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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

Faculdade de Cincias Farmacuticas


Programa de Ps-graduao em Toxicologia e Anlises Toxicolgicas

Determinao de 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA - Ecstasy), 3,4metilenodioxietilanfetamina (MDEA - Eve) e 3,4-metilenodioxianfetamina


(MDA) em fluidos biolgicos por cromatografia lquida de alta eficincia:
aspecto forense

Jos Luiz da Costa

Dissertao para obteno do grau de


MESTRE

Orientadora:
Profa. Dra. Alice Aparecida da Matta Chasin

So Paulo
2004

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS
Programa de Ps-Graduao em Toxicologia e Anlises Toxicolgicas

Determinao de 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA Ecstasy), 3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA - Eve) e 3,4metilenodioxianfetamina (MDA) em fluidos biolgicos por
cromatografia lquida de alta eficincia: aspecto forense

Jos Luiz da Costa

Dissertao para obteno do grau de


MESTRE
Orientadora:
Profa. Dra. Alice Aparecida da Matta Chasin

So Paulo
2004

Jos Luiz da Costa

Determinao de 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA Ecstasy), 3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA - Eve) e 3,4metilenodioxianfetamina (MDA) em fluidos biolgicos por
cromatografia lquida de alta eficincia: aspecto forense

Comisso Julgadora
da
Dissertao para obteno do grau de Mestre

Profa. Dra. Alice Aparecida da Matta Chasin


orientadora/presidente

____________________________
Profa. Dra. Elizabeth de Souza Nascimento
1o. examinador

____________________________
Profa. Dra. Silvia de Oliveira Santos Cazenave
2o. examinador

So Paulo, 18 de junho de 2004.

Em dezembro de 2002, ouvi de minha orientadora a


frase que passou a nortear este trabalho e minha vida:

Tudo dar certo no final.


Se ainda no deu certo, porque ainda no chegou o final.

Amigos
Tenho amigos que no sabem o quanto so meus amigos. No percebem o amor que lhes devoto e a absoluta
necessidade que tenho deles.
A amizade um sentimento mais nobre do que o amor, eis que permite que o objeto dela se divida em outros
afetos, enquanto o amor tem intrnseco o cime, que no admite a rivalidade.
E eu poderia suportar, embora no sem dor, que tivessem morrido todos os meus amores, mas enlouqueceria
se morressem todos os meus amigos! At mesmo aqueles que no percebem o quanto so meus amigos e o
quanto minha vida depende de suas existncias
A alguns deles no procuro, basta-me saber que eles existem. Esta mera condio me encoraja a seguir em
frente pela vida.
Mas, porque no os procuro com assiduidade, no posso lhes dizer o quanto gosto deles. Eles no iriam
acreditar. Muitos deles esto lendo esta crnica e no sabem que esto includos na sagrada relao de meus
amigos.
Mas delicioso que eu saiba e sinta que os adoro, embora no declare e no os procure. E s vezes, quando
os procuro, noto que eles no tem noo de como me so necessrios, de como so indispensveis ao meu
equilbrio vital, porque eles fazem parte do mundo que eu, tremulamente, constru e se tornaram alicerces do
meu encanto pela vida.
Se um deles morrer, eu ficarei torto para um lado. Se todos eles morrerem, eu desabo!
Por isso que, sem que eles saibam, eu rezo pela vida deles. E me envergonho, porque essa minha prece , em
sntese, dirigida ao meu bem estar. Ela , talvez, fruto do meu egosmo.
Por vezes, mergulho em pensamentos sobre alguns deles. Quando viajo e fico diante de lugares maravilhosos,
cai-me alguma lgrima por no estarem junto de mim, compartilhando daquele prazer
Se alguma coisa me consome e me envelhece que a roda furiosa da vida no me permite ter sempre ao meu
lado, morando comigo, andando comigo, falando comigo, vivendo comigo, todos os meus amigos, e,
principalmente os que s desconfiam ou talvez nunca vo saber que so meus amigos!
A gente no faz amigos, reconhece-os.

Vinicius de Moraes (1913-1980)

Dedico este trabalho

Aos meus pais, Teresa e Nelson, e aos meus irmos


Thiago e Nathlia, que sempre me fortaleceram com amor e carinho.
Nunca tiveram que saber o que era MDMA ou para que servia um
HPLC para apoiarem, incentivarem e rezarem para que este
trabalho se realizasse. Agradeo a vocs pela educao e
ensinamentos transmitidos ao longo da minha vida.

Fernanda Cortez Colsimo, nica pessoa no mundo


que realmente sabe o que esta dissertao de mestrado significa para
mim.

A Profa. Dra. Alice Aparecida da Matta Chasin.

No apenas pelos ensinamentos e orientao neste


trabalho, mas principalmente pela amizade, carinho, pacincia e
confiana que sempre depositou em mim. Espero ter sido um
orientado sua altura.
Ser sempre um espelho, a pessoa e o profissional que quero
ser quando crescer.

Agradecimentos
Terei sempre que agradecer em primeiro lugar a Professora Doutora Maria Elisa Pereira
Bastos de Siqueira, minha eterna orientadora, por ter guiado os primeiros passos de minha vida como
analista/toxicologista. Ter sempre minha eterna gratido e devoo.
Ao meu irmo Thiago Luiz da Costa, por ter ficado todo este tempo sem computador s para que
um pudesse terminar esta dissertao. Mano, muitssimo obrigado.
A toda famlia do Ncleo de Anlise Instrumental do Instituto de Criminalstica de
So Paulo: Alessandra (minha irm mais velha), Cristiane, Ftima, Milton Sadawo,
Nilza, Valria Furlan e Valria Reis, pelo apoio e por todas as vezes que vocs se desdobraram para
cobrir minhas ausncias no laboratrio. Agradeo de forma ainda mais especial e carinhosa a minha chefe,
Dra. Lucilena Martins Kayo, sempre conivente com minhas ausncias e pronta para ajudar quando
precisei.
A Profa. Dra. Maria de Ftima Menezes Pedrozo e a Profa. Dra. Pierina
Sueli Bonato pelos importantes apontamentos e sugestes cedidos durante o exame de qualificao.
Ao Dr. Jos Jarjura Jorge Jnior, Diretor do Instituto Mdico-Legal de So
Paulo, por permitir a coleta das amostras junto ao Ncleo de Toxicologia Forense. Do mesmo modo,

agradeo aos Peritos Criminais Dra. Vera Eliza Reinhardt, Dr. Erasmo Soares de Silva
e Dra. Clarice Caladoi, por colaborarem para a coleta do material.
As funcionrias do Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas da Faculdade de
Cincias Farmacuticas (USP) Dalva, Luzia, Roseli, Helena e Karla (SBTOX)
pelo imprescindvel apoio tcnico, pelo sempre delicioso caf e pelas conversas descontradas.
Aos meus eternos amigos da poca de Alfenas, Elisngela, Fernanda, Flvio, Gilson,
Ingrid, Nader, Ricardo, Roniel, Tatiane, Tiago (Bixo) e Waldir, pelos inesquecveis
momentos de risos e festas que passamos juntos, lembranas que sempre me do foras para seguir em frente.
Mesmo longe dos olhos, estaro sempre perto do meu corao.
Aos meus novos bons companheiros, Cssia, Emerson (Camb), Fausto (Frodo), Igo
(Naja), Jos Antnio (Pernambuco), Jos Roberto (Zero), Luiz Fernando (Nando) e
Mrcio (Astrinho), por terem me acolhido para esta turma animada.
A minhas amigas Danielle e Renata, pelas discusses e sugestes que enriqueceram este trabalho.
A Erica, presena importante nesta reta final, por todas as sugestes, comentrios e pelas vrias
vezes que leu e releu esta dissertao.
A todos que contriburam de alguma forma para a execuo deste trabalho, Muito obrigado

Sumrio
1. INTRODUO

01

2. GENERALIDADES

03

2.1. Histrico

03

2.2. Padres de consumo

04

2.3. Vias de sntese e propriedades fsico-qumicas

13

3. TOXICOCINTICA

16

3.1. Vias de administrao e concentraes plasmticas de pico

16

3.2. Distribuio e eliminao

17

3.3. Toxicocintica enantio-dependente

22

4. TOXICODINMICA
4.1. Mecanismos de ao das metilenodioxianfetaminas sobre o
Sistema Nervoso Central
4.2. Sinais e sintomas da intoxicao

25
25
28

4.2.1. Hepatotoxicidade

35

4.2.2. Nefrotoxicidade

38

4.2.3. Neurotoxicidade

42

5. ASPECTOS ANALTICOS

45

5.1. Matrizes biolgicas utilizadas

49

5.2. Tcnicas de extrao

48

5.3. Tcnicas de separao e identificao

54

6. Objetivo e Plano de Trabalho

57

7. MATERIAIS E MTODOS

58

7.1. Material

58

7.1.1. Equipamentos, vidrarias e acessrios

58

7.1.2. Solventes e reagentes

59

7.1.3. Condies cromatogrficas

60

7.1.3.1. Fase mvel

60

7.1.3.2. Sistema de deteco

60

7.1.4. Solues-padro

61

7.1.5. Amostras de sangue total

62

7.1.5.1. Amostras de sangue total referncia negativa

62

7.1.5.2. Amostras de sangue total selecionada para anlise

62

7.1.6. Amostras de urina

62

7.1.6.1. Amostras de urina referncia negativa

62

7.1.6.2. Amostras de urina selecionada para anlise

63

7.1.7. Tratamento estatstico

63

7.2. Mtodos
7.2.1. Procedimentos de extrao
7.2.1.1. Tcnica proposta para extrao de MDMA, MDEA e
MDA em sangue total
7.2.1.2. Tcnica proposta pra extrao de MDMA, MDEA e
MDA em urina

63
63
63
64

7.2.2. Condies cromatogrficas

67

7.2.2.1. Fator de reteno (k)

67

7.2.2.2. Fator de separao ()

67

7.2.2.3. Resoluo (Rs)

68

7.2.3. Otimizao do procedimento de extrao


7.2.3.1. Avaliao do efeito salting out
7.2.3.2. Avaliao da precipitao proteica sobre o rendimento
da extrao

68
68
69

7.2.4. Validao dos mtodos propostos

70

7.2.4.1. Especificidade e seletividade

70

7.2.4.2. Preparao das curvas analticas

70

7.2.4.3. Parmetros de confiana analtica

72

7.2.4.4. Estudo de estabilidade

74

7.3. Aplicao da metodologia proposta s amostras de sangue total e


urina selecionadas para este estudo
8. RESULTADOS

76
77

8.1. Condies cromatogrficas

77

8.2. Otimizao do procedimento de extrao

81

8.2.1. Avaliao do efeito salting out

81

8.2.2. Avaliao da precipitao protica sobre o rendimento da

81

extrao
8.3. Preparao das curvas analticas

83

8.3.1. Curvas analticas para sangue total

83

8.3.2. Curvas analticas para urina

85

8.4. Parmetros de segurana analtica

88

8.5. Pesquisa de possveis frmacos interferentes

91

8.6. Aplicao da metodologia proposta s amostras de sangue total e


urina selecionadas para este trabalho

94

9. DISCUSSO

95

10. CONCLUSES

108

11. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

109

Lista de Tabelas
Tabela 1 Uso concomitante do Ecstasy com outras drogas de abuso por usurios da 04
cidade de So Paulo (n=52), entrevistados entre os meses de junho e agosto de 1999.
Tabela 2 Mtodos analticos utilizados nas anlises de derivados anfetamnicos.

43

Tabela 3 - Tempo de reteno, reteno relativa, fator de reteno e simetria dos picos 72
cromatogrficos obtidos para os analitos e padro interno.
Tabela 4 - Parmetros cromatogrficos utilizados para avaliar a eficincia na separao 72
dos analitos nas condies cromatogrficas propostas.
Tabela 5 - Efeito da adio de cloreto de sdio sobre o processo de extrao de MDMA, 76
MDEA e MDA em urina, avaliado atravs de suas respectivas reas relativas.
Tabela 6 - Mdias das reas absolutas e relativas obtidas aps anlise de amostras de 76
sangue total enriquecidas (concentrao de 50 ng/mL) que sofreram processo de
precipitao ou diluio antes do procedimento de extrao.
Tabela 7 - reas relativas obtidas para a elaborao das curvas analticas dos analitos em 77
sangue total e respectivos coeficientes de variao (%CV).
Tabela 8 - reas relativas obtidas para a elaborao das curvas analticas dos analitos em 80
urina e respectivos coeficientes de variao (%CV).
Tabela 9 - Coeficientes de variao das concentraes sangneas e urinrias de MDMA, 83
MDEA e MDA obtidos nos ensaios de preciso intra e inter-ensaio.
Tabela 10 Exatido e recuperao dos mtodos propostos para anlise de MDMA, 84
MDEA e MDA em amostras de sangue total e urina, avaliados em diferentes
concentraes.

Lista de Figuras
Figura 1. Estrutura qumica das metilenodioxianfetaminas de maior interesse forense.

03

Figura 2. Alteraes no consumo de metilenodioxianfetaminas (MDMA, MDEA, MDA) 06


no mundo, 2001 (ou ltimo ano disponvel).
Figura

3.

Quantidade

apreendida

tendncias

do

trfico

mundial

de 09

metilenodioxianfetaminas (MDMA, MDEA, MDA) no binio 2001-2002.


Figura 4. Possveis vias de sntese do MDMA e seus anlogos a partir do safrol e 11
isosafrol.
Figura 5. Posio do carbono quiral (asterisco em vermelho) presente nas 12
metilenodioxianfetaminas de maior interesse forense.
Figura 6. Biotransformao das metilenodioxianfetaminas.

18

Figura 7. Estrutura qumica de catecolaminas endgenas, da anfetamina e seus alguns de 23


seus derivados.
Figura 8. Fluxograma do procedimento de extrao da MDMA, MDEA e MDA em 60
sangue total.
Figura 9. Fluxograma do procedimento de extrao da MDMA, MDEA e MDA em urina.

61

Figura 10. Cromatograma de amostra de sangue total referncia negativa.

73

Figura 11. Cromatograma de amostra de sangue total referncia negativa enriquecida com 73
MDMA, MDEA e MDA na concentrao de 50 ng/mL e padro interno (MBDB
100 ng/mL).

Figura 12. Cromatograma de amostra de urina referncia negativa enriquecida com padro 74
interno MBDB na concentrao de 500ng/mL.
Figura 13. Cromatograma de amostra de urina referncia negativa enriquecida com 74
MDMA, MDEA, MDA e MBDB na concentrao de 500 ng/mL.
Figura 14. Efeito da adio de cloreto de sdio (NaCl) sobre o processo de extrao do 75
MDMA, MDEA e MDA em sangue total.
Figura 15. Representao da curva analtica para a determinao de MDMA nas 78
concentraes sanguneas de 5 a 200 ng/mL.
Figura 16. Representao da curva analtica para a determinao de MDEA nas 78
concentraes sanguneas de 5 a 200 ng/mL.
Figura 17. Representao da curva analtica para a determinao de MDA nas 79
concentraes sanguneas de 5 a 200 ng/mL.
Figura 18. Representao da curva analtica para a determinao de MDMA nas 80
concentraes urinrias de 50 a 2000 ng/mL.
Figura 19. Representao da curva analtica para a determinao de MDEA nas 81
concentraes urinrias de 50 a 2000 ng/mL.
Figura 20. Representao da curva analtica para a determinao de MDA nas 81
concentraes urinrias de 50 a 2000 ng/mL.
Figura 21. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps 86
ciclos de congelamento.
Figura 22. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps 87
armazenamento sob refrigerao (10C).

Figura 23. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps 88
armazenamento a temperatura ambiente (estabilidade de bancada).

Lista de Siglas
5-HIAA: cido 5-hidroxiindolactico
5-HT: 5-hidroxitriptamina ou serotonina
AN: anfetamina
CG: cromatografia gasosa
CG/DIC: cromatografia gasosa com deteco por ionizao em chama
CG/DNP: cromatografia gasosa com deteco terminica especfica (detector seletivo de
nitrognio e fsforo)
CG/EM: cromatografia gasosa acoplada a espectrmetro de massas
Cmx: concentrao plasmtica mxima
CV: coeficiente de variao
CYP2D6: citocromo P-450 isoforma 2 D 6
EC: eletroforese capilar
EC/DAD: eletroforose capilar com deteco por arranjo de diodos
EC/DF: eletroforese capilar com deteco por fluorescncia
EC/EM: eletroforese capilar acoplada a espectrmetro de massas
ELL: extrao lquido-lquido
FPIA: imunofluorescncia polarizada
HHA: 3,4-dihidroxianfetamina
HHMA: 3,4-dihidroximetanfetamina
HMA: 4-hidroxi-3-metoxianfetamina
HMMA: 4-hidroxi-3-metoximetanfetamina
HPLC: do ingls, high performance liquid chromatography - cromatografia lquida de alta
eficincia
HPLC/DAD: cromatografia lquida de alta eficincia com deteo por arranjo de diodos
HPLC/DF: cromatografia lquida de alta eficincia com deteo por fluorescncia
HPLC/EM: cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrmetro de massas
LD: limite de deteco
LQ: limite de quantificao
LSD: dietilamina do cido lisrgico

MA: metanfetamina
MBDB: N-metil-1-(3,4-metilenodioxifenil)-2-butamina
MDA: 3,4-metilenodioxianfetamina
MDEA: 3,4-metilenodioxietilanfetamina
MDMA: 3,4-metilenodioximetanfetamina
MDPA: 3,4-metilenodioxipropilanfetamina
NTF-IML/SP: Ncleo de Toxicologia Forense do Instituto Mdico Legal de So Paulo
PMA: para-metoxianfetamina
SPE: do ingls, solid phase extraction - extrao em fase slida
SPME: do ingls, solid-phase microextraction - microextrao em fase slida
t1/2: meia-vida eliminao
TCA: cido tricloroactico

Resumo

Resumo
COSTA, J. L. Determinao de 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA Ecstasy),

3,4-metilenodioxietilanfetamina

(MDEA

Eve)

3,4-

metilenodioxianfetamina (MDA) em fluidos biolgicos por Cromatografia


Lquida de Alta Eficincia: aspecto forense. So Paulo, 2004. 121p.
Dissertao de Mestrado - Faculdade de Cincias Farmacuticas - Universidade
de So Paulo.

Em todo o mundo crescente o uso drogas de abuso sintticas


conhecidas com designer drugs. Os principais representantes desta classe so o
Ecstasy ou 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) e o Eve ou 3,4metilenodioxietilanfetamina (MDEA), substncias com efeitos estimulantes e
alucingenos. No Brasil crescente sua divulgao pela mdia e o uso
recreacional tem sido constatado em vrios pacientes que buscam tratamento nas
clnicas para dependentes. O presente trabalho constitui validao de
metodologia analtica para o diagnstico laboratorial do uso de MDMA, MDEA
e seu produto de biotransformao, o 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA), em
sangue total e urina, por cromatografia lquida de alta eficincia com deteco
por fluorescncia. Os mtodos desenvolvidos mostraram boa linearidade,
preciso, exatido, rendimento e capacidade de detectar os analitos mesmos
quando presentes em baixas concentraes, o que permite sua aplicao na
verificao da intoxicao aguda quanto no uso recreacional destas drogas de
abuso.

Abstract
COSTA, J. L. Determination of 3,4-methylenedioxymethamphetamine
(MDMA - Ecstasy), 3,4-methylenedioxyethylamphetamine (MDEA - Eve)
and 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA) in biological fluids by highperformance liquid chromatography: forensic aspect. So Paulo, 2004. 121p.
Dissertao de Mestrado - Faculdade de Cincias Farmacuticas - Universidade
de So Paulo.
There is a worldwide increase in the use of the synthetic drugs of abuse known
as designer drugs. The main representatives of this class are Ecstasy or
3,4-methylenodioxymethamphetamine

(MDMA)

and

Eve

or

3,4-

methylenodioxyethylamphetamine (MDEA), substances with stimulant and


hallucinogenic effects. In Brazil media coverage of them is on the increase and
their recreational is in evidence by the growing numbers of patients who seek
treatment at drug treatment centers. This paper validates the analytical
methodology for the laboratory diagnosis of the use of MDMA, MDEA and
their product of biotransformation, 3,4-methylenodioxyamphetamine (MDA), in
whole blood and urine by high performance liquid chromatography with
fluorescence. The developed methods showed good linearity, precision,
accuracy, yield and capacity to detect analytes even when present in low
concentrations, which enables its application in cases high intoxication as well
as in cases of the recreational use of these drugs of abuse.

Introduo

1. INTRODUO

O trfico internacional de Ecstasy aumentou geometricamente durante a dcada de


1990. Tagliaro et al., (2000) relataram que o Ecstasy est em terceiro lugar na lista das
substncias ilcitas mais utilizadas da Itlia, o mesmo ocorrendo em outros pases da Europa e
nos Estados Unidos. Peculiaridades desta classe de drogas de abuso como a facilidade de uso
quanto via de introduo (via de regra, oral) e sua discreta forma de apresentao (pequenos
comprimidos), acabam por facilitar o trfico e a difuso destas drogas entre os usurios. Isto
porque enquanto outras substncias ilegais geralmente exigem local reservado e acessrios
para seu uso, o Ecstasy no exige nenhuma preparao e pode ser consumido com muita
discrio em qualquer lugar (FERIGOLO; MEDEIROS; BARROS, 1998). Alm disso, as
quantidades relacionadas ao uso individual tornam mnimo o risco de ser identificado e
apreendido pela polcia.
No Brasil, crescente sua divulgao pela mdia e o uso recreacional tem sido
identificado em vrios pacientes que buscam tratamento para farmacodependncia nas
clnicas de So Paulo (SILVA; YONAMINE; REINHARDT, 1998). Segundo informaes
fornecidas pelo Ncleo de Exames em Entorpecentes do Instituto de Criminalstica de So
Paulo, durante o ano 2001 foram apreendidos 1061 comprimidos de Ecstasy pela Polcia Civil
do Estado de So Paulo; no ano seguinte este nmero foi de 5677. Segundo a Organizao das
Naes Unidas, o aumento no nmero de apreenses de determinada classe de drogas de
abuso indicativo do aumento no consumo desta substncia. Mesmo com o aumento no
nmero de apreenses e a notada presena das metilenodioxianfetaminas como frmacos de
abuso no Brasil, at o momento no existem informaes precisas sobre o consumo destas
substncias.

Introduo

Face ao exposto, de extrema importncia a padronizao de metodologia analtica


que possibilite a identificao e quantificao de metilenodioxianfetaminas em fluidos
biolgicos, ferramenta imprescindvel para futuros delineamentos epidemiolgicos sobre o
consumo de Ecstasy em nosso pas.

Generalidades

2. GENERALIDADES

2.1. Histrico

As chamadas designer drugs esto entre as drogas de abuso mais consumidas no


ocidente. Seus efeitos psicotrpicos especficos, e dos quais emanam sua utilizao como
drogas de abuso, so descritos como capacidade aumentada da comunicabilidade, empatia e
auto-conhecimento, o que distingue esta classe de compostos das substncias estimulantes e
alucingenas

tpicas.

Nesta

categoria

de

classificao

encontram-se

3,4-

metilenodioximetanfetamina (MDMA, Ecstasy), a 3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA,


Eve) e a 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA), substncias cuja estrutura qumica ilustrada
na Figura 1.

CH3
H
NH
C
CH3

O
O
MDMA

CH
H 2 5
NH
C
CH3

O
O
MDEA

H
NH2
C
CH3

O
O
MDA

Figura 1. Estrutura qumica das metilenodioxianfetaminas de maior interesse forense.


(VARESIO; VEUTHEY, 1995; SPITZER et al., 2001; MEYER et al., 2002; BUECHLER et
al., 2003).

Da mesma forma que a anfetamina e outros derivados anfetamnicos, a MDMA,


MDEA e a MDA so substncias sintticas que no existem na natureza. A MDA foi
sintetizada em 1910 e patenteada em 1956 como frmaco supressor da tosse, e em 1961 como
moderador de apetite, mas nunca chegou a ser comercializado para nenhum destes fins. A

Generalidades

MDMA foi sintetizada em 1914 pelo laboratrio alemo Merck, com intuito de ser um novo
moderador de apetite (BEITIA et al., 2000; KALANT, 2001).

Nas dcadas de 1960 e 1970 a MDMA foi utilizada como parte do movimento New
Age para estimulao e elevao de experincias sensoriais. Entre o final da dcada de 1970 e
incio da dcada de 1980, foi sugerido o uso da MDMA como adjuvante na psicoterapia por
provocar um estado controlado de alterao da conscincia, auxiliando na diminuio das
barreiras psicolgicas e no estabelecimento de um vnculo entre o terapeuta e o paciente,
facilitando a comunicao entre eles (ALMEIDA; SILVA, 2003). Em julho de 1985, o U. S.
Drug Enforcement Administration (DEA) classificou a MDMA como substncia Schedule I,
que significa a sua presena na lista de substncias controladas consideradas de alto potencial
de abuso, sem benefcio teraputico/mdico e cujo uso apresenta riscos mesmo sob superviso
mdica, tornando seu uso ilegal no territrio norte-americano. Contriburam tambm para a
deciso do DEA o crescente nmero de artigos cientficos que atribuam ao seu anlogo,
MDA, significativa ao neurotxica (RICAURTE et al., 1985). Em 11 de fevereiro de 1986 a
Organizao Mundial da Sade e a Comisso de drogas entorpecentes da Organizao das
Naes Unidas seguiram a deciso do DEA, classificando internacionalmente a MDMA como
substncia pertencente a Scheudule I.

2.2. Padres de consumo

O Ecstasy comercializado principalmente na forma de comprimidos, que possuem


grande variedade de cores, formas e tamanhos, estampados com vrios tipos de figuras e
logotipos. Pode tambm ser vendido na forma de cpsulas ou em p. Dentre os nomes mais
populares desta droga de abuso, os mais utilizados so Bala, A, E, XTC e ADAM.

Generalidades

semelhana de outras drogas vendidas no mercado ilcito, a dosagem e pureza destes


comprimidos podem variar muito (FERIGOLO; MEDEIROS; BARROS, 1998; GREEN et
al., 2003). Vrios artigos encontrados na literatura (SILVA; YONAMINE; REINHARDT,
1998; SHERLOCK et al., 1999; BAGGOTT et al., 2000; COLE et al., 2002; GIMENO;
BESACIER; CHAUDRON-THOZET, 2003) referem quais seriam os constituintes presentes
nos comprimidos comercializados no mercado ilcito como sendo Ecstasy, e observaram a
presena, alm da MDMA, de MDEA, MDA, PMA (para-metoxianfetamina), efedrina,
cafena, dextrometorfano, cetamina, dentre outras substncias. A dosagem tpica para uso
recreacional aquela geralmente presente em um comprimido que pode ser de 50 a 150 mg,
com variaes na concentrao que podem chegar a 70% ou mais (LARANJEIRA et al.,
1996; KALANT, 2001). Mesmo sendo proscrito em vrias partes do mundo desde a segunda
metade da dcada de 1980, a MDMA e seus anlogos tornaram-se drogas de abuso cada vez
mais comuns principalmente entre jovens que freqentam festas de msica eletrnica,
conhecidas como raves parties. Estas festas geralmente acontecem em grandes discotecas e
so uma mistura de msica eletrnica, vdeos e luzes controladas por computadores, onde os
participantes danam por horas sem parar (LARANJEIRA et al., 1996; FREESE; MIOTTO;
REBACK, 2002; GREEN et al., 2003). Neste contexto, a MDMA contribui para adiar a
fadiga e permitir que o usurio dance durante horas. Para este propsito, o consumo usual de
1 ou 2 comprimidos (entre 100 e 300 mg de MDMA) durante a festa, mas existem relatos da
utilizao de quantidades to grandes quanto 10 comprimidos e combinao com outras
drogas, normalmente levando a quadros de intoxicao grave. A quantidade ingerida costuma
ser maior entre indivduos que fazem uso freqente deste tipo de droga (KALANT, 2001).

Estima-se que cerca de 0,2% da populao global com idade acima de 15 anos
consuma Ecstasy. Aproximadamente 40% do consumo mundial deste tipo de droga de abuso
ocorre na Europa, seguido pela Amrica do Norte onde cresce seu consumo, o mesmo

Generalidades

ocorrendo no Leste Europeu e pases em desenvolvimento das Amricas, frica do Sul e


sudeste asitico (UNODC, 2003).

No Brasil, conforme pode ser observado na Figura 2, informaes sobre o consumo


deste tipo de droga de abuso ainda so escassas como tambm o so as informaes oficiais
sobre a quantidade de comprimidos apreendidos no pas. Recentemente, Almeida e Silva
(2003) entrevistaram 192 indivduos que haviam feito uso recente ou freqente de Ecstasy na
cidade de So Paulo. Observaram que a idade mdia dos usurios entrevistados era de 24
anos, e que a populao era composta principalmente por indivduos solteiros, com nvel de
escolaridade superior e pertencentes classe econmica mdia. Segundo estes autores, 78,8%
dos usurios fazem uso da droga em festas raves, na presena de outras pessoas e
normalmente adquirem a droga de amigos ou pessoas conhecidas. Um dado alarmante
exposto por estes autores que 93,3% dos indivduos entrevistados fazem uso concomitante
de outras drogas psicoativas, principalmente maconha, tabaco e LSD (dietilamina do cido
lisrgico), conforme pode ser observado na Tabela 1.

Generalidades

Tabela 1 Uso concomitante de Ecstasy com outras drogas de abuso por usurios da cidade
de So Paulo (n=52), entrevistados entre os meses de junho e agosto de 1999.

Drogas de abuso associadas ao consumo de Ecstasy*

Maconha

43

82,7

Tabaco

32

61,5

LSD

16

30,8

Etanol

14

26,9

Cocana ou Crack

17,3

Anfetamina

5,8

Outras drogas (opiides, inalantes)

5,8

No faz uso concomitante de outra droga

7,7

Respostas no excludentes. (Fonte: ALMEIDA; SILVA, 2003)

Embora a produo de MDMA ocorra nos Estados Unidos, a maior parte da droga
consumida naquele pas ainda importada da Europa Ocidental. Estima-se que a Holanda,
Blgica e Luxemburgo sejam responsveis pela produo de 80% da MDMA consumida no
mundo (NIDA, 2001). Gimeno, Besacier e Chaudron-Thozet (2003), relataram que de acordo
com a Europol (European Police Office), durante o ano 2000 foram apreendidos 17,4 milhes
de comprimidos de Ecstasy nos pases membros da Unio Europia, o que corresponde a um
aumento de 50% quando comparado com o nmero de apreenses que aconteceram durante o
ano de 1999. Estes mesmo autores comentam ainda que este aumento apresenta-se de forma
mais pronunciada em pases como a ustria (420%), Finlndia (394%), Grcia (1803%),

Generalidades

Irlanda (163%), Itlia (86%), Holanda (50%), Espanha (64%) e Sua (152%) (GIMENO;
BESACIER; CHAUDRON-THOZET, 2003). A quantidade de comprimidos de Ecstasy
apreendidos pela polcia de Taiwan aumentou de 700 para 44650 gramas nos ltimos quatro
anos (SUE; LEE; HUANG, 2002).

Generalidades

Figura 2. Alteraes no consumo de metilenodioxianfetaminas (MDMA, MDEA, MDA) no mundo, 2001 (ou ltimo ano disponvel).
(Fonte: Global Illicit Drug Trends 2003 - Office on Drugs and Crime, United Nations, 2003) .

Generalidades

10

No Brasil, a MDMA, MDEA e MDA so classificadas como substncias entorpecente


(Lista F2) pela Portaria n. 344 do Ministrio da Sade de 12 de maio de 1998. Segundo
informaes fornecidas pelo Ncleo de Exames de Entorpecentes do Instituto de
Criminalstica do Estado de So Paulo, somente neste Estado, entre os meses de maro e
dezembro de 2001, foram realizadas nove apreenses totalizando 1601 comprimidos de
Ecstasy; j entre os meses de janeiro e outubro de 2002 foram realizadas 13 apreenses,
totalizando 5677 comprimidos, o que representa um aumento de 355%.

O nmero de atendimentos relacionados ao uso de MDMA em salas de emergncia


dos EUA, que no ano de 1994 foi de 250, aumentou para 2850 no ano de 1999 (FREESE;
MIOTTO; REBACK, 2002). Entre 1974 e 2000, 160 mortes atribudas MDMA foram
relatadas na literatura cientfica internacional, nmero que certamente subestima o real
nmero de mortes causadas pela auto-administrao de MDMA (NIDA, 2001).

Alguns pesquisadores questionam se a MDMA realmente o agente de causa mortis


de todos estes bitos, uma vez que a droga de rua conhecida como Ecstasy nem sempre
contm apenas MDMA. Estudos realizados na Europa e Estados Unidos demonstraram que o
Ecstasy geralmente contm outras substncias ativas alm da MDMA. Entre fevereiro de
1999 e maro de 2000, a organizao annima conhecida como DanceSafe analisou 107
comprimidos por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas. Foi observado
que 63% dos comprimidos continham MDMA, enquanto que 29% continham outras
substncias ativas alm da MDMA. O frmaco mais identificado foi o dextrometorfano,
princpio ativo de xarope antitussgeno, em concentrao mdia de 136 mg, dose 4,5 a 9 vezes
maior que a dose teraputica. Em concentraes de 300 a 480 mg, o dextrometorfano pode
causar taquicardia e outros efeitos adversos que incluem depresso e psicose semelhante
causada pela fenciclidina. Alm disso, o dextrometorfano (assim como a MDMA) inibe a

Generalidades

11

enzima CYP2D6, o que indica que a administrao concomitante dos dois frmacos pode
produzir efeitos adversos inesperados. Outros frmacos identificados durante as anlises dos
comprimidos incluem cafena, efedrina, pseudoefedrina e cido acetilsaliclico (NIDA, 2001).

Cole et al. (2002) analisaram 136 amostras de comprimidos de Ecstasy apreendidos no


Reino Unido durante o ano de 2001 e observaram que a quantidade de MDMA presente
nestes comprimidos possui grande variao (entre 20 e 109 mg de MDMA por comprimido).

Os pases da Europa Ocidental so os principais fornecedores de Ecstasy para o


restante do mundo, como pode ser observado na Figura 3. Segundo relatrio da ONU, trs
quartos dos pases que realizaram apreenses de comprimidos de Ecstasy dentro de seu
territrio relataram que a droga era proveniente da Holanda. A Blgica o segundo maior
fornecedor de metilenodioxianfetaminas para o mundo, seguida pela Alemanha, Reino Unido,
Espanha e Estados Unidos da Amrica. China, Indonsia, Tailndia, frica do Sul e
Colmbia, so outros pases mencionados como fonte deste tipo de droga de abuso (UNODC,
2003).

Generalidades

12

Figura 3. Quantidade apreendida e tendncias do trfico mundial de metilenodioxianfetaminas (MDMA, MDEA, MDA) no binio
2001-2002. (Fonte: Global Illicit Drug Trends 2003 - Office on Drugs and Crime, United Nations, 2003).

Generalidades

13

2.3. Vias de sntese e propriedades fsico-qumicas

Na literatura cientfica internacional (RENTON; COWIE; OON, 1993; BAUDOT et


al., 1998), encontram-se descries de vrias vias de sntese da MDMA conforme pode ser
observado na Figura 4. Todas apresentam em comum o fato de que o composto inicial possui
o anel metilenodioxi. A primeira sntese e descrio da MDMA ocorreu na Alemanha em 24
de dezembro de 1912, realizada pelo laboratrio Merck sendo patenteado em 16 de maio de
1914. Neste processo (via III da Figura 4), a MDMA foi sintetizada em duas etapas a partir do
safrol. A MDMA tambm pode ser sintetizada a partir da MDA por reao com etil
cloroformato seguida por reduo (SHULGIN, 1986). Existem ainda dois processos de sntese
atravs da aminao redutiva da piperonil acetona (vias I e II da Figura 4), substncia
disponvel comercialmente.

As vias I e II parecem ser as mais comumente utilizadas em laboratrios que


sintetizam este frmaco clandestinamente, pois as reaes envolvidas nestes processos podem
ser facilmente adaptadas para a preparao dos anlogos da MDMA (RENTON; COWIE;
OON, 1993; BAUDOT et al., 1998).
As reaes descritas na patente do laboratrio Merck envolvem a formao do 3,4metilenodioxifenil-2-bromopropano (MDPBP) a partir do safrol seguido por reao com
metilamina e amnia para a formao de MDMA e MDA, respectivamente (RENTON;
COWIE; OON, 1993; BAUDOT et al., 1998).

A MDMA uma amina secundria, podendo ser encontrada na forma de base livre
(lquido de aspecto oleoso, insolvel em gua e solvel na maioria dos solventes orgnicos)
ou como sal de cidos (slido branco, hidrossolvel) (SHULGIN, 1986).

Generalidades

14

O
Safrol

Isosafrol

CH3CN
O
H3C

OH

NH

O
OH

N-acetil-MDA

Isosafrol glicol

Via III

LiAlH4

HBr

Via I

Via II

Piperonilmetilcetona

O
O

CH2H5

MDEA

O
N
CHO
H3C
N-formil-MDMA

CHO

MDPBP

N-formil-MDA

CH3NH2
O

Br

NH3
O

H
MDMA

CH3

MDA

Figura 4. Possveis vias de sntese da MDMA e seus anlogos a partir do safrol e isosafrol.

A base livre possui ponto de ebulio de 155C a 20 mm/Hg. A forma salina de


cloridrato pode ocorrer em um grande nmero de formas cristalinas hidratadas, o que torna

Generalidades

15

arriscada a identificao e estimativa da pureza desta substncia atravs de suas propriedades


fsicas e cristalinas. A forma anidra apresenta ponte de fuso em torno de 148C (SHULGIN,
1986).

A MDMA um composto quiral, sendo encontrado nos comprimidos de Ecstasy


vendidos no mercado ilcito exclusivamente na forma de racemato (BAGGOTT; JEROME,
2001). Sua sntese clandestina baseada em mtodos aquirais, resultando invariavelmente em
misturas racmicas dos produtos finais (MOORE et al., 1996). A estrutura destes compostos
mostrada na Figura 5.

CH3
NH

CH3

5.

Posio

C2H5
NH

carbono

quiral

(asterisco

NH2

CH3

MDEA

do

CH3

MDMA

Figura

MDA

em

vermelho)

presente

nas

metilenodioxianfetaminas de maior interesse forense (VARESIO; VEUTHEY, 1995;


SPITZER et al., 2001; MEYER et al., 2002; BUECHLER et al., 2003).

Esta substncia estruturalmente semelhante anfetamina e a algumas


fenilalquilaminas de atividades alucingenas como a mescalina. Contudo, a atividade
farmacolgica desta substncia parece no se restringir apenas simples atividade estimulante
ou alucingena, sendo classificado por Nichols (1986) como representante de uma nova
categoria de frmacos, os entactgenos, classe que abrigaria aquelas substncias que
provocam alterao controlada de conscincia, com harmonia sensual e emocional
(NICHOLS, 1986; ORTUO et al., 1999; KALANT, 2001).

Toxicocintica

16

3. TOXICOCINTICA

3.1. Vias de administrao e concentraes plasmticas de pico

semelhana de outras anfetaminas, a MDMA e seus anlogos so aminas e podem


ocorrer como base livre ou na forma de sal de vrios cidos. De um modo geral, as bases
livres so volteis e podem ser utilizadas na forma inalada. Contudo, o radical metilenodioxi
leva a um aumento no ponto de ebulio da base livre, o que impossibilita sua utilizao por
inalao de vapor. Os sais de cidos so hidrossolveis e por esta razo podem ser
administrados por via intravenosa, oral ou por inalao do p (procedimento semelhante ao
uso do cloridrato de cocana) (KALANT, 2001).

A via pela qual ocorre a auto-administrao do Ecstasy quase que exclusivamente a


oral, na forma de comprimidos ou cpsulas com concentraes que variam entre 50 e 150 mg
da substncia ativa, ou em p, misturado a sucos de fruta (FERIGOLO; MEDEIROS;
BARROS, 1998). Existem raros relatos sobre a administrao da droga por outras vias, como
a intravenosa e a intranasal (FERIGOLO; MEDEIROS; BARROS, 1998; KALANT, 2001).

A MDMA prontamente absorvida no trato intestinal e atinge pico de concentrao


plasmtica aproximadamente duas horas aps a administrao. Doses de 50 mg, 75 mg e
125 mg administradas a voluntrios sadios produziram concentraes plasmticas mximas de
106 ng/mL, 131 ng/mL e 236 ng/mL, respectivamente. Estas concentraes so
consideravelmente baixas, posto que a substncia passa rapidamente para os tecidos e liga-se
a seus constituintes (KALANT, 2001). Na literatura consultada no foram encontradas
informaes relevantes sobre a ligao da MDMA e seus anlogos a protenas plasmticas em
humanos. Bagott e Jerome (2001) relatam que a frao de MDMA ligada a protenas

Toxicocintica

17

plasmticas em experimentos com ces de aproximadamente 0,4 (razo entre a concentrao


do frmaco nos eritrcitos e sua concentrao livre no plasma) (GARRETT; SEYDA;
MARROUM, 1991) e possui relao independente da concentrao numa ampla faixa de
concentraes.

3.2. Distribuio e eliminao

A MDMA no possui comportamento farmacocintico linear e dose-dependente (DE


LA TORRE; FARR et al., 2000). Sua biotransformao fundamentalmente heptica, sendo
que a principal via oxidativa e envolve desmetilao, levando a catecis reativos que so
posteriormente convertidos por metilao, conjugao com cido glicurnico ou com radical
sulfato antes de ser eliminado (FERIGOLO; MEDEIROS; BARROS, 1998; KRETH et al.,
2000; BAGGOTT; JEROME, 2001), conforme pode ser observado na Figura 6. A cadeia
aliftica lateral degradada por N-desalquilao, levando inicialmente correspondente
amina primria (KRETH et al., 2000).

De um modo geral, estas substncias so biotransformadas principalmente no fgado,


por ao de enzimas do citocromo P-450, em particular pela CYP2D6 (ORTUO et al., 1999;
KRETH et al., 2000; KALANT, 2001; SEGURA et al., 2001). Outras enzimas esto
envolvidas nestes processos de degradao, sendo que algumas delas parecem sofrer
saturao em concentraes baixas do frmaco (KALANT, 2001).

Em estudos com voluntrios foi observado que a taxa de eliminao do frmaco da


circulao diminui com o aumento da dose. Estudos in vitro sugerem que produtos de

Toxicocintica

18

biotransformao da MDMA ligam e inativam a enzima CYP2D6, alm de saturar


rapidamente enzimas de alta afinidade envolvidas nesta biotransformao.
CH3
CH2

NH

CH3
O
MDEA
3,4-metilenodioxietilanfetamina

N-desmetilao

CH3

NH2

N-desmetilao

CH3

NH

MDA
3,4-metilenodioxianfetamina

CH3
MDMA
3,4-metilenodioximetanfetamina

desmetilenao

desmetilenao

CH3

HO
HO

NH2
CH3

Conjugao com radical sulfato


ou cido glicurnico

HO
HO

NH
CH3

HHMA
3,4-dihidroximetanfetamina

HMA
3,4-dihidroxianfetamina

O-metilao

O-metilao

CH3

CH3O
HO

NH2
CH3

HMA
4-hidroxi-3-metoxianfetamina

N-desmetilao

CH3O
HO

NH
CH3

HMMA
4-hidroxi-3-metoximetanfetamina

Figura 6. Biotransformao das metilenodioxianfetaminas (ORTUO et al., 1999; DE LA


TORRE; FARR et al., 2000; KALANT, 2001; GREEN et al., 2003).

Toxicocintica

19

Como resultado desta ligao enzimtica, doses maiores de MDMA podem


inativar/saturar mais enzimas, diminuindo a quantidade disponvel para biotransformar o
frmaco, resultando em farmacocintica no-linear. Conseqentemente, quando a dose
aumentada, ocorre um aumento desproporcional das concentraes sanguneas e cerebrais da
MDMA. Por esta razo, um pequeno aumento na dose oral de MDMA pode produzir
dramtica elevao nos nveis plasmticos do frmaco circulante, o que pode explicar alguns
dos efeitos txicos observados na superdosagem, como por exemplo quando usurios ingerem
outro comprimido antes da depurao da primeira dose (KALANT, 2001; NIDA, 2001).

A biotransformao destas substncias envolve reaes de N-desmetilao da cadeia


aliftica lateral, onde a MDEA convertida em MDMA e esta pode ser convertida em MDA.
A MDMA sofre O-desalquilao originando a 3,4-dihidroximetanfetamina (HHMA) e a 3,4dihidroxianfetamina (HHA), O-metilao originando a 4-hidroxi-3-metoximetanfetamina
(HMMA) e a 4-hidroxi-3-metoxianfetamina (HMA) (KRETH et al., 2000; BAGGOTT;
JEROME, 2001). A formao de HMMA e HMA a partir da HHMA e da HHA,
respectivamente, ainda no foi completamente estudada, mas possivelmente ocorra pela ao
da catecol-o-metil transferase.

Os metablitos dihidroxilados possuem meia-vida plasmtica curta, sendo de difcil


deteco (BAGGOTT; JEROME, 2001). Os principais produtos de biotransformao da
MDMA encontrados na urina so a MDA, HMMA e HMA (aproximadamente 90% dos
derivados hidroxilados so encontrados na urina na forma conjugada com o cido glicurnico,
o que explica a necessria etapa prvia de hidrlise para a realizao de anlises destas
substncias) (ORTUO et al., 1999). A MDA o principal produto de biotransfomao livre
(no conjugado) encontrado no plasma e urina, mas sua concentrao s representa uma

Toxicocintica

20

pequena porcentagem da concentrao de MDMA (10% da concentrao plasmtica de


MDMA) (ORTUO et al., 1999; GREEN et al., 2003).

Variaes genticas determinam diferenas na atividade da enzima CYP2D6, o que


pode ter efeito sobre a toxicidade da MDMA. A atividade desta enzima geneticamente
determinada e mais de 10% da populao caucasiana apresenta deficincia para esta enzima.
Desta forma, indivduos podem apresentar-se com metabolismo rpido ou lento para
compostos biotransformados pela CYP2D6, possuindo susceptibilidade diferente droga, o
que explica a ampla faixa de concentrao relacionada intoxicao aguda e aos efeitos
neurotxicos das metilenodioxianfetaminas (ORTUO et al., 1999; BAGGOTT; JEROME,
2001; SEGURA et al., 2001).

De la Torre et al., (2000), em experimento onde enfocaram administrao de dose


nica de MDMA a usurios recreacionais de Ecstasy, verificaram que os nveis plasmticos
da MDMA e MDA observados indicavam um comportamento cintico no-proporcional
dose administrada, verificando que sua biotransformao apresentava comportamento dosedependente, sendo reduzido em 50% aps a administrao de 125 mg de MDMA, indicando
falha no clerance heptico da substncia. Neste experimento, anlises de amostras de plasma
demonstraram que a HMMA o principal produto de biotransformao encontrado aps a
administrao de 50, 75 e 100 mg de MDMA, enquanto que o frmaco inalterado o
principal produto encontrado no plasma aps a administrao de doses maiores (125 mg ou
150 mg) da substncia. Esta informao demonstra que com o aumento da dose de MDMA, o
aumento na concentrao plasmtica no segue a mesma proporo, o que pode ser indicativo
de no-linearidade da farmacocintica desta substncia. Uma possvel explicao para estes
achados que as vias de biotransformao da MDMA tornam-se saturadas em doses maiores;
outra explicao seria uma possvel interao entre os produtos de biotransformao e as

Toxicocintica

21

enzimas envolvidas neste processo: a manuteno de grupos metoxi nas posies 3 e 4 das
metilenodioxianfetaminas, promove aumento na afinidade destas molculas pela enzima
CYP2D6, quando comparado com os respectivos produtos O-desmetilados (GREEN et al.,
2003).

Em modelos animais, a administrao de MDMA seguida por efeitos


neurodegenerativos no sistema serotonrgico central. O produto resultante da O-desmetilao,
a 3,4-dihidroximetanfetamina (HHMA), foi encontrado no crebro de ratos e postulado como
sendo responsvel por esta neurotoxicidade causada pelo Ecstasy, devido formao de
adutos com a glutationa e outros compostos endgenos que contenham radicais tiis
(ORTUO et al., 1999). Em humanos, a presena da HHMA s foi demonstrada em estudos
in vitro, aparecendo como principal produto da biotransformao da MDMA. As
concentraes plasmticas e urinrias da HHMA so proporcionais quantidade de MDMA
presentes nestas matrizes. Este produto possui alta reatividade e instabilidade devido sua
estrutura qumica, sendo encontrado apenas na forma conjugada um materiais biolgicos
(ORTUO et al., 1999).

Devido baixa taxa de ligao a protenas (aproximadamente 20%) e ao baixo peso


molecular da MDMA e seus anlogos, estes compostos possuem passagem praticamente
irrestrita entre o plasma e a saliva (NAVARRO et al., 2001). Estes frmacos distribuem-se
amplamente por todos os tecidos, atravessando a barreira hematoenceflica (FERIGOLO;
MEDEIROS; BARROS, 1998).

A eliminao da MDMA relativamente lenta, com meia-vida plasmtica da ordem de


8 horas. De acordo com o postulado de que o tempo mdio para eliminao de 95% de um
frmaco do organismo da ordem de 5 meia-vidas (aproximadamente 40 horas para a
MDMA), pode-se justificar por sua cintica de eliminao alguns dos efeitos adversos que

Toxicocintica

22

podem ocorrer at dois dias aps o uso. Alguns produtos de biotransformao da MDMA
possuem atividade farmacolgica, em especial a MDA, razo pela qual alguns efeitos do
Ecstasy podem durar mais do que o tempo de permanncia da MDMA no organismo
(KALANT, 2001). Ortuo et al. (1999), verificando a eliminao da MDMA e seus principais
produtos de biotransformao (MDA, HMMA, HMA), observaram que aproximadamente
50% da MDMA recuperada nas primeiras 24 horas, independente da dose administrada.
Enquanto a recuperao urinria da HMMA praticamente constante para todas as doses
estudadas, a recuperao da MDMA aumenta de maneira no-proporcional a dose
administrada, outro indicativo da no-linearidade da farmacocintica desta substncia
(GREEN et al., 2003). Como para todas as aminas, o pH urinrio influi decisivamente para a
excreo urinria, sendo que a acidificao da urina aumenta sua eliminao (FERIGOLO;
MEDEIROS; BARROS, 1998).

2.3. Toxicocintica enantio-dependente

Estereoismeros so ismeros que diferem apenas pelo modo como seus tomos esto
dispostos no espao. Nesta categoria de isomerismo, encontra-se uma forma especial, que
ocorre quando um tomo individual, na maioria das vezes carbono, possui quatro substituintes
distintos. Neste caso, ocorrem duas espcies denominadas enantimeros, cujas estruturas
diferem apenas por serem imagens especulares no sobreponveis. Esses enantimeros
recebem denominaes distintas R ou S de acordo com sua configurao e (+) ou (-) devido
propriedade de promover a rotao de plano de luz polarizada para a direita ou esquerda,
respectivamente (ROMERO, 1998).

Toxicocintica

23

Como ocorre com vrios outros frmacos, as metilenodioxianfetaminas estudadas


neste trabalho ocorrem na forma de dois ismeros pticos R(-) e S(+). Durante sua produo
clandestina e quando comercializadas como drogas de rua, estas substncias so vendidas
como mistura destas duas formas isomricas (NIDA, 2001).

Fallon et al. (1999) administraram 40 mg de mistura racmica de MDMA a oito


voluntrios no-usurios e mediram as concentraes sangneas e urinrias do
esteroismeros S(+)-MDMA, R(-)-MDMA, S(+)-MDA, R(-)-MDA em intervalos de tempo
regulares e observaram que a concentrao plasmtica mxima (Cmx) dos dois enantimeros
da MDMA foi atingida 4 horas aps a administrao, mas o valor da Cmx do enantimero
R(-)-MDMA foi significativamente maior que a do S(+)-MDMA e a rea sob a curva (AUC)
das concentraes plasmticas foi de duas a quatro vezes maior para o enantimero-R do que
para o enantimero-S aps a administrao de 40 mg para voluntrios. Alm disso, a meiavida de eliminao (t1/2) do S(+)-MDMA foi significativamente menor que a do R(-)-MDMA.
Outro estudo relata que aps a administrao de 1,5 mg/kg, a concentrao plasmtica
da forma S(+) retorna para aproximadamente zero aps 24 horas, enquanto que a forma R(-)
apresenta valores quantificveis at 36 horas aps a administrao. Anlises quantitativas
revelaram um acmulo aproximadamente trs vezes maior da forma R(-) na circulao
comparado com a forma S(+), e que a forma R(-) eliminada do plasma cerca de 35% mais
lentamente que a forma S(+). Estes resultados sugerem que a forma R(-) pode sofrer acmulo
com administraes sucessivas (NIDA, 2001).

No existe diferena no clerance renal dos dois enantimeros de MDMA, indicando


que o clerance no-renal (metablico) o processo estereoespecfico (GREEN et al., 2003).
Moore et al. (1996) observaram nveis maiores do enantimero-R da MDMA em amostras de

Toxicocintica

24

sangue, fgado, humor vtreo e bile de indivduos que morreram logo aps a ingesto de
Ecstasy.

A recuperao urinria mdia dos enantimeros de MDMA e MDA durante as


primeiras 24 horas aps a administrao foi de 21,4% para o R(-)-MDMA, 9,3% para o S(+)MDMA, 1,0% para o R(-)-MDA e 1,4% para o S(+)-MDA, mostrando substancial disposio
enantioseletiva da MDMA em humanos, com o enantimero S(+) apresentando maior
atividade farmacolgica com menor meia-vida, menor concentrao plasmtica e maior
clerance metablico (GREEN et al., 2003).

Toxicodinmica

25

4. TOXICODINMICA

4.1. Mecanismos de ao das metilenodioxianfetaminas sobre o Sistema Nervoso


Central

A MDMA possui estrutura qumica similar as catecolaminas endgenas (adrenalina,


noradrenalina e dopamina), conforme pode ser observado na Figura 7, e atua no crebro
aumentando a atividade de pelo menos trs neurotransmissores: serotonina, dopamina e
noradrenalina. Como outras anfetaminas, a MDMA aumenta a liberao destes
neurotransmissores nas fendas sinpticas, aumentando a atividade cerebral. Possui maior
atuao sobre a serotonina, principal neurotransmissor responsvel pela regulao do humor,
sono, dor, emoes, apetite e comportamentos. Pela liberao de grande quantidade de
serotonina, inibio da sua recaptao, e tambm por interferir em sua sntese, a MDMA leva
ao comprometimento da depleo deste neurotransmissor e, como resultado preciso
considervel espao de tempo para a restaurao nos estoques necessrios para realizao de
importantes funes fisiolgicas e psicolgicas (KALANT, 2001; FREESE; MIOTTO;
REBACK, 2002; TRAUB; HOFFMAN; NELSON, 2002). Desta forma, o uso crnico desta
substncia leva depleo de serotonina, podendo causar danos as vezes irreversveis aos
neurnios responsveis pela liberao deste neurotransmissor.

De modo similar, mas em menor extenso, este aumento na liberao e inibio da


recaptao ocorre com a dopamina, sendo atribudo a este neurotransmissor um importante
papel na mediao dos efeitos psicoestimulantes da MDMA (GREEN et al., 2003). H
tambm uma ao importante da droga sobre os receptores adrenrgicos 2, que parece
mediar a ao simptica provocada por este frmaco. luz dos conhecimentos atuais, est

Toxicodinmica

26

claro que o aumento na liberao de serotonina (e possivelmente de dopamina) seja os


principal mecanismo de ao da MDMA (KALANT, 2001).

H
C C NH2
H2
CH3

O
O

MDA

O
MDEA

OH

C C N CH3
H H2 H

HO

C2H5
H
C C NH
H2
CH3

MDMA
OH

HO

CH3
H
C C NH
H2
CH3

HO
HO

Adrenalina

C C NH2
H H2

HO
HO

Noradrenalina

H
C C NH2
H2
CH3
Anfetamina

C C NH2
H2 H2
Dopamina

CH3
H
C C NH
H2
CH3
Metanfetamina

Figura 7. Estrutura qumica de catecolaminas endgenas, da anfetamina e alguns de seus


derivados.

A serotonina sintetizada a partir do triptofano, um aminocido essencial, sendo que


os neurnios serotonrgicos possuem todas as protenas necessrias para sintetizar este
neurotransmissor a partir do L-triptofano. Sua principal via de metabolismo esta relacionada
com a enzima monoamino oxidase (MAO) originando aldedo, que ser convertido em cido
5-hidroxiindolactico (5-HIAA) pela ao da enzima aldedo desidrogenase. Muitas funes
cerebrais so mediadas pela serotonina, como sono, cognio, percepo sensorial, atividade
motora, regulao da temperatura corprea, apetite, comportamento sexual e secreo
hormonal. Todos os subtipos de receptores so expressos no crebro, muitas vezes em reas

Toxicodinmica

27

sobrepostas. Ainda que os padres de expresso em neurnios no tenham sido


completamente esclarecidos, provvel que muitos subtipos de receptores com aes
similares ou at mesmo antagnicas sejam expressas em um mesmo neurnio, o que resulta
em enorme diversidade de aes. A serotonina recm-formada rapidamente armazenada em
vesculas sinpticas onde fica protegida da ao da monoamino oxidase. Quando liberada na
fenda sinptica, a serotonina liga-se a receptores localizados nos neurnios ps-sinpticos,
causando alteraes nas propriedades eltricas deste neurnio. A serotonina liberada para a
fenda sinptica durante o impulso nervoso e que no se liga aos receptores, recaptada no
neurnio pr-sinptico por um carreador sdio-dependente, conhecido como transportador de
serotonina. A recaptao pr-sinptica um mecanismo altamente eficiente para eliminar a
ao da serotonina liberada pelo impulso nervoso. A monoamino oxidase localizada nos
neurnios ps-sinpticos e na fenda sinptica rapidamente inativa o neurotransmissor que
escapa da recaptao (BUSH; MAYER, 2003). Quando a MDMA se liga ao transportador de
serotonina, mais neurotransmissor liberado na fenda sinptica por dois mecanismos:
primeiro porque a MDMA impede que o transportador de serotonina retire-a da fenda
sinptica, pois bloqueia este transportador e segundo porque a MDMA pode fazer com que o
transportador de serotonina atue de modo reverso, transportando-a do interior do neurnio
pr-sinptico para a fenda sinptica. Assim, como mais serotonina est presente na fenda,
mais receptores so ativados, sendo este o principal mecanismo de ao da MDMA sobre a
fisiologia cerebral.

A MDMA e seus anlogos so geralmente produzidos como mistura racmica, mas os


estereoismeros diferem em vrios aspectos importantes. O ismero S(+)-MDMA mais
potente que o R(-)-MDMA na produo dos efeitos subjetivos caractersticos do Ecstasy.
Alguns estudos sugerem que o ismero R(-) est mais relacionado com os efeitos semelhantes
aos da mescalina e ao LSD (dietilamina do cido lisrgico), e que, portanto estariam

Toxicodinmica

28

relacionados aos efeitos alucingenos reportados, enquanto que o ismero S(+) estaria mais
relacionado com os efeitos semelhantes anfetamina. Os enantimeros diferem tambm
quanto a intensidade dos efeitos provocados, sendo que o ismero S(+) apresenta maior
potncia que o ismeros R(-). Neste aspecto a MDMA difere de outras anfetaminas
alucingenas, como a 2,5-dimetoxy-4-metilanfetamina (DOM), as quais invariavelmente so
mais ativas na forma levorotatria R(-) (GOWING et al., 2001).

De acordo com a American Psychiatric Association (1995), o Ecstasy causa


dependncia por satisfazer 4 critrios de diagnstico: utilizado mesmo com conhecimento
dos seus efeitos adversos, consumido em doses maiores que as planejadas, induz tolerncia
e causa ressaca caracterizada por cansao, insnia e depresso. A caracterizao da
tolerncia apresenta certas dificuldades, uma vez que pode ocorrer em maior grau para os
efeitos colaterais indesejveis, limitando assim, o consumo de doses elevadas e freqentes.

4.2. Sinais e sintomas da intoxicao

Mesmo tendo reputao de droga segura, os efeitos agudos causados pelo uso do
Ecstasy (hipertermia, complicaes cardiovasculares, falncia renal e heptica) podem levar
morte (KRETH et al., 2000).

Os efeitos buscados pelos usurios de Ecstasy incluem aumento do humor, elevao


de empatia e sensao de proximidade, alteraes visuais, sensoriais e emocionais, aumento
da energia fsica, extroverso e autoconfiana. Dentre os principais efeitos adversos destacamse o bruxismo, contratura da mandbula, diminuio do apetite, cefalia, alteraes
locomotoras e sudorese (FREESE; MIOTTO; REBACK, 2002).

Toxicodinmica

29

Os efeitos causados pelas metilenodioxianfetaminas variam de acordo com a dose,


freqncia e durao do uso. De modo geral, os efeitos desejados por muitos usurios so
aqueles produzidos por baixas doses usadas esporadicamente. A MDMA produz significativo
aumento na vivacidade, pacincia e sensao de energia, despertar sexual e adiamento da
fadiga e do sono. Os efeitos fisiolgicos observados so descritos como um aumento da
euforia, bem-estar, percepo sensorial aguada, melhora na sociabilidade, extroverso,
aumento na sensao de intimidade e proximidade com outras pessoas, maior tolerncia
opinio e sentimentos alheios (LARANJEIRA et al., 1996). Estes ltimos efeitos levam a
afirmar que a MDMA representa uma classe distinta entre as drogas de abuso designadas
como entactgenos, ou seja, que poderiam ser utilizadas com adjuvante em sesses de
psicoterapia (SHULGIN, 1986; KALANT, 2001; TRAUB; HOFFMAN; NELSON, 2002).

Como outras anfetaminas, a MDMA tambm possui efeitos adversos demonstrados


em muitas funes fsicas, mesmo quando utilizada em doses moderadas com finalidade
recreacional. Como a ao bsica das anfetaminas envolve o aumento do despertar e da
viglia, usualmente ocorre tambm aumento da tenso muscular, manifestada por contratura
da mandbula, bruxismo e movimentos constantes das pernas. O aumento da atividade
muscular, somado ao direta do frmaco no sistema termorregulador do crebro, leva a um
aumento na temperatura corprea. Rigidez e dor nos membros inferiores e na regio inferior
das costas so queixas freqentes durante os primeiros 2-3 dias aps o uso de MDMA. Dor de
cabea, nuseas, diminuio do apetite, viso turva, boca seca e insnia so outros sintomas
fsicos relatados aps a experincia do uso de Ecstasy. Os efeitos psicolgicos indesejados
resultantes da intoxicao aguda por MDMA representam uma resposta exagerada dos efeitos
desejados e buscados pelo usurio. Como exemplo o aumento da viglia, se em excesso,
convertido em hiperatividade, confuso e insnia. Outras queixas relacionadas ao uso de
MDMA incluem alucinao leve, despersonificao, ansiedade, agitao, comportamentos

Toxicodinmica

30

bizarros e repetitivos. Ocasionalmente estes sintomas podem levar a ataques de pnico, delrio
ou at episdios curtos de psicose (pouco freqentes) (FERIGOLO; MEDEIROS; BARROS,
1998; WEINMANN; BOHNERT, 1998; BAGGOTT; JEROME, 2001; KALANT, 2001).

Porquanto a MDMA seja considerado droga segura pelos usurios, este conceito
falso, pois alm de causar alteraes da percepo que comprometem a habilidade, por
exemplo, em dirigir, existem relatos de intoxicaes agudas envolvendo estas substncias,
etanol e outras drogas de abuso (WEINMANN; BOHNERT, 1998; TRAUB; HOFFMAN;
NELSON, 2002). O quadro clnico mais freqentemente associado intoxicao aguda por
Ecstasy caracterizado por leso heptica grave (podendo ocorrer necrose do tecido
heptico), hipertermia associada ou no rabdomilise, coagulao intravascular disseminada
e falncia renal. Outras complicaes freqentemente relatadas incluem hiponatremia, estupor
catatnico, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnide ou isquemia cerebral.
Concentraes sanguneas de MDMA superiores a 1000 g/mL so potencialmente fatais
enquanto que concentraes inferiores a 0,6 g/mL so capazes de levar a quadros de
intoxicao aguda (DE LETTER et al., 2004). As intoxicaes por MDMA ou MDEA no
podem ser diferenciadas clinicamente, mas apenas atravs de anlises toxicolgicas em
amostras de urina ou sangue (WEINMANN; BOHNERT, 1998).

Ao contrrio do grande nmero de relatos de intoxicao aguda por MDMA, poucas


so as informaes sobre casos de mortes relacionadas ao uso de MDEA (WEINMANN;
BOHNERT, 1998), talvez porque o consumo deste tipo de substncia seja inferior ao
consumo de MDMA.

Vrios relatos sobre a toxicidade da MDMA so associados hiponatremia e danos


hepticos que podem progredir at falncia fulminante do fgado. Problemas cardiovasculares
relatados incluem arritmias cardacas e hipertenso, mas as freqncias destes sinais no so

Toxicodinmica

31

conhecidos. Interao com outras drogas ou adulterantes presentes nos comprimidos podem
interferir no metabolismo e nos efeitos txicos da MDMA. Finalmente, a farmacocintica
no-linear aumenta a possibilidade de que pequenos aumentos na dose de MDMA
administrada, venha a resultar num aumento desproporcional das concentraes sanguneas
posto que, como citado anteriormente, a eliminao no dose-dependente o que aumenta o
risco de intoxicaes (FREESE; MIOTTO; REBACK, 2002).

A MDMA apresenta significativos efeitos sobre o sistema cardiovascular,


principalmente devido sua ao sobre a liberao de noradrenalina e por agir como agonista
-2-adrenrgico. Por este mecanismo provoca aumento dose-dependente da freqncia
cardaca e presso sangunea (DE LA TORRE; FARR et al., 2000). A hipertenso induzida
pelo Ecstasy pode causar danos a vrios rgos, o que geralmente ocorre quando a presso
diastlica excede 130 mm Hg (BAGGOTT; JEROME, 2001). Esta hipertenso pode estar
relacionada com outras patologias induzidas por este tipo de frmaco, como a falncia renal
aguda, distenso artica, infarto do miocrdio e hemorragia cerebral (MANCHANDA;
CONNOLLY, 1993; WOODROW; HARNDEN; TURNEY, 1995).

Outra ao da MDMA ocorre sobre a liberao hormonal, onde esta substncia leva a
um aumento dose-dependente da concentrao de cortisol, prolactina e do hormnio
adrenocorticotrfico, enquanto que as concentraes de hormnio do crescimento
permanecem inalteradas mesmo aps a administrao de 125 mg de MDMA (MAS et al.,
1999). Henry et al. (1998) demonstraram que mesmo em baixas doses (40 mg) a MDMA pode
induzir secreo de hormnio antidiurtico (vasopressina) em humanos, levando desta forma
a alteraes como aumento na reteno de fluidos, o que pode contribuir para a instalao do
quadro de hiponatremia (BAGGOTT; JEROME, 2001; SUE; LEE; HUANG, 2002).

Toxicodinmica

32

Algumas mortes associadas ao uso de MDMA envolvem aumento da temperatura


corprea (sndrome hipertrmica), e so devido atuao desta substncia sobre as vias
dopaminrgicas e serotonrgicas que regulam a temperatura corprea (ELLIS et al., 1996;
FREESE; MIOTTO; REBACK, 2002). Considera-se que este quadro clnico esteja
caracterizado sempre que a temperatura corprea se iguale ou exceda 38C. Os casos de
hipertermia induzida pelo Ecstasy so provavelmente o resultado da soma de vrios fatores: a
ao do frmaco sobre o sistema termoregulador do crebro e a vasoconstrio perifrica
induzida por este e que diminui a perda de calor corpreo. As atividades fsicas intensas,
reposio inadequada de eletrlitos e lquido e as altas temperaturas muitas vezes encontradas
nas festas raves, aumentam de modo significativo os riscos de hipertermia (GORDON et al.,
1991; ELLIS et al., 1996).

As principais manifestaes clnicas da hipertermia so edema cerebral, hipotenso e


hipxia tecidual com enfraquecimento da contratibilidade (ELLIS et al., 1996). O tratamento
da hipertermia requer atendimento mdico imediato, e pode levar a rabdomilise e leses
renais (FREESE; MIOTTO; REBACK, 2002). Na presena de distrbios neurolgicos, como
delrio, estupor ou convulses, a hipertermia significa alto risco de morbidade e mortalidade
(que acontece dependendo da temperatura mxima atingida, da durao da hipertermia e do
estado de sade e conscincia do indivduo) (WATSON et al., 1993; BAGGOTT; JEROME,
2001). O tratamento da hipertermia induzida pelo Ecstasy necessita de acompanhamento
mdico e envolve medidas de apoio e facilitao do resfriamento corpreo. A administrao
de soluo salina pode ser usada para corrigir a hipovolemia e muitas vezes o suficiente para
corrigir a taquicardia e hipotenso. A administrao de diazepam pode ser necessria a fim de
se evitar crises convulsivas (BAGGOTT; JEROME, 2001; MECHAN et al., 2002).

Toxicodinmica

33

Rabdomilise uma sndrome clnica resultante da degenerao muscular e liberao


de protenas musculares para a regio extracelular. Em usurios de Ecstasy, a degenerao
muscular na maioria das vezes ocorre devido hipertermia prolongada, excesso de esforo
fsico ou durante as crises convulsivas que podem ser desencadeadas pelos efeitos das
metilenodioxianfetaminas sobre o Sistema Nervoso Central (WATSON et al., 1993;
BAGGOTT; JEROME, 2001; SUE; LEE; HUANG, 2002). Baggott e Jerome (2001) relatam
que 38% dos usurios de Ecstasy que apresentam quadro de hipertermia podem apresentar
tambm rabdomilise. Possveis fatores de risco para o desenvolvimento desta sndrome
muscular so, alm da hipertermia, a desnutrio, desidratao, esforo fsico excessivo,
tabagismo e alcoolismo. Os sintomas da rabdomilise incluem dor muscular, fraqueza e urina
de colorao marrom. O contedo das clulas musculares lesadas pode causar ainda graves
riscos sade do indivduo, podendo desencadear falncia renal aguda e coagulao
intravascular disseminada (WATSON et al., 1993). A rabdomilise pode ser desenvolvida
tardiamente ao uso da droga (TRAUB; HOFFMAN; NELSON, 2002).

A coagulao intravascular disseminada uma patologia relacionada com a formao


de fibrina e o consumo de fatores de coagulao e plaquetas no interior dos vasos sanguneos.
Pode ser apresentada nos quadros de intoxicaes causadas pelo uso de Ecstasy e deve ocorrer
devido a uma combinao de fatores como necrose heptica, leses de clulas endoteliais e
pela termo-inativao de fatores de coagulao, plaquetas e megacaricitos (ELLIS et al.,
1996). Com o prejuzo destes fatores, a coagulao fica impossibilitada podendo ocorrer
hemorragia generalizada, caracterizada por sangramento nasal e da gengiva, febre,
dificuldades em respirar, taquicardia e hipotenso. Segundo Baggott e Jerome (2001), a
coagulao intravascular disseminada ocorre em 50% dos usurios de Ecstasy que apresentam
quadro de hipertermia.

Toxicodinmica

34

A coagulao intravascular disseminada pode levar ainda a problemas mais graves,


como hemorragia e infarto cerebral. O infarto cerebral pode ser devido isquemia causada
pela vasoconstrio que induzida pela droga ou pela formao de cogulos (possivelmente
relacionado com a desidratao e coagulopatia induzida pelo Ecstasy) (HUGHES; MCCABE;
EVANS, 1993). J a hemorragia cerebral comum entre usurios de substncias
psicoestimulantes principalmente devido hipertenso induzida pelo frmaco (que pode levar
a ruptura de vasos sanguneos do crebro) (CHASIN, 1990; HUGHES; MCCABE; EVANS,
1993; ROTHWELL; GRANT, 1993).

A hiponatremia outro efeito adverso associado ao uso de MDMA que no se


manifesta durante a utilizao de outras anfetaminas (HALL, 1997; SUE; LEE; HUANG,
2002; TRAUB; HOFFMAN; NELSON, 2002). Este efeito parece ser raro, ainda pouco
estudado, mas pode estar associado morbidade e mortalidade relacionadas ao frmaco. Sue,
Lee e Huang (2002) relatam ter conhecimento de apenas 14 casos deste tipo de efeito por
usurios de Ecstasy. Este efeito adverso causado pela MDMA pode estar associado com a
sndrome da secreo inapropriada de hormnio antidiurtico (ADH), uma vez que a MDMA
um agonista serotonrgico e existem evidncias de que a liberao de ADH seja mediada
por este neurotransmissor (SUE; LEE; HUANG, 2002; TRAUB; HOFFMAN; NELSON,
2002).

Os sintomas iniciais da hiponatremia aguda ocorrem quando os nveis sricos de sdio


caem at valores menores que 120 mEq/L (BAGGOTT; JEROME, 2001), e podem incluir
nuseas, vmitos e cibras musculares. Posteriormente, pode ocorrer a instalao de quadro
de edema cerebral. Neste estado, os efeitos neurolgicos so predominantes e incluem
cefalia, letargia, confuso, estupor, crises convulsivas e coma (SUE; LEE; HUANG, 2002;
TRAUB; HOFFMAN; NELSON, 2002).

Toxicodinmica

35

Quando a concentrao plasmtica de sdio comea a diminuir, a presso osmtica


imediatamente provoca entrada de gua para o interior das clulas. No crebro, vrios
mecanismos (incluindo a bomba de sdio-potssio ATPase) culminam na diminuio dos
solutos intracelulares na tentativa de prevenir o edema celular. Estes mecanismos podem
liberar sdio para dentro do espao subaracnide, causando difuso de gua do crebro para o
lquido cefalorraquidiano. Se este mecanismo for incapaz de compensar a hiponatremia,
haver aumento da presso intracraniana, edema cerebral, compresso do crebro e
possivelmente morte (SUE; LEE; HUANG, 2002; TRAUB; HOFFMAN; NELSON, 2002).

Sue, Lee e Huang (2002) observaram ainda que, mulheres no perodo pr-menopausa
so mais susceptveis hiponatremia e a crises de epilepsia aps o uso de Ecstasy, uma vez
que os nveis de estrgeno parecem ter efeito sobre a resposta antidiurtica da vasopressina,
contribuindo para a eliminao de sdio. O quadro de hiponatremia pode ainda ser agravado
pelo consumo excessivo de gua que normalmente acompanha o uso de Ecstasy.

3.2.1. Hepatotoxicidade

O consumo de Ecstasy foi relatado como sendo a segunda causa mais freqente de
hepatotoxicidade na Espanha entre jovens de at 25 anos (ANDREU et al., 1998).

O uso de MDMA pode causar alteraes hepticas graves, manifestadas


principalmente por ictercia, hepatomegalia, necrose centrolobular, hepatite, anorexia, nusea,
vmito e urina com colorao escura (relacionada ao aumento na quantidade de
urobilinognio presente na urina, causada pela elevada formao e excreo de bilirrubina
decorrente da hemlise provocada pela hipertermia e coagulao intravascular disseminada)

Toxicodinmica

36

(BEITIA et al., 2000; MOTTA, 2000; BAGGOTT; JEROME, 2001). A hepatotoxicidade


pode ocorrer aps o uso de um nico comprimido (ELLIS et al., 1996) ou aps meses de uso
regular da droga (ANDREU et al., 1998). De um modo geral, a falncia heptica aguda pode
ocorrer logo aps o uso de Ecstasy, enquanto que a hepatite pode se desenvolver ao longo de
semanas aps o uso da droga. A gravidade dos danos hepticos no parece estar relacionada
com a quantidade ou freqncia de utilizao, o que sugere um tipo de reao idiossincrtica
(ELLIS et al., 1996; BEITIA et al., 2000).

As leses hepticas aparecem com maior freqncia entre os usurios que manifestam
quadro de hipertermia. Contudo, os danos hepticos nestes casos so causados em parte
devido ao efeito da temperatura corprea, e parte devido ao da MDMA e seus produtos de
biotransformao sobre o fgado. Estudos in vitro, conduzidos em condies experimentais
que simulavam a hipertermia com hepatcitos de camundongo, mostraram que a MDMA
aumenta a peroxidao lipdica e diminui a viabilidade das clulas hepticas (CARVALHO;
CARVALHO; BASTOS, 2001).

Os organismos vivos possuem vrios sistemas de eliminao de radicais livres. A


forma reduzida da glutationa neutraliza muitas formas de radicais livres de forma direta ou em
associao com a enzima glutationa peroxidase. Depleo nos nveis de glutationa reduzida,
especialmente no fgado, pode causar leses irreversveis e morte celular. Esta forma de
glutationa desempenha importante funo na proteo das clulas contra espcies reativas de
oxignio, sendo que sua depleo pode agravar a toxicidade induzida por radicais livres.
Desta forma, a diminuio na quantidade de glutationa um marcador precoce de danos
causados por radicais livres e constitui evidncia observvel de morte celular. Beitia et al.
(2000) observaram que a administrao de nica dose de MDMA (20 mg/kg) a ratos Wistar,
no causou alteraes significativas nos nveis de glutationa. Contudo, no mesmo estudo,

Toxicodinmica

37

estes autores observaram que a administrao repetida deste frmaco produziu quantidade
suficiente de radicais livres para causar depleo de glutationa, alm de observarem tendncia
na diminuio da atividade da enzima glutationa peroxidase. Durante o experimento de
administrao repetida de MDMA, os autores observaram ainda um aumento desproporcional
da atividade da enzima AST (aspartato aminotransferase) comparada com a atividade da ALT
(alanina aminotransferase). Este efeito freqentemente classificado como um importante
marcador de necrose celular (ELLIS et al., 1996; BEITIA et al., 2000).

3.2.2. Nefrotoxicidade

Nos ltimos anos, vrios casos de falncia renal secundria ao consumo de Ecstasy
tm sido relatados (BINGHAM et al., 1998; CARVALHO et al., 2002). A falncia renal
aguda pode ocorrer quando cogulos de fibrina/plaquetas ou de mioglobina, que so liberados
das clulas musculares lesadas, precipitam e bloqueiam os tbulos renais. A desidratao
facilita o desenvolvimento deste tipo de problema renal e pode levar ao acmulo de
substncias, que deveriam ser depuradas e eliminadas no sangue, podendo causar danos
secundrios a outros tecidos ou rgos (BAGGOTT; JEROME, 2001; CARVALHO et al.,
2002). Segundo Baggott e Jerome (2001), a falncia renal aguda ocorre em 24% dos usurios
de Ecstasy que apresentam quadro de hipertermia. Ocorre tambm nos casos onde ocorreu
rabdomilise, mas que no houve evidncia de hipertermia. Este processo pode culminar em
isquemia renal sbita e/ou necrose tubular aguda (CARVALHO et al., 2002).

Toxicodinmica

38

3.2.3. Neurotoxicidade

Uma caracterstica observada a respeito dos efeitos da MDMA no Sistema Nervoso


Central, que este frmaco induz alteraes significantes na liberao e recaptao de
serotonina pelos neurnios, e estas alteraes podem persistir por longos perodos mesmo
aps o frmaco j ter sido biotransformado e eliminado. Experimentos com ratos mostram que
a MDMA dispara uma rpida liberao de serotonina no crebro seguida por significante
diminuio nos nveis de serotonina que persistem por pelo menos sete dias aps a
administrao (NIDA, 2001). As redues mais significativas de serotonina ocorreram no
crtex prefrontal, crtex estriado e hipocampo, com menor reduo no hipotlamo e nos
ncleos da base do crebro (COLE et al., 2002).

O uso crnico de MDMA pode levar ao desenvolvimento de neurotoxicidade,


especialmente dos neurnios serotonrgicos, como foi observado em estudos in vitro com
animais de experimentao. Devido a limitaes metodolgicas e ticas, os efeitos do uso
crnico de metilenodioxianfetaminas ainda restrito a exames por imagem e aplicao de
questionrios. Em humanos, o uso de MDMA associado depresso, debilidade da atuao
cognitiva e atuao anormal dos neurnios serotonrgicos quando analisados por tomografia
de emisso de positrons (PET). Estudos realizados no lquido cefalorraquidiano de usurios de
MDMA demonstraram uma reduo nos nveis de 5-HIAA (cido 5-hidroxiindolactico),
produto de degradao da serotonina, achado que confirma a neurotoxicidade desta substncia
(TRAUB; HOFFMAN; NELSON, 2002). O 5-HIAA excretado na urina e atua como
indicador da produo de serotonina no organismo, sendo originada a partir de desaminao
oxidativa catalisada pela monoamina-oxidase, seguida por oxidao catalisada pela enzima
aldedo desidrogenase, havendo relao direta entre a diminuio dos nveis de serotonina e a
concentrao de 5-HIAA (RANG; DALE; RITTER, 2001; BUSH; MAYER, 2003).

Toxicodinmica

39

Uma hiptese para explicar a neurotoxidade causada pela MDMA no sistema


serotonrgico, que este frmaco induz tanto estresse oxidativo quanto metablico nestes
neurnios que, como conseqncia, tm diminuda sua capacidade de produzir serotonina. O
suporte para esta hiptese vem de uma variedade de estudos, incluindo aqueles mostrando que
a MDMA provoca alteraes na atividade de vrias enzimas antioxidantes, como superxido
dismutase, catalase e glutationa peroxidase, e que o aumento artificial (induzido em
experimentos) dos nveis destas enzimas diminui os efeitos da MDMA sobre os neurnios
serotonrgicos (NIDA, 2001).

Estudos sobre a ao farmacolgica da MDMA no Sistema Nervoso Central realizados


com animais ou humanos, revelaram que esta substncia possui efeito txico sobre os
neurnios serotonrgicos, e presume-se que

seus

anlogos

possuam mecanismo

farmacolgico similar (WEINMANN; BOHNERT, 1998). Estudos com ratos e primatas tm


demonstrado efeitos neurotxicos seletivos no sistema serotonrgico central aps a
administrao de nica ou de mltiplas doses de MDMA. Esta toxicidade secundria
depleo de serotonina e aos danos causados na regio terminal dos axnios e implicam em
perda dos stios de recaptao de serotonina. Estudos clnicos sobre a toxicidade crnica da
MDMA em humanos so escassos. Existem evidncias de que alguns usurios de MDMA
apresentam problemas de memria e verifica-se um aumento na incidncia de psicopatologias
nestes indivduos (SEGURA et al., 2001).

Em estudos que empregaram animais de experimentao, a injeo direta de MDMA


no crebro no reproduziu os efeitos neurotxicos observados aps a administrao perifrica.
Este fato sugere que uma possvel correlao entre produtos de biotransformao da MDMA e
o desenvolvimento de neurotoxicidade (SEGURA et al., 2001). postulado que produtos
como a 3,4-dihidroximetanfetamina (HHMA), principal produto de biotransformao da

Toxicodinmica

40

MDMA em ratos e preparaes microssomais de fgado humano, podem estar relacionados


com este tipo de efeito pela formao de adutos com glutationa e outros compostos endgenos
que contenham radicais tiis (DE LA TORRE; FARRE et al., 2000; SEGURA et al., 2001).

Em humanos, a presena da HHMA s foi demonstrada em estudos in vitro,


aparecendo como principal produto da biotransformao da MDMA. Como visto
anteriormente (item 3.2. da toxicocintica), essa via de biotransformao catalisada
parcialmente pela enzima CYP2D6 do Citocromo P-450, que expressa polimorficamente em
humanos, sendo que cerca de 10% da populao caucasiana possui deficincia desta enzima,
possuindo susceptibilidade diferente intoxicao aguda e aos efeitos neurotxicos da
MDMA (ORTUO et al., 1999; BAGGOTT; JEROME, 2001; SEGURA et al., 2001). As
concentraes plasmticas e urinrias da HHMA so equivalentes a quantidades de MDMA
presentes nessas matrizes. Este produto possui alta reatividade e instabilidade devido sua
estrutura qumica, sendo encontrado apenas na forma conjugada nos materiais biolgicos
(ORTUO et al., 1999; SEGURA et al., 2001).

Porquanto as trs substncias enfocadas neste trabalho tenham potencial de provocar


neurotoxicidade, a maioria dos artigos a respeito evidenciam a neurotoxicidade serotonrgica
associada ao uso de MDMA em estudo com animais e humanos. Este fato explicado devido
toxicidade mais elevada deste ltimo em relao aos outros, o que explica conduta ticocientfica de autores que, para estudar a cintica destes compostos em voluntrios humanos,
optam pela administrao da MDEA ao invs da MDMA (PARROTT, 2002). Os resultados
obtidos em vrios estudos realizados com animais sugerem uma reduo dose-dependente da
atividade serotonrgica aps exposio repetida MDMA. Atualmente, pouco se sabe sobre a
neurotoxicidade em humanos associado ao uso de MDMA. Embora ainda no seja
demonstrado o nexo causal, pode-se conjecturar que este tipo de leso ao sistema

Toxicodinmica

41

serotonrgico, seria responsvel pelos possveis efeitos neuropsiquitricos e falhas cognitivas


(FREESE; MIOTTO; REBACK, 2002).

A co-administrao de inibidores seletivos da recaptao de serotonina parece, alm


de atenuar os efeitos das metilenodioxianfetaminas, proporcionar tambm uma ao
neuroprotetora (BAPTISTA, 2002).

Aspectos Analticos

42

5. ASPECTOS ANALTICOS

Os mtodos utilizados na anlise de metilenodioxianfetaminas em materiais biolgicos


podem ser compostos a partir de diferentes procedimentos de extrao, separao,
identificao e quantificao dos analitos presentes na amostra. A seleo da tcnica de
extrao a ser utilizada, bem como o tipo de equipamento empregado na identificao e
quantificao, deve levar em considerao alm da finalidade a que se destina a anlise e,
portanto, da sensibilidade requerida, o tipo de equipamento disponvel para a execuo dos
trabalhos. Em anlises forenses, deve-se buscar sempre a elaborao de mtodos sensveis,
seletivos e especficos, permitindo ao analista a emisso de resultados inquestionveis e
irrefutveis, uma vez que tais resultados com freqncia so utilizados como parte de
processos judiciais, que podero culminar com a condenao ou absolvio de um ru. Assim,
no emprego de mtodos cromatogrficos em anlises quantitativas de xenobiticos
necessrio que o procedimento analtico empregado possa garantir com qualidade e confiana
adequada o valor do dado gerado durante anlises em materiais biolgicos (CAUSON, 1997;
CHASIN, 2001; SOFT/AAFS, 2002). A Tabela 2 apresenta os principais mtodos analticos
citados na literatura cientfica internacional para determinao de derivados anfetamnicos,
como a MDMA e seus anlogos.

Aspectos Analticos

43

Tabela 2 Mtodos analticos utilizados nas anlises de derivados anfetamnicos.

material biolgico

analito

extrao

tcnica analtica

referncia

cabelo

MDMA, MDEA, MDA, MBDB, AN

SPME

CG/EM

Gentili, Cornetta e Macchia, 2004

saliva

MDMA, MDEA, MBDB, AN, MA

SPME

CG/EM

Fucci, Gionanni e Chiarotti, 2003

urina

MDMA, MDEA, MDA, AN, MA

SPME

CG/FID

Raikos et al., 2003

urina

MDMA, MDEA, MDA, MBDB, AN

EEL

CG/EM

Pellegrini et al., 2002

sangue, urina

MDMA, MDA, HMMA, HMA

SPE

CG/EM e EC/DAD

Pizarro et al., 2002

cabelo

MDMA, MDEA, MDA

SPE

CG/EM

Skender et al., 2002

saliva, plasma

MDMA, MDA, HMMA

SPE

CG/EM

Navarro et al., 2001

urina

MDMA, MDA, AN, MA

SPME

CG/EM

Jurado et al., 2000

plasma, soro

MDMA, MDA, HMMA, HMA

SPE

CG/EM e CG/DNP

de la Torre et al., 2000

plasma

MDMA, MDA, NA

SPE

CG/DNP

Mas et al., 1999

plasma, urina

MDMA, MDA, HMMA, HMA

SPE

CG/DNP

Ortuo et al., 1999

urina

MDMA, MDEA, MDA

SPME

CG/EM

Battu et al., 1998

comprimidos

MDMA, MDEA, MDA

diluo

CG/DNP e CG/EM

Silva, Yonamine, Reinhardt, 1998

soro, urina, cabelo, tecidos

MDEA, MDMA

ELL; SPE

CG/EM

Weinmann & Bohnert, 1998

sangue total

MDMA, MDEA, MDA, AN, MA

ELL

CG/EM

Marquet et al., 1997

cabelo

MDMA, MDEA, MDA

SPE

CG/EM

Rothe et al., 1997

sangue, urina, tecidos

MDMA, MDA, MDEA, AN

SPE

CG/EM e CG/DNP

Tamayo, Tena e Rodrguez, 1997

Aspectos Analticos

44

Continua
urina
urina, sangue, fgado, bile,
humor vtreo
cabelo, unha

MDMA, MDEA, AN, MA

SPME

CG/EM

Centini, Masti e Comparini, 1996

MDMA, MDA

ELL/SPE

CG/EM

Moore et al., 1996

MDMA, MDA, anfetamina


MDMA, MDA, HHMA, HMA,
HMMA

ELL

CG/EM
HPLC/DAD e
CG/EM

Cirimele; Kintz; Mangin, 1995

plasma, urina

MDEA, MDA, HME

SPE

HPLC/DF

Buechler et al., 2003

sangue, humor vtreo,


urina, tecidos

MDMA, MDA

ELL

HPLC/DF

de Letter et al., 2002

sangue, crebro

MDMA, MDEA, MDA, HMMA,


HME

SPE

HPLC/DF

Meyer et al., 2002

plasma, urina, saliva, suor

MDMA, MDEA, MDA

SPE

HPLC/EM-EM

Samyn et al., 2002

plasma

MDEA, MDA, HME

SPE

HPLC/DF

Brunnenberg e Kovar, 2001

sangue total, soro, urina


soro, sangue total, urina,
humor vtreo

MDMA, MDA, MDEA

ELL

HPLC/DF

Clauwaert, Bocxlaer e Leenheer, 2001

MDMA, MDEA, MDA

ELL

HPLC/DF

Clauwaert et al., 2000

microssomas heptico

MDMA, MDA

injeo direta

HPLC/DF

Kreth et al, 2000

soro, urina

MDMA, MDEA, MDA, AN, MA

ELL

comprimidos
plasma
urina

MDMA, MDEA, MDA


MDMA, MDA
MDMA, MDA, MBDB

urina
urina
urina

MDMA, MDEA, MDA, AN, MA


MDMA, MDEA, MDA, MBDB, AN
MDMA, MDA, HMMA

plasma, urina

SPE

Helmlin et al., 1996

dissoluo
ELL
ELL

HPLC/DAD e
HPLC/EM
HPLC/DAD
HPLC/DAD
EC/DF

Rothe et al., 1997


Garrett, Seyda e Marroum, 1991
Chung, Liu e Lin, 2001

SPE, ELL
ELL
SPE

EC/DAD
EC/EM
EC/DAD

Varesio e Veuthley, 1995


Geiser, Cherkaoui e Veuthey, 2000
Thormann et al., 1998

Bogusz, Kala e Maier, 1997

Aspectos Analticos

45

5.1. Matrizes biolgicas utilizadas

As anlises em amostras de sangue ou seus derivados (soro ou plasma) so de especial


importncia, pois atravs dos nveis sanguneos de determinado frmaco quase sempre
possvel realizar correlaes com os efeitos do frmaco sobre o organismo (CHASIN, 1990).
Estes achados, aliados a conhecimentos sobre a frmacocintica da substncia, ajudam na
inferncia sobre o momento de uso, quantidade de substncia administrada e possveis
alteraes psquicas causadas pelo frmaco no instante do delito.

Em indivduos vivos, os efeitos fisiolgicos da maioria dos frmacos possuem


correlao direta com suas concentraes no sangue e seus derivados (plasma e soro), fato que
serve de base para a monitorizao teraputica de frmacos. Quando, entretanto as amostras
de sangue so coletadas post-mortem so necessrias ressalvas, uma vez que fatores como o
local de coleta e outros relacionados redistribuio (cintica post mortem) que
eventualmente ocorreram quando cessados os fenmenos vitais, podem modificar os valores
encontrados (BLANKE; POKLIS, 1996).

A urina constitui importante material biolgico para a anlise de MDMA e seus


anlogos, pois neste material as concentraes dos frmacos inalterados (MDMA e MDEA) e
de seus produtos de biotransformao so relativamente altas (RAIKOS et al., 2003). Alm
disso, a urina , aps o humor vtreo que apresenta aproximadamente 98% de gua em sua
constituio, a matriz biolgica com menor nmero de interferentes endgenos, pois
constituda principalmente por gua e somente apresenta nveis significantes de protena e
lipdios (que poderiam interferir no processo de extrao e identificao de frmacos) durante
estados patolgicos. Contudo, os resultados de anlises realizadas em amostras de urina
oferecem poucas vantagens com relao aos efeitos fisiolgicos provocados por determinado

Aspectos Analticos

46

frmaco identificado nesta matriz. Os resultados obtidos em anlises realizadas em urina


estabelecem apenas que o frmaco/droga de abuso foi administrado, uma vez que a correlao
com os efeitos baixa devido grande variedade de fatores que afetam a taxa de excreo de
determinado composto e o volume urinrio (BLANKE; POKLIS, 1996). Nos casos de morte
causada por overdose de MDMA, a concentrao urinria pode chegar a 170 g/mL
(MOORE et al., 1996; DE LETTER et al., 2002).

O contedo estomacal pode constituir amostra de anlise post-mortem, uma vez que
prevalece no estmago a forma inalterada (CHASIN, 1990) e ionizada (aprisionamento
farmacocintico) das metilenodioxianfetaminas, que podem estar presentes tanto na forma de
resduos da droga ingerida quanto pela possvel secreo gstrica, posto que base fraca e
passvel de ser secretada para o lmem estomacal, onde se ioniza e permanece at a posterior
reabsoro no duodeno (DE LETTER et al., 2002). Humor vtreo, fragmentos de tecido
muscular e vsceras como fgado, rins e crebro tambm so materiais utilizados nos casos de
necropsia (WEINMANN; BOHNERT, 1998; CLAUWAERT et al., 2000; DE LETTER et al.,
2002).

A verificao do uso de drogas de abuso por anlise de cabelo uma ferramenta til
para demonstrar ou excluir a suspeita de uso crnico. Como amostra biolgica, o cabelo
fornece vantagens particulares como facilidade de obteno, coleta no invasiva, sem violao
da privacidade, maior dificuldade para adulterao, janela de deteco ampla (vrios meses) e,
principalmente, dispensa cuidados especiais durante o transporte e armazenamento, o que
favorece a estabilidade dos analitos (KINTZ; SAMYN, 1999; SKENDER et al., 2002;
GENTILI; CORNETTA; MACCHIA, 2004). As principais desvantagens do uso de cabelo
como matriz biolgica para a verificao do uso de drogas de abuso com aspecto forense a
falta de correlao entre a dose e a concentrao do frmaco no cabelo, que impede qualquer

Aspectos Analticos

47

inferncia sobre alteraes do comportamento do indivduo momentos antes do bito e/ou


prtica criminosa (ROTHE et al., 1997) e a possibilidade de contaminaes ambientais
(KINTZ; SAMYN, 1999). Rothe et al. (1997), aps estudo com usurios de Ecstasy,
concluram que a ingesto de um comprimido da droga pode levar a concentraes capilares
da ordem de 1 ng/mg.

Outra amostra biolgica capaz de fornecer evidncias retrospectivas do uso drogas de


abuso a unha. Assim como o cabelo, este tecido queratinizado pode armazenar frmacos
administrados por meses (CIRIMELE; KINTZ; MANGIN, 1995). Este tipo de matriz possui
praticamente as mesmas vantagens e desvantagens atribudas ao cabelo como amostra
biolgica para verificao do uso de drogas de abuso, agravado pelo fato de que a quantidade
de amostra de unhas disponvel geralmente escassa (CIRIMELE; KINTZ; MANGIN, 1995).

A saliva tambm se configura como amostra importante na determinao das


metilenodioxianfetaminas. A passagem de frmacos da corrente sangnea para a saliva j
havia sido sugerida desde a segunda metade da dcada de 1960. Mesmo assim, a utilizao de
saliva como matriz biolgica alternativa vem aumentando muito nos ltimos anos,
principalmente em estudos de farmacocintica, monitorizao teraputica e na verificao do
uso de drogas ilcitas, particularmente por agncias que monitoram motoristas de caminho
quanto ao uso de substncias psicoativas (KINTZ; SAMYN, 1999; FUCCI; GIOVANNI;
CHIAROTTI, 2003). A saliva possui ainda a vantagem de que sua coleta no invasiva e
provavelmente se constitui como o nico fluido biolgico pelo qual se podem traar paralelos
com a concentrao sangunea, podendo ser empregada em estudo de farmacocintica e em
anlises forenses por permitir correlacionar as concentraes obtidas com alteraes
comportamentais que possam eventualmente ser causadas pelo frmaco. Contudo, esta matriz

Aspectos Analticos

48

possui janela de deteco de apenas algumas horas e a quantidade de amostra disponvel


freqentemente baixa (KINTZ; SAMYN, 1999; NAVARRO et al., 2001).

Somente esto disponveis para a difuso para a saliva os frmacos que no estiverem
livre na circulao sangunea, ou seja, aqueles que no estiverem ligados a protenas
plasmticas. Assim, a baixa taxa de ligao a protenas (aproximadamente 20%) da MDMA e
seus anlogos somado ao baixo peso molecular destes compostos, confere a estas substncias
passagem praticamente irrestrita entre o plasma e a saliva (NAVARRO et al., 2001).
semelhana do que acontece no contedo estomacal, e por serem estas substncias bases
fracas com elevado pKa e sendo o pH da saliva mais cido do que o pH sanguneo, o que
promove a ionizao dos compostos e impede a difuso para o plasma, resultando em
acmulo na saliva. Samyn et al. (2002), durante um estudo controlado onde foram
administrados 75 mg de MDMA a voluntrios, observaram que as concentraes de MDMA
na saliva geralmente so superiores s concentraes plasmticas, fato tambm observado por
Navarro et al. (2001). Estes autores observaram ainda que as concentraes do frmaco na
saliva apresenta grande variabilidade interindivdual e atribuem esta variao viscosidade e
volume da amostra, que podem ser diferentes mesmo intra-indivduo. Navarro et al. (2001)
observaram que o pico de eliminao da MDA na saliva ocorre entre 1,5-4 horas aps a
ingesto de MDMA e sua concentrao representa aproximadamente 5% da concentrao
salivaria do frmaco inalterado. J os nveis plasmticos deste produto de biotransformao
apresenta concentrao mxima entre 5-6 horas aps a administrao.

A utilizao do suor como matriz alternativa ao sangue e seus derivados para


verificao do uso de substncias psicoativas sempre esbarrou nas dificuldades de coleta
inerentes a este fluido biolgico. Nos ltimos anos, este empecilho parece ter sido resolvido
pelo desenvolvimento dos sweat patch. O suor tambm possui a vantagem de no representar

Aspectos Analticos

49

coleta invasiva, no constrangedora e permite controle de indivduos internados em clnica de


tratamento e detentos em liberdade condicional (KINTZ; SAMYN, 1999).

A instabilidade dos analitos na matriz biolgica e os fenmenos de redistribuio post


mortem so interferentes importantes em toxicologia forense. Conhecimentos sobre a
estabilidade dos analitos no material biolgico so de fundamental importncia em vrias
situaes nas anlises toxicolgicas, uma vez que vrias situaes acabam por inserir
intervalos de tempo variveis entre a coleta do material, seu transporte at o laboratrio e o
momento da anlise. A MDMA e seus anlogos apresentam relativa estabilidade quando
presentes em materiais biolgicos. Clauwaert, Bocxlaer e Leenheer (2001) estudaram a
estabilidade da MDMA, MDEA e MDA em matrizes biolgicas como sangue total, soro, gua
(mimetizando a presena dos frmacos no humor vtreo) e urina durante 21 semanas quando
armazenados ao abrigo da luz a 20, 4 e 20C. Observaram que estas substncias no
sofreram perda significativa quando presentes na gua e urina, em todas as condies de
temperatura avaliadas. O mesmo resultado foi verificado para amostras de soro durante at 17
semanas e, at 5 semanas quando a matriz biolgica era sangue total. Os autores ressaltam
que, aps estes perodos, as anlises ficam inviveis devido degradao sofrida pela matriz
biolgica, levando formao de inmeros interferentes que dificultaram a identificao dos
analitos de interesse frente aos demais produtos de decomposio presentes (CLAUWAERT;
BOCXLAER; LEENHEER, 2001).

5.2. Tcnicas de extrao

Como citado no item referente fase toxicocintica, as quantidades de MDMA e/ou


MDEA eliminadas nas formas inalteradas, bem como a quantidade de MDA presente na urina

Aspectos Analticos

50

representam boa parte da quantidade administrada do frmaco. Assim, a pesquisa dos


frmacos inalterados e do produto de biotransformao que eliminado na forma no
conjugada de grande importncia para a avaliao do uso de Ecstasy ou Eve, uma vez que a
anlise destes compostos dispensa etapa de hidrlise.

Para a determinao dos produtos de biotransformao mono e diidroxilados da


MDMA, necessria etapa de hidrlise anterior ao processo de extrao, uma vez que estes
produtos so eliminados na forma conjugada com cido glicurnico. Esta hidrlise pode ser
realizada pela ao de cido clordrico (mais rpida, eficiente e menor custo) ou pela ao
enzimtica com o uso de -glicuronidase/sulfatase (HELMLIN et al., 1996). Alguns dos
produtos de biotranformao diidroxilados da MDMA, como a HHMA e a HHA, possuem
natureza extremamente instvel, o que inviabiliza sua quantificao (HELMLIN et al., 1996).

A anlise cromatogrfica de substncias presentes em matrizes biolgicas geralmente


requer etapas de pr-tratamento da amostra, que visam separar os analitos de interesse de
demais compostos presentes na amostra e que so incompatveis com a coluna cromatogrfica
(protenas, por exemplo), alm de servir como etapa de concentrao das substncias a serem
analisadas, freqentemente presentes em nvel de traos (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM,
2001). Com relao aos procedimentos de extrao de MDMA e seus anlogos, destacam-se
trs processos: extrao lquido-lquido (ELL), extrao em fase slida (SPE, do ingls Solid
Phase Extraction) e microextrao em fase slida (SPME, do ingls Solid Phase
Microextraction).

A extrao lquido-lquido ocorre atravs da partio da amostra entre duas fases


imiscveis (orgnica e aquosa), sendo que neste tipo de procedimento, a eficincia da extrao
depende de fatores como a afinidade dos analitos pelo solvente extrator, razo das fases e
nmero de extraes (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001). A afinidade dos analitos pela

Aspectos Analticos

51

fase orgnica pode ser aumentada pelo ajuste de pH (que ir prevenir a ionizao das
substncias de interesse). As metilenodioxianfetaminas, por serem bases fracas (pKa maior do
que 8,5), so melhor extradas de fluidos biolgicos por solventes orgnicos se o pH da fase
aquosa for ajustado a valores em torno de 9,0. Muitos artigos na literatura internacional
mencionam a utilizao da ELL, principalmente devido sua simplicidade (CIRIMELE;
KINTZ; MANGIN, 1995; MOORE et al., 1996; WEINMANN; BOHNERT, 1998;
CLAUWAERT; BOCXLAER; LEENHEER, 2001; DE LETTER et al., 2002).

O uso de colunas de extrao em fase slida como processo alternativo tradicional


ELL aparece com grande freqncia em publicaes cientficas (HELMLIN et al., 1996;
MOORE et al., 1996; ROTHE et al., 1997; TAMAYO; TENA; RODRGUEZ, 1997;
WEINMANN; BOHNERT, 1998; MAS et al., 1999; NAVARRO et al., 2001; SAMYN et al.,
2002; SKENDER et al., 2002). Possui a vantagem de evitar a formao de emulso, de ser
mais rpida que os processos tradicionais de extrao e de suprimir as passagens de
purificao e, conseqente aumento na porcentagem de recuperao das substncias
analisadas (CHASIN, 1990). A SPE utiliza colunas de slica quimicamente ligada a diferentes
tipos de radicais orgnicos, que so escolhidos de acordo com o tipo de anlise pretendida,
sendo que os mais utilizados nas anlises de metilenodioxianfetaminas so as fases de slica
ligada ao radical octadecil ou a radicais aninicos.

A microextrao em fase slida (SPME) uma tcnica moderna em que os processos


de extrao e pr-concentrao dos analitos ocorrem de modo diferente ao observado na
extrao lquido-lquido e na extrao em fase slida (PIRES; VALENTE, 2000; SNOW,
2000; QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001). Neste procedimento se emprega uma fibra de
slica fundida, recoberta com um filme delgado de polmero que pode possuir espessura
varivel (nas anlises de metilenodioxianfetaminas o polmero mais utilizado o

Aspectos Analticos

52

polidimetilsiloxano de 100 m de espessura), sendo que seu acondicionamento se d dentro


da agulha de uma espcie de microsseringa. A extrao atravs desta tcnica pode ser
conduzida de dois modos diferentes: atravs do contato direto da fibra com a amostra
biolgica, em condies controladas de agitao e tempo de contato; ou atravs da exposio
da fibra ao headspace, onde a amostra aquecida e agitada sob condies bem estabelecidas
para que os componentes volteis sejam adsorvidos fibra. Aps a extrao, os analitos
presentes na fibra so dessorvidos pela ao trmica do bloco de injeo do cromatgrafo
gasoso ou pelo contato com a fase mvel em interface apropriada para o cromatgrafo
lquido. A SPME apresenta vantagens significativas com relao a ELL e SPE, por ser um
procedimento analtico mais simples e rpido, fornecer extratos mais limpos e, por
conseqncia, melhores cromatogramas. Evidente proteo ao analista e ao meio ambiente,
tambm so vantagens desta tcnica, uma vez que no so utilizados solventes orgnicos na
eluio, alm da facilidade de automao (BATTU et al., 1998; UGLAND; KROGH;
RASMUSSEN, 1999; LORD; PAWLISZYN, 2000; PAWLISZYN; LORD, 2000;
THEODORIDIS; KOSTER; JONG, 2000; MESTER; STURGEON; PAWLISZYN, 2001;
QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001; WILSON et al., 2001; KUMAZAWA; LEE;
SUZUKI, 2003). Contudo, este procedimento de extrao ainda economicamente invivel
para os laboratrios forenses do Brasil.

A associao da SPME com amostragem por headspace (onde a fibra no


mergulhada no material biolgico, mas sim exposta frao voltil da amostra presente em
frasco fechado e aquecido) de especial interesse durante as anlises de derivados
anfetamnicos, uma vez que estes compostos apresentam considervel semi-volatilidade. Esta
composio de tcnicas, alm de fornecer as vantagens inerentes ao headspace
(cromatogramas com menor nmero de interferentes) apresenta ainda a vantagem de aumentar
a vida mdia da fibra quando comparada a SPME com imerso da fibra no material biolgico.

Aspectos Analticos

53

Battu et al. (1998) descreve um mtodo de triagem para 21 derivados anfetamnicos


atravs da SPME e cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas. Pelas
facilidades fornecidas durante o processo de anlise, a extrao por headspace-SPME com
anlise por cromatografia gasosa representa a maioria dos procedimentos observados na
literatura internacional consultada para anlise de MDMA e seus derivados (CENTINI;
MASTI; COMPARINI, 1996; BATTU et al., 1998; UGLAND; KROGH; RASMUSSEN,
1999; JURADO et al., 2000; LORD; PAWLISZYN, 2000; THEODORIDIS; KOSTER;
JONG, 2000; WILSON et al., 2001; FUCCI; GIOVANNI; CHIAROTTI, 2003;
KUMAZAWA; LEE; SUZUKI, 2003; RAIKOS et al., 2003; GENTILI; CORNETTA;
MACCHIA, 2004).

A utilizao de padro interno, substncia que apresenta similaridade estrutural e


fsico-qumica aos analitos de interesse, pode minimizar os erros provenientes de perdas que
eventualmente ocorram durante o procedimento de extrao, e que podem acarretar grande
variao na quantificao dos analitos. O uso de istopos estveis (substncias deuteradas)
como padro interno extremamente difundido e recomendado quando a deteco
conduzida por espectrometria de massas, uma vez que este equipamento faz a distino dos
analitos e do padro interno baseado na relao massa/carga (m/z) dos ons formados aps a
fragmentao da molcula (BATTU et al., 1998; SOFT/AAFS, 2002). Quando, entretanto, a
deteco est baseada na utilizao de mtodos ticos (freqentemente empregados aps
separao por cromatografia lquida) ou ainda, utiliza-se detectores mais simples em
cromatografia gasosa (como os de ionizao em chama ou em chama alcalina), necessrio
que

se

busque

compostos

similares

aos

analitos.

Durante

as

anlises

de

metilenodioxianfetaminas, as substncias mais freqentemente citadas como padro interno


so

3,4-metilenodioxipropilanfetamina

(MDPA)

(CLAUWAERT;

BOCXLAER;

Aspectos Analticos

54

LEENHEER, 2001), a metanfetamina (MA) (HELMLIN et al., 1996), N-etilanfetamina e


para-metoxianfetamina (PELLEGRINI et al., 2002).

5.3. Tcnicas de separao e identificao

As principais tcnicas de identificao das metilenodioxianfetaminas e seus produtos


de biotransformao presentes em material biolgico so imunoensaios, cromatografia gasosa
(CG), cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC, do ingls, high performance liquid
chromatography) e eletroforese capilar (EC).

Imunoensaios como radioimunoesaio, enzimaimunoensaio e imunoensaio por


fluorescncia polarizada so tcnicas normalmente utilizadas como procedimentos de triagem,
sendo que seus achados invariavelmente devem ser confirmados por tcnicas mais especficas
e sensveis (CHASIN, 1990; 2001). Entidades internacionais, como o do National Institute on
Drug Abuse (NIDA) e o Federal Workplace drug testing estabelecem como 1000 ng/mL valor
de cut-off para anfetamina e metanfetamina em amostra de urina, o que resultou na elaborao
de kits de imunoensaio com elevados limites de deteco (PELLEGRINI et al., 2002).
Tambm por esta razo, a maioria das tcnicas de imunoensaios disponveis comercialmente
para derivados anfetamnicos so desenvolvidas para a deteco de anfetamina e/ou
metanfetamina.

Estas tcnicas apresentam vrias limitaes como reaes cruzadas entre compostos
anfetamnicos, o alto valor de cut-off que permite deteco apenas do uso recente da droga de
abuso; possibilidade de resultados falso positivos com frmacos como efedrina e ranitidina,
(BOGUSZ; KALA; MAIER, 1997; BATTU et al., 1998; PELLEGRINI et al., 2002) e

Aspectos Analticos

55

finalmente, estes ensaios apresentam custo considervel o que inviabiliza sua utilizao na
rotina dos laboratrios forenses do Brasil.

A cromatografia em fase gasosa, utilizando detector seletivo de nitrognio e fsforo,


tem sido utilizada com significativa freqncia na determinao de MDMA, seus anlogos e
produtos de biotransformao em fluidos biolgicos, principalmente devido alta
especificidade e sensibilidade deste tipo de detector e a no necessidade da etapa de derivao
(TAMAYO; TENA; RODRGUEZ, 1997; SILVA; YONAMINE; REINHARDT, 1998; MAS
et al., 1999; ORTUO et al., 1999; DE LA TORRE; FARR et al., 2000). Quantidades da
ordem de 3 a 10 ng/mL em plasma podem ser quantificadas com alta preciso pelo uso deste
detector (DE LA TORRE; FARR et al., 2000).

A cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (CG/EM) a tcnica


instrumental mais utilizada (CENTINI; MASTI; COMPARINI, 1996; MARQUET et al.,
1997; BATTU et al., 1998; ORTUO et al., 1999; JURADO et al., 2000; PELLEGRINI et
al., 2002; PIZARRO et al., 2002; FUCCI; GIOVANNI; CHIAROTTI, 2003; RAIKOS et al.,
2003; GENTILI; CORNETTA; MACCHIA, 2004) na identificao da MDMA e seus
anlogos presentes em material biolgico, oferecendo grande sensibilidade e especificidade.
Contudo, neste tipo de sistema analtico faz-se necessria etapa prvia de derivao da
MDMA, seus anlogos e produtos de biotransformao, com o objetivo de melhorar o
comportamento cromatogrfico de aminas primrias e secundrias (ORTUO et al., 1999;
CLAUWAERT et al., 2000).

A cromatografia lquida de alta eficincia outra tcnica freqentemente citada na


literatura internacional (GARRETT; SEYDA; MARROUM, 1991; BOGUSZ; KALA;
MAIER, 1997; CLAUWAERT et al., 2000; BRUNNENBERG; KOVAR, 2001; MEYER et
al., 2002; BUECHLER et al., 2003). A grande vantagem da cromatografia lquida que esta

Aspectos Analticos

tcnica

dispensa

56

etapa

prvia

de

derivao,

necessria

para

anlise

de

metilenodioxianfetaminas por CG (CLAUWAERT et al., 2000). A deteco por arranjo de


diodos citada para a anlise da MDMA em urina e plasma (ORTUO et al., 1999), mas este
sistema de deteco possui baixa sensibilidade devido baixa absortividade destes compostos
(CLAUWAERT et al., 2000). A deteco eletroqumica pode ser utilizada durante anlise dos
produtos de biotransformao hidroxilados da MDMA (HMMA, HMA, HME) (ORTUO et
al., 1999; BRUNNENBERG; KOVAR, 2001). O detector de fluorescncia sem dvida o
mais utilizado na deteco de MDMA e seus anlogos aps separao no HPLC, pois
aproveita-se da fluorescncia natural destas substncias fornecendo anlises de alta
sensibilidade e especificidade, mesmo durante estudos em materiais biolgicos complexos
como sangue total (CLAUWAERT et al., 2000). A cromatografia lquida de alta eficincia
ferramenta til durante as anlises enantiomricas. Neste caso so utilizadas colunas de fase
estacionria quiral ou so adicionados fase mvel modificadores que permitem a separao
dos ismeros da MDMA e seus anlogos (BRUNNENBERG; KOVAR, 2001; MEYER et al.,
2002; BUECHLER et al., 2003).

Nos ltimos anos, a eletroforese capilar (EC) vem ganhando espao e se consagrando,
semelhana da cromatografia em fase gasosa ou lquida, como tcnica de separao de
grande utilidade para anlises de frmacos em materiais biolgicos. Diferentemente das
tcnicas cromatogrficas, na eletroforese a separao dos compostos ocorre sob influncia de
um campo eltrico. Na EC, as separaes so conduzidas em tubos capilares com dimenses
de 15 a 100 m de dimetro e 30 a 100 cm de comprimento, preenchidos com um eletrlito
condutor e submetido ao de um campo eltrico elevado (THORMANN et al., 1998;
PIZARRO et al., 2002; LIMA, 2003).

Objetivo e Plano de Trabalho

57

6. OBJETIVO E PLANO DE TRABALHO

O presente trabalho tem por objetivo o desenvolvimento de metodologia analtica


adequada para determinao de MDMA, MDEA e MDA em amostras de sangue total e urina,
com vistas ao estabelecimento do diagnstico laboratorial do uso de Ecstasy e/ou Eve.

Para cumprir tal objetivo, foi elaborado o seguinte plano de trabalho:


Reviso dos mtodos analticos existentes na literatura para identificao e
quantificao de MDMA, MDEA e MDA em material biolgico;
Desenvolvimento e validao de um mtodo para anlise destas substncias em sangue
total e urina empregando a cromatografia lquida de alta eficincia com deteco por
fluorescncia;
Aplicao da metodologia desenvolvida em amostras provenientes do Ncleo de
Toxicologia Forense do Instituto Mdico Legal de So Paulo, coletadas durante o ms
de maro de 2004.

Materiais e Mtodos

58

7. MATERIAIS E MTODOS

7.1. Material

7.1.1. Equipamentos, vidrarias e acessrios

- cromatgrafo lquido de alta eficincia Hewlett Packard modelo 1100 Series,


composto por degaseificador a vcuo (G1322A), bomba binria (G1312A), injetor
automtico (G1313A), compartimento de coluna com termostato (G1316A), detector
de arranjo de diodos DAD (G1315A) e detector de fluorescncia HP1046A. O
sistema cromatogrfico era acoplado a computador modelo Vectra XM 4-5/150, e
controlado atravs do software ChemStation;

- coluna cromatogrfica Spherisorb ODS2 (150 x 4 mm, 5 m), Hewlett Packard;

- frascos mbar com capacidade de 2,0 mL, septos de silicone e tampas de rosca
Hewlett Packard;

- sistema de purificao de gua Milli-Q Plus, Millipore;

- banho de ultra-som Thornton;

- peagmetro digital DMPH-2, Digimed;

- filtros Millex em polietileno com membrana Durapore, poro de 0,45 m, 13 mm de


dimetro, no estril, Millipore;

- membrana de celulose MFS, poro de 0,45 m e 47 mm de dimetro;

Materiais e Mtodos

59

- conjunto para filtrao a vcuo composto de funil, base e tampa tubulada em vidro
borosilicato e garra de alumnio anodizado, Millipore;

- bales volumtricos de 5, 10 e 25 mL;

- seringas de vidro com capacidade para 5 mL;

- pipetas automticas Finpipette, Labsystems com diferentes capacidades


volumtricas;

- balana analtica Sartorius research R200D;

- mesa agitadora de tubos TE-143, Tecnal;

- agitador mecnico tipo vortex Fanem 251;

- centrfuga T6000D, Sorvall;

- bloco de aquecimento com sistema de evaporao Reacti-therm Heatin, modelo


18870 Pierce.

7.1.2. Solventes e reagentes

- acetonitrila, grau de pureza adequado cromatografia lquida, J.T. Baker;

- metanol Omnisolv, grau de pureza adequado cromatografia lquida, Merck;

- dodecil sulfato de sdio, grau de pureza superior a 99%, Pharmacia Biotech;

Materiais e Mtodos

60

- acetato de etila, n-hexano, cloreto de sdio, cido clordrico e hidrxido de sdio


foram de grau analtico, Sigma.

7.1.3. Condies cromatogrficas

7.1.3.1. Fase mvel

Eluente A: soluo de dodecil sulfato de sdio foi preparada em gua


purificada no sistema Milli-Q Plus, na concentrao de 50 mM (14,40 g de dodecil sulfato de
sdio em 1000 ml de gua purificada). O pH desta soluo foi ajustado a 4,0 em peagmetro
utilizando soluo de cido clordrico 0,1 M;

Eluente B: acetonitrila.

A fase mvel utilizada nas anlises foi composta de mistura isocrtica na proporo
60% (v/v) do eluente A e 40% do eluente B. A fase mvel foi filtrada atravs de filtro
Millipore 0,45 m e degaseificada sob vcuo antes do uso.

7.1.3.2. Sistema de deteco

A deteco dos analitos valeu-se da capacidade intrnseca destas substncias de emitir


fluorescncia. Por esta razo foi utilizado detector de fluorescncia, com comprimento de
onda de excitao (ex) e de emisso (em) ajustados em 288 nm e 324 nm, respectivamente.
As condies de atenuao do sinal gerado pelo detector foram ajustadas de acordo com a
matriz biolgica analisada, uma vez que segundo a literatura internacional a concentrao
urinria dos analitos superior as encontradas em sangue.

Materiais e Mtodos

61

7.1.4. Solues-padro

Solues-padro

de

3,4-metilenodioximetanfetamina

(MDMA),

3,4-

metilenodioxietilanfetamina (MDEA), 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA), N-metil-1-(3,4metilenodioxifenil)-2-butamina

(MBDB,

padro

interno)

na

concentrao

de

1,0 mg/mL em metanol foram obtidas da Cerilliant, Round Rock, TX, USA.

Foram preparadas solues de trabalho de MDMA, MDEA e MDA a partir de


diluies das solues-padro, obtendo-se concentraes finais de 0,2, 0,4, 1, 2, 4 e
20 g/mL (para realizao das anlises em sangue total) e 1,2, 2, 4, 8, 20, 40 e 80 g/mL
(para realizao das anlises em urina).

A partir da soluo-padro de MBDB foram preparadas solues de trabalho em


metanol, obtendo-se concentrao final de 4 g/mL (padro interno das anlises em sangue
total) e 20 g/mL (padro interno das anlises em urina).

Solues padro de cafena, cetamina, cocana, dextrometorfano, dietilpropiona,


efedrina e femproporex na concentrao de 1,0 mg/mL em metanol foram gentilmente cedidas
pelo Ncleo de Anlise Instrumental do Instituto de Criminalstica do Estado de So Paulo e
foram utilizadas na pesquisa de possveis interferentes para as anlises.

Todas as solues (padro e de trabalho) foram acondicionadas em frascos de vidro


mbar e mantidas sob refrigerao (-20C).

Materiais e Mtodos

62

7.1.5. Amostras de sangue total

7.1.5.1. Amostras de sangue total referncia negativa

Sangue total proveniente de clnica mdica do Instituto Mdico Legal de So Paulo


encaminhados ao Ncleo de Toxicologia Forense do Instituto Mdico Legal de So Paulo
(NTF/IML/SP) e de cadveres humanos necropsiados nos postos mdico-legais do Estado de
So Paulo, sem indicao de uso de MDMA ou seus anlogos, conforme notificao
expressas nas respectivas requisies de exame toxicolgico.

7.1.5.2. Amostras de sangue total selecionadas para anlise

Coleo de amostras provenientes de clnica mdica do Instituto Mdico Legal de So


Paulo encaminhados ao Ncleo de Toxicologia Forense do Instituto Mdico Legal de So
Paulo (NTF/IML/SP) no perodo compreendido entre 01 de maro e 01 abril de 2004, sem
qualquer especificao. Este trabalho foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da
Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo, em reunio realizada em
30 de setembro de 2002 e comunicado atravs do Ofcio CEP n 89/2002.

7.1.6. Amostras de urina

7.1.6.1. Amostras de urina referncia negativa

Urina colhida de voluntrios no usurios de MDMA ou seus anlogos. Durante a


seleo destas amostras, no foi feito nenhum questionamento ou restrio quanto ao uso de
medicamentos a fim de avaliar a especificidade do mtodo proposto.

Materiais e Mtodos

63

7.1.6.2. Amostras de urina selecionadas para anlise

Coleo de amostras provenientes de clnica mdica do Instituto Mdico Legal de So


Paulo encaminhados ao Ncleo de Toxicologia Forense do Instituto Mdico Legal de So
Paulo (NTF/IML/SP) no perodo compreendido entre 01 de maro e 01 abril de 2004, sem
qualquer especificao.

7.1.7. Tratamento estatstico

O tratamento estatstico dos resultados obtidos foi feito atravs dos softwares
de computador Microsoft Excel 2000 e Microcal Origin 6.0.

7.2. Mtodos

7.2.1. Procedimentos de extrao

7.2.1.1. Tcnica proposta para extrao de MDMA, MDEA e MDA em sangue


total

Foram transferidos 2 mL de sangue total enriquecidos com 50 L de soluo


metanlica do padro interno MBDB (concentrao final no material biolgico igual a
100 ng/mL), para tubos com capacidade para 15 mL. Foram adicionados 2 mL de soluo
fisiolgica (soluo aquosa de cloreto de sdio 0,9%, m/v), 2 g de cloreto de sdio e 500 L
de soluo aquosa de hidrxido de sdio 1 M. Aps breve homogeneizao em vortex (30
segundos), foram adicionados 5 mL da mistura n-hexano/acetato de etila (7/3, v/v). Os tubos
foram ento agitados durante 15 minutos em mesa agitadora e, em seguida, centrifugados por
15 minutos a 2500 rpm. Da fase orgnica obtida, tomaram-se 4,7 mL que foram transferidos
para bqueres afunilados de 5 mL contendo 50 L de soluo metanlica de cido clordrico

Materiais e Mtodos

64

5 M e evaporados secura sob fluxo de nitrognio em temperatura ambiente. Os resduos


foram retomados com 250 L de fase mvel, filtrados em membrana Durapore (0,45 m de
poro) diretamente para frascos mbar que foram vedados por septo de silicone e tampa de
rosca, adequado para o amostrador automtico do cromatgrafo. Este procedimento de
extrao est ilustrado na Figura 8.

7.2.1.2. Tcnica proposta para extrao de MDMA, MDEA e MDA em urina

Foram transferidos 4 mL de urina, enriquecidos com 100 L de soluo metanlica do


padro interno MBDB (concentrao final no material biolgico igual a 500 ng/mL) para
tubos com capacidade para 15 mL. Foram adicionados 2 g de cloreto de sdio e 500 L de
soluo aquosa de hidrxido de sdio 1 M. Aps breve homogeneizao em vortex (30
segundos), foram adicionados 5 mL da mistura n-hexano/acetato de etila (7/3, v/v). Os tubos
foram ento agitados em mesa agitadora durante 10 minutos e, em seguida, centrifugados por
10 minutos a 2000 rpm. Da fase orgnica obtida, tomaram-se 4,7 mL que foram transferidos
para bqueres afunilados de 5 mL contendo 50 L de soluo metanlica de cido clordrico
5 M e evaporados secura sob fluxo de nitrognio em temperatura ambiente. Os resduos
foram retomados com 250 L de fase mvel, filtrados em membrana Durapore (0,45 m de
poro) diretamente para frascos mbar que foram vedados por septo de silicone e tampa de
rosca, adequado para o amostrador automtico do cromatgrafo. Este procedimento de
extrao est ilustrado na Figura 9.

Materiais e Mtodos

65

Figura 8. Fluxograma do procedimento para extrao de MDMA, MDEA e MDA em sangue


total.

Materiais e Mtodos

Figura 9. Fluxograma do procedimento para extrao de MDMA, MDEA e MDA em urina.

66

Materiais e Mtodos

67

7.2.2. Condies cromatogrficas

Amostras de sangue total e urina referncia negativa foram enriquecidas com


quantidades adequadas de solues de trabalho dos analitos de interesse e submetidas aos
procedimentos de extrao descritos no item 7.2.1.. Os extratos obtidos nestes processos
foram utilizados para a determinao das melhores condies cromatogrficas, avaliadas
atravs dos parmetros fator de reteno (k), simetria do pico obtido, fator de separao () e
resoluo (Rs).

7.2.2.1. Fator de reteno (k)

O fator de reteno foi calculado atravs da equao descrita abaixo.

k=

tempo de reteno da substncia - tempo de reteno do composto no retido


tempo de reteno do composto no retido

O tempo de reteno do composto no retido foi determinado atravs da injeo, nas


condies cromatogrficas descritas acima, de 20 L de metanol (substncia que sabidamente
no interage com a coluna cromatogrfica octadecil). Como o metanol no apresenta sinal no
detector de fluorescncia, sua deteco foi feita utilizando detector de arranjo de diodos, com
monitoramento em 200 nm.

7.2.2.2. Fator de separao ()

O fator de separao obtido atravs da razo entre os fatores de reteno de dois


compostos de eluies adjacentes, conforme a equao:

Materiais e Mtodos

68

k2
k1

Onde: k1 e k2 representam o fator de reteno de dois picos avaliados.

7.2.2.3. Resoluo (Rs)

A resoluo mede a separao (seletividade) e a largura do pico cromatogrfico


(eficincia da coluna cromatogrfica). O numerador consta da diferena na reteno dos
compostos enquanto que o denominador reflete a mdia da largura dos diferentes picos.

Rs =

2 (dr2 - dr1)
wb1 + wb2

Onde: dr1 e dr2 representam a distncia ou tempo de reteno dos dois picos avaliados;

wb1 e wb2 representam a largura dos picos avaliados.

7.2.3. Otimizao do procedimento de extrao

7.2.3.1. Avaliao do efeito salting out

Visando obter melhores rendimentos nos procedimentos de extrao, foi avaliada a


influncia da adio de cloreto de sdio (NaCl) ao material biolgico (salting out),
procedimento que contribui para um maior deslocamento dos analitos da fase aquosa (sangue
ou urina) para a fase orgnica (mistura extratora), por diminuir a solubilidade dos analitos
frao aquosa.

Materiais e Mtodos

69

Para as anlises em sangue total, este efeito foi avaliado pela adio de quantidades
crescente de NaCl (0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 gramas) em amostras referncia negativas
enriquecidas com os analitos na concentrao de 50 ng/mL. Para as anlises em urina, foi
verificado se havia diferena significativa entre a mdia das reas relativas obtidas aps a
extrao sem a adio de NaCl e a mdia das reas relativas obtidas quando foram
adicionados 2,0 g do sal. Para este estudo foram utilizadas amostras de urina referncia
negativas enriquecidas na concentrao de 500 ng/mL.

7.2.3.2. Avaliao da precipitao proteica sobre o rendimento da extrao

Nas anlises de sangue total foi avaliado o efeito da precipitao proteica pelo uso de
soluo aquosa de cido tricloroactico 20% (m/v) (TCA 20%). Estes estudos foram
conduzidos em amostras de sangue total referncia negativa enriquecidas, em triplicata, com
solues de trabalho dos analitos de tal forma que a concentrao final foi de 50 ng/mL.
A 2 mL destas amostras foi adicionado 1 mL da soluo de TCA 20%, sendo o tubo ento
agitado por 30 segundos em vortex e centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos. O
sobrenadante obtido neste processo (de aspecto lmpido e transparente) foi utilizado no
procedimento descrito no item 7.2.1.1..

Estes resultados foram comparados com aqueles obtidos quando as amostras de


sangue total foram diludas com 2 mL de soluo fisiolgica e extradas sem a adio de
qualquer soluo diluente ou precipitante.

Materiais e Mtodos

70

7.2.4. Validao dos mtodos propostos

7.2.4.1. Especificidade e seletividade

A especificidade definida como a capacidade do mtodo analtico em detectar os


analitos de interesse presentes em uma amostra na presena dos demais componentes
inerentes matriz biolgica (CAUSON, 1997; CHASIN et al., 1998). Este parmetro foi
avaliado atravs das anlises de pool (mistura de volumes iguais de seis amostras referncia
negativa) de sangue total e urina.

A fim de se avaliar possveis substncias que viessem a interferir nas anlises,


amostras de sangue total e urina referncia negativa foram enriquecidas com solues padro
dos frmacos cafena, cetamina, cocana, dextrometorfano, dietilpropiona, efedrina e
femproporex, obtendo concentrao igual a 100 g de cada frmaco por mililitro de material
biolgico. Estas amostras enriquecidas foram ento submetidas aos procedimentos analticos
propostos.

Amostras de urina que apresentaram resultado positivo para anfetaminas pela tcnica
de Imunofluorescncia Polarizada (FPIA) foram obtidas no Laboratrio de Anlises
Toxicolgicas do Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas/FCF/USP e submetidas
ao procedimento descrito no item 7.2.1.2..

7.2.4.2. Preparao das curvas analticas

As curvas analticas para os mtodos propostos foram feitas atravs das anlises de
amostras de sangue total e urina referncia negativa s quais foram adicionadas solues de

Materiais e Mtodos

71

trabalho dos analitos de interesse em concentraes crescentes e, a seguir especificadas,


respectivamente para sangue total e urina.

Sangue total

Foi preparado um pool de amostras referncia negativa de sangue total e que, aps a
separao em alquotas, cada uma delas foi enriquecida com 50 L das solues de trabalho,
para a obteno dos calibradores nas concentraes 5, 10, 25, 50, 100 e 200 ng/mL (n=6 para
cada um dos calibradores). As alquotas foram submetidas aos procedimentos descritos no
item 7.2.1.1. A curva analtica foi obtida pela projeo das concentraes de cada um dos
analitos (MDMA, MDEA e MDA) no eixo das abscissas e das relaes de reas referentes a
cada um deles e padro interno (MBDB) no eixo das ordenadas, utilizando-se a regresso
linear pelo mtodo dos mnimos quadrados para a obteno da equao da reta. A linearidade,
definida como a capacidade do mtodo gerar resultados proporcionais da espcie em estudo,
foi avaliada atravs do coeficiente de determinao (r2) da curva (CHASIN et al., 1998).

Urina

Foi preparado um pool de amostras referncia negativa de urina e que, aps a


separao em alquotas, cada uma delas foi enriquecida com 100 L das solues de trabalho,
para a obteno dos calibradores nas concentraes 50, 100, 200, 500, 1000 e 2000 ng/mL
(n=6 para cada um dos calibradores). As alquotas foram submetidas aos procedimentos
descritos no item 7.2.1.1. A curva analtica foi obtida pela projeo das concentraes de cada
um dos analitos (MDMA, MDEA e MDA) no eixo das abscissas e das relaes de reas
referentes a cada um deles e padro interno (MBDB) no eixo das ordenadas, utilizando-se a
regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados para a obteno da equao da reta. A
linearidade, definida como a capacidade do mtodo gerar resultados proporcionais da espcie

Materiais e Mtodos

72

em estudo, foi avaliada atravs do coeficiente de determinao (r2) da curva (CHASIN et al.,
1998).

7.2.4.3. Parmetros de confiana analtica

Para determinao dos parmetros de confiana analtica ou figuras analticas de


mrito as amostras de referncia negativa de sangue total e urina foram enriquecidas com
solues de trabalho diferentes daquelas utilizadas para enriquecimentos das amostras
referncia negativa utilizadas na preparao das curvas analticas.

Limite de deteco e limite de quantificao

O limite de deteco (LD) foi determinado atravs da anlise de amostras de sangue


total e urina referncia negativa que foram enriquecidas com solues de trabalho dos analitos
em concentraes decrescentes e considerou-se como LD aquele referente menor
concentrao na qual foi possvel obter picos integrados pelo equipamento, em seis replicatas,
nas condies especificadas (CHASIN et al., 1998).

O limite de quantificao (LQ) foi determinado como a menor concentrao que pde
ser determinada com preciso e exatido adequada (coeficiente de variao < 20%)
(GOLDBERGER; HUESTIS; WILKINS, 1997; CHASIN et al., 1998).

Impreciso intra-ensaio e inter-ensaio

A preciso de um mtodo bioanaltico uma medida do erro aleatrio e definida


como a concordncia de resultados obtidos durante as anlises de replicatas de amostras. Este

Materiais e Mtodos

73

parmetro avalia a proximidade entre vrias medidas efetuadas em uma mesma amostra
(CAUSON, 1997; GOLDBERGER; HUESTIS; WILKINS, 1997; CHASIN et al., 1998).
Neste estudo, a preciso intra-ensaio foi determinada atravs da anlise, em um mesmo dia, de
seis replicatas de amostras de sangue total e urina enriquecidas e adicionadas de padro
interno. Para determinao da preciso inter-ensaio foram analisadas, em cinco dias
diferentes, trs replicatas de amostras de sangue total nas concentraes de 5, 50 e 200 ng/mL
e urina nas concentraes de 50, 500 e 2000 ng/mL. Em ambos os casos a impreciso foi
calculada atravs do coeficiente de variao (CV) das reas relativas (razo entre rea
absoluta dos analitos e a rea absoluta do padro interno).

Exatido

A exatido de um mtodo bioanaltico a medida do erro sistemtico do processo


analtico (CAUSON, 1997). Pode ser definido como a proximidade entre a concentrao do
analito determinado pela metodologia proposta e a real concentrao desta substncia no
material analisado. Neste estudo, a exatido foi determinada atravs da anlise de trs
replicatas de amostras referncia negativa de sangue total enriquecidas com solues de
trabalho obtendo concentraes de 5, 50 e 200 ng/mL e urina nas concentraes de 50, 500 e
2000 ng/mL. Os valores de rea relativa foram convertidos de concentrao de analito por
mililitro de amostra atravs das respectivas equaes de regresso linear obtidas das curvas
analticas. A concentrao obtida foi comparada com a concentrao real presente na amostra,
obtendo-se a exatido do mtodo atravs da equao:

% Inexatido =

(concentrao obtida concentrao real)


100
concentrao real

Materiais e Mtodos

74

Recuperao

A eficincia dos procedimentos de extrao foi avaliada atravs da recuperao. A


recuperao dos analitos das amostras de sangue total foi avaliada por comparao da
concentrao obtida, quando amostras referncia negativa enriquecidas com quantidades
adequadas das solues de trabalho e padro interno, foram submetidas ao processo de
extrao, em relao concentrao obtida quando amostras referncia negativas contendo
somente padro interno passaram pelo processo de extrao e a adio da soluo de trabalho
nas mesmas concentraes que a correspondentes s alquotas extradas foram adicionadas
imediatamente antes da retomada do resduo. As anlises foram realizadas conforme descrito
no item 7.2.1. (n=6) (CHASIN et al., 1998).

7.2.4.3. Estudo da estabilidade

Estabilidade dos analitos na matriz biolgica

A estabilidade dos analitos foi determinada atravs do enriquecimento de amostras


referncia negativa obtendo-se concentrao final igual a 50 ng/mL de urina. A estabilidade
na matriz biolgica foi avaliada de trs formas diferentes:

(a) Estabilidade aps ciclos de congelamento e descongelamento

Amostras de urina referncia negativa foram enriquecidas e analisadas atravs dos


procedimentos descritos no item 7.2.1.2. (estes resultados foram considerados como sendo os

Materiais e Mtodos

75

relativos ao tempo zero do experimento), sendo ento congeladas e armazenadas em freezer a


20C. Estas amostras foram descongeladas e alquotas foram analisadas 4, 30 e 90 dias aps
seu preparo, sendo o restante novamente congelado, e os resultados comparados com os
obtidos nas anlises relativas ao tempo zero.

(b) Estabilidade aps armazenamento sob refrigerao

Amostras de urina referncia negativa foram enriquecidas e analisadas atravs dos


procedimentos descritos no item 7.2.1.2. (estes resultados foram considerados como sendo os
relativos ao tempo zero do experimento de estabilidade), sendo ento armazenadas sob
refrigerao (aproximadamente 10C). Estas amostras foram alquotadas e analisadas 1, 4 e 7
dias aps seu preparo, e os resultados comparados com os obtidos nas anlises relativas ao
tempo zero.

(c) Estabilidade aps armazenamento temperatura ambiente (estabilidade de


bancada)

Amostras de urina referncia negativa foram enriquecidas e analisadas atravs dos


procedimentos descritos no item 7.2.1.2. (estes resultados foram considerados como sendo os
relativos ao tempo zero do experimento de estabilidade), sendo ento armazenadas na
temperatura ambiente do laboratrio. Estas amostras foram alquotadas e analisadas 1, 4 e 7
dias aps seu preparo, e os resultados comparados com os obtidos nas anlises relativas ao
tempo zero.

Materiais e Mtodos

76

7.3. Aplicao da metodologia proposta s amostras de sangue total e urina


selecionadas para este estudo

As amostras de sangue total e urina descritas nos itens 7.1.5.2. e 7.1.6.2. foram
submetidas aos procedimentos descritos em 7.2.1.1. e 7.2.1.2. Os critrios adotados para as
amostras que eventualmente fornecessem concentraes fora dos valores pr-estabelecidos
para a curva analtica (intervalo dinmico) seria o de diluir com matriz biolgica referncia
negativa e proceder a re-anlise (CAUSON, 1997).

Resultados

77

8. RESULTADOS

8.1. Condies cromatogrficas

As condies cromatogrficas para o mtodo foram otimizadas e os parmetros


cromatogrficos encontram-se expressos nas Tabelas 3 e 4. Foi utilizada deteco por
fluorescncia, com comprimento de onda de excitao ajustado em 288 nm e comprimento de
onda de emisso ajustado em 324 nm. A Figura 10 apresenta cromatograma referente a
extrato proveniente de amostra de sangue total referncia negativa e a Figura 11 mostra
cromatograma de amostra de sangue total referncia negativo enriquecido com os analitos de
interesse na concentrao de 50 ng/mL e submetida ao procedimento de extrao descrito no
item 7.2.1.1..

A Figura 12 apresenta cromatograma referente a extrato proveniente de amostra de


urina referncia negativa e a Figura 13 mostra cromatograma de amostra de urina referncia
negativa enriquecida com os analitos de interesse na concentrao de 500 ng/mL e submetida
ao procedimento de extrao descrito no item 7.2.1.2..

Resultados

78

Tabela 3 - Tempo de reteno, reteno relativa, fator de reteno e simetria dos picos
cromatogrficos obtidos para os analitos e padro interno.

Analito

Tempo de reteno
(mim)

Reteno relativa*

Simetria

MDA

8,035

0,631

7,035

0,867

MDMA

9,768

0,767

8,768

0,781

MDEA

11,490

0,903

10,490

0,806

MBDB

12,729

1,000

11,729

0,867

Tempo de reteno do analito dividido pelo tempo de reteno do padro interno (MBDB).

Tabela 4 - Parmetros cromatogrficos utilizados para avaliar a eficincia na separao dos


analitos nas condies cromatogrficas propostas.
Analito

Fator de separao ()

Resoluo (Rs)

MDA/MDMA

1,246

3,022

MDMA/MDEA

1,196

2,423

MDEA/MBDB

1,118

1,548

Resultados

79

Figura 10. Cromatograma de amostra de sangue total referncia negativa.

Figura 11. Cromatograma de amostra de sangue total referncia negativa enriquecida com
MDMA, MDEA e MDA na concentrao de 50 ng/mL e padro interno (MBDB-100 ng/mL).

Resultados

80

Figura 12. Cromatograma de amostra de urina referncia negativa enriquecida com padro
interno MBDB na concentrao de 500ng/mL.

Figura 13. Cromatograma de amostra de urina referncia negativa enriquecida com MDMA,
MDEA, MDA e MBDB na concentrao de 500 ng/mL.

Resultados

81

8.2. Otimizao do procedimento de extrao

8.2.1. Avaliao do efeito salting out

Foi observado que a adio de 2,0 g de cloreto de sdio melhorou o rendimento dos
procedimentos de extrao dos analitos em sangue total (Figura 14) fornecendo valores de
rea relativa 20,7%, 12,3% e 14,1% para o MDMA, MDEA e MDA, respectivamente. A
adio de cloreto de sdio tambm melhorou o rendimento dos procedimentos de extrao dos
analitos presentes na urina, como pode ser observado na Tabela 5.

1,800

1,600

rea relativa

1,400

1,200

1,000

0,800

0,600
0

0,5

1,5

2,5

quantidade de NaCl (g)


MDA

MDMA

MDEA

Figura 14. Efeito da adio de cloreto de sdio (NaCl) sobre o processo de extrao da
MDMA, MDEA e MDA em sangue total.
8.2.2. Avaliao da precipitao proteica sobre o rendimento da extrao

A Tabela 6 apresenta os valores de rea absoluta e relativa obtidos durante os estudos


de precipitao proteica empregando soluo aquosa de cido tricloroactico a 20 % (m/v)
como agente precipitante.

Resultados

82

Tabela 5 - Efeito da adio de cloreto de sdio sobre o processo de extrao de MDMA,


MDEA e MDA em urina, avaliado atravs de suas respectivas reas relativas.
Mdia das reas relativas (500 ng/ml)
Analito

Aumento no valor da

Sem adio de NaCl

Com adio de NaCl

MDMA

0,930

1,004

8,0

MDEA

0,876

0,893

1,9

MDA

0,860

1,052

22,3

rea relativa (%)

Tabela 6 - Mdias das reas absolutas e relativas obtidas aps anlise de amostras de sangue
total enriquecidas (concentrao de 50 ng/mL) que sofreram processo de precipitao ou
diluio antes do procedimento de extrao.
Diluio com soluo fisiolgica

Precipitao com TCA 20%

Analito

rea absoluta

rea relativa*

rea absoluta

rea relativa*

MDMA

176,2

0,616

103,0

0,887

MDEA

191,3

0,668

99,9

0,860

MDA

150,3

0,525

62,5

0,536

MBDB

286,5

1,000

116,4

1,000

rea absoluta do analito dividida pela rea absoluta do padro interno (MBDB).

Resultados

83

8.3. Preparao das curvas analticas

8.3.1. Curvas analticas para sangue total

As curvas analticas (Figuras 15, 16, 17) foram obtidas atravs dos dados apresentados
na Tabela 7. A equao de regresso linear foi estabelecida pelo mtodo dos mnimos
quadrados e ser utilizada na quantificao da MDMA, MDEA e MDA em amostras de
sangue total selecionadas para anlise.

Tabela 7 - reas relativas obtidas para a elaborao das curvas analticas dos analitos em
sangue total e respectivos coeficientes de variao (%CV).
rea relativa dos analitos
Concentrao (ng/ml)
MDA

CV* (%) MDMA CV* (%)

MDEA

CV* (%)

0,041

18,98

0,042

10,77

0,038

18,74

10

0,130

6,53

0,156

12,12

0,109

5,22

25

0,335

4,52

0,384

5,55

0,290

5,03

50

0,585

3,41

0,626

6,74

0,499

3,23

100

1,211

3,56

1,312

3,77

1,050

3,38

200

2,246

2,08

2,610

3,00

2,119

0,74

Coeficiente de variao.

Resultados

84

Figura 15. Representao da curva analtica para a determinao de MDMA nas


concentraes sanguneas de 5 a 200 ng/mL.

Figura 16. Representao da curva analtica para a determinao de MDEA nas concentraes
sanguneas de 5 a 200 ng/mL.

Resultados

85

Figura 17. Representao da curva analtica para a determinao de MDA nas concentraes
sanguneas de 5 a 200 ng/mL.

8.3.2. Curvas analticas para urina

As curvas analticas (Figuras 18, 19 e 20) foram obtidas atravs dos dados
apresentados na Tabela 8. A equao de regresso linear foi estabelecida pelo mtodo dos
mnimos quadrados e ser utilizada na quantificao da MDMA, MDEA e MDA em amostras
de urina selecionadas para anlise.

Resultados

86

Tabela 8 - reas relativas obtidas para a elaborao das curvas analticas dos analitos em
urina e respectivos coeficientes de variao (%CV).
rea relativa dos analitos
Concentrao (ng/mL)
MDA

CV* (%) MDMA CV* (%) MDEA CV* (%)

50

0,140

8,96

0,149

16,21

0,124

12,74

100

0,256

8,82

0,248

7,18

0,233

10,26

200

0,475

8,58

0,440

7,32

0,407

5,52

500

1,140

6,30

1,044

5,77

0,937

4,24

1000

2,235

4,43

2,080

5,18

2,006

2,95

2000

3,350

6,08

3,566

4,09

3,638

2,98

Coeficiente de variao.

Figura 18. Representao da curva analtica para a determinao de MDMA nas


concentraes urinrias de 50 a 2000 ng/mL.

Resultados

87

Figura 19. Representao da curva analtica para a determinao de MDEA nas concentraes
urinrias de 50 a 2000 ng/mL.

Figura 20. Representao da curva analtica para a determinao de MDA nas concentraes
urinrias de 50 a 2000 ng/mL.

Resultados

88

8.4. Parmetros de segurana analtica

Limite de deteco e limite de quantificao

O limite de deteco para a tcnica de extrao proposta para a anlise em sangue total
foi de 3 ng/mL para os trs analitos. Para a anlise em urina os valores de limite de deteco
foram de 10 ng/mL, 15 ng/mL e 20 ng/mL para a MDA, MDMA e MDEA, respectivamente.

O limite de quantificao da tcnica proposta para as anlises em sangue total foi de


5 ng/mL para os trs analitos, enquanto que para as anlises em urina os limites de
quantificao foram 15 ng/mL, 20 ng/mL e 30 ng/mL para a MDA, MDMA e MDEA,
respectivamente.

Impreciso intra-ensaio e inter-ensaio

Os coeficientes de variao obtidos nas anlises das concentraes sangneas e


urinrias esto relacionados na Tabela 9.

Exatido

A exatido obtida em diferentes concentraes sanguneas e urinrias est expressa na


Tabela 10.

Recuperao

A recuperao dos analitos obtida em diferentes concentraes sanguneas e urinrias


est expressa na Tabela 10.

Resultados

89

Tabela 9 - Coeficientes de variao das concentraes sangneas e urinrias de MDMA, MDEA e MDA obtidos nos ensaios de preciso intra e
inter-ensaio.

Concentraes sanguneas

Concentraes urinrias

5 ng/mL

50 ng/mL

200 ng/mL

50 ng/mL

500 ng/mL

2000 ng/mL

MDMA

10,77

6,74

3,00

6,85

2,05

2,84

MDEA

18,74

3,23

0,74

12,03

3,53

2,07

MDA

12,98

3,41

2,08

6,69

2,49

3,74

MDMA

16,55

11,60

8,52

16,21

5,77

4,09

MDEA

15,78

9,75

4,65

12,74

4,24

2,98

MDA

14,45

13,10

7,82

8,96

3,00

6,08

Impreciso intra-ensaio CV* (%)

Impreciso inter-ensaio CV* (%)

Coeficiente de variao.

Resultados

90

Tabela 10 Exatido e recuperao dos mtodos propostos para anlise de MDMA, MDEA e MDA em amostras de sangue total e urina,
avaliados em diferentes concentraes.
Concentraes sanguneas

Concentraes urinrias

5 ng/mL

50 ng/mL

200 ng/mL

50 ng/mL

500 ng/mL

2000 ng/mL

MDMA

4,8

52,1

199,0

42,2

425,2

1860,0

MDEA

4,6

47,1

197,2

45,0

545,5

1916,0

MDA

5,0

49,9

199,2

48,5

541,0

2010,0

MDMA

67,77

72,11

71,35

86,88

87,11

91,14

MDEA

82,13

85,07

77,02

83,91

88,94

87,81

MDA

90,35

76,33

90,67

91,64

90,08

92,86

Exatido(ngml)

Recuperao (%)

Resultados

91

8.5. Pesquisa de possveis frmacos interferentes

Aps aplicao dos procedimentos analticos propostos, nenhum dos possveis


frmacos interferentes foi detectado pelo presente mtodo. Mesmo as amostras de urina
positivas para anfetaminas pela tcnica de Imunofluorescencia Polarizada (FPIA) fornecidas
pelo Laboratrio de Anlises Toxicolgicas do Departamento de Anlises Clnicas e
Toxicolgicas/FCF/USP e submetidas ao procedimento descrito no item 7.2.1.2., no
apresentaram picos interferentes quando analisadas.

Estabilidade dos analitos na matriz biolgica

As Figuras 21, 22 e 23 ilustram os resultados obtidos durante o estudo de estabilidade


dos analitos em amostras de urina sob diferentes condies de armazenamento.

Resultados

92

0,25
0,23
0,21

rea relativa

0,19
0,17
0,15
0,13
0,11
0,09
0,07
0,05
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

tem po (dias)
MDA

MDMA

MDEA

Figura 21. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps
ciclos de congelamento.

No houve variao superior a 20 % (coeficiente de variao) entre as reas relativas


dos analitos obtidas durante o estudo de estabilidade aps ciclos de congelamento e
descongelamento.

Resultados

93

0,25
0,23
0,21

rea relativa

0,19
0,17
0,15
0,13
0,11
0,09
0,07
0,05
0

tempo (dias)
MDA

MDMA

MDEA

Figura 22. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps
armazenamento sob refrigerao (10C).

0,18
0,17
0,16
rea relativa

0,15
0,14
0,13
0,12
0,11
0,1
0,09
0,08
0

tempo (dias)
MDA

MDMA

MDEA

Figura 23. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps
armazenamento a temperatura ambiente (estabilidade de bancada).

Resultados

94

Quando as amostras de urina foram armazenadas sob refrigerao (10C) e em


condies ambientais no foram observadas variaes entre os valores de rea relativa dos
analitos superior a 20%.

8.6. Aplicao da metodologia proposta s amostras de sangue total e urina


selecionadas para este estudo.
Foram analisadas quatorze amostras de sangue total e vinte amostras de urina. Estas
amostras representaram, respectivamente 15,4% (n=91) e 46,5% (n=43) do total de amostras
de clnica mdica que deram entrada no Ncleo de Toxicologia Forense do Instituto MdicoLegal de So Paulo, durante o perodo compreendido entre 01 de maro e 01 de abril de 2004.
No foi detectada a presena dos analitos pesquisados neste trabalho em nenhuma das
amostras analisadas (LD igual a 3 ng/mL para MDMA, MDEA e MDA para anlises
realizadas em 2 mL de sangue total e LD igual a10 ng/mL, 15 ng/mL e 20 ng/mL para a
MDA, MDMA e MDEA, respectivamente para 4 mL de urina).

Discusso

95

9. DISCUSSO

Como j foi descrito anteriormente, este trabalho teve por objetivo apresentar
metodologia analtica que possibilite aos laboratrios de toxicologia forense, estabelecer um
diagnstico laboratorial inequvoco da utilizao de Ecstasy e Eve atravs da anlise de seus
princpios ativos MDMA e MDEA, respectivamente. Para complementar estas anlises,
optou-se ainda pela quantificao da MDA, produto de biotransformao originado pela
desmetilao dos frmacos citados acima e eliminado na urina na forma livre (sem
conjugao com radicais hidroflicos).
A relevncia deste trabalho reside no fato de que, conforme mostrado no relatrio
elaborado pela Organizao das Naes Unidas (ONU), ainda no existe no Brasil qualquer
informao sobre o consumo de metilenodioxianfetaminas (UNODC, 2003). O aumento no
nmero de apreenses de comprimidos de Ecstasy pela Polcia no Estado de So Paulo e no
Brasil so indicativos da tendncia de aumento na prevalncia e incidncia do consumo ilcito
de designer drugs (UNODC, 2003). A correspondente morbidade e at mesmo a mortalidade
relacionada a este consumo no pode ser verificada, a menos que o laboratrio forense tenha
disposio metodologia apropriada e criteriosamente validada para que o resultado emitido
seja inequvoco e conseqentemente incontestvel (CHASIN, 2001).
Assim, para no comprometer a exeqibilidade da anlise, os critrios utilizados na
escolha da metodologia a ser testada, aps reviso da literatura cientfica, procuraram na
medida do possvel se adequar s condies tcnicas, a serem disponibilizadas nos
laboratrios de toxicologia forense do pas.
As intoxicaes por MDMA ou MDEA no podem ser diferenciadas atravs da
sintomatologia clnica, rigorosamente semelhante para os dois frmacos. Esta diferena pode
ser estabelecida com relativa facilidade atravs de anlises toxicolgicas em amostras de urina
ou sangue onde se pesquise a presena dos frmacos inalterados. Se considerarmos que os
comprimidos vendidos como Ecstasy possuem apenas MDMA em sua composio e os
comercializados com Eve contenham apenas a MDEA, espera-se que durante a realizao dos

Discusso

96

exames em material biolgico de usurios de Ecstasy seja verificada da presena da MDMA e


seu produto de desalquilao a MDA. J durante as anlises de usurios de Eve esperada a
presena, alm da MDEA, dos respectivos produtos de desalquilao MDMA e MDA. O
diagnstico diferencial da substncia utilizada s pode ser feito, portanto, atravs das anlises
toxicolgicas.
A presena de pequenas quantidades de MDA nos casos onde tambm seja
identificada a presena de MDMA e/ou MDEA interpretada apenas como presena de
produto de biotransformao destes frmacos precursores. Tamayo, Tena e Rodrguez (1997)
relataram que nenhuma quantidade significativa desta substncia per se foi identificada nas
amostras provenientes de necropsia analisadas pelos autores, o que confirma a idia de que a
MDA praticamente no utilizada como droga de abuso. Rothe et al., (1997) analisando
amostras de cabelo de usurios e comprimidos apreendidos, concluram tambm que a MDA
encontrado nas amostras biolgicas so provenientes exclusivamente da N-desalquilao da
MDMA e/ou MDEA, uma vez que a MDA no foi identificada em nenhum dos 124
comprimidos analisados e esteve presente com freqncia nas amostras de cabelo analisadas.
A escolha do material biolgico utilizado para realizao dos exames levou em
considerao principalmente as caractersticas toxicocinticas dos agentes investigados e a
finalidade do presente trabalho, qual seja, diagnstico laboratorial da intoxicao com
finalidade de auxlio-diagnstico nos casos de envolvimento mdico-legal.
O sangue a amostra biolgica ideal para se proceder a quantificao de substncias
relacionadas a intoxicaes exgenas, atravs do qual possvel estabelecer relao com os
efeitos apresentados, realizar inferncia sobre o momento do uso, quantidade de substncia
administrada, possveis alteraes psquicas causadas pelo frmaco no instante do delito, bem
como afirmar se o frmaco est relacionado com a causa mortis. A urina por sua vez a
amostra biolgica de eleio para identificao do uso de drogas de abuso com finalidade
forense, por possuir menor nmero de interferentes que as amostras de sangue e vsceras.
Soma-se a este fato o fenmeno de que praticamente 50% da quantidade ingerida dos
frmacos aqui estudados so eliminados na urina na forma inalterada.
Porquanto teis em toxicologia forense, as matrizes como humor vtreo, fragmentos de
tecido muscular e vsceras (fgado, rins, crebro e contedo estomacal) no so referidos

Discusso

97

freqentemente na literatura em relao a determinao das metilenodioxianfetaminas. Este


fato tem relao a estes materiais s estarem disponveis nos casos de necropsia
(WEINMANN; BOHNERT, 1998; DE LETTER et al., 2002). Cabe ainda ressaltar que o
nmero de intoxicaes fatais causadas por MDMA relativamente baixo, o que faz desta
substncia um agente cuja morbidade sobrepe a mortalidade (DE LETTER et al., 2002).
Ademais, as mortes documentadas pelo uso de Ecstasy so excepcionalmente raras e so
decorrentes

principalmente

de

doenas

cardacas

pr-existentes,

complicaes

cardiovasculares e/ou hipertermia. Freqentemente as vtimas de bito pelo consumo de


Ecstasy ou Eve, apresentam significativas alteraes hepticas, cardacas e cerebrais
(HELMLIN et al., 1996). Mesmo nos casos onde as metilenenodioxianfetaminas no esto
relacionadas com bito por intoxicao aguda, o abuso destas substncias pode acarretar ainda
outros riscos como perda da capacidade de dirigir devido diminuio da acuidade visual
decorrente da midrase provocada por estas substncias, nervosismo, confuso, diminuio da
inibio, o que refora o interesse forense na verificao do uso deste compostos (ROTHE et
al., 1997). semelhana do etanol, estas substncias no constituem agente de causa mortis
embora seu uso seja freqente como coadjuvante de morbidade e mortalidade nos casos onde
ocorrem.
A tcnica utilizada, cromatografia lquida de alta eficincia com deteco por
fluorescncia, est entre as tcnicas mais empregadas para a anlise de MDMA e compostos
anlogos. As metilenodioxianfetaminas so compostos naturalmente fluorescentes o que
permitiu a utilizao de detector sensvel e seletivo e conseqentemente a quantificao de
analitos em matriz biolgica complexa como sangue total, mesmo quando estes se apresentam
em baixas concentraes.
O

desenvolvimento

da

metodologia

para

separao

identificao

das

metilenodioxianfetaminas por cromatografia lquida demandou tempo e perseverana, uma


vez que esta anlise possua algumas peculiaridades: (a) grande similaridade estrutural
existente entre os analitos, diferindo entre si em apenas por um radical metil; (b) as
substncias analisadas so aminas secundrias, estando sujeitas interao com resduos
silanis presentes na coluna cromatogrfica. tomos de nitrognio com caractersticas bsicas
presentes nos frmacos analisados podem ser protonados dependendo de seu pKa e do pH do
eluente utilizado. Este fenmeno faz com que estes compostos interajam com grupamentos
silanis residuais do processo de empacotamento das colunas de fase reversa para HPLC,

Discusso

98

originando picos assimtricos, separao ineficiente e no reprodutibilidade no tempo de


reteno (VERVOORT et al., 2000).
A assimetria do pico cromatogrfico pode ser explicada pelo fato de que a cintica de
interao por troca inica que ocorre entre o frmaco de carter bsico e o grupamento silanol
pode ser mais lenta que a interao com o radical alquil (octadecil neste trabalho). Desta
forma, as molculas do analito acabaro sendo submetidas a diferentes formas e intensidades
de interao com a fase estacionria, sendo eludas em bandas mais largas e assimtricas.
Sabe-se que, para melhorar a forma dos picos cromatogrficos em cromatografia
lquida (e conseqentemente sua resoluo e sua reprodutibilidade), deve-se inicialmente
variar a composio da fase mvel do seguinte modo:
Seleo do pH da fase mvel, de forma que este seja maior do que o pKa dos
compostos analisados. Esta alternativa configurou-se invivel para as anlises de
metilenodioxianfetaminas uma vez que estes frmacos possuem pKa superior a 10 e as
colunas utilizadas normalmente em cromatografia lquida, onde o suporte slica, no
devem ser submetidas a valores de pH superiores a 8 para que no haja degradao da
fase estacionria. Outra alternativa seria diminuir o pH da fase mvel at valores
inferiores ao pKa dos grupos silanis, neutralizando estes radicais. Contudo, durante a
fase de otimizao do mtodo cromatogrfico para anlises de MDMA e seus
derivados, diminuiu-se o pH da fase mvel at 2,5 e no foi observada melhora na
resoluo e eficincia da separao dos analitos;
Aumento da fora inica da fase mvel, numa tentativa de deslocar o equilbrio da
reao para a esquerda, conforme a equao a seguir:
MDMA+ + Na+SiO- MDMA+SiO- + Na+
O aumento na concentrao salina no tampo fosfato de sdio da fase mvel,
alteraes que geralmente so suficientes para melhorar a separao de substncias em
cromatografia lquida, no mostraram resultados satisfatrios, pois a separao dos
analitos foi insatisfatria;

Discusso

99

Reduo na concentrao da amostra para moderar a saturao dos grupamentos


cidos. Esta alternativa tambm configura-se invivel durante a otimizao de
mtodos para anlises forenses, onde os analitos freqentemente esto presentes
em matrizes complexas e em baixas concentraes. A reduo da concentrao da
amostra injetada implicaria diretamente em valores de limite de deteco maiores;
Adio fase mvel de agentes que possam bloquear a interao inica entre o
frmaco bsico e o radical silanl cido. Dentre estes agentes os mais comumente
citados na literatura cientfica so o hexanosulfonato de sdio e o octanosulfonato
de sdio, geralmente chamados de reagentes de pareamento inico. Estes
compostos so constitudos por cadeia aliftica ligada a radical SO3-, capaz de
interagir com o grupamento amina do frmaco neutralizando sua carga e
permitindo que ocorra apenas interao hidrofbica entre a cadeia octadecil da
coluna e o analito. Neste trabalho, o reagente de pareamento inico escolhido foi o
dodecil sulfato de sdio, composto aliftico de doze carbonos que tambm possui
o radical SO3-. Esta escolha foi feita pelo fato de que o dodecil sulfato de sdio
um sal economicamente mais vivel do que o hexanosulfonato de sdio ou
octanosulfonato de sdio. Assim, a utilizao de pareamento inico, onde se utiliza
a adio fase mvel de um composto que apresente radical nucleoflico, capaz de
se ligar s aminas protonadas, diminuindo sua interao com os radicais silanis
presentes na coluna cromatogrfica, mostrou boa separao e eficincia.
Inicialmente testou-se a utilizao de dodecil sulfato de sdio 20 mM, mas nesta
concentrao no houve separao satisfatria entre o pico da MDEA e o pico do
padro interno. Assim, a melhor condio de fase mvel encontrada foi dodecil
sulfato de sdio 50 mM (pH=4,0):acetonitrila (60:40).
A utilizao de gradiente de eluio tambm foi testada e, apesar de melhorar a
separao dos analitos, causou drift (elevao causada pela variao na
composio da fase mvel) da linha de base e alargamento dos picos de MDA e
MDMA.
A tcnica de extrao proposta neste trabalho mostrou-se simples, rpida,
economicamente vivel e apresentou bons rendimentos (recuperao maior que 85% para

Discusso

100

todos os analitos), podendo perfeitamente ser aplicada por qualquer laboratrio forense. As
principais desvantagens observadas durante o emprego deste tipo de extrao foram a
dificuldade de automao do processo, formao de emulses (principalmente com as
amostras de sangue total) o que demandou a insero de etapa de diluio do material
biolgico antes da partio com solvente orgnico, grande consumo de tempo e o emprego de
solventes orgnicos que apresentam riscos ao meio ambiente e a sade do analista caso as
anlises no sejam conduzidas de acordo com boas prticas de conduta e manipulao de
substncias txicas, como a utilizao de capela de exausto, luvas, mscara e culos de
proteo.

Como j mencionado anteriormente, a microextrao em fase slida (SPME), apesar


de simples, rpida e limpa (pois praticamente no utiliza solventes orgnicos), no foi
selecionada para este trabalho, pois seu emprego na rotina dos laboratrios de anlise forense
do Brasil ainda economicamente invivel.

A utilizao da mistura extratora n-hexano/acetato de etila (7:3) citada inicialmente


por CLAUWAERT et al., (2000) forneceu melhores resultados do que quando foi utilizado
apenas n-hexano como solvente extrator como proposto por Sadegipour e Veuthey, (1997). A
tcnica de extrao proposta neste trabalho possui ainda a vantagem de utilizar menos
solvente orgnico do que os procedimentos citados por autores como (WEINMANN;
BOHNERT, 1998; CLAUWAERT et al., 2000; CLAUWAERT; BOCXLAER; LEENHEER,
2001; DE LETTER et al., 2002). Este procedimento de extrao apresentou bons resultados
(recuperao maior que 70% para anlises em sangue total e maior que 84% para anlises em
urina) e perfeitamente exeqvel em qualquer laboratrio forense que realize anlises em
matrias biolgicos.

Discusso

101

Como j havia sido mencionado por outros autores, antes da etapa de concentrao do
extrato, foi necessria a acidificao da fase orgnica com soluo metanlica de cido
clordrico

para

que

ocorresse

converso

das

formas

bsicas

das

metilenodioxianfetaminas para os correspondentes cloridratos, uma vez que esta segunda


forma menos voltil, diminuindo possveis perdas durante a evaporao do solvente
orgnico (MARQUET et al., 1997).

O padro interno utilizado nas anlises, o N-metil-1-(3,4-metilenodioxifenil)-2butamina (MBDB), mostrou-se adequado, pois apresenta grande semelhana estrutural e
fsico-qumica com os analitos. Mesmo sendo classificado como designer drug, o MBDB
raramente encontrado como adulterante dos comprimidos de Ecstasy e Eve (SHERLOCK et
al., 1999; BAGGOTT et al., 2000), e sua presena nunca foi detectada em comprimidos
apreendidos no Estado de So Paulo.

A identificao dos analitos eventualmente presentes nas amostras autnticas


analisadas seria feita atravs do tempo de reteno relativa ao padro interno, uma vez que a
reteno relativa um parmetro de identificao mais robusto que a avaliao dos tempos de
reteno de cada substncia isolada. De modo anlogo, a quantificao destas substncias
seria realizada atravs da metodologia validada que utilizou a razo entre as reas do analito e
do padro interno como varivel dependente da concentrao dos frmacos presentes no
material biolgico.

Durante a otimizao do procedimento de extrao, foi observado que a adio de


quantidades crescentes de cloreto de sdio s amostras de sangue total (efeito salting out)
aumentou de forma proporcional o rendimento do processo de extrao dos analitos, fato
observado atravs da avaliao dos valores de reas relativas. Esta melhora ocorreu at a

Discusso

102

quantidade mxima de 2,0 g do sal para a MDMA e 2,5 g para a MDA e MDEA, valores a
partir dos quais comea a haver diminuio do rendimento do procedimento.

Durante as anlises de urina verificou-se que a adio de dois gramas de cloreto de


sdio ao material biolgico causou pequeno aumento nos valores de rea relativa da MDMA e
da MDEA. Contudo, foi observada que esta adio de sal aumentou em 22% os valores das
reas relativas da MDA, obtidas com e sem a adio de cloreto de sdio na urina como
observado na Tabela 5.

Esta melhora no rendimento da extrao pela adio de cloreto de sdio ocorre porque
o sal diminui a solvatao dos analitos presentes no meio aquoso do material biolgico,
diminuindo sua solubilidade neste meio e facilitando sua partio para o solvente orgnico de
caractersticas apolares.

Ainda durante a etapa de otimizao das condies de preparao das amostras,


observou-se que a extrao das amostras de sangue total, quando submetidas ao contato direto
com o solvente orgnico, ficou comprometida provavelmente pela precipitao das protenas
causada pelo solvente e pela formao de emulso, que impediu o recolhimento da frao
orgnica mesmo quando os tubos foram centrifugados a 3500 rpm durante 20 minutos. Para
contornar este problema, duas alternativas foram testadas: precipitao das protenas presentes
no sangue antes de submeter o material a extrao ou diluio da matriz biolgica com
soluo fisiolgica.

A diluio do sangue com soluo de cloreto de sdio 0,9% na proporo 1:1 (v/v)
conferiu maior fluidez matriz biolgica, permitindo maior contato desta com o solvente
orgnico durante a agitao e facilitando a separao entre as fases orgnica e aquosa aps a
centrifugao, que pode ser realizada a 2500 rpm durante 15 minutos. Alm disso, este

Discusso

103

procedimento mostrou melhores resultados do que a precipitao proteica, tendo em vista que
a precipitao das protenas presentes no sangue pelo uso de soluo TCA 20% forneceu
reas absolutas, tanto dos analitos como do padro interno, menores do que as reas obtidas
quando a matriz biolgica foi apenas diluda com soluo fisiolgica na proporo 1:1 (v/v).

Os mtodos propostos apresentaram excelente linearidade dentro do intervalo


dinmico da curva analtica, com valores de coeficiente de determinao sempre superiores a
0,99 (exceto para as anlises de MDA em urina). Cabe aqui informar que a linearidade do
mtodo, neste caso especfico, coincide com aquela relativa ao sistema de deteco utilizado
neste trabalho. Segundo informaes fornecidas pelo representante do equipamento no pas, o
detector de fluorescncia utilizado opera atravs do uso de clula fotomultiplicadora. Para
possibilitar a deteco de baixas concentraes dos analitos (fundamental em anlises
forense), a atenuao do sinal gerado pelo equipamento foi diminuda de acordo com a faixa
de valores esperados para as duas matrizes analisadas neste trabalho, o que levou saturao
da clula fotomultiplicadora em concentraes mais elevadas, fazendo com que a resposta
deixasse de ser linear. Apesar do intervalo dinmico estar entre 5 ng/mL e 200 ng/mL para a
anlise de sangue total, e entre 50 ng/mL e 2000 ng/mL para urina, concentraes acima de
200 ng/mL para as anlises de sangue total e 2000 ng/mL para as anlises de urina sero
facilmente determinadas adotando-se como critrio, durante o processamento das amostras
reais, da diluio das mesmas com matriz biolgica referncia negativa, sempre que a
concentrao obtida ultrapassar o valor mximo do intervalo dinmico.

Os valores de limite de deteco e quantificao obtidos neste estudo podem ser


considerados satisfatrios quando se leva em considerao a tcnica de extrao e o sistema
de deteco empregados, e encontram-se de acordo com os observados por outros autores
(SADEGHIPOUR; VEUTHEY, 1997). Nas anlises de urina, os valore de LQ obtidos foram

Discusso

104

ainda menores do que os relatados por DE LETTER et al., (2002) e CLAUWAERT et al.,
(2000, 2001), que obtiveram LQ igual a 100 ng/mL.

Alm da possibilidade da utilizao deste mtodo para verificao forense do uso de


MDMA e seus anlogos, os valores de limite de deteco obtidos para urina mostram-se ainda
adequados para verificao do uso recreacional de Ecstasy e Eve, alm de serem inferiores aos
valores de cut-off propostos pelo National Institute on Drug Abuse (200 ng/mL) para tcnicas
de confirmao do uso de MDMA aps triagem por tcnica menos especfica (imunoensaios).

A ordem crescente de limite de quantificao observada entre MDA, MDMA e MDEA


tambm aparece como resultados de outros autores. Esta seqncia corresponde ordem de
eluio dos compostos da coluna cromatogrfica. Como os trs analitos possuem
caractersticas estruturais e fsico-qumicas muito semelhantes, uma possvel explicao para
este fato seria a de que os compostos que so eludos primeiramente apresentam picos mais
delgados do que os subseqentes e, por conseqncia, apresentam maior altura, o que melhora
a deteco e quantificao da substncia.

A preciso, avaliada atravs da impreciso e calculada como coeficiente de variao


apresentou resultados sempre inferiores a 20%, mesmo quando a impreciso foi analisada
durante dias consecutivos (impreciso interensaio), o que est perfeitamente de acordo para
anlises forenses (GOLDBERGER; HUESTIS; WILKINS, 1997).

Sempre que disponvel, a exatido de um mtodo analtico deve ser avaliada utilizando
amostras cuja concentrao dos analitos no material garantida por instituies
normatizadoras ou responsveis por programas de garantia da qualidade laboratorial
(amostras certificadas). Quando este tipo de material no disponvel, aceitvel que a
exatido do mtodo bioanaltico seja avaliada atravs do enriquecimento de amostras

Discusso

105

referncia negativa, comparando os valores encontrados com a concentrao nominal


adicionada (CAUSON, 1997; GOLDBERGER; HUESTIS; WILKINS, 1997; CHASIN et al.,
1998). Causon (1997) refere que a exatido do mtodo analtico deve estar entre 15% do
valor dito como real para todas concentraes avaliadas. Seguindo este preceito, a
metodologia desenvolvida neste trabalho apresenta exatido adequada, uma vez que nenhuma
concentrao avaliada apresentou inexatido superior a 15%.

Embora seja o desejado que a recuperao do mtodo analtico seja o mais prximo
possvel de 100%, a obteno de valores inferiores no compromete o mrito do mtodo
desenvolvido, uma vez que se pode obter boa preciso e exatido mesmo que a recuperao
do mtodo seja moderada. Pelos resultados obtidos neste trabalho, pode-se afirmar que a
mistura n-hexano/acetato de etila (7:3, v/v) foi eficiente na extrao da MDMA, MDEA e
MDA presentes na matriz biolgica, fornecendo rendimentos sempre superiores a 67%,
mesmo durante a conduo das anlises em sangue total, matriz biolgica mais complexa e
difcil de ser manipulada em processos de extrao lquido-lquido.

Em toxicologia forense, a especificidade de um mtodo figura dentre os parmetros


mais importantes e deve ser avaliado com rigoroso critrio durante a etapa de validao. Isto
porque o material biolgico disponvel para execuo dos exames no recebe os mesmos
cuidados e critrios utilizados durante a coleta de material para realizao de exames clnicos
e podem no receber o devido cuidado durante seu armazenamento e transporte, o que pode
aumentar ainda mais a quantidade de possveis interferentes endgenos em virtude da
decomposio da matriz biolgica. Soma-se a estes problemas o fato de que quando se realiza
a verificao do uso de drogas de abuso preciso sempre considerar os possveis adulterantes
presentes na droga de rua e que estaro sendo administrados concomitantemente ao usurio.

Discusso

106

Os frmacos avaliados como possveis interferentes, cafena, cetamina, cocana,


dextrometorfano e efedrina foram selecionados por serem freqentemente citados na literatura
internacional como adulterantes presentes nos comprimidos de Ecstasy (BAUDOT et al.,
1998; SHERLOCK et al., 1999; BAGGOTT et al., 2000; COLE et al., 2002). Os derivados
anfetamnicos como a dietilpropiona (anfepramona) e o femproporex foram selecionados para
estudo devido ao grande consumo destas substncias como frmacos moderadores de apetite
receitados para tratamentos de emagrecimento no Brasil e que so sabidamente abusados em
nosso meio. A metodologia proposta neste trabalho apresentou especificidade adequada para
aplicao em toxicologia forense, uma vez que nenhum dos possveis interferentes testados
foi detectado. Corrobora ainda para esta afirmao o fato que, mesmo amostras positivas para
anfetaminas pela tcnica de Imunofluorescncia Polarizada, no apresentaram picos
cromatogrficos com tempo de reteno prximo ao dos analitos.

O estudo de estabilidade necessrio para que se possa afirmar que a concentrao do


analito determinada na amostra corresponde ao valor presente na matriz biolgica na hora da
coleta e/ou bito, sendo de fundamental importncia em toxicologia forense, sem o que as
inferncias no so possveis. Segundo Causon (1997), pode-se considerar que os analitos so
estveis no material biolgico se sua concentrao no diferir em mais de 20% do valor
determinado no tempo zero do estudo de estabilidade. Este critrio pode perfeitamente ser
aceito em nosso estudo, pois as variaes demonstradas na situao interensaio no
excederam este percentual. Durante o estudo de ciclos de congelamento, a variao obtida
entre as reas relativas dos analitos no perodo estudado no excedeu o valor de 20%.
Utilizando-se este critrio, pode-se afirmar tambm que a MDMA, MDEA e a MDA so
estveis em urina por at uma semana se armazenada sob refrigerao (aproximadamente
10C) e mesmo quando armazenada temperatura ambiente e ao abrigo da luz, uma vez que
tambm nestes casos a variao no foi superior ao valor estipulado como limite (20%). Este

Discusso

107

achado coincide com os resultados obtidos durante dos estudos de Clauwaert, Bocxlaer e
Leenheer (2001), que citam que a MDMA possui boa estabilidade em amostras de sangue,
soro e urina, onde os pesquisadores no observaram degradao deste frmaco e seus
anlogos MDA e MDEA durante 13 semanas, quando os materiais foram armazenados em
baixas temperaturas (-20C).

Mesmo com o crescente aumento no consumo de Ecstasy no Brasil, fato que este uso
ainda muito inferior ao consumo de drogas como cocana e maconha. A no deteco de
metilenodioxianfetaminas nas amostras analisadas pode ser atribuda a fatores como pequeno
nmero de amostras, tanto em relao ao percentual no perodo estudado quanto em relao
ao nmero total de casos que do entrada ao laboratrio anualmente. Outra possibilidade seria
as circunstncias envolvidas nestes casos que so oriundos de exames de corpo de delito
(casos da clnica mdica) ou mortes a esclarecer. Nos casos de indivduos vivos poder-se-ia
conjeturar que as circunstncias normalmente associadas ao uso de Ecstasy (festas rave) no
apresentam relao pronunciada com episdios de envolvimento mdico-legal (situaes de
cunho policial). A aplicao de uma metodologia a um contingente maior de casos
provenientes da clnica mdica e ainda amostras oriundas de cadveres provenientes do
Instituto Mdico Legal, dever ser conduzida no sentido de se possibilitar inferncia sobre
este indicador populacional de uso.

Concluses

108

10. CONCLUSES

A metodologia proposta para anlise em sangue total e urina:

1. exeqvel em qualquer laboratrio de Toxicologia Forense de mdio porte;

2. Apresenta especificidade, limite de deteco e intervalo dinmico compatveis com os


teores referidos como aqueles encontrados em sangue e urina de indivduos
intoxicados por MDMA, MDEA e MDA;

3. Se presta a constituir metodologia inequvoca e que, portanto, pode constituir mtodo


confirmatrio e integrar Laudo Toxicolgico.

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