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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES

Autarquia associada Universidade de So Paulo

ESTUDO DA INCORPORAO E LIBERAO DE UM EXTRATO


DE ALGAS VERMELHAS EM MEMBRANAS DE HIDROGEL

RENATA HAGE AMARAL

Dissertao apresentada como parte


dos requisitos para obteno do Grau
de Mestre em Cincias na rea de
Tecnologia Nuclear Materiais

Orientador:
Dr. Ademar Benvolo Lugo

SO PAULO
2009

INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES


Autarquia associada Universidade de So Paulo

ESTUDO DA INCORPORAO E LIBERAO DE UM EXTRATO


DE ALGAS VERMELHAS EM MEMBRANAS DE HIDROGEL

RENATA HAGE AMARAL

Dissertao apresentada como parte


dos requisitos para obteno do Grau
de Mestre em Cincias na rea de
Tecnologia Nuclear Materiais

Orientador:
Dr. Ademar Benvolo Lugo

SO PAULO
2009

Este trabalho dedicado a todas as pessoas que


participaram de sua realizao.
Aos meus pais, David e Wilma, pelo apoio e pacincia.
Aos meus queridos amigos, pela fora e incentivo
que me deram durante este perodo.

Agradecimentos

Ao Dr. Lugo, obrigada pela oportunidade e apoio durante a realizao


deste projeto.
Sizue Ota Rogero, muito obrigada por todo apoio, incentivo e disposio
em me ajudar e ensinar nos momentos em que precisei de seus conhecimentos.
Ao Dr. Jos Roberto Rogero, obrigada pelo importante suporte dado
durante a realizao desta pesquisa.
Dra. urea S. Cruz e Rezolina Pereira dos Santos, do Instituto Adolfo
Lutz, muito obrigada pelo esforo em nos fornecer as micoplacas.
Ao Dr. Patrick Spencer, obrigada pela colaborao e apoio na parte
experimental deste trabalho.
Ao Dr. Jorge Sarkis e Helena Miho Shihomatsu pelo suporte e apoio dado
na parte experimental deste projeto.
Aos meus amigos Souza, Mara, Roberta, Carolina e Sirlene, do Laboratrio
de Biomateriais IPEN, muito obrigada pelo carinho, apoio e comprrenso.

ESTUDO DA INCORPORAO E LIBERAO DE UM EXTRATO


DE ALGAS VERMELHAS EM MEMBRANAS DE HIDROGEL

Renata Hage Amaral


RESUMO

Os hidrogis esto dentre as matrizes polimricas mais utilizadas em


tecnologia farmacutica em razo de sua vasta aplicao e funcionalidade,
especialmente em sistema de liberao de frmacos. Tendo em vista o grande
avano nas inovaes dos produtos cosmticos, tanto por meio da introduo de
novos princpios ativos quanto pelas matrizes utilizadas para liberao controlada
dos mesmos, o objetivo deste trabalho foi incorporar e avaliar a liberao de um
princpio ativo natural, o ArctAlg, em membranas de hidrogel, de modo a obter
um dispositivo de liberao para fins cosmticos. O ArctAlg um extrato aquoso
que possui uma excelente ao anti-oxidante, lipoltica, anti-inflamatria e
citoestimulante. Foi realizado o estudo das propriedades mecnicas, fsicoqumicas e a biocompatibilidade in vitro das membranas de hidrogis de poli(vinil2- pirrolidona) (PVP) e poli(vinil lcool) (PVA) obtidas pela reticulao por
radiao ionizante. A caracterizao fsico-qumica das matrizes polimricas foi
obtida pelos ensaios de frao gel e intumescimento e o de biocompatibilidade in
vitro pelo ensaio de citotoxicidade pelo mtodo de incorporao do vermelho
neutro. No ensaio de frao gel tanto o hidrogel de PVP quanto o de PVA
apresentaram um alto grau de reticulao. O hidrogel de PVP apresentou uma
maior porcentagem de intumescimento em relao ao de PVA e no ensaio de
citotoxicidade os hidrogis mostraram-se atxicos. A propriedade citoestimulante
do ArctAlg foi verificada no ensaio de citoestimulao com clulas fibroblsticas
de pele de coelho, em que foi evidenciado um aumento de cerca de 50% das
clulas quando em contato com 0,5% do princpio ativo. As membranas de
hidrogel preparadas com 3% de ArctAlg foram submetidas ao ensaio de
liberao em incubadora a 37C e as alquotas coletadas durante o ensaio foram
quantificadas por cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC). Os resultados
obtidos na cintica de liberao mostraram que as membranas de hidrogel de
PVP liberaram cerca de 50% do ArctAlg incorporado e as de PVA em cerca de
30%. No ensaio de citoestimulao do ArctAlg liberado, o dispositivo de PVP
apresentou um aumento em cerca de 80% da populao celular em relao ao
controle do ensaio, mostrando ser o dispositivo mais indicado para ser utilizado
em processos de reparao cutnea.

IMMOBILIZATION AND RELEASE STUDY OF A RED ALGA


EXTRACT IN HYDROGEL MEMBRANES

Renata Hage Amaral


ABSTRACT

In pharmaceutical technology hydrogel is the most used among the


polymeric matrices due to its wide application and functionality, primarily in drug
delivery system. In view of the large advance innovations in cosmetic products,
both through the introduction of new active agents as the matrices used for its
controlled release, the objective of this study was to evaluate the release and
immobilization of a natural active agent, the Arct'Alg in hydrogel membranes to
obtain a release device for cosmetics. Arct'Alg is an aqueous extract which has
excellent anti-oxidant, lipolytic, anti-inflammatory and cytostimulant action. Study
on mechanical and physical-chemical properties and biocompatibility in vitro of
hydrogel membranes of poly(vinyl-2- pyrrolidone) (PVP) and poly(vinyl alcohol)
(PVA) obtained by ionizing radiation crosslinking have been performed. The
physical-chemical characterization of polymeric matrices was carried out by gel
fraction and swelling tests and biocompatibility by in vitro test of cytotoxicity by
using the technique of neutral red incorporation. In the gel fraction test, both the
PVP and PVA hydrogel showed a high crosslinking degree. The PVP hydrogel
showed a greater percentage of swelling in relation to PVA and the cytotoxicity
test of the hydrogels showed non-toxicity effect. The cytostimulation property of
Arct'Alg was verified by the cytostimulation test with rabbit skin cells, it was
showed an increase at about 50% of the cells when in contact with 0,5% of active
agent. The hydrogel membranes prepared with 3% of Arct'Alg were subjected to
the release test in an incubator at 37C and aliquots collected during the test were
quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The results
obtained in the kinetics of release showed that the PVP hydrogel membranes
released about 50% of Arct'Alg incorporated and the PVA hydrogel membranes
at about 30%. In the cytostimulation test of released Arct'Alg, the PVP device
showed an increase at about 80% of cell population in relation of test control,
showing to be the greater device to be used in processes of skin repair.

SUMRIO
Pgina
1 INTRODUO

10

2 OBJETIVOS

12

3 REVISO DA LITERATURA

13

3.1 Pele humana

13

3.1.1 Epiderme

14

3.1.2 Derme

16

3.1.3 Vascularizao da pele

17

3.2 Cicatrizao

18

3.3 Polmeros

20

3.3.1 Ao da radiao ionizante sobre a matria e polmeros

20

3.3.2 Reticulao e degradao de polmeros

22

3.3.3 Aplicaes biomdicas dos polmeros

25

3.3.4 Hidrogis

27

3.3.5 Poli(vinil lcool)

29

3.3.6 Poli(N-vinil-2-pirrolidona)

30

3.3.7 gar

32

3.3.8 Poli(etilenoglicol)

32

3.4 Arctalg

33

3.5 Sistema de liberao de frmacos

34

3.6 Citotoxicidade

39

3.7 Citoestimulao de fibroblastos e produo de colgeno

40

4 MATERIAIS E MTODOS

42

4.1 Materiais

42

4.1.1 Matria prima utilizada para sntese das matrizes de hidrogel

42

4.1.2 Princpio ativo

42

4.2 Mtodos

42

4.2.1 Obteno das matrizes de hidrogel

42

4.2.2 Caracterizao da matriz de hidrogel

43

4.2.2.1 Frao Gel

43

4.2.2.2 Intumescimento

44

4.2.2.3 Propriedades mecnicas

45

4.2.2.4 Citotoxicidade

46

4.2.3 Preparo do dispositivo de hidrogel

47

4.2.3.1 Citoestimulao

47

4.2.3.2 Estudo do comportamento do dipeptdeo citrulil-arginina irradiado

51

4.2.3.3 Incorporao do ArctAlg na matriz de hidrogel

52

4.2.4 Cintica de liberao e doseamento do ArctAlg

53

4.2.5 Atividade citoestimulante do ArctAlg liberado

53

5 RESULTADOS E DISCUSSO

55

5.1 Obteno das matrizes de hidrogel

55

5.2 Caracterizao da matriz de hidrogel

56

5.2.1 Frao Gel

56

5.2.2 Intumescimento

57

5.2.3 Citotoxicidade

59

5.2.4 Propriedades Mecnicas

61

5.3 Citotoxicidade do ActAlg

64

5.4 Citoestimulao

65

5.6 Estudo do comportamento do dipeptdeo irradiado

67

5.7 Obteno do dispositivo de hidrogel

69

5.8 Cintica de liberao e doseamento do ArctAlg

70

5.9 Atividade citoestimulante do ArctAlg liberado

79

6 CONCLUSO

81

7 APNDICE

82

8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

91

LISTA DE FIGURAS
Pgina
FIGURA 1. Camadas da pele

13

FIGURA 2. Camadas da epiderme

14

FIGURA 3. Representao esquemtica dos plexos vasculares

17

horizontais: superficial e profundo


FIGURA 4. Formao da ligao entre as cadeias polimricas: reticulao

23

FIGURA 5. Ciso de cadeia pricipal

24

FIGURA 6. Poli(vinil lcool)

29

FIGURA 7. Poli(N-vinil-2-pirrolidona)

30

FIGURA 8. Formao do radical polimrico

31

FIGURA 9. Poli(etilenoglicol)

33

FIGURA 10. Frmula estrutural do dipeptdeo citrulil-arginina

34

FIGURA 11. Concentrao de frmaco absorvido em funo do tempo

35

FIGURA 12. Extrator de Soxhlet

44

FIGURA 13. Texturmetro da Micro System

45

FIGURA 14. Esquema da distribuio dos extratos das amostras e controle

47

na microplaca.
FIGURA 15. Esquema da distribuio das diferentes concentraes de

50

ArctAlg na microplaca 3.
FIGURA 16. Sistema de HPLC da Shimadzu

52

FIGURA 17. Matriz de hidrogel de PVP

55

FIGURA 18. Matriz de hidrogel de PVA

56

FIGURA 19. Perfil de intumescimento dos hidrogis de PVP e PVA

59

FIGURA 20. Curvas de viabilidade celular dos hidrogis de PVP e PVA

60

no ensaio de citotoxicidade pelo mtodo de incorporao do vermelho neutro


FIGURA 21. Performance da fora de trao aplicada membrana de PVP

62

FIGURA 22. Performance da fora de trao aplicada membrana de PVA

62

FIGURA 23. Curvas de viabilidade celular do ArctAlg

65

FIGURA 24. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg

66

FIGURA 25. Cromatograma do citrulil-arginina irradiado

68

FIGURA 26. Cromatograma do citrulil-arginina no-irradiado

68

FIGURA 27. Dispositivo de hidrogel de PVA

70

FIGURA 28. Dispositivo de hidrogel de PVP

70

FIGURA 29. Cromatograma da soluo padro de citrulil-arginina

71

FIGURA 30. Cromatograma de cintica de liberao do dispositivo

72

de PVP contendo ArctAlg aps 1h de liberao.


FIGURA 31. Cromatograma do extrato da membrana controle de PVP

72

FIGURA 32. Cromatograma de cintica de liberao do dispositivo

73

de PVA contendo ArctAlg aps 1h de liberao


FIGURA 33. Cromatograma do extrato da membrana controle de PVA

73

FIGURA 34. Cromatograma da anlise em HPLC do dispositivo de

74

PVA contendo citrulil-arginina


FIGURA 35. Perfil de liberao do citrulil-arginina contido no ArctAlg do

76

dispositivo de PVP
FIGURA 36. Perfil de liberao do citrulil-arginina contido no

77

ArctAlg do dispositivo de PVA


FIGURA 37. Viabilidade celular do ArctAlg liberado na primeira

79

hora dos dispositivos de hidrogis de PVP e PVA


FIGURA 38. Viabilidade celular em funo da concentrao de

82

ArctAlg em microplaca contendo 200.000 cls/mL


FIGURA 39. Viabilidade celular em funo da concentrao de

83

ArctAlg em microplaca contendo 180.000 cls/mL


FIGURA 40. Viabilidade celular em funo da concentrao de

84

ArctAlg em microplaca contendo 150.000 cls/mL


FIGURA 41. Viabilidade celular em funo da concentrao de

85

ArctAlg em microplaca contendo 100.000 cls/mL


FIGURA 42. Viabilidade celular em funo do uso de MEM com

86

diferenetes concentraes de SFB


FIGURA 43. Viabilidade celular em funo da concentrao de
SFB no MEM + L-15

87

FIGURA 44. Viabilidade celular em funo da concentrao de


ArctAlg com incubao da microplaca por 24h

88

FIGURA 45. Viabilidade celular em funo da concentrao de


ArctAlg com incubao da microplaca por 48 horas ensaio 1

89

FIGURA 46. Viabilidade celular em funo da concentrao de


ArctAlg com incubao da microplaca por 48 horas ensaio 2

90

10

1 INTRODUO
Hidrogis, ou gis contendo gua, so polmeros caracterizados pela
hidrofilicidade e insolubilidade em gua (Kudela, 1990).
Os hidrgeis tm despertado grande interesse devido apresentarem
caractersticas interessantes como, por exemplo, a biocompatibilidade. A utilidade
dos

hidrogis

como

biomateriais

encontra-se

na similaridade

de

suas

propriedades fsicas com aquelas dos tecidos vivos, fazendo-os teis para uma
grande variedade de aplicaes biomdicas, como curativos, implantes, lentes de
contato, matriz para imobilizao de enzimas e sistemas de liberao controlada
e/ou sustentada de princpios ativos (Peppas, 1996).
Bandagem de hidrogel base de poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP) e
poli(etilenoglicol) (PEG) foi originalmente inventada como curativo para o
tratamento de queimadura por Rosiak e colaboradores (1989). No entanto,
atualmente, este sistema polimrico amplamente aplicado como sistema de
liberao de frmacos entre outros. O sucesso desses sistemas est relacionado
com as propriedades da matriz e a tecnologia de fabricao das mesmas.
Inicialmente os sistemas de liberao de frmacos foram desenvolvidos
para rotas tradicionais de administrao, como oral e intravenoso, porm,
recentemente ocorreu um aumento nas pesquisas que visam utilizao de rotas
consideradas no tradicionais como nasal, ocular, pulmonar, vaginal, retal e
transdrmica (ZHANG et al., 2004).
Durante dcadas a pele tem sido utilizada como via de administrao
de substncias dermatologicamente ativas, ou seja, com ao farmacolgica nos
tecidos da pele. Nessas terapias considera-se que as molculas do frmaco
difundem-se para o tecido no local da aplicao para produzir seus efeitos
teraputicos (Chien, 1987).
Uma das principais aplicaes das membranas de hidrogel sobre o
tecido cutneo lesionado, por serem flexveis, no txicas e possibilitarem a
aplicao tpica de frmacos por meio da membrana (Rosiak, 1991).

11

Tendo em foco o desenvolvimento de um novo produto para a


regenerao cutnea, na rea cosmtica, este trabalho teve por objetivo o estudo
da incorporao e liberao de um princpio ativo natural, o ArctAlg, em
membranas de hidrogel. Este princpio ativo foi escolhido por possuir em sua
composio o dipeptdeo citrulil-arginina que apresenta propriedades biolgicas
como ao anti-oxidante, citoestimulante, lipoltica e anti-inflamatria. A escolha
de hidrogis de PVP e PVA como matrizes para incorporar e liberar este princpio
ativo foi motivada pela comprovada biocompatibilidade e alto grau de
intumescimento dos mesmos. Partindo do pressuposto de que o princpio ativo
no se liga ao polmero, realizou-se o ensaio de liberao do ArctAlg a partir dos
hidrogis para verificar o seu perfil de liberao e uma possvel viabilidade
comercial deste dispositivo.

12

2 OBJETIVOS

O objetivo principal deste trabalho foi o estudo da incorporao do


ArctAlg em membranas de hidrogel de poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP) e poli(vinil
lcool) (PVA) obtidas pela radiao ionizante e cintica de liberao do mesmo.
Para alcanar este objetivo foram realizadas as seguintes etapas:

Caracterizar o hidrogel de PVP e PVA;

Estudar a incorporao do ArctAlg na matriz polimrica;

Analisar a liberao in vitro do ArctAlg;

Verificar in vitro a propriedade de citoestimulao do ArctAlg em cultura


de clulas fibroblsticas.

13

3 REVISO DA LITERATURA

3.1 Pele humana


A pele o maior rgo do corpo humano, ocupando rea mdia de 2
2

m , o que corresponde a cerca de 10 a 15% do peso total corporal (Leonardi &


Matheus, 2008). Ela formada por tecidos de origem ectodrmica e mesodrmica
que se arranjam em trs camadas distintas: a epiderme, a derme e a hipoderme.
Esta ltima no considerada por muitos autores como parte integrante da pele,
embora seja estudada dentro do sistema tegumentar (Sousa & Vargas, 2004).
As camadas da pele humana esto ilustradas na FIG. 1

FIGURA 1. Camadas da pele.


O tegumento, mesmo sem restringir a maleabilidade do corpo humano,
constitui uma barreira eficiente contra agresses exgenas, de natureza qumica
ou biolgica e impede a perda de gua e de protenas para o exterior. A pele
tambm age como rgo sensorial, participa do sistema imunolgico e exerce
outras funes, como a regulao da temperatura corprea, a produo de
vitamina D3, a excreo de eletrlitos e outras substncias e confere uma
proteo relativa para os rgos internos (Sousa & Vargas, 2004).

14

A espessura da pele varia dependendo da rea do corpo, sendo a pele


mais espessa encontrada nas regies sujeitas a presses e atritos constantes
(Ribeiro, 2006).
3.1.1 Epiderme
A epiderme, de origem ectodrmica, um epitlio de revestimento
estratificado e pavimentoso por possuir vrias camadas de clulas que vo se
achatando medida que se tornam mais superficiais. Como todo epitlio, as
clulas da epiderme se renovam indefinidamente devido a uma atividade mittica
contnua. A principal funo da epiderme produzir queratina, uma protena
fibrosa malevel, responsvel pela impermeabilidade cutnea, e as clulas que
esto envolvidas nesta funo so denominadas queratincitos (Sousa & Vargas,
2004).
As camadas que formam a epiderme so conhecidas como basal,
espinhosa, granulosa e crnea (FIG. 2). Uma quinta camada, a lcida,
encontrada entre as camadas crnea e granulosa na palma das mos e sola dos
ps, conferindo maior espessamento da pele nestas regies (pele espessa), ao
contrrio das demais regies do corpo onde a pele mais fina (pele delgada)
(Ribeiro, 2006).

FIGURA 2. Camadas da epiderme

15

As clulas da epiderme constituem um sistema dinmico, ou seja,


esto em constante renovao, desde sua juno com a derme at a sua
superfcie cutnea, onde se efetua uma descamao permanente (Leonardi &
Matheus, 2008).
O estrato basal chamado tambm de estrato germinativo, por conter
clulas em diviso. As clulas recm produzidas migram em direo s camadas
superiores da epiderme, com a finalidade de substituir as que descamaram. Logo,
na camada germinativa originam-se as clulas epidrmicas, que vo pouco a
pouco ganhando a superfcie, sofrendo modificaes graduais na forma e na
composio qumica, at se tornarem anucleadas (na camada crnea) e se
esfoliarem. H, assim, um deslocamento permanente e repetido de clulas, que
da camada basal atingem gradualmente a superfcie da epiderme para se
desprenderem j mortas (Leonardi & Matheus, 2008).
O

ciclo

de

queratinizao,

ou

corneificao,

consiste

nesta

transformao das clulas epiteliais em clulas crneas. A pele elimina


diariamente cerca de 6 a 14g de clulas mortas, que so substitudas por outras
clulas epidrmicas, as quais gradualmente se queratinizam (Leonardi &
Matheus, 2008).
O tempo que um queratincito basal leva para se tornar um
queratincito crneo duas semanas, e o mesmo perodo de tempo gasto para
que o queratincito crneo venha a descamar. Portanto, a epiderme tem a sua
populao queratinoctica renovada a cada quatro semanas, em condies
habituais (Sousa & Vargas, 2004).
Acima da camada basal encontra-se a espinhosa, formada por vrias
fileiras de clulas, sendo as mais profundas polidricas e as superficiais mais
achatadas (Ribeiro, 2006). Apresentam prolongamentos citoplasmticos na forma
de espinhos que formam pontes entre as clulas adjacentes chamadas
desmossomos, os quais so responsveis pela manuteno da integridade da
epiderme. Entre esses prolongamentos h um espao preenchido com tecido
fluido que separa as clulas vizinhas e permite que nutrientes e oxignio
difundam-se em direo s demais camadas da epiderme (Barry, 1983).
Os corpos lamelares, reconhecidos como o primeiro sinal de
queratinizao, surgem no estrato espinhoso. Esses grnulos contm lipdeos

16

como ceramidas, cidos graxos e colesterol, alm de proteases, fosfatases


cidas, lpases e glicosidases (Baumann &Weisberg, 2002).
A camada granulosa, com a espessura de duas ou trs camadas de
clulas carregadas em grnulos de querato-hialina, situa-se entre a camada
crnea e a camada espinhosa (Ribeiro, 2006).
Esta regio da epiderme a responsvel pela formao da bicamada
de lipdeos presente entre as fileiras de clulas corneificadas que formam a
camada crnea. Esta estrutura lamelar tem como funo prevenir a desidratao
das camadas subjacentes da epiderme, formar barreira e oferecer resistncia
absoro percutnea, alm de atuar como cimento, fixando as clulas
queratinizadas umas s outras, impedindo o seu desprendimento (Ribeiro, 2006).
A ltima camada da epiderme, a crnea, o resultado final do
processo de diferenciao celular pelo qual passam os queratincitos e que
comea na camada germinativa ou basal (Ribeiro, 2006).
A poro menos permevel da epiderme o estrato crneo, onde as
clulas so mais queratinizadas e o teor de lipdeos mais elevado. Depois que
uma molcula atravessa este estrato no h outra barreira difuso para outras
camadas da pele (Leonardi & Matheus, 2008).
As clulas do estrato crneo so muito ricas em queratina e no
possuem ncleo e nenhuma organela. Embora seja uma membrana muito fina, o
estrato comporta-se como uma eficiente barreira, protegendo nosso corpo da
desidratao. Os lipdeos disponveis neste estrato formam membranas lamelares
intercelulares que retm gua, conservando a superfcie da nossa pele saudvel e
macia (Leonardi & Matheus, 2008).
3.1.2 Derme
A derme consiste em um tecido resistente e elstico que proporciona
resistncia fsica ao corpo frente a agresses mecnicas, fornece nutrientes
epiderme e abriga os apndices cutneos, vasos sanguneos e linfticos, clulas
de natureza conjuntiva e de origem sangunea (Ribeiro, 2006).
dividida em duas regies, a poro superior conhecida como derme
papilar, sendo a camada inferior epiderme e que apresenta maior densidade de
elementos vasculares, e a outra logo abaixo, a derme reticular que possui maiores
feixes de fibras colgenas (Baumann &Weisberg, 2002).

17

O colgeno sintetizado no retculo endoplasmtico do fibroblasto,


iniciado pelo pr-colgeno que por ao de peptidases se transforma em
tropocolgeno, rico em aminocidos lisina e prolina, que sofrem hidroxilao para
transformar o tropocolgeno em colgeno, este rico em hidroxilisina e
hidroxiprolina. Fazem parte desta reao bioqumica os cofatores silcio orgnico,
cido ascrbico, magnsio e clcio (Leonardi & Matheus, 2008).
As fibras elsticas permitem extensa deformao da pele, que retorna
passivamente ao estado original quando suspensa a fora aplicada (Ribeiro,
2006). Essas fibras esto reunidas em feixes de microfibrilas compostas de
fibrilina. A fibrilina forma um molde, sobre o qual a elastina depositada. As fibras
elsticas esto localizadas na periferia dos feixes de fibras colgenas e formam
uma rede estrutural na derme e, juntamente com o colgeno, respondem pelas
propriedades mecnicas dos tecidos conectivos (Baumann &Weisberg, 2002).
3.1.3 Vascularizao da pele
A derme possui dois plexos vasculares horizontais, um superficial e
outro profundo (FIG. 3). Esta rede vascular de fundamental importncia para a
nutrio da epiderme, que no vascularizada (Ribeiro, 2006).

FIGURA 3. Representao esquemtica dos plexos vasculares horizontais:


superficial e profundo.
O plexo superficial situa-se na poro superficial da derme reticular,
com arterolas pequenas, de camada muscular descontnua, e delas partem alas

18

capilares com sangue arterial que ascendem at o topo de cada papila drmica e
retornam como papilares venosos (Sousa & Vargas, 2004).
O plexo profundo situa-se na base da derme reticular e composto por
arterolas e vnulas de parede muscular contnua. H ntima ligao dos dois
plexos, pois das arterolas do plexo profundo, sobem vasos que se ligam no plexo
superficial (Sousa & Vargas, 2004).
3.2 Cicatrizao
O processo de cicatrizao se d fundamentalmente no tecido
conjuntivo, no qual diversos fatores de ordem geral ou local intervm em sua
constituio e funo. A cicatriz consiste na substituio do tecido lesado por
tecido conjuntivo neoformado, indicado como cicatricial (Guirro, 2002).
A reparao cutnea constituda por uma sucesso de fenmenos
complexos e estreitamente ligados, que podem ser classificados em diferentes
etapas ou fases (Guirro, 2002):

Fase inflamatria: Fase inicial e fundamental do processo de reparo que dura


em mdia 72 horas desencadeada pela leso, independentemente de seu
agente etiolgico. Numa primeira etapa, observa-se uma vasoconstrio, que
fugaz, seguida pela liberao de substncias vasoativas (histamina,
serotonina, 5-hidroxi-triptamina, cininas, plasmina, calicrena e prostaglandinas
PgE1 e PgE2), capazes de promover aumento da permeabilidade vascular. O
fluido originado do exudato principalmente o plasma, que coagula,
delimitando o processo.

Fase de latncia: Essa fase assim denominada em virtude de se acreditar


inicialmente que havia uma interrupo na cicatrizao, porm atualmente
sabe-se que uma fase bastante ativa. Substncias denominadas fatores de
crescimento (cininas) esto aumentadas em nvel srico em torno do sexto
dia, e atuam em diversas fases da proliferao celular.

Fase de fibroplasia (biossntese do colgeno): a ao de macrfagos inicia a


transio para essa segunda fase do reparo da leso em que se desenvolve a
formao do tecido de granulao. O tecido de granulao consiste de uma

19

densa populao de macrfagos, fibroblastos e novos vasos, embebidos em


uma matriz frouxa de colgeno, fibronectina e cido hialurnico.

Fase de contrao: Fase dinmica que objetiva a reduo da superfcie


cruenta, produzindo a aproximao das bordas da leso, contribuindo para o
fechamento da mesma. Esta fase tem incio entre o stimo e o dcimo quarto
dias de leso.
A cicatrizao processa-se na maioria das vezes de forma rpida e

satisfatria. No entanto, fatores como estado nutricional, doena preexistente, uso


de vestimenta, exposio terapia com radiao, lcool e fumo podem influenciar
neste processo de regenerao da pele (Sousa & Vargas, 2004).
O processo de cicatrizao pode ser classificado segundo o tipo e a
quantidade de tecido em cicatrizao por primeira inteno e cicatrizao por
segunda inteno. A primeira ocorre em casos de incises cirrgicas limpas noinfectadas, cujas bordas so aproximadas por suturas. A leso provoca a morte
de um nmero limitado de clulas epiteliais e do tecido conjuntivo, alm da
ruptura da continuidade da membrana basal epitelial. A reao inflamatria mais
branda e ao final do processo observa-se uma cicatriz formada por tecido
conjuntivo destitudo de infiltrado inflamatrio recoberto por uma epiderme intacta.
Cicatrizao por segunda inteno ocorre quando h uma perda extensa de
clulas e tecido que deve ser preenchida, como na ulcerao inflamatria,
formao de abscesso e em feridas superficiais que geram grandes defeitos.
Observa-se uma reao inflamatria mais intensa e so necessrias a
regenerao das clulas parenquimatosas e a formao de um tecido de
granulao abundante para completar o reparo tecidual. Grandes feridas de
superfcie podem sofrer contrao, um efeito possivelmente causado pela
presena de miofibroblastos, que resulta na reduo do tamanho da leso ao final
do processo cicatricial (Cotran et al., 2000).
As cicatrizes podem ser classificadas em (Sousa & Vargas, 2004):

Atrficas: leses lisas, planas, retrteis, sem sulcos, poros e plos,


acompanhadas de discromia.

20

Hipertrficas: leses discrmicas, fibrticas, lisas, salientes, sem sulcos,


poros e plos. So limitadas rea do processo cicatricial inicial, seu
tamanho tende a diminuir ao longo dos anos.

Queloidianas: salientes, duras, com superfcie lisa e brilhante, de colorao


rsea ou castanha e que apresenta dor e/ou prurido.

3.3 Polmeros
3.3.1 Ao da radiao ionizante sobre a matria e polmeros
A qumica das radiaes consiste no estudo dos efeitos qumicos
produzidos quando a matria exposta radiao de energia alta, ou tambm
denominada, radiao ionizante. Geralmente, os tipos de radiao mais
conhecidos so aqueles produzidos pela decomposio de ncleos radioativos
(radiao , e ), partculas reativas de alta energia (eltrons, prtons, etc.) e
radiao eletromagntica de onda curta (raios X) (Spinks & Woods, 1990).
Quando a radiao eletromagntica interage com a matria ocorrem
vrios processos de atenuao, sendo os trs principais: efeito fotoeltrico, efeito
Compton e produo de pares (Spinks & Woods, 1990).

Efeito fotoeltrico: ocorre principalmente com ftons de baixa energia


(menor que 1 MeV), que interagem predominantemente pelo efeito
fotoeltrico. Neste tipo de interao, toda a energia do fton transferida
para um nico eltron atmico, que ejetado com uma energia igual
diferena entre a energia do fton e a energia de ligao do eltron ao
tomo. A ocorrncia de interaes fotoeltricas mais provvel em
materiais com nmero atmico elevado e para ftons de baixa energia.

Efeito Compton: ocorre quando um fton interage com um eltron que pode
estar fracamente ligado ou livre, sendo que o eltron acelerado e o fton
defletido com energia reduzida. A energia do fton incidente dividida
entre o fton espalhado e o eltron. A interao Compton ocorre

21

predominantemente para ftons com energia entre 1 e 5 MeV em materiais


com elevado nmero atmico .


Produo de pares: a produo de pares envolve a completa absoro de


um fton nos arredores de um ncleo atmico ou, menos freqentemente,
um eltron com formao de duas partculas, um eltron e um psitron. A
produo de pares no ocorre com ftons de energia menor que 1,02 MeV
(Spinks & Woods, 1990).
A interao da radiao ionizante com a matria promove eventos

fsico-qumicos, em nvel atmico, os quais so complexos e podem ser divididos


em trs etapas consecutivas e distintas: etapa fsica, etapa fsico-qumica e etapa
qumica (Farhataziz & Rodgers, 1987).
Na etapa fsica (10-18 a 10-15s), devido ao da radiao sobre a
matria, ocorre transferncia de energia. Esta energia transferida provoca
excitaes eletrnicas e ionizao. As espcies primrias formadas com alta
energia so muito instveis, sofrendo reaes secundrias (Farhataziz &
Rodgers, 1987).
Na etapa fsico-qumica (10-15 a 10-11s) ocorre a formao de espcies
secundrias reativas (H+, radicais livres, etc.) que podem se originar de uma nica
reao ou podem resultar de uma sucesso complexa de reaes (Farhataziz &
Rodgers, 1987).
A etapa qumica (10-11s em diante) se inicia quando o sistema
restabelece o equilbrio trmico que havia sido alterado pela transferncia de
energia da radiao. As espcies reativas continuam a reagir entre si e com
outras espcies vizinhas. O tempo de durao desta etapa depende do meio
(slido, lquido, etc.) em que a radiao vai interagir (Farhataziz & Rodgers,
1987).
As mudanas qumicas produzidas em um polmero quando exposto
radiao no so muito diferentes das observadas em compostos de massa molar
baixo (Charlesby, 1960). Nem todas as molculas polimricas possuem o mesmo
tamanho, e muitas de suas propriedades no esto relacionadas somente com a
massa molar, mas com sua distribuio (Farhataziz & Rodgers, 1987).
Basicamente, na irradiao de polmeros, os objetivos so a
modificao das propriedades fsicas como o comportamento mecnico,
condutividade, ponto de fuso, entre outros (Farhataziz & Rodgers, 1987).

22

Os principais efeitos da radiao sobre os polmeros so: ciso da


cadeia principal, com conseqente reduo da massa molar; reticulao, com
conseqente aumento da massa molar (podendo formar uma rede tridimensional
insolvel) e formao de insaturaes. Como conseqncia da modificao
estrutural do polmero irradiado pode ser verificada alteraes de suas
caractersticas morfolgicas como, por exemplo, perda da cristalinidade e
alterao de cor (Reichmanis & ODonnell, 1989).
A reticulao de materiais polimricos pode ser iniciada por uma
dissociao do hidrognio ou por um radical que abstrai um hidrognio de uma
cadeia polimrica prxima formando um stio reativo adicional. Para cada
excitao-ionizao, um radical polimrico e um tomo de hidrognio so
formados. Estes tomos de hidrognio podem retirar outro hidrognio e formar um
radical polimrico adicional, ou tambm percorrer uma longa distncia e sofrer
vrias colises antes de abstrair um segundo hidrognio, produzindo radicais
polimricos em outros locais (Bradley, 1984).
Alguns polmeros, aps exposio radiao de alta energia, mostram
um aumento na massa molar, levando a formao de uma rede tridimensional
(reticulao), j outros mostram uma reduo na sua massa molar, ocorrendo
mudanas na viscosidade e propriedades mecnicas. Estas mudanas podem ser
devido a uma ciso na cadeia principal, induzida pela radiao, ocorrendo um
rearranjo dos tomos perto do ponto de ruptura para estabilizar os grupos finais
(degradao) (Charlesby, 1960).
As modificaes causadas pela radiao ionizante em polmeros
dependem das condies de processo, ou seja, tipo de radiao, presena de
oxignio ou diferentes atmosferas, aditivos, solventes, grau de cristalinidade e
homogeneidade do material polimrico que ir absorver a energia, etc (Clegg &
Collyer, 1964).
3.3.2 Reticulao e degradao de polmeros
A radiao ionizante pode produzir a ciso ou reticulao de molculas
polimricas, levando a diminuio ou o aumento do peso molecular (Clough &
Shalaby, 1991).

23

Na reticulao ocorre uma ligao entre as cadeias polimricas (FIG.4)


formando uma rede tridimensional (Charlesby, 1960). Dentre os mecanismos
propostos para a reticulao pode-se citar os seguintes (Schnabel, 1981):

Quebra da ligao C-H de uma cadeia polimrica com a formao de um


tomo de hidrognio seguido da retirada de um segundo tomo de uma
molcula prxima formando hidrognio molecular (H2). Sendo assim, os
dois radicais polimricos combinam-se formando uma reticulao;

Migrao de radicais produzidos pela quebra das ligaes C-H ao longo


das cadeias polimricas at que duas delas tornem-se adjacentes e se
unam formando a reticulao;
Estes

processos

podem

ocorrer

de

forma

individual

ou

concomitantemente. Apesar de nenhuma destas explicaes ser completamente


aceita, admite-se que para cada excitao ou ionizao, um radical polimrico e
um tomo de hidrognio, devido a sua energia cintica, produzem radicais
polimricos secundrios. Pares de radicais adjacentes, formados pela radiao ou
por tomos de hidrognio, podem unir-se (Schnabel, 1981).

FIGURA 4. Formao da ligao entre as cadeias polimricas: reticulao.


O

fator

mais

importante

que

influencia

na

capacidade

de

intumescimento do hidrogel a reticulao. Os hidrogis altamente reticulados


possuem uma estrutura mais apertada diminuindo o intumescimento em
comparao com hidrogis menos reticulados. A reticulao diminui a mobilidade

24

da cadeia polimrica, por isso diminui a capacidade de intumescimento do


hidrogel (Peppas, et al., 2000).
O uso da radiao de alta energia para promover a reticulao entre
molculas adjacentes do polmero uma das principais aplicaes industriais das
radiaes (Farhataziz & Rodgers, 1987).
O termo degradao polimrica usado para denotar as mudanas
nas propriedades fsicas causadas por reaes qumicas envolvendo ciso de
cadeia na macromolcula (Schnabel, 1981). A degradao polimrica consiste na
reduo da massa molar do polmero e de mudanas em sua estrutura qumica
(ODonnell, 1991).
A ciso de cadeia (FIG. 5) um efeito importante da radiao sobre os
polmeros. As reaes de competio entre a ciso de cadeia e a reticulao
ocorrem simultaneamente em muitos sistemas polimricos, a predominncia de
uma dessas reaes ir depender das condies de irradiao e da estrutura
qumica do polmero. Apesar das reaes de ciso ser geralmente consideradas
uma deteriorao, alguns produtos industriais usam esta reao de degradao
para produzir produtos comerciais (Bradley, 1984).

FIGURA 5. Ciso de cadeia pricipal


Em materiais como a celulose, o poliisobutileno e o polipropileno a
ciso da cadeia, ou reduo da massa molar predominante. J em poliamidas,
poliacrilatos e polivinil lcool, a reao de reticulao a predominante (Bradley,
1984).
O polmero pode sofrer degradao por outros processos, como a
degradao qumica, enzimtica, mecnica, biodegradao, etc., alm da
degradao por meio da radiao (Schnabel, 1981).

25

3.3.3 Aplicaes biomdicas dos polmeros


Atualmente, o maior grupo de materiais usados para fins biomdicos
so os polmeros, que podem ser utilizados separadamente ou em combinaes
com outros materiais (Rosiak et al.,1995).
A aplicao de polmeros sintticos na rea mdica tem crescido
substancialmente nos ltimos 30 anos. Na TAB. 1 so mostradas algumas das
aplicaes dos polmeros sintticos na medicina (Peppas et al., 2000).
TABELA 1: Aplicaes biomdicas dos polmeros.
Instrumentos
mdicos

Sistemas com funo


Sistemas substituintes ou melhoradores de
partes do corpo

teraputica

cirrgicos
Externamente

Internamente

Lentes de contato

Prteses
ortopdicas

Coraes artificiais

Implantes
cardiovasculares

Bombas de insulina

"Stents"

Rins artificiais

Mamoplastia

Fgados artificiais

Reconstruo maxilofacial

Peles artificiais

Reconstruo das cordas


Vocais

Seringas

Catteres

Sistema de liberao de
frmacos

Biosensores

Curativos

Bombas de insulina

Reconstruo de rgos
Sexuais
Suturas

Tendes artificiais
Cartilagem articular

O polmero para ser considerado um biomaterial deve preencher


alguns requisitos como (Rosiak et al.,1995):

no-toxicidade: os materiais no devem ser pirognicos ou carcinognicos e


no devem provocar inflamaes crnicas;

26

funcionalidade: os biomateriais devem substituir temporariamente ou para a


vida toda os rgos e tecidos que esto com suas funes comprometidas;

estril: devem ser facilmente esterilizveis em autoclave ou radiao ionizante;

biocompatibilidade: o biomaterial deve causar o mnimo de stress ao


organismo receptor, ou seja, no causar nenhum dano as clulas e tecidos.
Polmeros so molculas de cadeia longa que consiste de um nmero

de pequenas unidades repetidas, as quais se denominam monmeros. Vrios


tipos de polmeros so utilizados em aplicaes biomdicas como os
homopolmeros e os copolmeros (Visser et al.,1996).
A radiao ionizante produz ons e radicais livres que podem iniciar a
polimerizao ou a copolimerizao em monmeros e degradao e reticulao
em polmeros (Schnabel, 1981). O uso da radiao ionizante para a formao de
biomateriais polimricos possui algumas vantagens como (Rosiak, 1991):

reticulao e esterilizao simultnea do produto;

O processo de reticulao pode ocorrer em uma ampla faixa de temperatura


sem necessitar de um aquecimento para ocorrer reao no sistema;

Propriedades fsicas e/ou qumicas do produto final podem ser obtidas pelo
ajuste da intensidade e tipo de radiao, tempo de irradiao (dose), etc.
O curativo de hidrogel a base de PVP utilizado em queimaduras e

ulceraes da pele utiliza a radiao ionizante para obter a reticulao do


polmero e simultnea esterilizao do produto (Rosiak, 1991).
H tambm outros tipos de hidrogis utilizados como curativos
reportados na literatura, hidrogis de PVP e PVA (Razzak et al., 2001) e de poli
xido de etileno (PEO) e PVA (Yoshii et al., 1999) obtidos por radiao gama, e
de PVA intumescidos com quitosana (Rodas et al., 2005) so alguns exemplos.
Desde a dcada de 1980, folhas de silicone na forma de gel tm sido
testadas no tratamento de escaras hipertrficas e quelides apresentando bons

27

resultados. Estudos demonstraram que as bandagens de silicone em gel so


seguras e efetivas para essa aplicao, podendo ser especialmente teis para
crianas e outros pacientes intolerantes dor e a outros procedimentos (Valenta
& Auner, 2004).
Outro produto muito utilizado no tratamento de feridas que requeiram
enxerto o Integra. Ele constitudo por membrana de colgeno que quando
colocado sobre a ferida sofre invaso dos vasos sanguneos promovendo sua
vascularizao. Aps algum tempo esta membrana degradada pelo organismo e
substituda por tecido do prprio paciente (Jones et al., 2002).
3.3.4 Hidrogel
Hidrogis, ou gis contendo gua, so polmeros caracterizados pela
hidrofilicidade e insolubilidade em gua. Na gua, eles intumescem at atingir o
equilbrio preservando a sua forma (Kudela, 1990).
A hidrofilicidade do hidrogel devido a presena de grupos hidroflicos
em gua como OH, -COOH, -CONH, etc. A insolubilidade e estabilidade de sua
forma em gua so devido a presena da rede tridimensional (Kudela, 1990).
Os hidrogis podem ser classificados em vrios tipos, dependendo do
seu mtodo de preparo, carga inica, ou caractersticas fsicas estruturais
(Peppas, 1996).
A sntese do hidrogel pode ser a partir de qualquer polmero hidroflico
que possa ser reticulado formando uma rede tridimensional. A reticulao pode
ser feita por reao qumica, radiao ionizante ou interaes fsicas (Gehrke &
Lee, 1990).
A reticulao por reao qumica necessita de um agente iniciador.
Este agente normalmente liga as cadeias de massa molar maior atravs de seus
grupos

multifuncionais. Um segundo mtodo utilizado

a reao de

copolimerizao entre um ou mais monmeros e um monmero multifuncional,


que presente em menor quantidade. Outro mtodo utilizado envolve o uso da
combinao de um monmero e uma cadeia polimrica linear que so reticulados
por um agente qumico (Peppas, 1996).
A formao de hidrogis via radiao ionizante pode ser definida como
resultado de combinao mtua de macrorradicais. Estes macrorradicais so
produtos obtidos pela interao da radiao com a matria prima, formando

28

produtos reativos como ons e estados excitados, que perdem sua energia
formando radicais livres. Se estes radicais estiverem localizados em cadeias
polimricas

diferentes

posicionados

favoravelmente,

podem

sofrer

recombinaes havendo a formao de ligao covalente entre as cadeias


(Rosiak & Olejniczak, 1993).
Na reticulao por radiao ionizante ocorre a interconeco das
cadeias polimricas longas por meio de ligaes covalentes. Nos hidrogis fsicos
(gis reversveis, pseudogis) tambm formada uma rede tridimensional, mas
as cadeias polimricas individuais so conectadas por pontes de hidrognio ou
interaes eletrostticas. Neste caso normalmente possvel converter este tipo
de hidrogel em uma soluo homogenia. Os exemplos clssicos de alguns so
gelatina e gar (Rosiak, 1991).
O processo de formao de hidrogis por radiao ionizante possui
algumas vantagens, como por exemplo, obter a reticulao e esterilizao
simultnea do produto, possibilidade de reticulao em temperaturas baixas e
ausncia de iniciadores qumicos (Rosiak et al.,1995).
A habilidade de absorver gua e ons, sem perder sua forma e suas
propriedades mecnicas uma das principais caractersticas do hidrogel. Outra
propriedade importante de alguns hidrogis a biocompatibilidade em contato
com o sangue, fluidos corpreos e tecidos vivos (Rosiak, 1991).
As propriedades fsicas dos hidrogis fazem com que eles tenham uma
ampla aplicao no campo biomdico e farmacutico, sendo utilizados como
curativos, lentes de contato, matrizes para imobilizao de enzimas e sistemas de
liberao de frmacos (Peppas, 1996).
Um dos hidrogis mais utilizados o PHEMA. Este foi apresentado
como um material biolgico por Wichterle e Lim em 1960. A estrutura do PHEMA
permite um contedo de gua similar ao do tecido vivo. Este hidrogel inerte ao
organismo, resistente a degradao e no absorvido pelo corpo (Peppas, 1996).
Rosiak e colaboradores (1989) desenvolveram um sistema polimrico
base de poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG) e gar, reticulado
por feixe de eltrons de alta energia, com excelentes caractersticas para ser
utilizado como curativo. O hidrogel de PVP, produzido pela irradiao de sua
soluo aquosa, tem sido aplicado no tratamento de queimaduras, ulceraes da
pele, curativo ps-operatrio, etc.

29

A tecnologia de produo dos curativos de hidrogel via radiao


ionizante possui algumas vantagens em relao ao por processo qumico, pois
alm de ser uma tecnologia mais simples, fcil e limpa (sem resduos) o produto
final completamente esterilizado (Rosiak, 1991).
Alm do hidrogel produzido por Rosiak e colaboradores (1991), existem
outros tipos de curativo de hidrogel comercializados como o Vigilon e Kik gel.
Estes tambm so esterilizados utilizando a tcnica de irradiao (Razzak et al.,
2001).
Os

hidrogis

tambm

tm

sido

utilizados

amplamente

no

desenvolvimento de sistema de liberao controlada de frmacos, podendo liberlo de acordo com os estmulos do ambiente, devido a uma mudana de pH ou de
temperatura, por exemplo. Esta classe de hidrogis sensveis a estmulos,
tambm chamada de hidrogis inteligentes. Hidrogis de poliacrilameda e
quitosana sensveis a variao de pH (Bonina et al., 2004) e hidrogis de gelatina
e dextrano sensveis a estmulos duplos (Kurissawa & Yui, 1998) so alguns
exemplos.
3.3.5 Poli(vinil lcool)
O poli(vinil lcool) (PVA) produzido pela hidrlise controlada do
poli(vinil acetato). So produzidos PVA de massa molar varivel e com diferentes
graus de hidrlise, sendo que este ir determinar a solubilidade em gua do
polmero resultante (Ulrich, 1982).
A descoberta do PVA (FIG. 6) foi em 1924 quando Herrman e Haehnel
adicionaram lcali em uma soluo de poli(vinil acetato) e obtiveram o poli(vinil
lcool), mas foi em 1927 que foi realizado a sua primeira publicao cientfica
(Marten, 1989).

FIGURA 6. Poli(vinil lcool)

30

Os filmes de PVA possuem uma excelente resistncia a ruptura e


abraso. As propriedades mecnicas deste polmero dependem do grau de
hidrlise, massa molar e umidade relativa (Marten, 1989).
O PVA solvel em solventes hidroflicos e altamente polares, como a
gua. A viscosidade das solues de PVA dependente principalmente da massa
molar, concentrao, grau de hidrlise e temperatura. Materiais com alto grau de
hidrlise tm uma maior viscosidade e podem at formar gel (Marten, 1989).
A excelente resistncia qumica e propriedades fsicas do PVA fazem
com que ele tenha um amplo uso industrial. Ele muito utilizado na produo de
poli(vinil butiral), em fibras, adesivos, papel, etc. (Marten, 1989).
3.3.6 Poli(N-vinil-2-pirrolidona)
Polivinilamidas so polmeros anfotricos, altamente polares, que esto
sendo estudados desde 1930. Os polmeros derivados de estruturas cclicas so
os mais importantes, como o poli(N-vinil-2-pirrolidona), tambm chamado de
polivinilpirrolidona, povidone ou PVP (Barabas, 1989).
O PVP (FIG. 7) produzido pela polimerizao do N-vinil-pirrolidona
iniciada por um radical livre. Ele utilizado em formulaes cosmticas, na
indstria txtil, em adesivos, etc (Ulrich, 1982).
Este polmero apresenta uma combinao de propriedades, incluindo
solubilidade em gua e em solventes orgnicos, baixa toxicidade, boas
caractersticas para formar filmes e habilidade de aderir inmeros substratos
(Barabas, 1989).

FIGURA 7. Poli(N-vinil-2-pirrolidona)

31

Devido sua propriedade adesiva e formadora de filmes utilizado em


sprays de cabelo e adesivos. J na indstria farmacutica utilizado em sistema
de liberao de frmacos e na indstria de alimentos para clarificao da cerveja
e do vinho. Na Segunda Guerra Mundial o PVP foi usado como espessante de
plasma sanguneo (Barabas, 1989).
O PVP um p higroscpico branco ou levemente amarelado. Este
polmero consiste de um grupo metileno hidrofbico e um grupo amina hidroflico.
Como conseqncia deste balano hidrofbico-hidroflico, ele solvel em
diversos solventes orgnicos e tambm em gua (Barabas, 1989).
Devido s caractersticas do vinilpirrolidona, o PVP quimicamente
inerte. O polmero seco pode ser estocado em condies normais sem ocorrer
sua decomposio, degradao, ou mudanas estruturais. Em solues aquosas
tambm

podem

ser

estocadas

por

um

longo

perodo

se

estocadas

adequadamente (Barabas, 1989).


A irradiao da soluo aquosa de PVP resulta na formao de
macroradicais (na cadeia polimrica) e radicais Hidroxilas (OH) formados durante
a radilise do solvente. A reticulao resultante da recombinao mtua de
macroradicais formados, e como resultado deste processo h formao de
ligaes covalentes entre estas molculas. Se a quantidade destas novas
ligaes for suficientemente grande, aparece no sistema uma frao de gel
insolvel (FIG. 8) (Rosiak &Ulanski, 1999).

Direto

(formao do radical)

(reticulao)

32

Indireto

(formao do radical)

(abstrao do H do polmero)

(reticulao)
FIGURA 8. Formao do radical polimrico.
3.3.7 gar
O gar uma mistura complexa de polissacardeos extrados de
espcies de algas vermelhas, conhecidas como agarofitas (espcies de Gelidium,
Gracilaria, Pterocladia, Acanthopeltis e Ahnfeltia) (Bridson, 2006). insolvel em
gua e solvel em gua fervente. Quando fervido (no funde abaixo de 85C)
torna-se um lquido lmpido e na temperatura entre 32C e 38C ele torna-se
slido para resultar em um gel firme (Farmacopia Brasileira, 1977).
Agarose o componente responsvel pelas propriedades de
geleificao forte do gar, enquanto a agaropectina responsvel pelas
propriedades de viscosidade. A proporo entre agarose e agaropectina em gar
varia de acordo com a alga de origem (Bridson, 2006).
3.3.8 Poli(etilenoglicol)
O

poli(etilenoglicol)

(PEG)

(FIG.

9)

um

homopolmero

termoplstico, obtido pela polimerizao cataltica do xido de etileno (Carey &


Sundberg, 1983).

33

FIGURA 9. Poli(etilenoglicol)
O PEG miscvel em gua, possui baixa toxicidade e consegue ser
compatvel com uma grande variedade de formulaes. Possui uma boa
estabilidade e pode ser misturado com gua (ou outros solventes) para obter uma
ampla faixa de viscosidade (Clinton & Matlock, 1990).
Este polmero utilizado como surfactante, lubrificante, plastificante
(Ulrich, 1982), em formulaes cosmticas, solues de lentes de contato, etc.
(Clinton & Matlock, 1990).
3.4 Arctalg
Observando a vida selvagem na regio subrtica do Atlntico,
pesquisadores verificaram que as algas vermelhas resistiam s baixas
temperaturas do inverno extremo, assim como a pouca luminosidade devido os
dias serem mais curtos. Estas algas, como a Chondrus crispus, quando
submetidas em situao de stress, como no inverno intenso, sintetizam em
grande quantidade o dipeptdeo citrulil-arginina, que utilizado como uma reserva
energtica (fonte de nitrognio) para este perodo do ano (Christophe, 2006).
Baseado nesses fatos foi estudado e desenvolvido um extrato natural
padronizado desta alga vermelha do mar rtico, o qual foi registrado como
ArctAlg. Este extrato derivado da biomassa da Chondrus crispus que
selecionada sob condies controladas de frio intenso, pouca luminosidade e
processo de extrao especfico que permite a padronizao dos principais
constituintes

(dipeptdeo

citrulil-arginina,

osmoreguladores) (Exsymol, 2005).

aminocido

taurina

agentes

34

FIGURA 10. Frmula estrutural do dipeptdeo citrulil-arginina

ArctAlg um extrato aquoso com cerca de 7,5% de resduo seco. Um


de seus principais componentes o dipeptdeo citrulil-arginina (FIG. 10), rico em
nitrognio, representando cerca de 7% do extrato seco. Outros componentes
importantes so: o aminocido taurina (importante fonte de energia celular), o
agente osmoregulador floridosdeo e seus ismeros representando cerca de 13%
do resduo seco, alm de sais minerais como Ca, Mg, K, Cl. Este extrato possui
uma excelente ao antioxidante, lipoltica, antiinflamatria e citoestimulante.
Devido essas propriedades, o ArctAlg pode ser utilizado em produtos
cosmticos com ao anti-envelhecimento, anti-celulite e tambm na no auxlio da
cicatrizao (Exsymol, 2005).
3.5 Sistema de liberao de frmacos
O maior avano no desenvolvimento de sistemas de liberao de
frmacos est na possibilidade de manter a concentrao do princpio ativo em
um nvel teraputico plasmtico por um longo perodo de tempo, abaixo do nvel
txico e acima do nvel mnimo efetivo, como ilustrado na FIG.11 (Heller, 1996).

35

FIGURA 11. Concentrao de frmaco absorvido em funo do tempo.


(____) dose segura (- - -) dose no segura (__ . __ .__) liberao controlada
Um dos materiais mais utilizados como matriz para compor um
dispositivo de liberao controlada de medicamentos so os polmeros,
principalmente devido biocompatibilidade, biodegradabilidade, e a possibilidade
de se projetar mecanismos ou sistemas diferentes de liberao de drogas (Uhrick
et.al., 1999).
Os sistemas polimricos para a liberao controlada podem ser
classificados de acordo com o mecanismo que controla a liberao do agente
teraputico: por difuso, pela penetrao de gua e quimicamente, como pode ser
visto na TAB. 2 (Heller, 1996).
Nos sistemas controlados por difuso existem dois tipos de
dispositivos, os monolticos e os controlados por membrana (dispositivos
reservatrios). Em um dispositivo monoltico o frmaco disperso uniformemente
na matriz polimrica e a liberao controlada por difuso atravs da matriz. A
difuso vai depender da solubilidade do frmaco no polmero, em que ou o
princpio ativo vai estar abaixo do limite de solubilidade e dissolvido no polmero
ou ele vai estar bem acima do seu limite de solubilidade disperso na matriz
(Heller, 1996). Outro fator que interfere na difuso em dispositivos monolticos o
tamanho do poro. Em hidrogis, a difuso ocorre atravs dos poros, em que o
frmaco se move por meio das regies que esto preenchidas com gua (Gehrke
& Leee, 1990).

36

Nos dispositivos reservatrios o frmaco est contido em um


compartimento envolto por uma membrana polimrica que pode ou no ser
porosa e que controla a difuso da droga para o meio externo. Um exemplo deste
tipo de dispositivo so os contraceptivos transdrmicos (Heller, 1996).
No mecanismo controlado pela penetrao de gua, a taxa de
liberao do frmaco controlada pela taxa de penetrao de gua no
dispositivo, sendo dois tipos de sistema: o osmtico e o por intumescimento. Nos
dispositivos do tipo bomba osmtica o agente osmtico est contido dentro de
uma cmara rgida e separado do frmaco por uma partio mvel, sendo que um
dos lados do compartimento rgido uma membrana semipermevel. Quando o
dispositivo imerso em meio aquoso, a gua penetra no dispositivo atravs da
membrana aumentando o volume do compartimento osmtico que por
conseqncia exerce uma presso sobre a parte mvel fazendo com que o
frmaco saia por meio de um orifcio. Nos dispositivos controlados por
intumescimento o princpio ativo disperso uniformemente em uma matriz
hidroflica reticulada, no estado slido seco. Esta matriz, quando em contato com
um meio aquoso, se expande e o frmaco se difunde para fora do polmero
(Heller, 1996).
No mecanismo de liberao controlado quimicamente o frmaco
liberado devido degradao do polmero. Essa degradao pode ocorrer por
enzimas, por reaes qumicas ou pela gua. Neste mecanismo existem dois
tipos de sistema: monolticos e de cadeias pendentes. No sistema monoltico o
frmaco disperso uniformemente em um polmero biodegradvel, em que sua
liberao pode ser controlada pela difuso ou pela degradao ou ainda pela
combinao dos dois (Heller, 1996). Nos sistemas de cadeias pendentes o
princpio ativo ligado covalentemente cadeia de um polmero biodegradvel,
sendo que sua liberao ocorre com o rompimento das ligaes entre o polmero
e o frmaco (Heller, 1996).

37

TABELA 2. Classificao dos Sistemas de Liberao Controlada.


TIPOS DE SISTEMA

MECANISMO DE LIBERAO

Controlado pela Difuso


Dispositivos reservatrios

Difuso atravs da membrana.

Dispositivos monolticos

Difuso atravs do corpo do polmero.

Controlado pela Penetrao de gua


Sistema osmtico

Transporte osmtico da gua por meio de


uma membrana semipermevel.

Sistema por intumescimento

Penetrao de gua em um polmero


seco.

Controlado Quimicamente
Sistemas monolticos

Por eroso ou pela combinao de


eroso com difuso.

Sistemas de cadeias laterais (enxertos) Combinao entre a hidrlise do grupo


pendente e a difuso do corpo do
polmero.
Em sistemas de liberao de frmacos, o termo hidrogel reservado
para materiais polimricos que conseguem absorver quantidades significantes de
gua (mais que 20% do seu peso seco) enquanto mantm sua estrutura
tridimensional (Gehrke &Lee, 1990).
Os dispositivos de hidrogel possuem uma relevante importncia em
sistemas de liberao, pois alm de possibilitar o controle da liberao do
frmaco, eles aumentam a estabilidade de princpios ativos instveis por proteglos do meio externo (Gehrke &Lee, 1990).
Em relao incorporao de princpios ativos em hidrogis,
destacam-se dois mtodos gerais. O primeiro mtodo consiste na mistura do

38

frmaco com o hidrogel e sua posterior reticulao, fazendo com que o princpio
ativo fique preso dentro da matriz. No segundo mtodo, primeiramente, o hidrogel
seco e assim obtido o dispositivo. Este mergulhado em uma soluo
contendo o princpio ativo que incorporado atravs da capacidade de
intumescimento do hidrogel. Este ltimo mtodo possui algumas vantagens em
relao ao primeiro, pois durante o processo de reticulao pode haver uma
alterao nas propriedades teraputicas do princpio ativo (Kim et.al., 1992).
Os hidrogis devem possuir propriedades fundamentais para que
possam ser utilizados como matrizes para compor dispositivos de liberao
controlada, sendo elas a biocompatibilidade, permeabilidade e capacidade de
intumescimento. Embora esta ltima propriedade seja a mais importante, a
permeabilidade que faz com que ele possa ser utilizado como um sistema de
liberao de frmacos (Gehrke &Lee, 1990).
Os hidrogis podem ser impermeveis, semipermeveis e totalmente
permeveis em relao a um soluto. Sua permeabilidade pode ser alterada em
relao ao tempo ou devido resposta a um estmulo externo (Gehrke & Lee,
1990).
A capacidade de intumescimento de um hidrogel tambm pode ser
interferida por um estmulo externo. Assim, nos ltimos 30 anos houve um grande
interesse no desenvolvimento dos hidrogis que respondem a estmulos do
ambiente. O uso de hidrogis inteligentes tem sido proposto, principalmente pelo
fato desses gis absorverem uma grande quantidade de gua, de possurem uma
natureza

elstica

similar

de

tecidos

naturais,

por

apresentarem

biocompatibilidade e, principalmente, por terem a capacidade de controlar a taxa


de liberao do frmaco em funo de estmulos externos e das condies do
meio em que se encontra. Como algumas manifestaes de doenas alteram
parmetros do organismo tais como pH, temperatura, concentrao de
substncias e etc., esses hidrogis tm a capacidade de alterar a cintica de
liberao do frmaco de acordo com essas mudanas (Langer & Peppas, 2003).

39

3.6 Citotoxicidade
A biocompatibilidade pode ser definida como a capacidade de um
material funcionar com uma resposta apropriada do hospedeiro em uma aplicao
especfica (Williams, 1986). Esta resposta apropriada, na maioria dos casos,
significa que um sistema vivo na presena de tal material no apresenta resposta
adversa. O material no pode ser afetado pelo meio fisiolgico, e os tecidos locais
e remotos no podem sofrer danos pela presena deste material (Ratner, 1996).
A seleo e avaliao de qualquer material ou dispositivo com inteno
de uso em humanos requer um programa estruturado de avaliao. Num
processo descrito, deve ser feita uma descrio informada que pesa as vantagens
e desvantagens dos vrios materiais e escolhas de procedimentos de testes. Para
se ter segurana de que o produto final ir realizar/efetuar como desejado e ser
seguro para uso humano, o programa dever incluir uma avaliao biolgica (ISO
10993-1, 2003).
A

caracterizao

de

materiais

biocompatveis

implica

na

obrigatoriedade do teste de citotoxicidade. A toxicidade de um material pode ser


avaliada por testes in vitro, em animais de experimentao, incluindo testes de
uso, e por estudos clnicos em seres humanos (ISO 10993-5, 1992).
Os testes in vitro minimizam o uso de animais em pesquisa. Eles so
normalmente efetuados como um teste de triagem inicial na primeira fase de
avaliao da biocompatibilidade. Eles avaliam os danos causados pelo material
s clulas, fornecendo dados rpidos e de baixo custo. Dentre os vrios testes de
toxicidade para biomateriais, o teste de citotoxicidade o mais sensvel e sua
sensibilidade depende da linhagem celular, do tipo de aplicao dos materiais no
teste e da interpretao da resposta celular (ISO 10993-5, 1992).
O teste de citotoxicidade uma tcnica que utiliza cultura celular e
determina a lise das clulas (morte celular), inibio do crescimento celular e
outros efeitos, causados pelos dispositivos, materiais e/ou seus extratos (ISO,
1992). Este teste consiste em colocar o material direta ou indiretamente em
contato com uma cultura de clulas de mamferos, verificando-se as alteraes
celulares por diferentes mecanismos, entre os quais a incorporao de corantes
vitais ou a inibio da formao de colnias celulares (ISO 10993-5, 1992).
Uma das tcnicas mais utilizadas para verificar a toxicidade de um
material a de Incorporao do Vermelho Neutro (Ciapetti et. al., 1996). Esta

40

tcnica foi descrita inicialmente por Finter (1969) e consiste em avaliar a


toxicidade por meio da viabilidade celular pela medida da quantidade do corante
vermelho neutro incorporado nas clulas vivas.
3.7 Citoestimulao de fibroblastos e produo de colgeno
A principal clula envolvida no processo de regenerao cutnea o
fibroblasto. Com estmulos adequados, durante a reparao tecidual, os fibrcitos
(forma inativa da clula) revertem para o estado de fibroblastos (forma ativa da
clula) reativando a capacidade de sntese de colgeno e elastina (Junqueira &
Carneiro, 2008).
A sntese de colgeno um processo bioqumico complexo que ainda
no totalmente conhecido. Os fibroblastos que se encontram no tecido
lesionado, durante o processo de regenerao tecidual, so caracterizados por
possurem uma alta produo de colgeno e sintetizar espontaneamente xido
ntrico (NO), o que no ocorre com os fibroblastos que no esto em locais com
leso (Witte et al., 2002).
O NO produzido em condies inflamatrias e constitui um
importante mediador em diversos processos biolgicos. Ele produzido a partir
da L-arginina por uma reao mediada pela enzima NO-sintetase (Dusse, et. al.,
2003). Esta enzima possui trs isoformas, sendo uma delas a NO-sintetase
induzvel (iNOS) em que sua expresso est diretamente relacionada a processos
inflamatrios na pele. A expresso da iNOS no est restrita somente em clulas
do sistema imune como os macrfagos, ela tambm expressa em fibroblastos.
(Frank et. al., 2002).
A L-arginina produzida em situaes de stress como traumas,
ferimento, queimadura, etc. Este aminocido pode ser metabolizado via NOsintetase produzindo NO ou via arginase produzindo ornitina e uria (Witte et al.,
2002).
A ornitina precursora das poliaminas e prolinas (Lehninger, 1995). As
poliaminas so bases orgnicas alifticas, pertencentes ao grupo das aminas
bioativas, so encontradas em quase todas as clulas e desempenham diversas
atividades biolgicas (Lima & Glria, 1999). J a prolina essencial para a
formao da fibra colgena devido ser a precursora do colgeno tipo III (Gimnez
et. al., 2005).

41

As poliaminas so essenciais para a citoestimulao celular, ou seja, a


proliferao das clulas fibroblsticas (Witte et al., 2002), devido estarem
envolvidas em quase todas as etapas de sntese do DNA, RNA e protenas.
Sendo assim, as poliaminas so indispensveis as clulas vivas por estarem
diretamente envolvidas com o crescimento e renovao celular (Bardcz, 1995) e
principalmente em tecidos com alta demanda celular como na cicatrizao de
feridas (Kalac & Krausov, 2005), para que haja um maior nmero de clulas
fibroblsticas e uma maior produo de colgeno.

42

4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 MATERIAIS

4.1.1 Matria prima utilizada para sntese das matrizes polimricas


Poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP) K 90, Kollidon 90F, massa molar mdia
1000000 1500000 proveniente da BASF, poli(etileno glicol) (PEG 300) da
Oxiteno, gar tipo tcnico n 3 da Oxoid e poli(vinil lcool) (PVA), Celvol E47/88,
grau de hidrlise 87-89%, ponto de fuso de 180oC, temperatura de transio
vtrea de 58C, proveniente da Dermet Agekem.

4.1.2 Princpio ativo


ArctAlg um extrato de algas de colorao amarela fornecido pela
Exymol. Possui cerca de 7,5% de resduo seco, sendo cerca de 7% de dipeptdeo
citrulil-arginina, 0,15% de aminocido taurina, 0,9% de floridosdeo, 0,14% de
metil parabeno sdico e sais minerais.

4.2 MTODOS

4.2.1 Obteno das matrizes de hidrogel


Foram utilizadas duas formulaes para a obteno das matrizes de
hidrogel. Os componentes e suas concentraes esto descritos na TAB. 3.

43

TABELA 3. Descrio da formulao das membranas de PVP e PVA.


MATRIZ

COMPOSIO
PVP K90
PVP

PVA

CONCENTRAO (%)
6,0

PEG 300

1,5

GAR

0,5

GUA DESTILADA

92,0

PVA

GAR

GUA DESTILADA

91

Para sntese do hidrogel de PVP foram misturados primeiramente o


PVP K90, o PEG 300 e a gua destilada, deixando durante 24h em temperatura
ambiente. Aps este perodo a mistura foi aquecida e adicionou-se o gar,
mantendo-se em aquecimento at a completa dissoluo dos componentes. O
hidrogel de PVA foi sintetizado a partir da mistura de PVA e gua destilada com
aquecimento at a dissoluo do PVA. Posteriormente foi adicionado o gar e
manteve-se o aquecimento at dissoluo total dos componentes.
As membranas de hidrogel foram preparadas vertendo-se 5 mL da
soluo resfriada a aproximadamente 40C em moldes circulares de 5 cm de
dimetro e 0,2 cm de espessura, as quais, aps resfriamento, foram seladas,
embaladas adequadamente e enviadas para irradiao em uma fonte de raios
gama de Co-60. As membranas de PVP foram irradiadas na dose de 25 kGy e as
membranas de PVA na dose de 20 kGy.

4.2.2 Caracterizao da matriz de hidrogel


As matrizes de hidrogel de PVP e PVA foram submetidas aos
seguintes ensaios:
4.2.2.1 Frao Gel
As amostras de membranas de hidrogel foram secas em estufa na
temperatura de 60C at peso constante. Aps a secagem, cada amostra com
cerca de 0,15 g cada, em triplicata, foi acondicionada em saquinho de tecido non

44

woven e colocadas para remoo da frao solvel, por 36h, no extrator Soxhlet
(FIG. 12), utilizando como solvente a gua. Decorrido este tempo as amostras
foram novamente secas em estufa na temperatura de 60 C at atingirem peso
constante.

FIGURA 12. Extrator Soxhlet


O clculo da frao gel foi realizado pelas Equaes 1 e 2 de acordo
com a norma ASTM D 2765 (ASTM, 2001).
Fs = ( mi mf) / mi x 100

(1)

FG = 100% - Fs

(2)

Onde: mi = massa inicial da amostra


mf = massa de gel seco
Fs = frao solvel
FG = frao gel
4.2.2.2 Intumescimento
As amostras de membranas de hidrogel foram secas em estufa na
temperatura de 60C at peso constante. Cada amostra seca, em triplicata, com

45

cerca de 0,15g foi colocada em frasco contendo 20mL de tampo fosfato salina
(PBS) 0,1M pH = 5,0 e durante um perodo de 24 horas, foi verificada a massa a
cada hora durante as primeiras 6 horas do ensaio e aps 24 horas.
O grau de intumescimento foi calculado utilizando a Equao 3 de
acordo com a norma ASTM D 570 (ASTM, 1998).
I% = (mf mi) / mi x 100

(3)

Onde: I% = grau de intumescimento em porcentagem


mf = massa final em gramas
mi = massa inicial em gramas

4.2.2.3 Propriedades Mecnicas


As propriedades mecnicas das matrizes de hidrogel foram avaliadas
pelo ensaio de trao utilizando-se o texturmetro, modelo TA-TX2i com clula de
carga 25 Kg, da marca Stable Micro System (FIG 13).

FIGURA 13. Texturmetro, modelo TA-TX2i da Stable Micro System


Foram utilizados corpos de prova retangulares (2,4 x 10 cm) fixados em
probes roller grips (modelo A/TGT). No ensaio as amostras foram tracionadas a
uma velocidade de 0,8 mm/s, partindo-se de uma distncia inicial (lo) de 60mm,
at a ruptura. Este ensaio seguiu a norma ASTM D882-95 (ASTM,1995) e

46

metodologia encontrada na literatura (Carvalho e Grosso, 2006) com algumas


alteraes.
4.2.2.4 Citotoxicidade
O ensaio in vitro de citotoxicidade das matrizes de hidrogel foi realizado
utilizando-se a tcnica de Incorporao do Vermelho Neutro seguindo normas
internacionais

(ISO

10993-1,

10993-5

1992)

metodologia

publicada

anteriormente (Rogero, et. al., 2003). Os extratos das amostras das membranas
de hidrogel e do controle negativo foram preparados pela imerso dos mesmos
em meio mnimo de Eagle (MEM) e incubados em estufa durante 24h a 37C. Foi
utilizado 1/8 de cada membrana de hidrogel, equivalente a 4,5cm2 em 9mL de
MEM, ou seja, 0,5cm2/mL. Como controle negativo foi utilizado pellets de PVC
(policloreto de vinila) atxico (1cm2/mL) e como controle positivo soluo de fenol
0,02%. Aps este perodo, foram feitas diluies seriadas (100, 50, 25, 12,5 e
6,25%) dos extratos obtidos das amostras e do controle negativo assim como da
soluo de fenol. Em seguida, 200 L de cada diluio dos extratos e dos
controles, em triplicata, foram colocados em contato com uma cultura de clulas
de tecido conectivo de camundongo, a linhagem NCTC clone 929 do ATCC
(American Type Culture Collection), cultivadas em microplaca de 96 poos (FIG.
14). A microplaca preparada foi colocada a 37C por 24h em estufa incubadora de
CO2, modelo CB150, marca Binder, com atmosfera mida e 5% de CO2. O cultivo
das clulas e a distribuio da suspenso celular na microplaca foram realizados
na Seo de Culturas Celulares do Instituto Adolfo Lutz.
Esta primeira etapa do ensaio foi realizada em capela de fluxo laminar
utilizando tcnicas asspticas e todo material estril.
Aps 24h, a microplaca foi retirada da estufa e os extratos foram
substitudos por 200 L de soluo do corante vermelho neutro e incubada
novamente a 37C por 3h para incorporao do corante nas clulas. Decorrido
este perodo o corante foi desprezado e a microplaca lavada com soluo tampo
fosfato pH 7,4 e posteriormente com soluo de lavagem (1% de CaCl2 10% em
soluo de formaldedo 0,5%). Aps a lavagem os poos da microplaca foram
preenchidos com 200 L de soluo de extrao (50% de cido actico 2% e
etanol 50%) para a lise das clulas vivas e liberao do corante.

47

10

11

12

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

50%

50%

50%

50%

50%

50%

50%

50%

50%

50%

50%

50%

25%

25%

25%

25%

25%

25%

25%

25%

25%

25%

25%

25%

12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5%

12,5%

12,5% 12,5%

6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25%

6,25%

6,25% 6,25%

MEM MEM

100%

50%

25%

12,5% 6,25% 100%

50%

25%

12,5% 6,25%

MEM MEM

100%

50%

25%

12,5% 6,25% 100%

50%

25%

12,5% 6,25%

MEM MEM

100%

50%

25%

12,5% 6,25% 100%

50%

25%

12,5% 6,25%

FIGURA 14. Esquema da distribuio dos extratos das amostras e controle na


microplaca. Legenda:
Amostra 1

Amostra 2

Controle de clulas

Amostra 3

Controle negativo

Amostra 4
Controle positivo

A leitura da microplaca foi realizada em espectrofotmetro, leitora


ELISA modelo Sunrise da Tecan, em 540 nm. Com as densidades ticas (DO)
obtidas foram feitos clculos da porcentagem de viabilidade celular tomando-se
como referncia a DO do controle de clulas no ensaio.
O potencial txico foi determinado quantitativamente pelo ndice de
citotoxicidade (IC50%) encontrado no grfico obtido. O IC50% a concentrao de
extrato que provoca a morte de metade da populao celular do ensaio.
4.2.3 Preparo do dispositivo de hidrogel
Primeiramente foi feito um estudo do princpio ativo para avaliar sua
atividade citoestimulante e verificar a sua integridade frente radiao ionizante.
4.2.3.1 Citoestimulao
A atividade citoestimulante do ArctAlg foi verificada no ensaio in vitro
de citoestimulao utilizando o mtodo de incorporao do corante vermelho
neutro de acordo com a metodologia encontrada na literatura (Christophe, 2006).

48

Essa metodologia requereu como primeira etapa a verificao da faixa


de concentrao do princpio ativo ArctAlg a ser utilizada, em que foi
estabelecida no ensaio de citotoxicidade.
Posteriormente, foram realizados vrios ensaios de citoestimulao
(cerca de 18) para padronizao da quantidade ideal de clulas, tipo de meio de
cultura com a quantidade adequada de Soro Fetal Bovino (SFB), tempo de
incubao e concentrao do princpio ativo.
As concentraes de princpio ativo utilizadas nestes ensaios foram de
2, 1, 0,5 e 0,25%. Estas concentraes foram determinadas de acordo com o
ensaio de citotoxicidade do ArctAlg realizado previamente, em que o resultado
obtido mostrou que as concentraes abaixo de 2,5% do princpio ativo eram
atxicas.
Em seguida, foram realizados alguns ensaios com clulas fibroblsticas
de pele de coelho, linhagem celular FPC IAL para padronizar o nmero de
clulas/mL que iria conter na suspenso celular que seria utilizada para preparar
a microplaca. No primeiro ensaio foi utilizada uma microplaca que foi preparada
com uma suspenso de 200.000 clulas/mL, sendo que duas fileiras da
microplaca foram cultivadas com MEM e L-15 (v/v) mais 5% SFB como controle
do ensaio; outras duas fileiras com MEM e L-15 (v/v) mais 10% SFB, meio que
proporciona condio nutricional total e nas outras fileiras foi colocado as
diferentes concentraes do ArctAlg com o MEM e L-15 (v/v) mais 5% SFB.
Neste ensaio a microplaca foi incubada durante 24h e depois feito a leitura da DO.
O resultado obtido foi que a viabilidade celular deste ensaio, em todas as
condies nutricionais das clulas, foi semelhante e elevada, no havendo
diferena significativa entre as clulas que se encontravam em condio restrita
de nutrio com as que estavam com o princpio ativo ou em condio de nutrio
total (Apndice A). Portanto decidiu-se diminuir a quantidade do nmero de
clulas/mL para o prximo ensaio.
Outros 4 ensaios foram realizados, iguais ao descrito anteriormente,
onde foi alterado somente o nmero de clulas/mL. Foram testadas suspenses
de 180.000 clulas/mL, 150.000 clulas/mL e 100.000 clulas/mL, sendo este
ltimo realizado em duplicata. O melhor resultado encontrado foi com a
suspenso celular de 100.000 clulas/mL, mas mesmo assim no foi muito

49

satisfatrio devido a viabilidade celular do controle do ensaio ainda estar elevada


(Apndice B).
Aps a padronizao do nmero de clulas/mL foram realizados os
ensaios para padronizar a concentrao adequada de SFB e tambm verificar se
o L-15 interferia no crescimento celular. Para tanto, foi realizado um ensaio
utilizando uma microplaca preparada com uma suspenso de 100.000 clulas/mL
cultivadas com MEM e as concentraes de 15, 10, 5 e 2% de SFB. A microplaca
foi incubada durante 24h e aps trmino do ensaio feito a leitura da DO (Apndice
C). Neste ensaio pode-se observar que houve um aumento da viabilidade celular
nas concentraes de 10 e 15% de SFB, mas no houve uma diferena
significativa do crescimento celular entre essas concentraes. J as clulas que
estavam em contato com 5% de SFB apresentaram um pequeno crescimento e
as que estavam com 2% mantiveram-se sem crescimento. Este mesmo ensaio foi
repetido utilizando MEM e L-15 (v/v) junto com o SFB para verificar se no havia
alterao no crescimento das clulas (Apndice D). O resultado obtido neste
ensaio foi semelhante ao obtido quando se utilizou somente o soro fetal bovino.
Sendo assim, foi determinado utilizar o meio de cultura MEM e L-15 (v/v) com 2%
SFB para o controle do ensaio de citoestimulao e o MEM e L-15 (v/v) com 10%
SFB como o meio de cultura com condio total de nutrio.
Tendo a padronizao da suspenso celular de 100.000 cls/mL e das
concentraes de SFB (2 e 10%), foram realizados os ensaios com o ArctAlg.
No primeiro ensaio foi utilizada apenas uma microplaca, contendo o meio de
condio total de nutrio (MEM e L-15 (v/v) com 10% SFB), o meio com dficit
de nutrio (MEM e L-15 (v/v) com 2% SFB), ou seja, o controle do ensaio, e o
princpio ativo em diferentes concentraes (2; 1; 0,5 e 0,25%) sendo esta
diluio seriada feita em meio MEM e L-15 (v/v) mais 2% SFB. A microplaca foi
incubada durante 24h e aps finalizar o ensaio feito a leitura da DO (Apndice E).
Neste ensaio, ainda no foi possvel observar um crescimento significativo das
clulas em contato com o princpio ativo. Tentou-se, portanto aumentar a
incubao da microplaca para 48h.
No ensaio realizado com 48h de incubao o resultado mostrou que
houve aumento no nmero das clulas que estavam em contato com o ArctAlg.
Este ensaio foi repetido, mas o resultado no foi reprodutvel (Apndice F).
Portanto, decidiu-se trabalhar com microplacas separadas, ou seja, uma

50

microplaca para MEM e L-15 (v/v) mais 2% SFB; outra para MEM e L-15 (v/v)
mais 10% SFB e outra para o princpio ativo. Foram realizados mais 3 ensaios
utilizando esta metodologia e os mesmos apresentaram reprodutibilidade. Este
resultado est apresentado no item 5.4 em resultados e discusso.
Portanto, de acordo com a metodologia desenvolvida, em cada ensaio
foram utilizadas 3 microplacas com linhagem celular FPC IAL onde foram
distribudos 200 L de uma suspenso de 100.000 clulas/mL. A cultura celular e
a preparao da microplaca foi realizada na Seo de Culturas Celulares do
Instituto Adolfo Lutz. Na microplaca 1 - placa controle do ensaio - as clulas
ficaram em dficit nutricional parcial (MEM e L-15 (v/v) contendo 2% SFB);
microplaca 2 - as clulas em condio nutricional total (MEM e L-15 (v/v)
contendo 10% SFB); microplaca 3 as clulas em contato com o princpio ativo
em diferentes concentraes (2; 1; 0,5 e 0,25%) sendo esta diluio seriada feita
em meio MEM e L-15 (v/v) contendo 2% SFB. A distribuio das diferentes
concentraes do princpio ativo est ilustrada na FIG. 15.

10

2%

2%

2%

1%

1%

1%

0,5%

0,5%

0,5% 0,25%

0,25% 0,25%

2%

2%

2%

1%

1%

1%

0,5%

0,5%

0,5%

0,25%

0,25% 0,25%

2%

2%

2%

1%

1%

1%

0,5%

0,5%

0,5%

2%

2%

2%

1%

1%

1%

0,5%

0,5%

0,5%

0,25%

0,25% 0,25%

2%

2%

2%

1%

1%

1%

0,5%

0,5%

0,5%

0,25%

0,25% 0,25%

2%

2%

2%

1%

1%

1%

0,5%

0,5%

0,5%

0,25%

0,25% 0,25%

2%

2%

2%

1%

1%

1%

0,5%

0,5%

0,5%

0,25%

0,25% 0,25%

2%

2%

2%

1%

1%

1%

0,5%

0,5%

0,5%

0,25%

0,25% 0,25%

0,25%

11

12

0,25% 0,25%

FIGURA 15. Esquema da distribuio das diferentes concentraes de ArctAlg


na microplaca 3. Legenda:
2% de ArctAlg

1% de ArctAlg

0,5% de ArctAlg

0,25% de ArctAlg

51

As microplacas foram colocadas a 37C por 48h em estufa incubadora


de CO2, modelo CB150, marca Binder,com atmosfera mida e 5% de CO2. Aps
este perodo, a microplaca foi retirada da estufa e os extratos foram substitudos
por 200 L de soluo do corante vermelho neutro e incubada novamente a 37C
por 3h para incorporao do corante nas clulas. Posteriormente o corante foi
desprezado e a microplaca lavada com soluo tampo fosfato pH 7,4 e
posteriormente com soluo de lavagem (1% de CaCl2 10% em soluo de
formaldedo 0,5%). Aps a lavagem os poos da microplaca foram preenchidos
com 200 L de soluo de extrao (50% de cido actico 2% e etanol 50%) para
a lise das clulas e liberao do corante.
A citoestimulao foi verificada pelo aumento do nmero de clulas,
medida pelo aumento da incorporao do vermelho neutro, sendo quantificada em
espectrofotmetro, leitora ELISA, modelo Sunrise da Tecan, em 540nm. Com as
DO obtidas na leitura da microplaca foram feitos os clculos do aumento do
nmero de clulas em relao microplaca 1, controle de clulas do ensaio,
considerado 100% de viabilidade celular.
4.2.3.2 Estudo do comportamento do dipeptdeo citrulil-arginina irradiado
Para o preparo do dispositivo de hidrogel, ou seja, a incorporao do

ArctAlg na membrana de PVP e PVA, foi realizado anteriormente um estudo


sobre o comportamento do dipeptdeo citrulil-arginina frente radiao ionizante.
Uma soluo padro de citrulil-arginina foi preparada, em um balo
volumtrico de 100 mL, dissolvendo 20mg de citrulil-arginina em gua purificada
no sistema Milli-Q. Uma parte desta soluo padro foi irradiada em uma fonte de
Co-60 com taxa de dose de 5,72 kGY/h-1 na dose de 20 kGy. A estabilidade desta
soluo foi verificada por meio da cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)
conforme

metodologia

descrita

pelo

fabricante

(Exsymol)

com algumas

modificaes. O equipamento utilizado foi um HPLC composto por mdulos da


Shimadzu (FIG.16) como: desgaseificador de fase mvel, modelo DGU-3A;
bomba binria de vazo constante, modelo LC-10Ai; detetor UVvis, modelo SPD10AVi; unidade de aquecimento de coluna, modelo CTO-10 A; injetor automtico,
modelo SIL-10Ai; mdulo de comunicao para operao CBM-10 A e programa
para aquisio de dados CLASS-LC10.

52

FIGURA 16. Sistema de HPLC da Shimadzu


Foi injetado 5 L da amostra em uma coluna de fase reversa C18 (4
m x 250 mm x 4.6 mm) proveniente da Varian, utilizando fluxo de 1mL/min e
deteco realizada em 200 nm. A fase mvel utilizada neste ensaio consiste em
3% de acetonitrila e 97% de PIC B6 proveniente da Waters em um sistema
isocrtico.
Pela comparao das reas de pico do citrulil-arginina nas duas
amostras foi verificada a integridade da soluo de citrulil arginina irradiada.
4.2.3.3 Incorporao do ArctAlg na matriz de hidrogel
A incorporao do ArctAlg na matriz de hidrogel de PVP e PVA foi
feita logo aps a preparao da formulao do hidrogel.
Primeiramente obtiveram-se as formulaes de hidrogel de PVP e PVA
de acordo com a metodologia descrita no item 4.2.1. Aps o resfriamento em
aproximadamente 40C, foi incorporado 3% de ArctAlg em cada uma das
formulaes e misturado at completa homogeneizao.
Foram ento preparados os dispositivos de liberao, em forma de
membranas, vertendo-se 5mL da formulao contendo o princpio ativo em
moldes circulares de 5cm de dimetro e 0,15cm de profundidade, as quais, foram
seladas, embaladas e enviadas para irradiao em uma fonte de raios gama de
Co-60 com taxa de dose de 5,72 kGY/h-1. Os dispositivos de PVP foram irradiados
na dose de 25 kGy e os de PVA na dose de 20 kGy.

53

4.2.4 Cintica de liberao e doseamento do ArctAlg


Para o estudo da cintica de liberao in vitro do dispositivo de
liberao de ArctAlg foram realizados ensaios de cintica de liberao com:
membranas das matrizes de PVP e PVA, dispositivos de PVP e PVA contendo
ArctAlg e dispositivos de PVP e PVA contendo citrulil-arginina. As membranas
de hidrogel foram cortadas ao meio e imersas em 35mL de PBS 0,1M pH = 5,0
em frascos de vidro, em triplicata, e colocadas em uma incubadora da Tecnal,
modelo TE-420, sob agitao constante a 37C. Alquotas de 1mL foram
coletadas de 1 em 1 hora durante as primeiras 7 horas do ensaio e uma ltima
aps 24 horas. O doseamento do princpio ativo liberado foi realizado em HPLC
por meio da injeo de 100L das amostras coletadas durante o ensaio de
liberao em uma coluna de fase reversa C18 conforme metodologia descrita no
item 4.2.3.2.
A quantidade de ArctAlg liberado foi calculado por meio da
comparao da rea do pico da soluo padro de citrulil arginina com a rea do
pico de citrulil-arginina presente no ArctAlg liberado.
As alquotas coletadas das membranas controle de PVP e PVA e das
de PVP e PVA contendo citrulil-arginina no foram doseadas. Foi realizada
apenas uma injeo de cada amostra aps 1 hora do ensaio de liberao para
que fosse feito a anlise comparativa dos picos dos cromatogramas.
4.2.5 Atividade citoestimulante do ArctAlg liberado
O ArctAlg liberado in vitro foi testado quanto a sua atividade
citoestimulante pelo mtodo da incorporao do corante vermelho neutro. As
alquotas utilizadas neste ensaio foram as que apresentaram a maior quantidade
liberada, obtida no estudo da cintica de liberao.
Em capela de fluxo laminar as membranas de hidrogel de PVP e PVA
contendo 3% ArctAlg cada foram colocadas em frasco estril com 24mL de
MEM com L-15 mais 2% SFB. Estes fracos foram colocados em uma incubadora
da Tecnal, modelo TE-420, com agitao constante na temperatura de 37C
durante uma hora, para liberao do princpio ativo. Aps este perodo os frascos
foram retirados da incubadora e levados a uma capela de fluxo laminar onde o
meio de cultura foi transferido para as respectivas microplacas contendo clulas

54

fibroblsticas de pele e coelho, linhagem celular FPC IAL. As microplacas de 96


poos foram preparadas com uma suspenso de 100.000 clulas/mL, tendo sido
distribudas 200L em cada poo. A cultura celular e preparao das microplacas
foram realizadas pelo Instituto Adolfo Lutz .
Foram utilizadas 4 microplacas onde houve substituio do meio de
cultura das clulas fibroblsticas por 200L de cada tipo de meio, conforme
descrito a seguir:


Microplaca 1: meio com dficit nutricional parcial - MEM e L-15 (v/v) com 2%
SFB, para o controle do ensaio;

Microplaca 2: meio com condio nutricional total - MEM e L-15 (v/v) com 10%
SFB;

Microplaca 3 e 4: foi colocado na primeira metade da microplaca o meio com o


princpio ativo liberado da membrana de PVP e na outra metade o meio
contendo o princpio ativo liberado da membrana de PVA.
As microplacas foram colocadas a 37C por 48h em estufa incubadora

de CO2, com atmosfera mida e 5% de CO2.


A citoestimulao do princpio ativo liberado foi verificada pelo aumento
do nmero de clulas por meio da incorporao do corante vermelho neutro. A
quantificao do corante foi obtida em espectrofotmetro, leitora ELISA, modelo
Sunrise da Tecan, em 540nm. O clculo do aumento do nmero de clulas foi
feito com base no controle de clulas do ensaio o qual foi considerado 100%.

55

5 RESULTADOS E DISCUSSO
5.1 Obteno das matrizes de hidrogel
As matrizes de hidrogel de PVP e PVA foram obtidas por meio da
radiao ionizante conforme descrito no item 4.2.1 em materiais e mtodos.
O critrio para considerar as membranas adequadas ou no para
serem submetidas aos ensaios de caracterizao foi a formao de um filme
homogneo, transparente e elstico, parmetros avaliados visualmente e
manualmente. Ambas as matrizes formaram um filme homognio, transparente,
com boa adesividade e mostraram uma resistncia adequada para a
manipulao. A matriz de PVP apresentou uma transparncia mais acentuada
que a de PVA, como pode ser observado nas FIG. 17 e 18.

FIGURA 17. Matriz de hidrogel de PVP

56

FIGURA 18. Matriz de hidrogel de PVA

5.2 Caracterizao da matriz de hidrogel


5.2.1 Frao Gel
A determinao da frao gel, frao do polmero reticulada, uma
forma eficiente para avaliar a reticulao de matrizes polimricas. Membranas de
PVP e PVA foram preparadas e a frao gel medida segundo o procedimento
descrito no item 4.2.2.1 em materiais e mtodos. Neste ensaio pode-se observar
que se obteve um contedo de gel elevado, indicando uma elevada formao de
retculos entre as molculas polimricas.
Apesar da membrana de PVA apresentar porcentagem de frao gel
cerca de 10% maior que a membrana de PVP, os resultados da TAB. 4 mostram
que tanto o PVA quanto o PVP so polmeros capazes de obter um alto grau de
reticulao.

57

TABELA 4. Resultados do ensaio de frao gel das membranas de PVP e


PVA.
Membrana
PVP

PVA

mi (g)

mf(g)

0,1433

0,1075

0,1490

0,1123

0,1267

0,0901

0,1309

0,1107

0,1492

0,1253

0,1550

0,1310

% frao gel
73,8 2,4

84,4 0,3

Segundo estudo semelhante realizado por Zhao e colaboradores


(2003), o hidrogel de PVA associado quitosana carboximetilada irradiado na
dose de 20kGy apresentou porcentagem de frao gel cerca de 88%, sendo este
resultado bem prximo ao obtido neste trabalho, o qual foi de aproximadamente
84%.
5.2.2 Intumescimento
O intumescimento definido como a quantidade de gua absorvida
pelo material polimrico no equilbrio, quando o mesmo submerso em gua por
um perodo de tempo suficiente para que o sistema atinja volume constante
(Flory, 1986). Esta absoro de gua modifica significativamente as propriedades
dos materiais polimricos, no caso das membranas hidroflicas, permite estimar o
seu comportamento em sistemas de liberao de frmacos (Sen, 1999).
Foi realizado o ensaio de intumescimento com as membranas de
hidrogel de PVP e PVA obtidas conforme descrito no item 4.2.2.2 em materiais e
mtodos. Os resultados esto apresentados na TAB. 5 e o perfil de
intumescimento dos hidrogis pode ser observado na FIG. 19. Os resultados
mostram que tanto o hidrogel de PVP quanto o de PVA possuem uma boa
capacidade de intumescimento, sendo que nas primeiras 6h observa-se um
intumescimento rpido de ambos os hidrogis. Pode ser verificado que o hidrogel
de PVP apresentou intumescimento maior do que o hidrogel de PVA, sendo esta
diferena de 25% em 24 horas. Esta diferena dever ser levada em

58

considerao na eventual utilizao de incorporao de um agente ativo pela


capacidade de intumescimento da membrana de hidrogel e tambm no momento
da sua liberao.
Em trabalho publicado na literatura por Ajji e colaboradores (2005)
sobre a produo de curativos de hidrogis de PVP por meio da radiao gama,
foi verificado a capacidade de intumescimento dos mesmos utilizando diferentes
concentraes de PVP e PEG sendo irradiado na dose de 25 kGy. Neste estudo,
o hidrogel de PVP irradiado na dose de 25 kGy apresentou comportamento
semelhante ao obtido por Ajji e colaboradores aps 24 horas, podendo o mesmo
aumentar quase 20 vezes o seu peso inicial.
De acordo com Flory (1986), a absoro de gua pela rede
(intumescimento) depende do grau e da natureza das reticulaes do hidrogel.
Esta afirmao pode explicar a diferena na capacidade de intumescimento entre
os hidrogis, pois possivelmente o hidrogel de PVA intumesceu menos devido
apresentar um grau de reticulao maior que o hidrogel de PVP. Outra
possibilidade, conforme Flory, seria a natureza das reticulaes, pois a rede de
PVA poderia conter tambm reticulaes fsicas.
TABELA 5. Resultados do ensaio de intumescimento dos hidrogis de PVP e
PVA.
TEMPO
(h)
1
2
3
4
5
6
24

INTUMESCIMENTO (%)
PVP
PVA
847,58 16
325,03 14
1180,38 18
680,88 13
1355,07 20
839,65 19
1470,38 13
988,26 19
1564,70 16
1020, 89 20
1593,59 19
1105, 54 18
1658,99 14
1309,12 18

59

1800
1600

% Intumescimento

1400
1200
1000
800
600

PVP
PVA

400
200
0
0

10

15

20

25

Tempo (h)
FIGURA 19. Perfil de intumescimento dos hidrogis de PVP e PVA

5.2.3 Citotoxicidade
Para a avaliao da biocompatibilidade dos hidrogis obtidos foi
realizado o ensaio in vitro de citotoxicidade pelo mtodo de incorporao do
vermelho neutro. Este teste permite analisar a citotoxicidade ou reatividade
biolgica induzida pelo material testado em culturas celulares, tomando como
parmetro a viabilidade celular. Segundo Eisenbrand e colaboradores (2002),
mtodos que avaliam a citotoxicidade basal detectam a capacidade de um
material em causar morte celular como conseqncia de danos na funo bsica
da clula e apresentam boa correlao com a toxicidade aguda em animais e no
homem.
Com os resultados de DO obtidos neste ensaio foi calculada a
viabilidade celular em relao ao controle de clulas no ensaio, a qual foi
considerada 100%. Os resultados de viabilidade celular esto apresentados na
TAB. 6. Projetando-se os valores de viabilidade celular em relao
concentrao dos extratos foram obtidas as curvas de viabilidade celular,
apresentadas na FIG. 20. O ndice de citotoxicidade IC50% determina

60

quantitativamente o potencial txico das amostras, indicando a concentrao de


extrato que provoca a morte de 50% da populao celular. No ensaio, todas as
amostras que apresentarem curvas de viabilidade celular acima da linha do IC50%
so consideradas no citotxicas, como o controle negativo. As amostras que
cortarem a linha do IC50% pode-se obter o valor do ndice de citotoxicidade na
interseco das linhas, e aquelas cujas curvas estiverem abaixo do IC50% so
consideradas citotxicas.
TABELA 6. Resultados da viabilidade celular do ensaio de citotoxicidade in vitro
dos hidrogis de PVP e PVA.
CONCENTRAO

Controle
Positivo
00
22 21
80 14
97 12
93 7

Viabilidade celular (%)

DE EXTRATO (%)
100
50
25
12,5
6,25

VIABILIDADE CELULAR (%)


Controle
PVP
Negativo
99 15
108 10
105 6
85 4
100 7
89 15
103 7
78 7
104 5
76 14

PVA
83 8
93 4
97 9
98 2
82 5

100

50

IC50%
PVP
PVA
Controle negativo
Controle positivo

0
10

100

Concentrao de extrato (%)


FIGURA 20. Curvas de viabilidade celular dos hidrogis de PVP e PVA no ensaio
de citotoxicidade in vitro pelo mtodo de incorporao do vermelho neutro.

61

Conforme

estudos

anteriores

encontrados

na

literatura,

biocompatibilidade dos hidrogis de PVP (Higa, et.al., 1999) e PVA (Burczack


et.al., 1996) foi comprovada. Assim como esperado, neste presente estudo,
apenas o controle positivo apresentou toxicidade, com IC50% igual a 37,
significando que o extrato do controle positivo na concentrao de 37% provocou
a morte da metade da populao celular do ensaio. As amostras das membranas
de hidrogel apresentaram comportamento semelhante ao controle negativo,
mostrando as curvas de viabilidade celular acima da linha do IC50%, portanto
tanto o hidrogel de PVP quanto o hidrogel de PVA no apresentaram efeito
citotxico. Isso significa que esses materiais so biologicamente seguros,
cumprindo um dos requisitos de segurana exigidos para biomateiais.
5.2.4 Propriedades Mecnicas
As propriedades mecnicas esto associadas habilidade do material
resistir a foras mecnicas. O ensaio de resistncia a trao avalia a tenso
mxima requerida para deformao e, ou ruptura do material. O objetivo do
ensaio descrever o comportamento do material quando este submetido a
foras que tendem a pux-lo separadamente (Nielsen, 1988).
Vrios

fatores estruturais podem influenciar o comportamento

mecnico de materiais polimricos, tais como: massa molecular, reticulaes,


ramificaes, cristalinidade, morfologia cristalina, copolimerizao, plastificao,
entre outros (Macdermott, 1984).
Os principais parmetros que quantificam a resistncia mecnica dos
polmeros nos ensaios de trao so: mdulo elstico (E), tenso na ruptura
(rup) e porcentagem de alongamento ( (%)).
Por meio dos ensaios de trao foram obtidas curvas de tenso (N)
versus deformao (mm) como pode ser observado nas FiG. 21 e 22. Neste
ensaio foram analisadas 8 amostras de cada tipo de hidrogel sendo que 3 delas
foram selecionadas por apresentarem resultados reprodutveis.

62

3,5

A1
A2
A3

3,0

Fora (N)

2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Deformaao (mm)
FIGURA 21. Performance da fora de trao aplicada membrana de PVP

3,5
3,0

Fora (N)

2,5
2,0
1,5
1,0

PVA1
PVA2
PVA3

0,5
0,0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Deformao (mm)
FIGURA 22. Performance da fora de trao aplicada membrana de PVA

63

O Mdulo de Elasticidade (E) foi calculado a partir da inclinao da


linha de tenso na curva de deformao, uma vez que o coeficiente angular do
trecho reto do diagrama Tenso(N) x Deformao (mm) sempre o mesmo.
A porcentagem de alongamento at a ruptura ( ) foi calculada dividindo
a elongao mxima pelo comprimento inicial (60 mm) e multiplicando por 100.
Na TAB. 7 esto apresentados os resultados obtidos a partir da anlise
dos dados.
TABELA 7. Resultados de resistncia mxima trao, elongao e mdulo
elstico.
Tenso na ruptura

Alongamento

()

Mdulo Elstico
(E)

(N)

(%)

(N)

PVA1
PVA2
PVA3
Mdia
DP

3,10
2,91
3,09
3,03
0,11

160,80
136,27
152,78
149,95
12,51

0,56
0,62
0,58
0,59
0,03

PVP1
PVP2
PVP3
Mdia
DP

1,24
1,05
1,11
1,13
0,10

104,18
54,60
65,23
74,67
26,10

0,43
0,38
0,37
0,39
0,04

AMOSTRAS

()

Neste ensaio pode-se observar por meio do perfil da curva de


Tenso(N) x Deformao (mm) que a membrana de hidrogel de PVA possui uma
maior resistncia trao e uma maior elongao em relao de PVP. Segundo
Hilmy e colaboradores (1993) a adio de gar e PEG na composio de
hidrogis de PVP pode melhorar as propriedades mecnicas das membanas de
PVP, mas, apesar do uso desses dois componentes na formulao deste hidrogel
neste estudo, a membrana de hidrogel de PVA obteve uma maior resistncia a
trao, este comportamento pode ser atribudo ao maior nmero de ligaes
cruzadas, ou seja, uma maior densidade de reticulao. Em outro estudo
encontrado na literatura, realizado por Yoshii e colaboradores (1995), foi
verificado que a resistncia a trao de membranas de hidrogel de PVA obtidas
por reticulao qumica inferior as obtidas por raios gama. Portanto, por meio

64

desses estudos pode-se observar que os hidrogis de PVA obtidos pela radiao
ionizante apresentam melhores propriedades mecnicas.
5.3 Citotoxicidade do ArctAlg
O ensaio de citotoxicidade do ArctAlg foi realizado para determinar a
faixa de concentrao a ser utilizada, deste princpio ativo, no ensaio de
citoestimulao.
Este ensaio foi realizado conforme descrito no item 4.2.2.4 em
materiais e mtodos. Foi utilizado concentraes de 1, 2,5, 5 e 10% do princpio
ativo para a verificao de sua citotoxicidade e os resultados esto apresentados
na TAB. 8.
TABELA 8. Resultados da viabilidade celular do ensaio de citotoxicidade do
ArctAlg .
CONCENTRAO (%)
Controles
100
50
25
12,5
-6,25
----

ArctAlg
----10
-5
2,5
1

VIABILIDADE CELULAR (%)


Controle
Controle Negativo
ArctAlg
Positivo
00
104 21
-70 21
103 14
-87 10
97 11
-96 8
99 15
---5 20
110 18
105 7
---25 21
--75 17
--76 14

Viabilidade Celular (%)

65

100

50

IC50%
Arct'Alg
Controle negativo
Controle positivo

0
0

10

12

30

45

60

75

90

105

Concentraao do Arct'Alg e Controles (%)


FIGURA 23. Curvas de viabilidade celular do ArctAlg
As curvas de viabilidade celular do ArctAlg foram obtidas pela
projeo dos dados de porcentagem de viabilidade celular em funo da
concentrao do princpio ativo. Como pode ser observado na FIG. 23 as
concentraes acima de 2,5% de ArctAlg mostraram ser citotxicas, cortando a
linha do IC50% na concentrao de 3,8%, indicando que nesta concentrao de
princpio ativo ocorreu a morte de metade da populao celular do ensaio,
portanto dever ser utilizada uma concentrao abaixo de 3,8% no ensaio de
citoestimulao. As curvas de viabilidade celular, nas concentraes de 2,5% e
1% do ArctAlg, ficaram acima do IC50%, apresentando comportamento
semelhante ao do controle negativo, ou seja, nestas concentraes o princpio
ativo no apresentou efeito citotxico nas clulas.
5.4 Citoestimulao
A caracterstica citoestimulante do ArctAlg foi verificada pelo aumento
do nmero de clulas fibroblsticas utilizando o mtodo de incorporao do
corante vermelho neutro.

66

A propriedade de citoestimulao de grande importncia pelo fato


dos fibroblastos serem clulas diretamente envolvidas no processo de reparao
tecidual. Portanto, havendo o aumento do nmero de fibroblastos, ocorre
conseqentemente um aumento da produo de colgeno e elastina, favorecendo
assim o processo de cicatrizao (Junqueira & Carneiro, 2008).
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que o princpio ativo
utilizado possui uma atividade citoestimulante em algumas concentraes
utilizadas, como pode ser observado na TAB. 9 e FIG.24.
TABELA 9. Resultados da viabilidade celular do ensaio de citoestimulao do
ArctAlg .
CONCENTRAO DE
SFB (%) em MEM + L-15
10
2
CONCENTRAO DE ARCTALG (%)
0,25
0,5
1
2

VIABILIDADE CELULAR (%)


128 19
100 13
132 19
151 19
128 17
108 18

170

Viabilidade celular(%)

160
150
140

10%SFB

130
120
110

2%SFB

100
90
0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

Concentraao de Arct'Alg
FIGURA 24. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg.

67

Na concentrao de 2% do ArctAlg no foi evidenciado um aumento


significativo no nmero de clulas, obtendo um resultado bem prximo ao controle
celular do ensaio. Nas concentraes de 0,25% e 1% obteve-se um aumento em
cerca de 30%, sendo este resultado semelhante ao obtido nas clulas que se
encontravam em condio nutricional total (10% SFB). O princpio ativo na
concentrao de 0,5% proporcionou um aumento de 50% no nmero de clulas
do ensaio. Estes resultados demonstraram que as concentraes ideais do
ArctAlg para um aumento significativo no nmero de fibroblastos foram de 0,25
a 1%, evidenciando a atividade citoestimulante do princpio ativo em estudo.
Em estudo realizado por Christophe (2006) sobre a atividade
citoestimulante do dipeptdeo citrulil-arginina, principal constituinte do ArctAlg ,
mostrou resultado semelhante ao deste estudo, sendo que em uma concentrao
de 0,05% do dipeptdeo, houve um aumento de aproximadamente 50% da
populao celular no ensaio.
5.6 Estudo do comportamento do dipeptdeo citrulil-arginina irradiado
Neste estudo foi utilizado o citrulil-arginina por ser o componente de
maior interesse do ArctAlg. O comportamento do dipeptdeo frente radiao
ionizante foi verificado para direcionar a escolha do mtodo de incorporao do
princpio ativo na membrana de hidrogel. A soluo de citrulil-arginina foi irradiada
na dose de 20 kGy devido esta ser a menor dose utilizada para obter as
membranas de hidrogel.
Os resultados das anlises obtidos no ensaio realizado em HPLC
podem ser observados nas FIG. 25 e 26. No comprimento de onda de 200nm, o
cromatograma do citrulil-arginina irradiado apresentou uma rea de pico menor
em relao ao do no irradiado e com presena de um outro pico que aparece no
incio da anlise, sendo provavelmente produto de degradao do dipeptdeo pela
ao da radiao.

68

FIGURA 25. Cromatograma do citrulil-arginina irradiado

FIGURA 26. Cromatograma do citrulil-arginina no-irradiado

69

Na TAB. 10 esto apresentados os resultados de tempo de reteno e


rea do pico. O dipeptdeo citrulil-arginina irradiado e no irradiado mostraram
tempo de reteno semelhante, sendo ambos em cerca de 8 min.
TABELA 10. Resultados do ensaio em HPLC: tempo de reteno e rea do pico
do dipeptdeo citrulil-arginina irradiado e no irradiado.
citrulil-arginina

tempo de reteno
(min)

rea do pico

no-irradiado
Irradiado

8.02
8.99

1834301
299607

Em relao rea dos picos, pode-se observar que houve perda de


massa do citrulil-arginina de cerca de 84% quando irradiado. Esta elevada perda
de massa foi possivelmente pelo fato do dipeptdeo ter sido irradiado em soluo
aquosa, havendo assim reaes das espcies produzidas pela radilise da gua.
5.7 Obteno do dispositivo de hidrogel
Apesar do dipeptdeo citrulil-arginina apresentar perda de massa
quando irradiado decidiu-se testar a incorporao direta do princpio ativo no
hidrogel para verificar sua liberao. Esta tentativa baseia-se na hiptese de que
o dipeptdeo seria protegido da ao da radiao pelos componentes da
formulao, apesar da presena de gua.
Os dispositivos de hidrogel de PVP e PVA contendo 3% de ArctAlg
foram obtidos conforme descritos no item 4.2.4.2 em materiais e mtodos.
O critrio para considerar os dispositivos adequados ou no para
serem submetidos ao ensaio de liberao foi a formao de uma membrana
homognia,

transparente,

flexvel,

macia,

com

propriedades

mecnicas

adequadas para a manipulao. Os dispositivos de hidrogel de PVA e PVP foram


avaliados visualmente e pelo tato, como podem ser observados nas FIG. 27 e 28
respectivamente.

70

FIGURA 27. Dispositivo de hidrogel de PVA

FIGURA 28. Dispositivo de hidrogel de PVP


5.8 Cintica de liberao e doseamento do ArctAlg
O ensaio in vitro de liberao foi realizado para determinar o perfil de
liberao do ArctAlg dos dispositivos de PVP e PVA obtidos. Para determinar a
quantidade liberada de princpio ativo pelos dispositivos foram coletadas alquotas
em um determinado intervalo de tempo e quantificadas em HPLC conforme
descrito no item 4.2.5 em materiais e mtodos.
Para este ensaio foram utilizados dispositivos de PVP e PVA contendo
ArctAlg, dispositivos de PVP e PVA contendo citrulil-arginina e membranas das
matrizes de PVP e PVA como controle do ensaio, sendo que as alquotas
coletadas do dispositivo contendo citrulil-arginina e das membranas controles

71

foram utilizadas para uma anlise comparativa dos cromatogramas dos mesmos
com os do ArctAlg liberado.
Para verificar a liberao do ArctAlg (extrato composto por vrias
substncias) foi utilizado como padro o dipeptdeo citrulil-arginina, um de seus
principais constituintes. A quantificao do citrulil-arginina contido no ArctAlg
liberado foi obtida pela comparao da rea do pico de uma soluo padro de
0,2 mg/mL do citrulil-arginina com a rea do pico da citrulil-arginina liberado do
dispositivo contendo o ArctAlg.
A rea do pico do citrulil-arginina foi obtida pela injeo de 5 L da
soluo padro em uma coluna de fase reversa C18 conforme descrito no item
4.2.3.2. Na FIG. 29 apresenta-se o cromatograma do padro em que se observa o
pico no tempo de reteno de aproximadamente 8 min.

FIGURA 29. Cromatograma da soluo padro de citrulil-arginina


Na quantificao do ArctAlg liberado dos dispositivos de PVP e PVA
foi considerado o pico do dipeptdeo citrulil-arginina. Os cromatogramas obtidos
aps 1h de liberao do dispositivo de PVP com ArctAlg e da matriz controle de
PVP podem ser observados nas FIG. 30 e 31 respectivamente.

72

FIGURA 30. Cromatograma de cintica de liberao do dispositivo de PVP


contendo ArctAlg aps 1h de liberao.

FIGURA 31. Cromatograma do extrato da membrana controle de PVP

73

As FIG. 32 e 33 apresentam os cromatogramas obtidos aps 1h de


liberao do dispositivo de PVA contendo ArctAlg e da matriz controle de PVA
respectivamente.

FIGURA 32. Cromatograma de cintica de liberao do dispositivo de PVA


contendo ArctAlg aps 1h de liberao.

FIGURA 33. Cromatograma do extrato da membrana controle de PVA

74

Nos

cromatogramas

das

alquotas

de

cintica

de

liberao

apresentados nas FIG. 30 e 32 encontra-se o pico do dipeptdeo citrulil-arginina


com tempo de reteno de cerca de 8 min, muito prximo do tempo de reteno
do padro.
Nos cromatogramas das FIG. 31 e 33, correspondente s membranas
controle de PVP e PVA, no se observa o pico no tempo de reteno do padro.
Observa-se somente picos no incio do cromatograma e estes podem ser
observados nos cromatogramas dos dispositivos correspondentes.
Para comprovar que o pico obtido em torno de 8 min das amostras de
ArctAlg liberado o dipeptdeo citrulil-arginina, foi incorporado este dipeptdeo
em membranas de PVA. Na anlise de liberao em HPLC, o cromatograma
obtido apresentou tempo de reteno semelhante aos picos obtidos nos
cromatogramas dos dispositivos com ArctAlg. Na FIG. 34 apresenta-se o
cromatograma do dispositivo de PVA com citrulil-arginina.

FIGURA 34. Cromatograma da anlise em HPLC do dispositivo de PVA


contendo citrulil-arginina
A concentrao de citrulil-arginina liberada dos dispositivos preparados
com

ArctAlg

foi

calculada

pela

comparao

das

reas

dos

picos

correspondentes rea do pico da soluo padro. A quantidade de citrulil-

75

arginina padro no volume injetado corresponde a 1 g de citrulil-arginina que


forneceu uma rea de pico de 1834301. Assim, com esta rea do pico obtida, foi
possvel calcular a concentrao de citrulil-arginina nas alquotas da cintica de
liberao do ArctAlg, cujos resultados esto apresentados na TAB. 11.
TABELA 11. Resultados do ensaio da cintica de liberao do citrulil-arginina dos
dispositivos de PVP e PVA analisado em HPLC
DISPOSITIVO

PVP

PVA

TEMPO DE
LIBERAO
(h)
1
2
3
4
5
6
7
24
1
2
3
4
5
6
7
24

TEMPO DE
RETENO
(min)
7,94
7,48
8,02
7,59
7,96
7,56
7,51
7,6
7,55
7,66
7,59
7,64
7,59
7,61
7,61
7,59

REA DO
PICO
1102231
938004
916417
824082
839009
828229
818832
842494
667615
653028
626414
621342
616679
503148
509028
493516

CITRULIL-ARGININA
(g/mL)
6,009
5,114
4,996
4,493
4,574
4,515
4,464
4,593
3,639
3,56
3,415
3,387
3,362
2,743
2,775
2,69

Para obter a concentrao liberada real dos dispositivos foram


realizados alguns clculos partindo das concentraes do citrulil-arginina
encontradas em 100 L. Primeiramente a concentrao do dipeptdeo em g/mL
obtida no ensaio em HPLC foi multiplicada por 35 mL para se ter a concentrao
total liberada. Aps este clculo foi feito uma correo das concentraes, pois a
cintica de liberao foi realizada com reposio da soluo tampo a cada
retirada de alquota. Para fazer esta correo foi somada a concentrao total
liberada do citrulil-arginina com a concentrao obtida em 100 L da coleta
anterior.
O perfil de liberao do citrulil-arginina contido no ArctAlg dos
dispositivos de PVP e PVA esto apresentados nas FIG. 35 e 36.

76

10

Concentrao (g/mL)

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

20

22

24

Tempo (h)

FIGURA 35. Perfil de liberao do citrulil-arginina contido no ArctAlg do


dispositivo de PVP
Analisando os resultados da TAB. 11 e o perfil de liberao do
dispositivo de PVP verifica-se que houve a liberao total do ArctAlg na primeira
hora do ensaio, pois em at 24h no houve aumento no nvel de liberao.
No caso do dispositivo de PVA o comportamento foi similar, como
observado na TAB. 11 e FIG. 36.

77

Concentrao (g/mL)

0
0

20

22

24

Tempo (h)

FIGURA 36. Perfil de liberao do citrulil-arginina contido no ArctAlg do


dispositivo de PVA
Segundo Burczack e colaboradores (1994) a rea disponvel para a
difuso do soluto o espao livre que existe entre as cadeias macromoleculares
de hidrogis. Quando os espaos entre as cadeias forem preenchidos por gua
ou fluidos biolgicos, alcanando equilbrio de intumescimento, essas cadeias se
alongaro e o princpio ativo se difundir para fora da matriz de hidrogel. Este
comentrio pode explicar a liberao total do Arct Alg da matriz de hidrogel de
PVA e de PVP na primeira hora de ensaio, pois provavelmente o espao entre as
cadeias dos hidrogis maior que a massa molar do princpio ativo, facilitando
assim a sua difuso.
Outro estudo encontrado na literatura que poderia explicar a liberao
total de ArctAlg do dispositivo de PVP na primeira hora do ensaio o estudo
realizado por Sen e colaboradores (2007), que mostram que a utilizao de PEGs
hidrossolveis de baixo peso molecular na preparao de hidrogis por radiao

78

gama, no se reticula e consequentemente aumenta o tamanho dos poros no


hidrogel formado havendo assim uma maior facilidade na difuso do princpio
ativo.
Comparando a porcentagem de ArctAlg liberado entre os dispositivos,
o de PVP liberou cerca de 50% e o de PVA em torno de 30% em relao a
quantidade de ArctAlg incorporado conforme apresentado na TAB. 12. Deve-se
ressaltar que o dipeptdio citrulil-arginina, quando submetido radiao,
apresentou 80% de perda de massa, portanto sugere-se que os componentes da
formulao dos hidrogis protegeram o princpio ativo e provavelmente esta
porcentagem liberada a quantidade total que se encontrava no dispositivo. No
entanto, no se pode eliminar a possibilidade do ativo estar retido na rede
polimrica, tendo em vista a afinidade qumica. Para elucidar exatamente o
mecanismo em pauta, ensaios de extrao ou microscopia eletrnica so de
grande ajuda, porm fugiam ao previsto em nossa proposta.
TABELA 12. Porcentagem de liberao de ArctAlg a partir dos dispositivos de
hidrogis
DISPOSITIVO

PVP

PVA

TEMPO DE LIBERAO
(h)
1
2
3
4
5
6
7
24
1
2
3
4
5
6
7
24

CITRULIL-ARGININA LIBERAO DE ARCTALG


(mg)
(%)
0,421
53,3
0,370
46,8
0,359
45,6
0,324
41,1
0,329
41,6
0,325
41,1
0,321
40,7
0,330
41,6
0,255
32,2
0,256
32,4
0,246
31,2
0,244
30,9
0,242
30,6
0,198
25,2
0,199
25,3
0,194
24,5

79

5.9 Atividade citoestimulante do ArctAlg liberado


O ArctAlg liberado in vitro em meio fisiolgico (MEM e L-15 (v/v) com
2% SFB) foi avaliado quanto a sua atividade citoestimulante pelo mtodo da
incorporao do vermelho neutro.
O ArctAlg liberado do dispositivo de PVP apresentou um aumento
significativo do crescimento celular em relao ao controle de clulas no ensaio,
em cerca de 80%, sendo que as clulas que se encontravam em condio
nutricional total (MEM e L-15 com 10% SFB) apresentou crescimento de cerca de
22%, como mostra a FIG. 37.
Em relao ao dispositivo de PVA, no ensaio de citoestimulao, no
mostrou aumento significativo do nmero de clulas, sendo o resultado bem
prximo ao controle celular no ensaio.

Arct'Alg liberado do PVP


Arct'Alg liberado do PVA

200

Viabilidade celular (%)

180

160

140

10%SFB
120

2%SFB

100

Tempo (h)
FIGURA 37. Viabilidade celular do ArctAlg liberado na primeira hora dos
dispositivos de hidrogis de PVP e PVA

80

Estes resultados demonstraram que nas condies do ensaio in vitro o


dispositivo de PVP liberou uma quantidade adequada de ArctAlg para promover
a estimulao do crescimento de clulas fibroblsticas e que o princpio ativo
mesmo aps irradiao em 25 kGy ainda mantinha sua propriedade de
citoestimulao.

81

6 CONCLUSO

De acordo com os resultados obtidos nos ensaios de caracterizao da


matriz polimrica pode-se concluir que os hidrogis de PVP e PVA apresentaram
caractersticas adequadas para serem utilizados como dispositivos de liberao
de princpios ativos. Ambas as matrizes no apresentaram efeito txico no ensaio
de citotoxicidade e obtiveram um grau de reiculao e intumescimento elevado.
Apesar da membrana de PVA ser mais resistente que a de PVP, no foi
descartada a possibilidade de seu uso, pois a mesma apresentou uma resistncia
adequada ao manuseio durante o ensaio.
O estudo da cintica de liberao do ArctAlg mostrou que a
incorporao deste princpio ativo nos hidrogis, antes de serem irradiados,
possvel, pois tanto no dispositivo de PVP quanto no de PVA houve liberao,
sendo em cerca de 50% e 30% respectivamente. Apesar de ocorrer a liberao
do princpio ativo a partir do dispositivo de PVA, este no foi suficiente para
promover a citoestimulao das clulas fibroblticas. Esta propriedade foi
observada somente na amostra do ArctAlg liberado a partir do dispositivo de
PVP, em que houve um aumento em cerca de 80% da populao celular em
relao ao controle do ensaio.
Portanto, por meio dos resultados analisados, pode-se concluir que o
dispositivo de PVP liberou uma concentrao adequada de ArctAlg para
promover a citoestimulao, sendo nestas condies, o mais adequado para ser
utilizado em processos de reparao cutnea.

82

APNDICE

APNDICE A Ensaio de citoestimulao com 200.000 cls/mL


TABELA 13. Resultados da viabilidade celular do ensaio de citoestimulao do
ArctAlg em microplaca contendo 200.000 cls/mL.
CONCENTRAO DE
SFB (%) em MEM + L-15
10
5

CONCENTRAO DE ARCTALG
(%)
0,25
0,5
1
2

VIABILIDADE CELULAR (%)


85 15
100 16

92 15
85 19
87 19
91 12

105

5%SFB

Viabilidade celular (%)

100

95

90

10%SFB

85

80
0,0

0,5

1,0

1,5

Concentrao de Arct'Alg

2,0

2,5

FIGURA 38. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg em


microplaca contendo 200.000 cls/mL.

83

APNDICE B Ensaio de citoestimulao para a padronizao do


nmero de clulas/mL

TABELA 14. Resultados da viabilidade celular do ensaio de citoestimulao do


ArctAlg em microplaca contendo 180.000 cls/mL.
CONCENTRAO DE
SFB (%) em MEM + L-15
10
5
CONCENTRAO DE ARCTALG
(%)
0,25
0,5
1
2

VIABILIDADE CELULAR (%)


98 15
100 15

106 13
111 12
105 15
104 14

Viabilidade celular (%)

115

110

105

5%SFB

100

10%SFB

0,0

0,5

1,0

1,5

Concentrao de Arct'Alg

2,0

2,5

FIGURA 39. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg em


microplaca contendo 180.000 cls/mL.

84

TABELA 15. Resultados da viabilidade celular do ensaio de citoestimulao do


ArctAlg em microplaca contendo 150.000 cls/mL.
CONCENTRAO DE
SFB (%) em MEM + L-15
10
5

CONCENTRAO DE ARCTALG
(%)
0,25
0,5
1
2

VIABILIDADE CELULAR (%)


72 19
100 18

102 18
109 18
112 14
96 15

120
115

Viabilidade celular (%)

110
105
5%SFB

100
95
90
85
80
75

10%SFB

70
0,0

0,5

1,0

1,5

Concentrao de Arct'Alg

2,0

2,5

FIGURA 40. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg em


microplaca contendo 150.000 cls/mL.

85

TABELA 16. Resultados da viabilidade celular do ensaio de citoestimulao do


ArctAlg em microplaca contendo 100.000 cls/mL.
CONCENTRAO DE
SFB (%) em MEM + L-15
10
5

CONCENTRAO DE ARCTALG
(%)
0,25
0,5
1
2

VIABILIDADE CELULAR (%)


97 13
100 16

120 15
125 11
122 18
118 16

130

Viabilidade celular (%)

125
120
115
110
105
5%SFB

100

10%SFB
95
0,0

0,5

1,0

1,5

Concentrao de Arct'Alg

2,0

2,5

FIGURA 41. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg em


microplaca contendo 100.000 cls/mL.

86

APNDICE C Ensaio de citoestimulao para padronizao de SFB

TABELA 17. Resultados da viabilidade celular em funo do uso de MEM com


diferentes concentraes de SFB.
CONCENTRAO DE SFB (%)
15
10
5
2

VIABILIDADE CELULAR (%)


117 17
124 18
108 12
100 17

125

Viabilidade Celular (%)

120

115

110

105

100
0

10

15

20

Concentrao de SFB (%)

FIGURA 42. Viabilidade celular em funo do uso de MEM com


diferentes concentraes de SFB.

87

APNDICE D Ensaio de citoestimulao para a padronizao de SFB


no MEM + L-15

TABELA 17. Resultados da viabilidade celular em funo da concentrao de


SFB no MEM + L-15.
CONCENTRAO DE
SFB (%) em MEM + L-15
15
10
5
2

VIABILIDADE CELULAR (%)


121 18
127 14
103 18
100 11

130

Viabilidade celular (%)

125

120

115

110

105

100
0

10

15

20

Concentrao de SFB (%) + L-15

FIGURA 43. Viabilidade celular em funo da concentrao de


SFB no MEM + L-15.

88

APNDICE E Ensaio de citoestimulao com incubao da


microplaca por 24 horas

TABELA 18. Resultados da viabilidade celular em funo da concentrao de


ArctAlg com incubao da microplaca por 24 horas.
CONCENTRAO DE
SFB (%) em MEM + L-15
10
2

CONCENTRAO DE ARCTALG
(%)
0,25
0,5
1
2

VIABILIDADE CELULAR (%)


102 17
100 18

102 17
109 19
107 17
103 19

110

Viabilidade celular (%)

108

106

104
10%SFB

102

2%SFB

100

98
0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Concentrao de ArctAlg (%)

FIGURA 44. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg com


incubao da microplaca por 24 horas

89

APNDICE F - Ensaio de citoestimulao com incubao da


microplaca por 48 horas

TABELA 19. Resultado da viabilidade celular em funo da concentrao de


ArctAlg com incubao da microplaca por 48 horas ensaio 1.
CONCENTRAO DE
SFB (%) em MEM + L-15
10
2
CONCENTRAO DE ARCTALG
(%)
0,25
0,5
1
2

VIABILIDADE CELULAR (%)


122 17
100 18

127 12
147 13
122 19
109 16

150
145

Viabilidade celular (%)

140
135
130
125

10%SFB

120
115
110
105
2%SFB

100
0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Concentrao de ArctAlg (%)

FIGURA 45. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg com


incubao da microplaca por 48 horas ensaio 1.

90

TABELA 20. Resultado da viabilidade celular em funo da concentrao de


ArctAlg com incubao da microplaca por 48 horas ensaio 2.

CONCENTRAO DE
SFB (%) em MEM + L-15
10
2

CONCENTRAO DE ARCTALG
(%)
0,25
0,5
1
2

VIABILIDADE CELULAR (%)


104 12
100 15

109 10
105 12
102 14
98 12

115

Viabiliade celular (%)

110

105

10%SFB

2%SFB

100

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Concentrao de ArctAlg (%)

FIGURA 46. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg com


incubao da microplaca por 48 horas ensaio 2.

91

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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