do gene normalizador, calcula-se a diferena entre o Ct do gene que se quer avaliar
e o Ct do gene normalizador ( Ct). Para expresso relativa necessrio haver pelo menos
duas situaes experimentais, sendo que uma tomada como referncia (controle). Calcula-se
ento a diferena entre o Ct da condio teste e o Ct da condio referncia (controle). Essa
diferena definida como Ct. O Ct utilizado para o clculo da razo de expresso (fold
change) dos genes entre as amostras analisadas com a equao 2
-Ct
. Os valores obtidos
para as diferentes rplicas biolgicas (geralmente trs rplicas) so comparados por testes
estatsticos que avaliam se as diferenas observadas so ou no significativas (Livak &
Schmittgen, 2001; Karlen et al., 2007).
131


Referncias:
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239.
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(RT-PCR): trends and problems. J. Mol. Endocrinol. 29:23-39.
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Medicine 27: 95-125.
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stability. BioTechinique s 39:52-56.
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real-time quantitative PCR and the 2(T)(-Delta Delta C) method. Methods 25: 402-408.
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restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science 230:1350-1354.
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Zipper, H. et al., 2004. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green
I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32:e103.


132
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL RT-qPCR


A tcnica de qPCR uma das metodologias mais sensveis para a deteco de
molculas de RNA, DNA ou cDNA, e capaz de detectar menos de 10 molculas alvo por
reao. Recomenda-se a observao de diretrizes mnimas para realizao de experimentos
de RT-qPCR definidas por Bustin et al., 2009.
Alm disso, cuidados adicionais devem ser observados para garantir o sucesso da
reao e obteno de resultados corretos, tais como:
Todos os reagentes e material plstico devem ser livre de nucleases.
Utilizar sempre luvas sem talco.
Utilizar placas e tampas ticas, e evitar ao mximo o contato com a superfcie
das tampas (a leitura da fluorescncia realizada de cima para baixo).
Utilizar ponteiras com filtro para minimizar o efeito de contaminao por
aerossis.
Em cada placa colocar sempre amostras controles sem template (NTC non
template control) para cada um dos primers e amostras de RNA no transcritos
reversamente (NRT control) para cada cDNA analisado.


Ensaio de RT-qPCR

Anlise da expresso diferencial do gene de uma adesina de Xylella fastidiosa

O experimento de RT-qPCR que ser realizado tem como objetivo avaliar a expresso
do transcrito de um gene que codifica uma adesina de superfcie na bactria Xylella fastidiosa.
Essa bactria se utiliza de diversas protenas de adeso (adesinas) e exopolisacardeos para
se fixar e produzir um biofilme compacto capaz de obstruir vasos do xilema, umas das causas
das doenas que esta bactria causa em diferentes plantas, como videira, laranjeira, cafeeiro e
amexeira. Uma das classes dessas adesinas constituda por autotransportadores trimricos,
que podem estar ancoradas na superfcie das clulas ou serem secretadas. Alguns isolados de
X. fastidiosa possuem apenas um gene para essa adesina, enquanto outras possuem at 3,
como o caso da linhagem que utilizaremos. Iremos avaliar se a expresso de um desses
genes parlogos diferente em clulas presentes no biofilme em relao a clulas planctnicas
(clulas em suspenso na cultura).
Como gene normalizador utilizaremos dnaQ, que codifica uma das cadeias da DNA
polimerase III. Esse gene apresenta expresso equivalente em clulas no biofilme e
planctnicas. Todos os pares de primers utilizados neste experimento apresentam eficincia de
amplificao semelhante (j padronizado).
As culturas de X. fastidiosa foram mantidas a 28
o
C a 100rpm por 7 dias em meio rico
PWG para promover a formao de biofilme. As clulas planctnicas foram ento separadas
das clulas do biofilme e os monitores procederam extrao do RNA total, tratamento com
DNAse e sntese de cDNA. O grupo receber amostras de cDNA pronto para a reao de
qPCR.


Extrao de RNA total

O sedimento de clulas de X. fastidiosa (planctnicas e de biofilme) ter o RNA total
extrado com o reagente Trizol (Invitrogen). Por se tratar de RNA, deve-se tomar todo cuidado
com manipulao, para evitar degradao por RNAses presentes nas mos, cabelos, saliva.
Deve-se sempre trabalhar com a amostra em gelo e o mais rpido possvel.

133


1. Adicionar 1000 L de Trizol ao sedimento de clulas e misture at completa
homogeneizao. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos para permitir
completa dissociao dos complexos de nucleoprotenas;
2. Adicionar 200 L de clorofrmio a cada amostra, agitar vigorosamente (vortex) por 15
segundos e incubar temperatura ambiente por 3 minutos;
3. Centrifugar as amostras a 12000g por 15 minutos, a 4C;
4. Retirar os tubos da centrfuga cuidadosamente, sem agitar;
5. Retirar a fase aquosa (superior), evitando pegar a fase branca leitosa, e transferi-la
para novos tubos;
6. Adicionar um volume de etanol 70% (igual ao transferido da fase aquosa a novos
tubos) e vortexar;
7. Inverter o tubo para dispensar qualquer precipitado visvel que possa se formar aps
adio de etanol;
8. Transferir at 700L da amostra a um filtro-coletor com um tubo coletor (Kit de
extrao de RNA PureLink
TM
RNA Mini Kit);
9. Centrifugar as amostras a 12000g por 15seg em temperatura ambiente. Descartar o
filtrado e reinserir o filtro-coletor no mesmo tubo coletor;
10. Repetir os passos 7 e 8 at a mostra original ser processada por completo;
11. Adicionar 700L de tampo de lavagem ao filtro-coletor. Centrifugar as amostras a
12000g por 15seg em temperatura ambiente. Descartar o filtrado e o tubo coletor.
Inserir o filtro-coletor em um novo tubo coletor;
12. Adicionar 500L de tampo de lavagem II com etanol ao filtro-coletor;
13. Centrifugar a 12000g por 15seg em temperatura ambiente. Descartar o filtrado e
reinserir o filtro-coletor no mesmo tubo coletor;
14. Repetir os passos 11 e 12 mais uma vez;
15. Centrifugar 12000g por 1 minuto em temperatura ambiente para secar a membrana
com RNA anexado. Descartar o tubo coletor e inserir o filtro-coletor em um tubo de
recuperao de 1,5mL;
16. Adicionar ~50L de RNase-Free Water no centro do filtro-coletor;
17. Incubar em temperatura ambiente por 1 minuto;
18. Centrifugar o filtro-coletor com o tubo de recuperao a 12000g por 2 minutos em
temperatura ambiente;
19. Quantificar 1,5uL no NanoDrop a 260 e 280nm;
20. Avaliar a integridade do RNA total isolado utilizando BioAnalyzer ou eletroforese em
gel de agarose;
21. Guardar no ultrafreezer (-80C) at a utilizao



134
Remoo de DNA genmico da amostra de
1. 1. Adicionar a um microtubo os seguintes reagentes:
RNA 1 g
10X Reaction Buffer 1 L
DNase i, RNase-free 1 L
H
2
O , RNAse-free qsp 10 L
2. Incubar as amostras a 37C por 30 min.
3. Adicionar 1 l de EDTA 50mM ou 1L de EGTA 20mM (pH 8.0) incube as amostras a
65C por 10 min.
ATENO: RNA sofre hidrlise se aquecido com ctions divalentes na ausncia do agente
quelante.
4. Usar a amostra de RNA como template para a reao de transcrio reversa.


Reao de transcrio reversa
A transcrio reversa do RNA em cDNA pode ser realizada com primer Oligo-dT (que se
anela a cauda poli A na extremidade 3 do mRNA eucaritico), ou ento com pool de random
primers, que iro anelar de forma aleatria ao RNA para sntese do cDNA.
extremamente importante usar a mesma quantidade de RNA inicial para todas as amostras,
a fim de normalizar e padronizar a sntese de cDNA para todas amostras.

O seguinte procedimento usa 1g de RNA.
ATENO: NO ALTERAR A PROPORO ENTRE PRIMERS E RNA

1. Em um microtubo estril, livre de RNase, adicionar 0,5 g de random primers para
cada micrograma de amostra de RNA em um volume total de 5 L por reao.
2. Aquecer os tubos a 70C por 5 minutos e coloc-los imediatamente no gelo por 5
minutos. A seguir, se necessrio, centrifugar os tubos para coletar toda a amostra no fundo dos
mesmos.
3. Para cada reao acima (5L de reao) adicionar o mix abaixo, composto por:



ImProm-II
TM
5x Reaction Buffer 4L
MgCl
2
25mM (3mM final) 2,4L
dNTPs 10mM 1L
RNase OUT (20U) 1L

Vortexar a mistura acima e adicionar:
ImProm-II
TM
Reverse Transcriptase 1L
Nuclease-Free Water qsp 15L


4. Homogeneizar suavemente as solues e incubar as amostras sa 25C por 5 minutos e
em seguida, a 42C por 60 minutos;
5. A seguir, aquecer os tubos por 15 minutos a 70;
6. Diluir as amostras conforme a necessidade;
7. Para cada amostra de RNA fazer uma reao controle substituindo a enzima ImProm-II
TM
Reverse Transcriptase por gua miliQ livre de nucleases. Estas reaes sero utilizadas
como No Reverse Transcriptase Controls (NRT) na reao de qPCR.



135
Reao de qPCR

Aps a sntese de cDNA, ser realizada a qPCR sendo cada amostra em triplicata
(rplica tcnica), utilizando o aparelho ABI 7300, e o mtodo de deteco com SYBR Green
Dye. A Sybr Green Select Master Mix (Applied Biosystems/Life Technologies) j contem a DNA
polimerase termoestvel (AmpliTaq Gold DNA Polymerase), o corante fluorescente SYBR
Green I Dye, dNTPs incluindo dUTP, Uracil-DNA Glicosilase (Heat-labile Uracil-DNA
Glycosylase) e tampo apropriado. A enzima UDG minimiza reamplificao de produtos de
PCR residuais gerados em reaes anteriores realizadas com a mistura contendo dUTP.
Alm do transcrito do gene de interesse, ser amplificado o transcrito de um gene
normalizador. A concentrao final de primers j foi padronizada anteriormente para cada
transcrito e ser de 400nM.


O protocolo utilizado ser o seguinte:

Reagente Quantidade
cDNA (50ng)/ RNA (100ng) 5 L
Sybr Green master mix 10 L
Primers mix 5 L

Antes de comear faa um mapa da sua placa, informando a posio das amostras e
primers


1. Adicionar 5 L de cDNA j diludo no fundo de cada poo da placa;
2. Adicione os 5 L da soluo de primers na lateral do poo, evitando contato com o
cDNA do fundo;
3. Adicione os 10 L do master mix SYBR Green Dye na outra lateral da placa, evitando
novamente contato com o cDNA e com a soluo de primers;
4. Utilizar um poo para as amostras NRT (no necessrio fazer em triplicata);
5. Bater a placa levemente para coletar todo material no fundo;
6. Vedar a placa com o filme plstico indicado;
7. Centrifugar rapidamente a placa para misturar os reagentes.
8. Levar imediatamente a placa ao aparelho de PCR em tempo real;
9. A condio de ciclagem utilizada ser: 50
o
C por 2min (etapa de ativao da Uracil DNA-
Glicosilase), 95
o
C por 2min (etapa de ativao da DNA Polimerase termoestvel), 50
ciclos de 95
o
C de 15seg (etapa de desnaturao) e 60
o
C por 30 seg (etapa de
anelamento dos primers e extenso/sntese de DNA).

Anlise dos resultados obtidos das reaes de RT-qPCR

Fazer todas as anlises necessrias, com auxilio dos monitores para determinar:
Se as amplificaes para cada transcrito foram especificas;
Se existe contaminao residual com DNA genmico em alguma amostra;
Se existe contaminao nos primers ou na mistura de reao;
Determinar se houve expresso diferencial do transcrito em estudo entre as
amostras controle e teste;
Calcular a diferena de expresso (Ct) e razo de expresso (2-Ct);
Determinar a significncia estatstica das diferenas observadas.


136
Como calcular o 2
-Ct
:

O clculo da razo de expresso ser feito com o mtodo 2
-Ct
no qual assumido que
o amplicon tenha um tamanho mximo de 150pb e que a eficincia da reao prxima de
100%. Neste mtodo, a expresso do gene alvo em duas amostras (controle e teste)
corrigida pela expresso do gene normalizador.


Calcule a mdia dos valores de Ct obtidos nas replicatas tcnicas
Calcule o valor de Ct para a amostra controle e amostra teste (Ct do gene alvo-Ct do
gene normalizador).
Calcule a diferena de expresso entre amostra teste e controle (Ct)
Calcule a razo de expresso (2
-Ct
)
Calcule a mdia dos valores de razo de expresso entre replicatas biolgicas
Os desvios padro sero considerados para anlise da significncia estatstica das
diferenas observadas.





C
t
= (C
t avo
- C
t

normalizador
)
tete
-(C
t

avo
- C
t

normalizador
)
controle



Razo de expresso=2
-Ct



Exemplo:
Deseja-se avaliar a variao na expresso dos genes XF1981 e XF0599 em resposta a
exposio a uma droga. Para tal, a cultura de clulas dividida em dois frascos, sendo a droga
adiciona a um deles (condio teste). A cultura no exposta corresponde condio controle.
O gene XF2157 normalizador. Os valores de C
t
das culturas controle e tratada esto
mostrados na tabela abaixo:

Cultura controle Cultura tratada
Gene C
t
Gene C
t

XF1981 27,7 XF1981 32,4
XF0599 25,2 XF0599 23,1
XF2157 30,1 XF2157 31,0

Clculos:
Para XF1981:
Tratado/Controle 2
- (27,7-30,1)-(32,4-31,0)

Tratado/Controle: 2
- (-2,4)-(1,4)
Tratado/Controle: 2
- (-3,8)
Tratado/Controle: 13,93
Para XF0599:
Tratado/Controle 2
-(25,2-30,1)-(23,1-31,0)
Tratado/Controle: 2
-(-4,9)-(-7,9)
Tratado/Controle: 2
-(3)
Tratado/Controle: 0,13

O gene XF1981 13,9 vezes mais expresso (up regulated) enquanto o gene XF0599 tem
expresso diminuda em 9 vezes (down regulated) na cultura tratada com a droga em relao
a cultura controle no tratada.



C
t teste


C
t controle


137
Laboratrio de Expresso Gnica em Eucariotos
Sergio Verjovski-Almeida (responsvel);
Letcia Anderson Bassi (monitora)


ANLISE DE EXPRESSO GNICA UTILIZANDO MICROARRANJOS DE DNA

1. Introduo
A esquistossomose uma doena crnica causada por parasitas platelmintos do
gnero Schistosoma, ocorrendo principalmente em reas urbanas negligenciadas de pases
em desenvolvimento (Martins-Bede, Freitas et al. 2009).Schistosoma mansoni uma das 3
principais espcies (S. haematobium, S. japonicum e S. mansoni) que infectam humanos,
habitando os vasos sanguneos das veias mesentricas do sistema porta-heptico. A doena
atinge 76 pases em desenvolvimento, constituindo um dos maiores problemas de sade
pblica, onde estima-se que 207 milhes de pessoas estejam infectadas e 779 milhes vivam
em reas endmicas (WHO, 2002). Os sintomas mais comuns so diarria, clica, febre, dor
de cabea, nuseas, tontura, sonolncia, perda de peso e hepatomegalia(Rey 2001).
O S. mansoni pertence famlia Schistosomatidae, classe Trematoda, subclasse
Digenea(Rey 2001). Os vermes adultos pareados se fixam nas paredes dos vasos por meio de
ventosas e encontram condies favorveis para seu desenvolvimento no sistema porta intra-
heptico. Seus ovos so eliminados pelas fezes e em condies apropriadas se rompem
liberando os miracdeos que penetram no molusco do gnero Biomphalaria, seu hospedeiro
intermedirio. No interior do molusco por reproduo assexuada se formam esporocistos que
daro origem a cercrias (larvas de vida livre) que sero eliminadas na gua. As cercrias so
capazes de infectar humanos atravs da penetrao na pele e chegam corrente sangunea,
desenvolvendo-se em esquistossmulos. Pela corrente sangunea chegam ao fgado, onde
realizam o processo de pareamento sexual (acasalamento entre machos e fmeas) e migram
para as veias mesentricas onde se inicia a postura dos ovos (Rey 2001).
O ciclo de vida complexo do parasita com diferentes fentipos se reflete no tamanho do
genoma com 363 megabases distribudo em 7 pares de cromossomos autossmicos e um par
ZW sexual, havendo 11807 genes que codificam 13197 transcritos (Protasio, Tsai et al. 2012).
Os mecanismos epigenticos so o eixo central da regulao gnica programada, permitindo
diferentes perfis de expresso gnica ao longo do ciclo de vida deste complexo eucarioto. A
regulao epigentica em eucariotos inclui modificaes ps-traducionais de histonas,
metilao de DNA, RNAs de interferncia, histonas variantes e modificaes ps-traducionais
de protenas no-histonas(Kouzarides 2007).
Em eucariotos o DNA genmico est enovelado em histonas organizadas em
nucleossomos, formando um complexo macromolecular denominado cromatina. O
nucleossomo consiste em 147 pares de bases de DNA enovelado ao redor de um octmero,
composto por 2 cpias de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4, e incluindo uma unidade
de H1, tendo o complexo uma massa molecular de aproximadamente 206 kD(Luger, Mader et
al. 1997; Zupkovitz, Tischler et al. 2006). A cauda N-terminal das histonas pode sofrer
alteraes ps-traducionais tais como acetilao, metilao, fosforilao, ubiquitinao,
carbonilao e glicosilao, contribuindo para a formao de uma complexa estrutura da
cromatina, relacionada asilenciamento ou ativao, e representando sinais para
reconhecimento de protenas (Bolden, Peart et al. 2006).

138
A modificao da cromatina por acetilao em resduos de lisina das histonas regula a
transcrio, reparo, replicao e condensao de DNA. Em S. mansoni enzimas com atividade
de acetiltransferase em histonas foram identificadas como SmGCN5 e SmCBP1 (de Moraes
Maciel, de Silva Dutra et al. 2004; Bertin, Oger et al. 2006). A classe I de Histonas Deacetilases
(HDAC1, 3 e 8) foi descrita no parasita por anlise filogentica e a expresso confirmada em
todos os estgios de desenvolvimento (Oger, Dubois et al. 2008). O efeito do inibidor de
HDACs,Tricostatina A (TSA), foi inicialmente testado em esporocistos, bloqueando a
metamorfose para miracdeos(Azzi, Cosseau et al. 2009). Em vermes adultos e
esquistossmulos por ensaios de TUNEL e caspase 3/7 foi visto que TSA induz a apoptose do
parasita, sendo este efeito correlacionado hiperacetilao de histona H4 (Dubois, Caby et al.
2009).
Recentemente nosso grupo analisou o genoma e transcriptoma do parasita em busca
dos membros das famlias de histonas (H2A, H2B, H3, H4) (Anderson, Pierce et al. 2012) e da
evidncia de expresso de todos estes genes por anlise in silico em banco de dados de ESTs.
Foram encontrados 29 genes de histonas, tendo sido identificados in silicona sequncia da
poro 3UTR dos pr-mRNAS de histonas os elementos conservados relacionados ao
processamento dos prprios pr-mRNAs, alm de terem sido identificados no genoma os
genes que codificam protenas relacionadas biossntese e processamento destes mRNAs.
Alm disso, por similaridade com ortlogos humanos foi possvel identificar as variantes de
histonas dentre as famlias (Anderson, Pierce et al. 2012).



2. Microarranjos de DNA
H uma grande variedade de microarranjos de DNA, que permitem a anlise por
hibridizao de DNA e/ou RNA em plataformas miniaturizadas. As aplicaes para
microarranjos de DNA so geralmente direcionadas para anlise de expresso gnica ou
busca por single nucleotidepolymorphisms (SNPs) em amostras. Alm de aplicaes para
anlise em biologia molecular e pesquisas de genmica, os sistemas de microarranjos so
aplicados para pesquisa em farmacogenmica, doenas infecciosas e genticas e diagnstico
de cncer, por exemplo(Heller 2002).
O princpio do experimento de microarray, ao contrrio da anlise clssica por northern-
blotting, que o mRNA de uma linhagem de clula ou tecido usada para gerar uma amostra
marcada, o qual hibridizada em paralelo um grande nmero de sequncias de DNA que
esto imobilizadas em uma superfcie slida (array). Milhares de diferentes transcritos podem
ser detectados e quantificados simultaneamente(Schulze and Downward 2001).
As plataformas de microarrayevoluiram nos ltimos anos, e so dividas em dois grupos
distintos de acordo com o material imobilizado na superfcie slida o qual recebe o nome de
probe: DNA complementar (cDNA) ou oligonucleotdeo. Probes de cDNA so geralmente
produtos de PCR (Realo da Polimerase em Cadeia) geradas de bibliotecas de cDNA ou
coleo de clones, usando vetores especficos ou primers gene-especficos, e so fixadas em
lminas de vidro (formando os spots). Neste tipo de array, cada spot tem entre 100 300 m e
so espaados pela mesma distncia. Para arrays de oligonucleotdeos, os probes de 60
bases so sintetizados in situ, base por base, derivadas de arquivos de sequncia digital. A
tecnologia ink-jet permite a deposio de pequenos volumes (picolitros) dos reagentes a serem
colocados no spot e a sntese das sondas realizada no prprio array. Cada nucleotdeo
ligado serialmente sonda num processo cclico de sntese de fosforamitida, composto de trs
fases como ilustrado na figura 2. Essa tecnologia permite a construo do microarray a partir
do conhecimento das sequncias dos genes de interesse, sem necessidade da disponibilidade
de clones fsicos de cDNA.A figura 1 resume os quatro passos da tecnologia ink-jet.


139




Figura 1: Processo ink-jet de sntese de sonda desenvolvido pela Agilent Technologies. A) A primeira
camada de nucleotdeos depositada na superfcie ativada do microarray. B) O crescimento da sntese
do oligonucleotdeo se d atravs de mltiplas camadas que so precisamente adicionadas conforme a
sequncia desejada. C e D) Adio de uma nova base a cadeia crescente de oligonucleotdeo em
detalhe.




Figura 2: Ciclo de sntese de DNA por fosforamidita. 1) Para que ocorra a sntese o nucleosdeo
protegido pelo grupo DMT ligado a um grup OH disponvel na superfcie da lmina. O grupo DMT no
O ligado ao carbono 5 previne a adio de mltiplos nucleotdeos durante o ciclo de sntese. 2) Um
agente oxidante converte o PIII em PV normalmente encontrado nos nucleotdeos de DNA. 3) Um agente
desbloqueador remove o grupo DMT do nucleotdeo adicionado deixando exposto um OH ligado ao
carbono 5 para a prxima reao de acoplamento. DMT: Dimetoxitritil.

140

3. Preparao de amostras e hibridizao de microarranjos de DNA.
Nos experimentos com microarranjos de DNA para anlise da expresso gnica, o RNA
mensageiro isolado do organismo/tecido de interesse utilizado para a gerao de alvos
marcados com fluorforos, e posteriormente hibridizados sobre os microarranjos que contm
molculas de DNA (sondas). A boa qualidade do RNA isolado essencial para a obteno de
resultados confiveis. Os alvos fluorescentes podem ser gerados a partir da marcao do
cDNA gerado a partir de uma reao de transcrio reversa. Outra alternativa comumente
utilizada a amplificao linear da populao inicial de RNA mensageiro atravs da sntese de
DNA e uma subseqente transcrio in vitro onde sero incorporados os nucleotdeos
marcados. Esta abordagem tem permitido a anlise do perfil de expresso gnica a partir de
amostras disponveis em pequena quantidade.Existem vrias abordagens possveis em um
experimento de microarranjo cuja escolha depende da pergunta biolgica.
Comparaes diretas, onde duas amostras so marcadas com fluorforos distintos na
mesma hibridizao so mais adequadas quando as condies experimentais so controladas
e restritas (ex: duas populaes de clulas tratadas e no tratadas com determinado agente).
Em estudos envolvendo um nmero elevado de condies (ex. comparao de estgios de
desenvolvimento de um organismo e estudos utilizando grande nmero de pacientes),
comparaes indiretas so mais apropriadas. Tipicamente, nesses estudos cada amostra co-
hibridizada com uma amostra referncia externa comum (tipicamente um pool de RNA ou de
oligonucleotdeo referncia), posteriormente as razes de expresso entre as amostras-teste e
a amostra referncia so comparadas entre si (Alizadeh, Eisen et al. 2000; Perou, Sorlie et al.
2000). Alternativamente, a mesma amostra pode ser marcada com 2 cores e hibridizada no
mesmo array(abordagem denominada self-self), de modo a obter uma rplica tcnica no
mesmo experimento (Nakaya, Amaral et al. 2007).
Em um tpico experimento de hibridizao (Figura 3), quantidades iguais de alvos
(mesma massa de RNA) provenientes de duas condies experimentais, marcados com
fluorforos distintos (ex. Cy3 ou Cy5) so combinadas e incubadas sobre os microarranjos de
DNA e o pareamento especfico alvo-sonda acontece por complementaridade de sequncia.
Aps lavagem para remoo dos alvos no hibridizados, a quantidade de fluorescncia
correspondente as molculas de alvo hibridizadas com os arrays ento detectada atravs de
um leitor de lminas com uma fonte de luz laser (Scanner).Para que seja possvel a
comparao da abundncia de transcritos nas diferentes condies necessrio que a
quantidade de sonda depositada no arranjo no seja limitante.
A etapa seguinte consiste em utilizar programas que localizam os elementos de DNA
representados nos microarrays (spots) e convertam os sinais de fluorescncia detectados
(pixels) em valores numricos. Alm dos spots contendo os fragmentos de genes de interesse,
os microarrays frequentemente contm spots com DNA sem similaridade com genes expressos
na espcie em estudo e que fornecem informao sobre a hibridizao no-especfica de alvos
ao microarranjo (controles negativos), que posteriomente podem ser utilizados para definir o
rudo (background) do experimento e um limite inferior de intensidade para considerar um gene
expresso.


141

Figura 3: Resumo do desenho experimental de microarray. O RNA das amostras de interesse isolado,
gerado o cDNA e marcado com fluorforos (Cy3 e Cy5) e ento hibridizado no array, onde cada alvo
complementar a uma sonda depositada no spot.


4. Anlise de Dados
Aps a obteno dos dados de intensidade dos spots atravs do software de extrao,
o processo de anlise de dados composto essencialmente das seguintes etapas:


Filtragem
A filtragem dos dados uma etapa importante para a anlise de dados e prima em estimar
um limite inferior de intensidade para considerar um gene expresso. Isto necessrio pois os
experimentos de abordagem de microarranjos vem atrelados com hibridizaes inespecficas
das molculas alvos marcadas. Para filtrar esta deteco decorrente de hibridizaes
inespecficas, muitas vezes so utilizados controles negativos, que em geral so sondas de
DNA selecionadas para obter a menor homologia de sequncia com a espcie estudada (ex.
Sondas referentes ao genoma de planta como controle negativo para estudar humanos). Desta
forma, s so considerados expressos os spots que apresentarem intensidade n desvios
padres (sendo n = 1,2,3,... e etc.) acima da mdia dos controles negativos presentes na
plataforma de microarray. Outros tipos de controles podem ser utilizados, como por exemplo,
spots vazios, que esto localizados na plataforma, entretanto no possuem sonda de qualquer
espcie. Este tipo de abordagem tambm evidencia a quantidade de hibridizao inespecfica
da molcula alvo marcada na plataforma de microarray, podendo tambm ser usada para
calcular um thresholdmnimo para considerar um gene expresso.
Normalizao de dados de expresso gnica
No caso de microarray de duas cores, os sinais de intensidade dos dois fluorforos (Cy3
e Cy5) lidos pelo scanner necessitam de processamento prvio (normalizao) antes que seja
possvel a sua utilizao para comparar os padres de expresso gnica em diferentes
situaes biolgicas. A normalizao dos sinais de Cy3 e Cy5 necessria para corrigir
caractersticas intrnsecas de cada um dos fluorforos que afetam as intensidades medidas,
como por exemplo, a menor eficincia da DNA Polimerase em incorporar nucleotdeos
acoplados ao Cy5 nova fita de cDNA formada a partir de mRNA, ou a diferentes eficincias
de deteco dos fluorforos pelo scanner. Esses efeitos ficam evidente quando os dados de

142
expresso so plotados em grficos chamados de disperso M vs. A, onde M=log2Cy5/Cy3 e
A= log2(Cy5*Cy3) (Figura 3). possvel observar que em baixo valores de A, os valores de
M perdem a tendncia de oscilar em torno de 0, em funo de uma menor intensidade de Cy5,
A no-correo dos efeitos relacionados ao fluorforo utilizado pode resultar na deteco de
diferenas de expresso gnicas que no so reais (falso-positivos). A correo do vis
relacionado ao fluorforo utilizado pode ser feita utilizando uma ferramenta chamada LOWESS
(LocallyWeightedScatterPlotSmoother), que normaliza os canais de Cy3 e Cy5 por janelas de
intensidade de sinal (Quackenbush 2002) (Figura 4).



Figura 4: Normalizao LOWESS. No painel da esquerda apresentado o dado bruto. Em cinza esto
assinalados spots com intensidade abaixo do limite de deteco. A linha em vermelho representa a linha
ajustada pelo Lowess. O painel da direita mostra o dado normalizado. Essa estratgia de normalizao
permite a correo de vises relacionados diferenas de incorporao e/ou deteco dos fluorforos
Cy3 e Cy5.


Frequentemente outros procedimentos de normalizao so necessrios antes que seja
possvel a anlise conjunta de dados de diferentes hibridizaes. Ao construir um grfico
representando as frequncias das intensidades obtidas em um conjunto de experimentos de
microarray, pode-se perceber que existe uma heterogeneidade na distribuio dos
dados(Figura 5A). Na maior parte dos experimentos de expresso gnica, em especial usando
plataformas de microarranjos que medem a maior parte dos genes do organismo, possvel
assumir que a expresso da maior parte dos genes no varia entre as vrias condies
testadas. Assim espera-se que as intensidades mdias dos spots presentes nas lminas sejam
comparveis. Nesse caso, a disperso na distribuio das intensidades pode ser corrigida
atravs de um mtodo baseado na energia total, de modo a tornar as intensidades entre
lminas comparveis. Existem vrios mtodos de normalizao a partir da energia total (mdia,
mediana, mdia trimada). Como pode ser observado na Figura 5B, a normalizao pela mdia
aparada aproxima as distribuies de intensidades tornando os dados mais apropriados para
comparaes posteriores. A metodologia consiste em calcular a mdia de cada um dos
experimentos de microarrayque se deseja normalizar, excluindo-se aqueles valores que so
20% mais altos e os 20% mais baixos da lmina. Assim, a mdia ser calculada a partir de
60% dos valores de intensidade restantes. Essa mediana ser ento usada como o divisor de
cada um dos valores de intensidade daquela lmina. Esse novo valor ser a intensidade
normalizada daquele spot.

143

Figura 5: Grficos de distribuio dos valores de intensidade dos spots de 64 lminas de microarrays de
mama antes (A) e depois (B) da normalizao dos dados pela mdia trimada a 40%, excluindo os 20%
de spots mais e menos intensos das lminas. Cada uma das linhas coloridas no eixo das abscissas
corresponde aos resultados dos experimentos de hibridizao de uma amostra de aRNA de tecido
tumoral proveniente de uma dada paciente. Observar o efeito da normalizao no segundo grfico que
concentrou a maior parte dos spots numa faixa de intensidade comparvel em cada uma das amostras.


Identificao de genes diferencialmente expressos
Aps concludas as etapas de filtragem e normalizao, os dados de expresso podem
ser utilizados em anlises com o objetivo de identificar genes diferencialmente expressos em
diferentes situaes biolgicas. As ferramentas mais populares utilizam testes de hiptese
paramtricos, como o teste-t de Student (comparar 2 classes de amostras) e ANOVA
(comparar 3 ou mais classes de amostras). Esses testes apontam para genes diferencialmente
expressos entre 2 ou mais condies, a partir da anlise de um conjunto de medidas do gene
(rplicas) em cada condio, levando em considerao a distncia entre os valores mdios e a
variabilidade das medidas. A significncia estatstica dos valores obtidos no teste-t e ANOVA
(p-value) pode ser determinada por tabelas de referncia (que assumem uma distribuio
normal dos dados) ou a partir de testes de permutao. Na comparao entre 2 grupos de
amostras (ex. amostras de tecido normal e tumoral), o valor de p< 0.005 para um dado gene
indica que existe mais de 99.5% de chance desse gene estar diferencialmente expresso entre
os 2 grupos.
Um aspecto intrnseco anlise estatstica de dados de microarranjo que tipicamente
so realizados milhares testes de hiptese (igual ao nmero de genes presentes nos
microarranjos) utilizando um nmero limitado de amostras. Isso significa que, ao usar o limiar
de p< 0.005 em uma anlise de 40 mil genes, existe a probabilidade de se encontrar 0.005 x
40.000 = 200 genes abaixo desse limiar por acaso. Esse efeito, chamado de problema de
testes mltiplos leva identificao de genes falso-positivos, e deve ser levada em conta nas
anlises de microarranjo. Existem diversas abordagens para controlar a taxa de falso-positivos
(FDR) nas anlises de dados de expresso, onde se busca minimizar a FDR sem perder

144
sensibilidade. Uma das ferramentas mais populares utilizadas para esse tipo de anlise,
SignificanceAnalysisof Microarrays (SAM) (Tusher, Tibshirani et al. 2001), pode ser utilizada
tanto em Excel como no ambiente Linux. Essa ferramenta avalia a diferena de expresso
gnica mdia para um dado transcrito em um grupo de experimentos controle e o compara com
o grupo experimental (por exemplo, tecido tumoral x tecido normal). Paralelamente, a
ferramenta cria um conjunto de dados sorteado randomicamente a partir dos dados originais
fornecidos e realiza a mesma anlise feita com os dados originais. Dessa forma pode-se definir
intervalos de FDR e selecionar genes que apresentem expresso diferencial entre os grupos
estatisticamente significativa, nesse intervalo.
Frequentemente h o interesse de se identificar novos subgrupos de amostras a partir
de semelhanas/diferenas em seus perfis de expresso gnica. Nesse caso utilizam-se
abordagens no-supervisionadas, que no utilizam informao prvia sobre a identidade das
amostras, para agrupar os genes e as amostras a partir dos seus perfis de expresso. Entre
essas tcnicas esto a clusterizao hierrquica, os mapas auto-organizveis e a
clusterizaok-means.



Figura 6: Exemplos de agrupamentos que evidenciam as mudanas significativas no perfil de expresso
de genes de S. mansoni induzidas por TNF-alfa humano detectadas utilizando microarrayde cDNA com
4k elementos. A) Perfis de expresso, agrupados por k-means, de 250 genes com mudanas transientes
em seu padro de expresso (p-value< 0.03). B) Agrupamento Hierrquico de 90 genes com mudanas
sustentadas em seu perfil de expresso (q-value< 0.011). Cada linha representa um gene e cada coluna
representa a mdia do log2 da razo das intensidades entre Tratado/Controle para cada tempo de
tratamento. A intensidade da cor proporcional razo dentro da escala -1 (verde) a +1 (vermelho).


Anotao funcional
Tendo-se o conjunto de genes diferencialmente expressos necessrio compreender
quais processos biolgicos esto alterados nas condies em estudo. Uma abordagem
utilizada a identificao de categorias funcionais baseadas em ontologia gnica (GO Gene
Ontology), alteradas entre os genes diferencialmente expressos. Vrias ferramentas esto
disponveis gratuitamente para anlise em ontologia gnica. Entre elas citamos: BinGO, eGOn,
DAVID entre outros, que realizam testes estatsticos com objetivo de verificar evidncia de
enriquecimento em categorias funcionais especficas entre os genes selecionados,
comparando a frequncias de genes pertencentes a cada categoria no conjunto selecionado
em relao a frequncia total no array(Maereet al. 2005).
Outro tipo de abordagem complementar a busca de redes de interao gnica entre
o grupo de genes diferencialmente expressos. Estas ferramentas computacionais utilizam
abordagens estatsticas para determinar se no seu conjunto de genes existe uma
representatividade dos elementos pertencentes a esta rede. Estas redes so elaboradas a
partir do conhecimento de interaes gnicas disponvel nos bancos de dados e na literatura.
Dentre elas citamos a ferramenta IngenuityPathwayAnalysis, Oncomine 3.0 e ArrayXPath.

145

5. Anlise do perfil de expresso gnica do parasita Schistosoma mansoni
tratado com inibidor de Histona Deacetilase
A regulao epigentica da atividade gnica por processos que envolvem a cromatina
tais como modificaes ps-traducionais de histonas tem uma implicao importante nos perfis
de expresso gnica e consequentemente no fentipo. Para encontrar os genes que sejam
possivelmente regulados por acetilao de histonas em S. mansoni, analisamos o perfil global
do transcriptoma do parasita sob o efeito de inibidor de HDAC, usando cultura de
esquistossmulos tratados com 1M de TSA por 12h, 24h, 48h e 72h, e em paralelo os
respectivos controles com etanol. Este experimento foi baseado em dados de viabilidade do
parasita, que demostram que com 1M de TSA ocorre morte por apoptose, mas esta morte
somente se inicia partir de 3 dias de tratamento (Dubois, Caby et al. 2009). Assim, estamos
medindo a expresso de parasitas ainda viveis, antes da morte celular. O RNA total das
amostras foi extrado, purificado, amplificado e marcado com fluorforos Cy3 e Cy5 de forma
que cada rplica biolgica tivesse rplica tcnica com inverso dos fluorforos. As amostras
foram hibridizadas em plataforma de oligoarray4x180K desenhada por nosso grupo, baseando-
se no "assembly" de 260.035 ESTs disponveis no GenBank e 2.485.177 sequncias de high-
throughputRNA-seq obtidas em nosso laboratrio (Almeida, Amaral et al. 2011) representando
assim todo o transcriptoma do parasita. A figura 7 representa o perfil de mudana da expresso
gnica de esquistossmulos tratados com TSA comparados com controle, em quatro tempos
de tratamento do parasita, e o nmero de genes diferencialmente expressos est representado
na tabela 1.


Figura 7: Efeito do inibidor de HDAC Tricostatina A (TSA) no perfil de expresso gnica de esquistossmulos aps
12h, 24h, 48h e 72h de tratamento. Esquistossmulos tratados com 1M de TSA comparado a controle tratado com
etanol. Para a medida em larga escala da expresso gnica foi utilizada a tcnica de microarrayem plataforma
4x180K. Cada linha horizontal representa um gene; cada coluna representa uma rplica experimental (sendo duas
rplicas biolgicas, S1 e S2, com duas rplicas tcnicas cada, A e B). A intensidade da cor proporcional ao nvel
de expresso de cada gene, representado como o Log2 da razo (Tratado TSA/Controle), na faixa de valores
indicada na escala na parte de baixo da figura; verde indica gene com expresso diminuida no tratado e vermelho
com expresso aumentada no tratado, em relao ao controle. O grfico mostra o clustering hierrquico de genes
com mudana significativa nos nveis de expresso em relao ao controle (q-value 0,05). O nmero de genes
diferencialmente expressos representados neste heat-map est representado na tabela 1.
146
Tabela 1: Nmero de genes expressos e diferencialmente expressos em esquistossmulos
tratados com TSA.
Expresso
Gnica
Genes expressos Genes diferencialmente
expressos (q<0.05)
Genes induzidos
por TSA
Genes reprimidos
por TSA
12 h 7555 3710 1299 2411
24h 7233 3324 2269 1055
48h 7406 3099 882 2217
72h 7515 1737 100 1637


A partir dos dados de genes diferencialmente expressos, alterados por 12 horas de
tratamento, foi possvel identificar redes de interao, significativamente enriquecidas com
genes reprimidos por TSA, e relacionadas a algumas funes interessantes, tais como
modificao ps-transcricional de RNA, organizao celular e replicao e reparo de DNA
(Figura 8).
Com 72 horas de tratamento de esquistossmulos, houve a inibio de genes
interligados relacionados sntese proteica e metabolismo de cidos nuclicos. Como visto por
Dubois, et al, 2009 a apoptose do parasita ativada com a dose de 1M de TSA e h um
aumento de mortalidade significativa aps 3 dias de tratamento. Um dos fatores de ativao de
apoptose pode estar diretamente relacionado a diminuio da expresso dos genes presentes
na network da figura 9(Dubois, Caby et al. 2009).


Figura 8: Rede de genes diferencialmente expressos aps 12 horas de tratamento de esquistossmulos
com TSA. Em vermelho so genes induzidos e em verde os genes reprimidos aps 12 horas de
tratamento com o inibidor de HDAC, e em cinza est o gene no diferencialmente expresso. Esta rede
de genes est relacionada funo de modificao ps-transcricional de RNA, organizao celular e
replicao e reparo de DNA.


147

Figura 9: Rede de genes diferencialmente expressos aps 72 horas de tratamento de esquistossmulos
com TSA. Em verde so os genes reprimidos e em vermelho o gene induzido por TSA. Esta rede de
interao gnica apresenta genes de funo biolgica interessante como sntese proteica e metabolismo
de cidos nucleicos.

PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
IMPORTANTE: Todos os procedimentos devem ser realizados com materiais e
em bancada livres de contaminao com RNAse.

1. Extrao de RNA total com Trizol
Extrao:
1. Recuperar da cultura at 5x10
6
clulas e lavar com PBS.
2. Ressuspender o pellet com PBS e centrifugar 2000 rpm por 5 min.
3. Descartar o sobrenadante e adicionar 1mL de Trizol
4. Incubar por 5 min T.A.
5. Adicionar 200uL de clorofrmio/tubo.
6. Inverter os tubos vigorosamente por 15 s. Incubar por 3 min T.A.
8. Centrifugar 12200g por 15 min 0C.
9. Pegar a fase aquosa cuidadosamente (~500uL) e transferir p/ novo tubo 1.5uL.

Precipitao:
10. Adicionar 500uL de isopropanol. Misturar por inverso.
11. Incubar por 10 min T.A.
12. Centrifugar 12200g por 10 min 0C.
13. Remover o sobrenadante.

148
Lavagem:
14. Adicionar 1mL de etanol 75%. Misturar por inverso.
15. Centrifugar 7000g por 5 min 0C.
16. Remover o sobrenadante, com cuidado o pellet est solto nessa etapa.
17. Deixar os tubos abertos para secar o pellet de 5 10 min, T. A. (cuidado para no deixar
secar totalmente se no o RNA no ir ressuspender.)
18. Ressuspender o pellet em 100uL de gua RNAsefree, pr aquecida a 50C.
19. Deixar no banho por 3 min a 50C para ressuspender totalmente o RNA.


2. Purificao do RNA em colunas de troca-inica
Colunas RNeasy Mini kit Qiagen
Capacidade da coluna: 100ug de RNA.
Todo o procedimento realizado em temperatura ambiente!
I. Ajustar o volume da amostra para 100l com gua RNAsefree.
II. Aliqutar tampo RLT para uso e adicionar B-ME (1l B-ME/100l Tampo RLT). Para
10mL so100l.
III. Separar alquotas de Dnase I (freezer); tampo RDD (geladeira).


A. Mix:
- 100l da amostra,
- 350l de tampo RLT
- 250l de etanol 100%.

1. Aplicar os 700l na coluna.
2. Centrifugar por 15s a 8000g. Substituir o tubo coletor.

B. Tratamento com DNAse:
1. Pipetar 350l de tampo RW1 na coluna.
2. Centrifugar 15s a 8000g.
3. Descartar o filtrado. Manter mesmo tubo coletor.
4. Adicionar na coluna a mistura de 70l de tampo RDD e de 10l de DNase.
5. Incubar 15min temperatura ambiente.
6. Pipetar 350l de tampo RW1 na coluna.
7. Centrifugar 15s a 8000g. Substituir tubo coletor.

C. Lavagem e eluio.
1. Pipetar 500l de tampo RPE na coluna.
2. Centrifugar 15s a 8000g. Descartar o filtrado.
3. Pipetar 500l de tampo RPE na coluna.
4. Centrifugar 2 min a 8000g. Descartar o filtrado.
5. Centrifugar 1 min na velocidade mxima.
6. Transferir a coluna para o tubo coletor.
7. Pipetar 30l de gua Rnasefree.
8. Centrifugar 1min a 8000g.
9. Repetir a eluio se a quantidade esperada for >30ug.
10. Quantificar o RNA total purificado (NanoDrop)
11. Analisar a qualidade do RNA total extrado (BioAnalyser)

149
3. Quantificao de RNA por espectrofotometria (NanoDrop)


Figura 1: Quantificao da concentrao de RNA pelo NanoDrop: aplicao da amostra (1),
formao da tenso superficial entre superfcie e brao ptico (2), limpeza da superfcie aps cada
aplicao (3).

O NanoDrop um espectofotmetro de alta sensibilidade que permite medidas
acuradas de concentrao de cidos nucleicos em amostras de quantidade limitada a partir
da absorbncia a 260 nm. A utilizao de pequnasquantidaes de material possivel pois as
medidas so obtidas em um caminho ptico formado por uma gota de amostra, mantida por
tenso superficial entre o brao ptico e a superfcie do equipamento (Figura 1). Dessa
forma, ele permite a medio da concentrao de amostras com at 1l de volume.
1. Abra o software do NanoDrop.
2. Escolha a opo NucleicAcidMeasurement para quantificao de RNA no marcado ou
a opo MicroArrayMeasurement para a quantificao de RNA marcado.
3. Coloque 1,5 l de gua DEPC na plataforma de leitura. Aperte ok para inicializar o
aparelho.
4. Altere o parmetro sampletype para RNA
5. Calibre o espectrofotmetro com o branco (1,5 l de gua DEPC).
6. Aperte Start Reporter para que as medidas sejam computadas em uma tabela.
7. Faa as medidas com 1,5 l das amostras, utilizando, com cuidado, o leno de papel
Kimwipes EX-L para limpar a plataforma entre uma leitura e outra.
8. Ao final das leituras, aperte Show Reporter para resgatar as medidas obtidas em uma
tabela.

4. Anlise qualitativa de RNA por eletroforese capilar em equipamento Agilent 2100
BioAnalyzer
O BioAnalyser um equipamento que realiza uma eletroforese em microchips de vidro
que possuem uma pequena rede de canais e reservatrios interconectados (Figura 2). Cada
um dos microchips possui espao para a aplicao de 12 amostras por corrida, alm do
marcador de peso molecular. A cada corrida, a rede de canais interna inicialmente
preenchida com um gel (matriz capilar) o qual contm um fluorforo excitado por luz UV e que
possui afinidade para cidos nucleicos. Esse fluorforo se liga as molculas de RNA presentes
na amostra, permitindo a deteco de diferentes bandas aps separao por eletroforese
capilar. Dessa forma, o resultado de uma corrida de eletroforese no BioAnalyser gera uma
imagem de um gel virtual com bandas (Figura 3), semelhante a um gel de agarose, e um
eletroferograma com a deteco dos picos das bandas num dado tempo da corrida. Atravs
dos resultados obtidos, pode-se fazer uma anlise quantitativa e qualitativa das amostras. A
anlise qualitativa de RNA total feita atravs do clculo da razo de intensidade das
subunidades 28S e 18S do RNA ribossomal. Como a subunidade 28S tende a degradar em
maior grau, considerado um RNA total de boa qualidade aquele que apresenta razo
28S/18S aproximadamente igual a 2.
150
Esse mtodo permite uma maior reprodutibilidade e sensibilidade nos resultados em
relao ao gel de agarose comum, j que existe uma alta voltagem impressa em cada uma das
amostras devido ao pequeno espao fsico e temporal, diminuindo a disperso das mesmas.


Figura 2: Parte interna de um micro chip do BioAnalyser mostrando a rede de canais e reservatrios
interconectados. A amostra se move para os micro canais dos poos (1) e ento injetada no canal de
separao (2). A eletroforese ocorre (3) e os componentes so detectados de acordo com sua
fluorescncia (4).



Figura 3: Imagem obtida do BioAnalyser aps eletroforese capilar de amostras de RNA total. A,
exemplos de RNAs totais de boa qualidade. As duas bandas observadas em cada corrida representam
as subunidades 28S e 18S do RNA ribossomal. Note a maior intensidade das bandas de 28S em relao
18S, o que indica a boa qualidade do RNA extrado. B, exemplos de RNAs totais degradados. Nesse
caso, no se pode identificar as 28S e 18S do RNA ribossomal.

A. Preparao do Gel:
- Colocar 550 l de RNA 6000 Nano gel matrix (tampa vermelha) na parte superior do
filtro.
- Centrifugar o filtro em microcentrfuga por 10 min a 1500 g, ou 4000 rpm.
- Descartar o filtro e aliquotar 32,5 l do gel em tubos de 0,5 ml RNAsefree.
- Estocar as alquotas a 4C e usar em um ms.
151
B. Preparao do Mix Gel-Dye:
Retirar os reagentes da geladeira 30 min antes do uso. Proteja o Dye da luz.
- Mixar o RNA 6000 NanoDye concentrado (tampa azul) por 10 segundos e spin.
- Adicionar 0,5 l do dye em 32,5 l do gel filtrado (preparado anteriormente).
- Fechar o tubo e mixar at formar uma mistura homognea. Guardar o dye concentrado
a 4C e no escuro, novamente.
- Centrifugar o tubo por 10 min em temperatura ambiente a 13000 g ou 14000 rpm. Usar
o mix Gel-Dye em um dia.


C. Montagem do Nano Chip:
- Pegar um RNA Nano Chip novo. Retirar da embalagem e posicion-lo da maneira
indicada sobre a ChipPrimingStation, j com a seringa acoplada.
- Pipetar 9,0 l do mix Gel-Dye no pocinho marcado pela letra G em branco. Cuidado
para no fazer bolhas ao dispensar o mix Gel-Dye. Inserir a ponteira da pipeta de
maneira a colocar o mix Gel-Dye no fundo do pocinho.
- Acerte o timer para 30 segundos. Suba o mbolo da seringa at 1 ml e feche a Chip
PrimingStation. Voc ouvir um click quando a PrimingStation estiver fechada
corretamente.
- Pressione o mbolo da seringa at prend-lo no clip.
- Espere por exatamente 30 segundos e ento libere o mbolo, desplugando o clip.
- Espere por 5 segundos e ento puxe devagar o mbolo da seringa at a posio de 1
ml, novamente.
- Abra a Chip Priming Station.
- Pipete mais 9,0 l do mix Gel-Dye nos dois pocinhos marcados pela letra G em preto.


D. Pipetar o RNA 6000 NanoMarker:
- Pipetar 5l de RNA Nano Marker (tampa verde) no pocinho marcado com o smbolo
ladder (escada) e em cada um dos 12 pocinhos reservados para as amostras.
OBS: Se for correr algum pocinho vazio, sem amostra, pipetar 6l de RNA Nano
Marker.


E. Pipetar o marcador de peso molecular (ladder) e as amostras:
- Pegar uma alquota de 1,2 l de RNA 6000 ladder (frezer 20 C).
- Aliquotar as amostras de RNA (RNA total, RNA mensageiro, aRNA) em um volume de
1,2 l. A concentrao das amostras de RNA deve estar entre 50-200 ng/l.
- Desnaturar o ladder e as amostras de RNA a 70 C por 2 min para desfazer estruturas
secundrias.
- Pipetar 1l do ladder e de cada uma das amostras nos respectivos pocinhos.
- Mixar o chip por 1 min a 2400 rpm. Muito cuidado para o chip no pular do Vortex!


F. Inserir o Chip no Bioanalyser:
- Abra o software 2100 expert.
- Abra a tampa do Bioanalyser e insira o chip no local apropriado de maneira delicada.
- Feche cuidadosamente a tampa.
- O software reconhecer o chip.
- Selecione o protocolo e inicie a corrida.


152
G. Descontaminao dos eletrodos:
- Aps a corrida, retire o chip do Bioanalyser, abrindo a tampa do aparelho com cuidado.
Jogue fora o chip.
- Pipete 350 l de RNAseAway (Invitrogen) no limpador de eletrodos.
- Abra a tampa do Bioanalyser e coloque o limpador de eletrodos com RNAseAway.
Feche a tampa e espere por 1 min.
- Abra a tampa e retire o limpador de eletrodos com RNAseAway.
- Em outro limpador de eletrodos, pipete 350 l de gua RNAse-free (DEPC).
- Coloque o limpador de eletrodos com gua no Bioanalyser. Espere mais 1 minuto.
Feche a tampa.


5. Amplificao do cRNA


Figura 4: Procedimento esquemtico de amplificao de cRNA. Gerao de cRNA para um
experimento de microarrays duas cores.
153
Protocolo de amplificao e marcao de RNA resumido (para maiores detalhes ver Low Input
QuickAmpLabelingProtocolAgilent).


Figura 5: Workflow para preparao de amostra e processamento do array.



Preparo de RNA Spike-In
Para cada quantidade de RNA total inicial, deve ser preparado uma diluio de spike
especfica.


Tabela 1: Diluies de Spike A Mix para Cy3 e Spike B Mix para Cy5 para reao de
marcao.


154
Preparo de reao de marcao
- Adicione de 10 a 200ng de RNA total em dois tubos etiquetados para Cy3 e Cy5 em um
volume final de 1,5l.
- Adicione 2l de Spike mix diludo em cada tubo respectivo ao fluorforo (A para Cy3 e B
para Cy5)
- Prepare um mix de T7 promoter primer.
o 0,8l de T7 promoter primer + 1l de gua nuclease-free (volume para cada
reao)
- Adicione 1,8l do T7 promoter primer mix em cada tubo
- Denature o primer e amostra a 65C por 10 min.
- Transfira os tubos para o gelo


Tabela 2:cDNA Master Mix



- Adicione 4,8l do mix de transcrio em cada tubo de reao e incube as amostras a
40 por 2 horas e 70C por 15 min.
- Transfira os tubos para o gelo.

Tabela 3: Mix de Transcrio



- Adicione 6l do mix de transcrio em cada tubo.
- Incube as amostras a 40C por 2 horas.



155
Purificao do RNA amplificado(cRNA)

Para purificar o cRNA recomendado usar a coluna RNeasy mini spin da Qiagen.

Quantificao do cRNA

Antes de hibridizar as amostras no microrray, deve ser quantificado a massa resultante aps as
reaes de transcrio, e a taxa de incorporao do fluorforo na amostra. Para isso deve ser
usado no NanoDrop na funo Microarray. A quantidade total de cRNA (ng/l) obtida e a
concentrao de Cy3 ou Cy5 (pmol/l) so usadas para calcular a atividade especfica da
amostra.

Concentrao de Cy3 ou Cy5 / Concentrao de cRNA x1000 = pmol Cy3 por ug de cRNA

Este valor deve ser superior a 6. Caso no atinja este critrio, ou a quantidade de cRNA gerado
seja inferior a massa necessria para hibridizao, a reao de marcao deve ser refeita.



Preparo das amostras para hibridizao
- Preparar o mix de fragmentao indicado para o formato da plataforma



- Incubar a 60C por exatos 30 min e imediatamente em seguida transferir para o gelo por
um minuto.
- Adicionar 55l (4-pack) ou 25l (8 pack) de GE Hybridization Buffer HI-PRM.
- Logo em seguida partir para a hibridizao do array.



- Hibridizar a 65C por 17 horas.

156
Lavagem e Scanner das lminas



A lavagem das lminas um passo importante, evitando background e hibridizaes
inespecficas no array. Logo em seguida deve ser escaneada em Scanner prprio para as
especificaes do microarray.


Extrao dos Dados
O FeatureExtraction um processo o qual a informao de cada sonda extrada da
imagem da lmina escaneada. A partir destes dados possvel realizar a anlise de medida de
expresso gnica do experimento.


Referncias:

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158



Laboratrio de Genmica e Expresso Gnica Em Cncer
Prof. Dr. Eduardo M. Reis (responsvel);
Gabriel Francisco Zaniboni e Estr Riserio Matos Bertoldi (monitores)





1. ANLISE DA EXPRESSO GNICA POR SEQUENCIAMENTO EM
LARGA ESCALA (RNA-SEQ)




1.1 INTRODUO


O transcriptoma o conjunto completo de RNAs (transcritos) existentes na clula em
um determinado momento e em determinada condio fisiolgica. Os principais objetivos do
estudo do transcriptoma so: descrever todas as espcies de transcritos, incluindo mRNAs e
RNAs no codificadores de protenas curtos e longos; quantificar a mudana dos nveis de
expresso de cada transcrito durante o desenvolvimento ou sob diferentes condies
fisiolgicas ou patolgicas; e descrever a estrutura transcricional dos genes, incluindo stios de
incio da transcrio, extremidades 5`e 3`, variantes de splicing e outras modificaes ps-
transcricionais.
Alm de transcritos classicamente conhecidos e caracterizados, como RNAs
mensageiros (mRNAs), RNAs transportadores (tRNAs), RNAs ribosomais (rRNAs), e pequenos
RNAs com funes estruturais e regulatrias (snRNAs, snoRNAs, microRNAs), estudos
recentes tm demonstrado que a transcrio em eucariotos ocorre de maneira disseminada,
com quase a totalidade das regies no-repetitivas do genoma sendo transcritas (figura 1).
Uma frao significativa do transcritoma composta por RNAs no codificadores de protenas
(ncRNAs), que podem desempenhar funes regulatrias na expresso gnica em situaes
normais e patolgicas.

159

Figura 1: Complexidade transcricional de um gene eucaritico. Regio genmica hipottica com regio
em destaque mostrando que um gene pode ter mltiplos stios de incio da transcrio (TSS, de
Transcriptional Start Site), assim como dar origem a transcritos codificadores e no-codificadores de
protenas intercalados. Exons so mostrados como caixas vermelhas e TSSs como setas verdes. Vrias
classes de RNAs podem ser observadas, incluindo pequenos RNAs com funes conhecidas, tais como
snoRNAs e miRNAs, alm de ncRNAs longos e curtos no caracterizados. Adaptado de (Gingeras
2007).


Diferentes estratgias tm sido utilizadas para detectar e quantificar a diversidade
transcricional em preparaes de RNA, utilizando principalmente tecnologias baseadas na
hibridizao com microarranjos de DNA, ou pelo sequenciamento de bibliotecas de cDNA
geradas a partir da transcrio reversa do RNA original.
Microarranjos de DNA consistem em conjuntos de oligonucleotdeos curtos (25 a 60 nt,
chamados de sondas) imobilizados em um substrato slido e complementares aos RNAs cuja
presena se pretende investigar. Preparaes de RNAs so marcadas fluorescentemente,
incubadas com os microarranjos, e as sondas com complementariedade ao RNA transcrito
hibridizam ao seu alvo complementar. Uma vez que os transcritos so marcados com corantes
fluorescentes, a intensidade da luz pode ser usada como uma medida da expresso gnica.
Abordagens baseadas em hibridizao tm em geral relativo baixo custo e analisam os
transcritos em larga escala. Entretanto, estes mtodos possuem limitaes, tais como:
dependncia de conhecimento prvio da sequncia que se deseja estudar; altos nveis de
background em funo de hibridizao cruzada; e uma faixa de deteco limitada, em funo
tanto do background quanto da saturao do sinal.
Mtodos baseados em sequenciamento, por outro lado, determinam diretamente a
estrutura primaria do cDNA. A figura 2 demonstra o avano dos diferentes mtodos de
sequenciamento ao longo dos ltimos 30 anos, em funo do nmero de nucleotdeos
depositados em bancos de dados pblicos.

160


Figura 2: Sequncias de nucleotdeos depositadas no GenBank (losangos, linha fina) e no SRA
(Sequence Read Archive, crculos, linha espessa). O desenvolvimento de tecnologias de
sequenciamento de segunda gerao e single-molecule sequencing tem aumentado drasticamente o
nmero de sequncias depositadas em bancos de dados pblicos. Menos de um ano aps seu incio, o
SRA j tinha ultrapassado o GenBank e agora corresponde a mais de 95% de todas as novas
sequncias depositadas. Adaptado de (Thompson and Milos 2011).


Os primeiros sequenciamentos de bibliotecas de genes expressos foram realizados
utilizando-se a tcnica de Sanger automatizada, baseada em gis de poliacrilamida ou
sequenciamento capilar (Boguski et al. 1994). Os instrumentos baseados em sequenciamento
capilar, que compunham esta primeira gerao de sequenciadores, so capazes de processar
centenas de amostras por semana, tendo permitido o sequenciamento do genoma humano.
Contudo, esta tecnologia cara para a anlise de transcritomas, e geralmente no
quantitativa. A partir do fim dos anos 1990 e incio dos anos 2000, surgiram estratgias para
sequenciamento de trechos definidos de transcritos (tags) : serial analysis of gene expression
(SAGE) (Velculescu et al. 1995), cap analysis of gene expression (CAGE) (Shiraki et al. 2003)
e massively parallel signature sequencing (MPSS) (Brenner et al. 2000). Apesar de permitir o
sequenciamento de transcritos em larga-escala, de forma quantitativa, os tags obtidos por
estas tcnicas so curtos (< 25 nt) e uma grande frao no pode ser mapeada unicamente no
genoma de referncia, o que limita o uso das mesmas na anotao da estrutura do
transcriptoma.
A segunda gerao de sequenciadores surgiu em 2005 com o lanamento do
pirossequenciamento de DNA pela empresa 454, aumentando em 100 vezes a escala de
sequenciamento. Esse avano foi seguido pelo lanamento de plataformas de sequenciamento
por sntese ainda mais massivos, tais como o Solexa/Illumina e ABI SOLiD, que aumentaram a
escala e diminuram os custos.
Mais recentemente, o surgimento do single-molecule sequencing permitiu o
sequenciamento de DNA e RNA diretamente de amostras biolgicas. O single-molecule
sequencing tem fornecido solues para algumas das limitaes da segunda gerao de
sequenciadores, tais como a reduo da quantidade de amostra e a eliminao da
necessidade de amplificao de DNA, o que evita a introduo de artefatos quantitativos e
qualitativos nas seqncias. Entre estas tecnologias esto o Helicos Sequencer (Harris et al.
2008) e o Pacific Biosciences (Korlach et al. 2008), j disponveis no mercado. A tendncia de
barateamento do custo de sequenciamento foi evidenciada recentemente pelo lanamento
comercial de uma tecnologia que dispensa o uso de anlogos fluorescentes e que baseada
no monitoramento de mudanas de pH decorrentes da incorporao de nucleotdeos (Ion
Torrent) (Mardis 2013).

161

A segunda gerao de sequenciadores baseadas na leitura massiva e paralela de
milhes de fragmentos de DNA aumentou drasticamente a escala de gerao de informao do
transcriptoma, eliminando a necessidade de construo de bibliotecas de cDNA baseadas na
clonagem em vetores bacterianos. Embora as tecnologias de segunda gerao tenham sido
inicialmente inferiores ao sequenciamento clssico em termos de comprimento das sequncias
e da taxa de erro (cerca de 2%, contra 0,1%), essas limitaes tm sido superadas pela
enorme quantidade de dados gerados (alta cobertura) e melhorias na qumica do processo.
A tabela 1 compara as performances e aplicaes entre microarranjos, sequenciamento
de cDNA ou de ESTs e RNA-Seq.


Tabela 1: Vantagens de RNA-Seq comparado a outros mtodos para estudo de
transcriptomas. Adaptado de (Wang et al. 2009).




O barateamento do sequenciamento de DNA em larga escala permitiu o
desenvolvimento de metodologias para o mapeamento e quantificao de transcriptomas
denominado RNA-Seq (sequenciamento de RNA), que tem grandes vantagens em relao s
outras abordagens j citadas, e tem mudado drasticamente a maneira atravs da qual
transcriptomas so analisados.
Algumas plataformas de nova gerao possibilitam o sequenciamento de molculas de
RNA diretamente (Ozsolak et al. 2009). No entanto, na maioria dos experimentos de RNA-Seq
nas plataformas atuais, necessria uma etapa anterior ao sequenciamento em que a
populao de RNAs (total ou fracionado, tais como poliA+ RNAs ou RNAs curtos) convertida
a uma biblioteca de fragmentos de cDNA com adaptadores ligados a uma ou duas
extremidades (figura 3).


162


Figura 3: Aps fragmentao por mtodos qumicos ou enzimticos, RNAs longos so convertidos a
uma biblioteca de fragmentos de cDNA por meio de transcrio reversa. Em seguida, adaptadores de
sequenciamento (azul) so acrescentados a cada fragmento de cDNA. Sequncias de cDNA, que variam
de aproximadamente 50 a 1000 pares de bases, dependendo da tecnologia utilizada, so sequenciadas
em larga escala. As sequncias resultantes podem ser alinhadas com o genoma ou transcriptoma de
referncia, e podem ser classificadas em diferentes tipos, como, por exemplo, seqncias exnicas,
sequncias de juno intron-exon e sequncias correspondentes cauda poliA. Estes trs tipos podem
ser usados para gerao de um perfil de expresso para cada gene com resoluo de nucleotdeo, como
ilustrado no painel inferior. Uma ORF (Open Reading Frame) de levedura com um intron mostrada.
Adaptado de (Wang et al. 2009).


Embora ainda seja uma tecnologia em desenvolvimento, RNA-Seq oferece vrias
vantagens em relao a mtodos baseados em hibridizao, tais como:

a. Capacidade de deteco de transcritos novos, no previamente caracterizados, que
correspondem a sequncias genmicas ainda no descritas. Em abordagens baseadas em
hibridizao, necessrio conhecimento prvio das sequncias genmicas que se deseja
analisar. Essa caracterstica torna os sequenciadores de nova gerao especialmente teis
para organismos no-modelos, ou organismos dos quais se tem pouca quantidade de
dados genmicos disponveis;
b. Nvel baixo de sinal background, visto que as sequncias de DNA podem ser mapeadas
unicamente em regies do genoma. Alm disso, RNA-Seq no tem um limite superior para
quantificao, o que faz com que esta tcnica permita a quantificao de transcritos em
uma ampla faixa de nveis de expresso. Por outro lado, as tcnicas baseadas em
hibridizao perdem sensibilidade em nveis baixos ou muito altos de expresso;
c. Menor quantidade de amostra inicial, visto que no h passos de clonagem;


163



d. Nveis elevados de reprodutibilidade entre experimentos, tanto para rplicas tcnicas
quanto biolgicas (Cloonan et al. 2008).


O sequenciamento de transcritos pode ser utilizado para responder vrias questes
biolgicas como, por exemplo: identificao de genes de fuso em amostras de cncer,
deteco de splicing alternativo, identificao de novos genes, edio de RNA, estimativa da
abundncia relativa de transcritos, entre outros. A maioria dos estudos de RNA-Seq tem focado
principalmente na gerao de diferentes perfis de expresso gnica entre amostras. A
tendncia que, com o barateamento do sequenciamento, ocorra a prevalncia desse mtodo
para a anlise de expresso gnica diferencial frente aos microarranjos.
Por outro lado, alguns desafios ainda permanecem a ser superados pelas novas
tecnologias de sequenciamento que esto em fase de desenvolvimento. Por mais que a
quantidade de amostra inicial necessria para gerao de bibliotecas de cDNA seja reduzida,
em algumas aplicaes especficas, como anlise de transcritos de clulas nicas, passos
adicionais podem ser necessrios. Alm disso, protocolos adicionais para gerao de
bibliotecas fita-especficas (que mantenham a informao de qual fita do DNA genmico foi
usada como molde para transcrio do RNA) devem ser elaborados para algumas das
plataformas de sequenciamento de segunda gerao.
Uma caracterstica nica de experimentos de RNA-Seq a profundidade do
sequenciamento ou cobertura, que frequentemente estimada como o nmero de sequncias
mapeadas. Genes so transcritos em diferentes nveis em cada transcriptoma. Devido
amostragem randmica da tcnica de RNA-Seq, necessrio um grande nmero de
seqncias para medir os transcritos que so expressos em nveis baixos. Assim, para um
dado experimento, crtico decidir pelo aumento da profundidade do sequenciamento para se
ter uma medida mais acurada dos genes que so transcritos em baixos nveis, ou pelo
aumento do tamanho da amostra com nmero limitado de cobertura para cada amostra.
Outro desafio que os conjuntos de dados gerados so grandes, complexos e de
interpretao no muito simples, embora haja diversos mtodos e ferramentas disponveis para
a anlise. Alm disso, existe uma constante evoluo das ferramentas de anlise, das formas
de interpretao das informaes e dos prprios sequenciadores.
Uma viso geral do pipeline de um tpico processamento de RNA-seq para detectar a
expresso gnica diferencial est apresentada na figura 4 (Oshlack et al. 2010a).

164



Figura 4: Resumo do pipeline de anlises de RNA-Seq para deteco da expresso gnica diferencial.
As etapas no pipeline esto representadas por caixas vermelhas; os componentes metodolgicos esto
representados em caixas azuis e com textos em negrito. Exemplos de softwares e mtodos para cada
etapa so mostrados em textos nas caixas azuis. Adaptado de (Oshlack et al. 2010b).


Tipicamente, uma anlise de RNA-seq envolve os seguintes passos: Em casos de
organismos modlo, em primeiro lugar, as sequncias so mapeadas (alinhadas) no
genoma ou no transcritoma de referncia. Em seguida feita uma reconstruo dos transcritos
presentes na amostra de RNA. Os transcritos reconstrudos so anotados em relao a genes
e formas cannicas e alternativas de RNAs j conhecidos. Em seguida, os dados so
normalizados entre as diferentes amostras e so utilizados testes estatsticos para encontrar
diferenas de expresso estatisticamente significativas entre condies experimentais.
Finalmente, a partir das listas de expresso gnica so executadas anlises para identificao
de redes de interao gnica e de vias moleculares alteradas, semelhantes aos
realizados em experimentos de expresso gnica usando microarranjos de DNA.
Uma lista de ferramentas de cdigo aberto comummente utilizadas para essas anlises
pode ser encontrada no link http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_RNA-Seq_bioinformatics_tools.

165


1.2 PROCEDIMENTO

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL



Nessa atividade terico/prtica sero abordados mtodos bem estabelecidos para
analisar a expresso de genes em clulas eucariticas utilizando dados de RNA-Seq. Como
modelo experimental sero utilizados dados de sequenciamento em larga-escala do
transcriptoma de uma linhagem celular derivada de tumor de prstata (LNCaP). Foram
sequenciadas em nosso laboratrio bibliotecas de cDNA provenientes de culturas de clulas
LNCaP tratadas ou no com o hormnio andrgeno utilizando a plataforma 454-Roche. O
desenho experimental do procedimento est descrito na figura 5 abaixo:



Figura 5: Desenho experimental: clulas LNCaP foram tratadas por 24 horas com o hormnio
andrgeno sinttico ou seu veculo. Aps extrao do RNA total e seleo de RNAs poliA+, bibliotecas
de cDNA orientadas foram geradas e sequenciadas na plataforma 454/Roche. As anlises de expresso
gnica diferencial e de identificao de novos transcritos sero realizadas ao longo do curso.


Os objetivos da prtica sero:
1) identificar genes e transcritos expressos na linhagem LNCaP;
2) identificar genes e formas alternativas de splicing diferencialmente expressos aps
tratamento com andrgeno;
3) Analisar os resultados obtidos no contexto de dados genmicos disponveis;

Os dados de RNA-Seq sero processados de acordo com o protocolo Tuxedo descrito
por Trapnell e colaboradores (Trapnell et al. 2012), utilizando programas de cdigo aberto
(TopHat, Bowtie) que rodam no ambiente Linux.
A anotao dos trancritos identificados no experimento de RNA-Seq ser realizada
utilizando a suite de anlise Galaxy (http://main.g2.bx.psu.edu/). Esta ferramenta acessvel
pela internet e permite a manipulao de dados genmicos e realizao de anlises
sofisticadas sem a necessidade de conhecimento prvio de computao.


166
Referncias:

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