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C h e mk e y s - L i b e r d a d e p a r a a p r e n d e r

w w w . c h e m k e y s . c o m
* Autor para contato
1
Faixa Linear de Uma Curva de Calibrao
Fbio Augusto
Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Qumica
Criado em Junho de 1997
Atualizado em Maro de 2000
Dados experimentais
Curva de calibrao
Tcnicas analticas
Regresso linear
Tcnicas numricas
Estruturas lineares
Faixa linear
Para as tcnicas analticas consideradas clssicas (ex.:
gravimetria e volumetria), o resultado da determinao
analtica provm da combinao de medidas de massas
e/ou volumes e de consideraes sobre a estequiometria
dos processos qumicos envolvidos. J para as chamadas
tcnicas instrumentais, preciso medir alguma propriedade
fsico-qumica da amostra, que possa ser correlacionada
com a sua composio. A natureza da medida efetuada
depende da tcnica empregada, tal como a luz absorvida
ou emitida (mtodos espectrofotomtricos), a corrente,
potencial ou resistncia eltrica (mtodos eletroanalticos)
e a rea ou altura de picos cromatogrcos (mtodos
cromatogrcos), dentre outros.
P a r me t r o s d e u ma c a l i b r a o l i n e a r
Chemkeys. Licenciado sob Creative Commons (BY-NC-SA)
roger@iqm.unicamp.br
I n f o r ma e s d o Ar t i g o
Histrico do Artigo
Palavras-Chaves
R e s u mo
Sistemas lineares so extremamente teis na representao de dados
experimentais e as curvas de calibrao so os mais conhecidos. Nestes
casos, os desvios da linearidade so geralmente atribudos a efeitos
qumicos e fsicos que no foram preliminarmente levados em conta e que
tornam-se agentes complicadores na anlise matemtica dos dados. As
tcnicas numricas utilizadas para avaliar o comportamento de sistemas
lineares e estabelecer a faixa linear sero abordadas no texto a seguir.
Nas tcnicas clssicas, a existncia de relaes
matemticas bem denidas entre as medidas e a massa ou
concentrao da espcie a ser quanticada, provenientes
da estequiometria das reaes envolvidas, simplica
os clculos. O mesmo no ocorre com as tcnicas
instrumentais. A correlao entre o sinal medido (luz
absorvida ou emitida, corrente eltrica, rea de pico
cromatogrco, etc.) e a massa ou concentrao da espcie
a ser quanticada muito raramente conhecida a priori.
Na maior parte dos casos, a relao matemtica entre o
sinal e a concentrao ou massa da espcie de interesse
deve ser determinada empiricamente a partir dos sinais
medidos para massas ou concentraes conhecidas dessa
espcie. Essa relao matemtica, muitas vezes, pode ser
Rogrio Custodio *
Joo Carlos de Andrade
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Us o d a r e g r e s s o l i n e a r
expressa como uma reta por
S=aQ+b Equao 1
onde S o sinal medido, Q a massa ou concentrao
da espcie a ser quanticada e a e b os coecientes
angular e linear da reta, respectivamente. Essas retas so
conhecidas como curvas de calibrao. Matematicamente,
a estimativa dos coecientes de uma curva de calibrao a
partir de um conjunto de medidas experimentais pode ser
efetuada usando o mtodo matemtico conhecido como
regresso linear [1-3]. Alm dos coecientes de regresso
a e b, tambm possvel calcular, a partir dos pontos
experimentais, o coeciente de correlao r
2
(ou r). Este
parmetro permite uma estimativa da qualidade da curva
obtida, pois quanto mais prximo da unidade, maior a
preciso do conjunto de pontos experimentais e menor a
incerteza dos coecientes de regresso estimados.
A regresso linear [2] faz parte do repertrio bsico
de qualquer estudante da rea das Cincias Exatas.
As calculadoras cientcas mais comuns trazem, pr-
programado, o algoritmo para este clculo. Porm, ainda
que operacionalmente simples, certos aspectos do uso de
regresso linear merecem uma discusso adicional e um
destes aspectos a faixa linear dinmica. Em qualquer
tcnica instrumental, a relao linear simples descrita
pela Equao 1 s vlida at uma determinada massa
ou concentrao da espcie medida. Por exemplo, no
caso da espectrofotometria de absoro, a Lei de Beer,
que estabelece uma relao linear entre concentrao da
espcie absorvente e absorbncia, s vlida at uma
concentrao limite. Qualquer incremento adicional na
concentrao acima deste limite provoca um desvio no
valor da absorbncia medida, em relao ao que o que
seria esperado por uma curva de calibrao estimada
teoricamente ou usando medidas efetuadas com
concentraes menores. A Figura 1 mostra uma curva de
calibrao, onde so correlacionadas as concentraes de
solues aquosas de KMnO
4
e suas absorbncias.
O intervalo de massas ou concentraes dentro do qual
pode-se construir uma curva de calibrao linear a faixa
linear dinmica. Ainda que as causas para a perda de
linearidade sejam caractersticas de cada tcnica, este
um fenmeno que pode ocorrer com qualquer conjunto
de dados. Assim, o clculo dos coecientes de regresso
de uma curva de calibrao deve ser acompanhado de
uma cuidadosa inspeo, para vericar se todos os pontos
a serem usados esto dentro da faixa linear dinmica
correspondente.
Figura 1 - Curva de absorbncia a 545 nm em funo da concentrao,
para solues de KMnO4 . At a concentrao limite (indicada
pela seta), a absorbncia medida (pontos) coincide com a curva de
calibrao linear (linha cheia). A partir desta concentrao limite (40
mg /L), a relao linear no mais obedecida.
F a i x a l i n e a r
No existe uma denio universal para o estabelecimento
correto da faixa linear, e muito menos um procedimento
sistemtico bem estabelecido para sua determinao.
Sua avaliao geralmente baseada em dois parmetros,
calculados a partir dos pontos experimentais disponveis
para construo da curva:

[a] Resduos de Interpolao, dados por:
Equao 2
onde o resduo de interpolao para o i-simo ponto
experimental, R
i
, calculado como a diferena percentual
entre o sinal medido S
i
e o correspondente sinal interpolado
na curva <S>
i
.
Dentro da faixa linear dinmica e na hipottica ausncia
de erros indeterminados (i.e., com r
2
= 1), todos os
pontos teriam R
i
= 0%. Na prtica, sempre existem
erros experimentais e portanto Ri 0% para qualquer
ponto experimental usado na construo da curva. Se
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for construdo um grco dos R
i
em funo das massas
ou concentraes, dentro da faixa linear observar-se-
que os resduos se distribuiro aleatoriamente entre
valores positivos e negativos. Entretanto, para massas
ou concentraes maiores que o limite da faixa linear,
geralmente o sinal medido menor que o sinal interpolado
a partir da curva de calibrao. Deste modo, do nal
da faixa linear em diante, a tendncia geral de todos
os valores de R
i
serem negativos. A Figura 2 mostra os
resduos de interpolao obtidos com os dados empregados
na construo da Figura 1.
Figura 2 - Resduos da interpolao, em funo da concentrao.
At o limite da faixa linear, a distribuio dos resduos entre valores
negativos e positivos aleatria; aps o nal da faixa linear, a
tendncia geral de R
i
< 0.
A inspeo de grcos de resduo em funo de massa ou
concentrao pode auxiliar o usurio a estabelecer a faixa
linear dos seus dados.
[b] Razes (Sinal / Massa), ou (Sinal / Concentrao),
denidas por:
Equao 3
onde a razo sinal/massa ou sinal/concentrao para
o i-simo ponto da curva analtica, (S/Q)i, calculada
a partir do correspondente sinal medido Si, da massa
ou concentrao Qi correspondente e do interceptor
da curva de calibrao b. A denio exata dos valores
S e Q depender da tcnica analtica em estudo. No
caso da espectrofotometria de absoro, as curvas de
calibrao so construdas a partir de pares absorbncia
(que corresponde a S na Equao 3) e concentrao
(correspondente a Q). Para cada tcnica analtica, sero
usados os parmetros equivalentes: em potenciometria,
potencial de cela e concentrao; em cromatograa, rea
do pico cromatogrco e massa, etc.
Na ausncia de erros indeterminados (i.e., com em r
2
= 1)
e dentro da faixa linear, pode-se provar que (S/Q)i = a
para todos os pares de valores experimentais usados para
construir a curva. Na presena de erros indeterminados
(r
2
< 1) e dentro da faixa linear, (S/Q)i a. Se (S/Q)i <<
a ou (S/Q)i >> a, ento o dado pode ser assumido como
estando fora da faixa linear. Nesta discusso, sero
considerados na faixa linear os pontos com valores de (S/
Q)i no intervalo (1,00 0,05)a, isto , pontos cujas razes
sinal/massa ou sinal/concentrao no diram mais do
que 5% do coeciente angular da reta. Este intervalo de
tolerncia foi sugerido com base nas normas da IUPAC
para Cromatograa [4], e aqui ser proposto como uma
regra geral, aplicvel a curvas de calibrao de qualquer
tcnica analtica.
S i s t e m t i c a i t e r a t i v a
A sistemtica iterativa proposta para clculo de uma
curva de calibrao, com determinao simultnea da
faixa linear, baseada no exame de valores de Ri e (S/Q)i
e pode ser descrita pelas seguintes etapas:
Inspeo preliminar. Colocar em um grco os pontos
experimentais disponveis e vericar visualmente se
existe algum desvio de linearidade e aproximadamente
a partir de que valor ele se manifesta.
Estimativa da Curva de Calibrao para a parte linear.
Calcular os coecientes a, b e r para uma curva de
calibrao, descartando os pontos preliminarmente
eliminados na etapa anterior. Calcular tambm os
limites inferior (LI) e superior (LS) a partir dos quais
as razes (sinal / massa) ou (sinal / concentrao)
indicam que um ponto est fora da faixa linear LI =
0,95a e LS = 1,05a, respectivamente.
Clculo dos resduos de interpolao e razes sinal /
massa ou sinal / concentrao. Com os coecientes
a e b preliminarmente calculados em [b], calcular
para todas as massas ou concentrao disponveis,
inclusive as preliminarmente descartadas, os resduos
de interpolao e as razes (sinal / massa) ou (sinal
/ rea). Construir grcos dos resduos em funo
das massas ou das concentraes e das razes sinal /
massa ou sinal / concentrao em funo das massas
ou concentraes.
Convalidao do limite da faixa linear. Inspecionar
os valores calculados em [c] e vericar se existe
algum ponto preliminarmente includo na curva de
calibrao que, por comparao com os limites de
corte calculados em [b] deveria ser excludo (i.e.,
se a correspondente razo (sinal / massa) ou (sinal
a.
b.
c.
d.
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/ concentrao) menor que LI ou maior que LS)
ou se algum ponto inicialmente excludo deveria ser
considerado para o clculo da curva de calibrao.
Incluso ou excluso de novos valores na curva. Se
o exame feito em [d] indicar que todos os pontos
preliminarmente includos ou excludos da curva o
foram corretamente, o procedimento est encerrado.
Caso contrrio, repetir as etapas de [b] a [d], incluindo
ou excluindo os pontos necessrios, at que mais
nenhum valor deva ser descartado ou considerado
para o clculo da curva de calibrao.
Este tipo de sistemtica pode ser facilmente implementado
empregando planilhas de clculo eletrnicas. Os programas
de planilhas como Lotus 1-2-3, Excel e Quattro Pro so
comumente associados a aplicaes contbeis e nanceiras.
Entretanto, esses programas tm recursos que permitem
a soluo de problemas cientcos de forma bastante
simples e conveniente. Eles so especialmente adequados
quando so envolvidos clculos repetitivos, onde o uso de
calculadoras especialmente trabalhoso e sujeito a erros de
operao. Os programas de planilhas incorporam a maior
parte das funes matemticas e estatsticas comuns.
Operaes de anlise de dados mais complexas, como
por exemplo a anlise de variana e clculos matriciais,
podem ser realizadas por pacotes de rotinas pr-
programadas que os acompanham. Alm disso, possvel
a construo diretamente de grcos pelos programas
de planilhas. Uma outra vantagem desses programas
que, uma vez construda uma planilha para a soluo
de um determinado problema, com a simples insero
de novos dados os resultados e grcos construdos so
automaticamente atualizados, dispensando a redigitao
de frmulas. Estas aplicaes cientcas incluem o clculo
e avaliao de curvas de calibrao analticas [5, 6], o
modelamento e a predio de comportamento de sistemas
analticos [7, 8] e a aquisio e processamento de dados
em tempo real [9], dentre outras.
e.
E mp r e g o d a p l a n i l h a
Ser demonstrado a seguir o uso do programa de
planilha eletrnica Microsoft Excel 5.0 para Windows
na implementao da sistemtica de clculo para a
determinao de uma curva de calibrao. Os dados deste
exemplo (Tabela 1) so provenientes de experimentos
com um Cromatgrafo Gasoso com Detector por
Emisso Atmica em Plasma de Hlio Induzido por
Microondas (CG-PIM) [10], e referem-se s reas de picos
cromatogrcos de n-decano. Em Cromatograa Gasosa,
as curvas de calibrao correlacionam a rea dos picos com
a massa de substncia eluda que chega ao detector. No
entanto, o procedimento adotado neste exemplo vlido
para qualquer curva de calibrao linear.
Tabela 1. rea A dos Picos Cromatogrcos, em unidades, em funo
das massas de n-decano (em ng) para um sistema CG-PIM.
m A
5,66 139170
11,33 265907
16,99 379767
22,66 521607
28,32 626827
33,99 707497
39,65 805867
45,32 823577
Para a construo da curva de calibrao (A = am + b) os
dados listados devem ser inicialmente inseridos em uma
planilha de clculos vazia. A Figura 3 mostra o aspecto
da planilha aps a insero dos dados. As massas foram
colocadas na coluna A da planilha, na faixa de celas de
A3 a A10, e as reas correspondentes na coluna B, na
faixa de celas de B3 a B10. Notar que nas celas A2 e B2
foram digitadas legendas para as colunas correspondentes
de dados. Apesar de no ser estritamente necessrio para
os clculos subsequentes, esta operao recomendvel
para tornar mais clara e compreensvel a planilha em
construo.
Figura 3 - Aspecto da planilha para clculo da curva de calibrao aps
insero dos dados.
Aps a entrada dos dados, o passo seguinte uma inspeo
visual, atravs de um grco de rea x Massa, construdo
na prpria planilha. Nesta primeira vericao, pode-
se detectar os possveis pontos discrepantes (outliers)
do conjunto, alm ser feita uma avaliao inicial da
linearidade da curva. A Figura 4 mostra o grco rea x
Massa, construdo na planilha com os dados acima.
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Figura 4 - Grco rea x Massa para inspeo inicial dos dados.
Fica claro nesta primeira avaliao que a rea no varia
linearmente com a massa em toda a faixa coberta pelos
dados. Como os ltimos pontos fogem visivelmente da
linearidade, alguns dados devem ser descartados.
T u t o r i a l
[1] Atravs do grco rea x Massa construido, vericar
quais pontos do conjunto podem, com razovel certeza,
ser includos na faixa linear. Pela Figura 4, percebe-se que
a curva aparentemente linear at o quarto par de pontos
rea - massa (A = 521607 unidades; m = 22,66 ng).
[2] Estimam-se os coecientes de regresso para uma reta
cobrindo esta faixa selecionada de pontos. A sintaxe das
frmulas para clculo dos coecientes angular a, linear b e
de correlao r (ou r2) nas verses em ingls do programa
de planilhas Excel :
Coeciente Angular: =SLOPE (Valores de Y; Valores
de X);
Coeciente Linear: =INTERCEPT (Valores de Y;
Valores de X) e
Coeciente de Correlao: =CORREL (Valores
de Y; Valores de X) onde Valores de Y e Valores de
X referem-se, respectivamente, s faixas de celas
que contm as reas e as massas. Para calcular os
coecientes de regresso para os quatro primeiros
pontos experimentais (massas nas celas de A3 a A6 e
reas nas celas de B3 a B6), as frmulas acima devem
ser digitadas em celas limpas da planilha: =SLOPE
(B3..B6;A3..A6); =INTERCEPT (B3..B6;A3..
A6) e =CORREL (B3..B6;A3..A6). Neste exemplo,
usaram-se as celas B13, B14 e B15 para conter estes
coecientes.

Observao: Nas verses em portugus do


programa Excel, os equivalentes das funes citadas
acima so, respectivamente, =INCLINAO(...),
=INTERCEPTAO(...) e =CORREL(...). A forma
de uso e sintaxe dessas funes a mesma da verso em
ingls.
[3] Calculam-se as reas interpoladas <A> usando os
coecientes de regresso estimados anteriormente para
todos os valores experimentais disponveis. Na planilha,
inicialmente calcula-se <A> para o primeiro ponto
da curva digitando-se, na cela vazia imediatamente
direita daquelas usadas para os dados (C3), a frmula
= $B$13*A3+$B$14 ($B$13 = cela com o coeciente
angular a, $B$14 = coeciente linear b e A3 = massa
para o primeiro ponto). Para os demais pontos, copia-
se o contedo da cela C3 para a faixa de celas de C4 a
C10. Deve ser lembrado que uma cela cujos endereos so
digitados entre cifres (por exemplo, $B$13) assumida
pela planilha como constante. Pode-se ento obter a curva
de calibrao provisria (Figura 5).
Figura 5 - Grco rea x Massa e curva de calibrao antes da
denio da Faixa Linear.
[4] Estimam-se os resduos de interpolao para todos os
valores experimentais. Na cela direita da usada para o
primeiro valor de <A> (D3), digita-se =B3-C3, e copia-se
esta cela para a faixa correspondente aos demais valores
(D4 a D10).
[5] Calculam-se as razes rea / massa para todos os
pontos experimentais: na cela E3, calcula-se A/m para
o primeiro ponto, atravs de =(B3-$B$14)/A3 e copia-se
para a faixa de E4 a E10.
[6] Determinam-se os limites inferior e superior de
tolerncia para a razo A/m atravs das equaes
=0.95*$B$13 (limite inferior) e =1.05*$B$13 (limite
superior). Usaram-se aqui as celas F13 e F14 para estas
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frmulas, respectivamente. A Figura 6 mostra o aspecto
da planilha, aps a insero das frmulas acima. Tambm
foram inseridas, em celas adequadas, as legendas para os
valores calculados como discutido anteriormente.
Figura 6 - Planilha aps clculo dos coecientes de regresso (B13,
B14 e B15), dos limites para o intervalo de tolerncia das razes A/m
(F13 e F14), das reas interpoladas <A> (C3 a C10), dos resduos de
interpolao (D3 a D10) e das razes A/m (E3 a E10).
[7] Prepara-se um histograma (grco de colunas) dos
resduos de interpolao (calculados na faixa de celas D3
a D10). A Figura 7 exibe o grco para este exemplo.
Figura 7 - Histograma dos resduos de interpolao, antes da denio
da Faixa Linear.
[8] Prepara-se um grco das razes A/m (E3 a E10) e
dos limites da faixa de tolerncia (F13 e F14), em funo
da massa (Figura 8).
[9] Atravs destes dois grcos, verica-se a existncia de
outros pontos que podem ser adicionados ou devem ser
excludos da reta. A razo A/m do quinto ponto da srie
(A = 626827 unidades; m = 28,32 ng) encontra-se dentro
da faixa admitida pelos limites de tolerncia calculados,
o que indica que este ponto pode ser includo na reta. O
histograma dos resduos concordante com esta avaliao.
At este ponto, a distribuio dos resduos tende a ser
aleatria ao redor de zero, mas a partir do sexto ponto
os resduos mostram claramente um padro tpico de no
linearidade.
Figura 8 - Razes A/m () e limites superior e inferior do limite de
tolerncia para as razes A/m, antes da renio da Faixa Linear.
[10] Caso algum ponto deva ser includo ou excludo da
faixa usada nos clculos, editar as frmulas dos coecientes
de regresso (celas B13, B14 e B15), de modo que as faixas
de celas referidas nestas frmulas incluam (ou excluam) os
pontos selecionados no passo anterior. Por exemplo, a cela
B13, que contm a frmula =SLOPE (B3..B6;A3..A6)
deve ser alterada para =SLOPE (B3..B7;A3..A7), para
incluir o quinto par rea/massa (contido em A7 e B7) no
cmputo do coeciente angular.
Alteradas as frmulas dos coecientes de regresso, a
planilha (Figura 9) recalcula automaticamente todos
os valores que dependem destes coecientes: reas
interpoladas, resduos, razes rea/massa e limites
de tolerncia para A/m. Os grcos dos resduos de
interpolao (Figura 10) e das razes A/m (Figura
11) tambm so corrigidos para os novos valores, sem
interveno do usurio:
Figura 9 - Planilha aps insero do ponto #5 no clculo dos
coecientes de regresso.
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Figura 10 - Histograma dos resduos de interpolao, aps a insero
do ponto #5 no clculo dos coecientes de regresso.
Figura 11 - Razes A/m () e limites superior e inferior do limite de
tolerncia para as razes A/m (linhas pontilhadas), aps a insero do
ponto #5 no clculo dos coecientes de regresso.
[11] Repete-se continuamente a avaliao conduzida em
[9] com os valores recalculados, at que mais nenhum
ponto deva ser inserido ou excludo dos clculos. Neste
exemplo, aps a primeira alterao (adio do quinto ponto
experimental aos clculos), mais nenhum valor deve ser
includo. As razes A/m dos pontos #6 a #8 esto bastante
afastadas do intervalo de tolerncia, e o histograma
dos resduos mostra uma tendncia pronunciada a no
linearidade a partir destes pontos. Desta maneira, a curva
de calibrao determinada foi A = 21730 m + 17413, com
r = 0,9992, vlida para a faixa de massas de n-decano
entre 5,66 ng e 28,32 ng (Figura 12).
Figura 12 - Grco rea x Massa e curva de calibrao, aps a
denio da Faixa Linear.
R e f e r n c i a s
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10.