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Orientadora:
Profa. Dra. Alice Aparecida da Matta Chasin
So Paulo
2004
UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS
Programa de Ps-Graduao em Toxicologia e Anlises Toxicolgicas
Determinao de 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA Ecstasy), 3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA - Eve) e 3,4metilenodioxianfetamina (MDA) em fluidos biolgicos por
cromatografia lquida de alta eficincia: aspecto forense
So Paulo
2004
Determinao de 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA Ecstasy), 3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA - Eve) e 3,4metilenodioxianfetamina (MDA) em fluidos biolgicos por
cromatografia lquida de alta eficincia: aspecto forense
Comisso Julgadora
da
Dissertao para obteno do grau de Mestre
____________________________
Profa. Dra. Elizabeth de Souza Nascimento
1o. examinador
____________________________
Profa. Dra. Silvia de Oliveira Santos Cazenave
2o. examinador
Amigos
Tenho amigos que no sabem o quanto so meus amigos. No percebem o amor que lhes devoto e a absoluta
necessidade que tenho deles.
A amizade um sentimento mais nobre do que o amor, eis que permite que o objeto dela se divida em outros
afetos, enquanto o amor tem intrnseco o cime, que no admite a rivalidade.
E eu poderia suportar, embora no sem dor, que tivessem morrido todos os meus amores, mas enlouqueceria
se morressem todos os meus amigos! At mesmo aqueles que no percebem o quanto so meus amigos e o
quanto minha vida depende de suas existncias
A alguns deles no procuro, basta-me saber que eles existem. Esta mera condio me encoraja a seguir em
frente pela vida.
Mas, porque no os procuro com assiduidade, no posso lhes dizer o quanto gosto deles. Eles no iriam
acreditar. Muitos deles esto lendo esta crnica e no sabem que esto includos na sagrada relao de meus
amigos.
Mas delicioso que eu saiba e sinta que os adoro, embora no declare e no os procure. E s vezes, quando
os procuro, noto que eles no tem noo de como me so necessrios, de como so indispensveis ao meu
equilbrio vital, porque eles fazem parte do mundo que eu, tremulamente, constru e se tornaram alicerces do
meu encanto pela vida.
Se um deles morrer, eu ficarei torto para um lado. Se todos eles morrerem, eu desabo!
Por isso que, sem que eles saibam, eu rezo pela vida deles. E me envergonho, porque essa minha prece , em
sntese, dirigida ao meu bem estar. Ela , talvez, fruto do meu egosmo.
Por vezes, mergulho em pensamentos sobre alguns deles. Quando viajo e fico diante de lugares maravilhosos,
cai-me alguma lgrima por no estarem junto de mim, compartilhando daquele prazer
Se alguma coisa me consome e me envelhece que a roda furiosa da vida no me permite ter sempre ao meu
lado, morando comigo, andando comigo, falando comigo, vivendo comigo, todos os meus amigos, e,
principalmente os que s desconfiam ou talvez nunca vo saber que so meus amigos!
A gente no faz amigos, reconhece-os.
Agradecimentos
Terei sempre que agradecer em primeiro lugar a Professora Doutora Maria Elisa Pereira
Bastos de Siqueira, minha eterna orientadora, por ter guiado os primeiros passos de minha vida como
analista/toxicologista. Ter sempre minha eterna gratido e devoo.
Ao meu irmo Thiago Luiz da Costa, por ter ficado todo este tempo sem computador s para que
um pudesse terminar esta dissertao. Mano, muitssimo obrigado.
A toda famlia do Ncleo de Anlise Instrumental do Instituto de Criminalstica de
So Paulo: Alessandra (minha irm mais velha), Cristiane, Ftima, Milton Sadawo,
Nilza, Valria Furlan e Valria Reis, pelo apoio e por todas as vezes que vocs se desdobraram para
cobrir minhas ausncias no laboratrio. Agradeo de forma ainda mais especial e carinhosa a minha chefe,
Dra. Lucilena Martins Kayo, sempre conivente com minhas ausncias e pronta para ajudar quando
precisei.
A Profa. Dra. Maria de Ftima Menezes Pedrozo e a Profa. Dra. Pierina
Sueli Bonato pelos importantes apontamentos e sugestes cedidos durante o exame de qualificao.
Ao Dr. Jos Jarjura Jorge Jnior, Diretor do Instituto Mdico-Legal de So
Paulo, por permitir a coleta das amostras junto ao Ncleo de Toxicologia Forense. Do mesmo modo,
agradeo aos Peritos Criminais Dra. Vera Eliza Reinhardt, Dr. Erasmo Soares de Silva
e Dra. Clarice Caladoi, por colaborarem para a coleta do material.
As funcionrias do Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas da Faculdade de
Cincias Farmacuticas (USP) Dalva, Luzia, Roseli, Helena e Karla (SBTOX)
pelo imprescindvel apoio tcnico, pelo sempre delicioso caf e pelas conversas descontradas.
Aos meus eternos amigos da poca de Alfenas, Elisngela, Fernanda, Flvio, Gilson,
Ingrid, Nader, Ricardo, Roniel, Tatiane, Tiago (Bixo) e Waldir, pelos inesquecveis
momentos de risos e festas que passamos juntos, lembranas que sempre me do foras para seguir em frente.
Mesmo longe dos olhos, estaro sempre perto do meu corao.
Aos meus novos bons companheiros, Cssia, Emerson (Camb), Fausto (Frodo), Igo
(Naja), Jos Antnio (Pernambuco), Jos Roberto (Zero), Luiz Fernando (Nando) e
Mrcio (Astrinho), por terem me acolhido para esta turma animada.
A minhas amigas Danielle e Renata, pelas discusses e sugestes que enriqueceram este trabalho.
A Erica, presena importante nesta reta final, por todas as sugestes, comentrios e pelas vrias
vezes que leu e releu esta dissertao.
A todos que contriburam de alguma forma para a execuo deste trabalho, Muito obrigado
Sumrio
1. INTRODUO
01
2. GENERALIDADES
03
2.1. Histrico
03
04
13
3. TOXICOCINTICA
16
16
17
22
4. TOXICODINMICA
4.1. Mecanismos de ao das metilenodioxianfetaminas sobre o
Sistema Nervoso Central
4.2. Sinais e sintomas da intoxicao
25
25
28
4.2.1. Hepatotoxicidade
35
4.2.2. Nefrotoxicidade
38
4.2.3. Neurotoxicidade
42
5. ASPECTOS ANALTICOS
45
49
48
54
57
7. MATERIAIS E MTODOS
58
7.1. Material
58
58
59
60
60
60
7.1.4. Solues-padro
61
62
62
62
62
62
63
63
7.2. Mtodos
7.2.1. Procedimentos de extrao
7.2.1.1. Tcnica proposta para extrao de MDMA, MDEA e
MDA em sangue total
7.2.1.2. Tcnica proposta pra extrao de MDMA, MDEA e
MDA em urina
63
63
63
64
67
67
67
68
68
68
69
70
70
70
72
74
76
77
77
81
81
81
extrao
8.3. Preparao das curvas analticas
83
83
85
88
91
94
9. DISCUSSO
95
10. CONCLUSES
108
109
Lista de Tabelas
Tabela 1 Uso concomitante do Ecstasy com outras drogas de abuso por usurios da 04
cidade de So Paulo (n=52), entrevistados entre os meses de junho e agosto de 1999.
Tabela 2 Mtodos analticos utilizados nas anlises de derivados anfetamnicos.
43
Tabela 3 - Tempo de reteno, reteno relativa, fator de reteno e simetria dos picos 72
cromatogrficos obtidos para os analitos e padro interno.
Tabela 4 - Parmetros cromatogrficos utilizados para avaliar a eficincia na separao 72
dos analitos nas condies cromatogrficas propostas.
Tabela 5 - Efeito da adio de cloreto de sdio sobre o processo de extrao de MDMA, 76
MDEA e MDA em urina, avaliado atravs de suas respectivas reas relativas.
Tabela 6 - Mdias das reas absolutas e relativas obtidas aps anlise de amostras de 76
sangue total enriquecidas (concentrao de 50 ng/mL) que sofreram processo de
precipitao ou diluio antes do procedimento de extrao.
Tabela 7 - reas relativas obtidas para a elaborao das curvas analticas dos analitos em 77
sangue total e respectivos coeficientes de variao (%CV).
Tabela 8 - reas relativas obtidas para a elaborao das curvas analticas dos analitos em 80
urina e respectivos coeficientes de variao (%CV).
Tabela 9 - Coeficientes de variao das concentraes sangneas e urinrias de MDMA, 83
MDEA e MDA obtidos nos ensaios de preciso intra e inter-ensaio.
Tabela 10 Exatido e recuperao dos mtodos propostos para anlise de MDMA, 84
MDEA e MDA em amostras de sangue total e urina, avaliados em diferentes
concentraes.
Lista de Figuras
Figura 1. Estrutura qumica das metilenodioxianfetaminas de maior interesse forense.
03
3.
Quantidade
apreendida
tendncias
do
trfico
mundial
de 09
18
61
73
Figura 11. Cromatograma de amostra de sangue total referncia negativa enriquecida com 73
MDMA, MDEA e MDA na concentrao de 50 ng/mL e padro interno (MBDB
100 ng/mL).
Figura 12. Cromatograma de amostra de urina referncia negativa enriquecida com padro 74
interno MBDB na concentrao de 500ng/mL.
Figura 13. Cromatograma de amostra de urina referncia negativa enriquecida com 74
MDMA, MDEA, MDA e MBDB na concentrao de 500 ng/mL.
Figura 14. Efeito da adio de cloreto de sdio (NaCl) sobre o processo de extrao do 75
MDMA, MDEA e MDA em sangue total.
Figura 15. Representao da curva analtica para a determinao de MDMA nas 78
concentraes sanguneas de 5 a 200 ng/mL.
Figura 16. Representao da curva analtica para a determinao de MDEA nas 78
concentraes sanguneas de 5 a 200 ng/mL.
Figura 17. Representao da curva analtica para a determinao de MDA nas 79
concentraes sanguneas de 5 a 200 ng/mL.
Figura 18. Representao da curva analtica para a determinao de MDMA nas 80
concentraes urinrias de 50 a 2000 ng/mL.
Figura 19. Representao da curva analtica para a determinao de MDEA nas 81
concentraes urinrias de 50 a 2000 ng/mL.
Figura 20. Representao da curva analtica para a determinao de MDA nas 81
concentraes urinrias de 50 a 2000 ng/mL.
Figura 21. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps 86
ciclos de congelamento.
Figura 22. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps 87
armazenamento sob refrigerao (10C).
Figura 23. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps 88
armazenamento a temperatura ambiente (estabilidade de bancada).
Lista de Siglas
5-HIAA: cido 5-hidroxiindolactico
5-HT: 5-hidroxitriptamina ou serotonina
AN: anfetamina
CG: cromatografia gasosa
CG/DIC: cromatografia gasosa com deteco por ionizao em chama
CG/DNP: cromatografia gasosa com deteco terminica especfica (detector seletivo de
nitrognio e fsforo)
CG/EM: cromatografia gasosa acoplada a espectrmetro de massas
Cmx: concentrao plasmtica mxima
CV: coeficiente de variao
CYP2D6: citocromo P-450 isoforma 2 D 6
EC: eletroforese capilar
EC/DAD: eletroforose capilar com deteco por arranjo de diodos
EC/DF: eletroforese capilar com deteco por fluorescncia
EC/EM: eletroforese capilar acoplada a espectrmetro de massas
ELL: extrao lquido-lquido
FPIA: imunofluorescncia polarizada
HHA: 3,4-dihidroxianfetamina
HHMA: 3,4-dihidroximetanfetamina
HMA: 4-hidroxi-3-metoxianfetamina
HMMA: 4-hidroxi-3-metoximetanfetamina
HPLC: do ingls, high performance liquid chromatography - cromatografia lquida de alta
eficincia
HPLC/DAD: cromatografia lquida de alta eficincia com deteo por arranjo de diodos
HPLC/DF: cromatografia lquida de alta eficincia com deteo por fluorescncia
HPLC/EM: cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrmetro de massas
LD: limite de deteco
LQ: limite de quantificao
LSD: dietilamina do cido lisrgico
MA: metanfetamina
MBDB: N-metil-1-(3,4-metilenodioxifenil)-2-butamina
MDA: 3,4-metilenodioxianfetamina
MDEA: 3,4-metilenodioxietilanfetamina
MDMA: 3,4-metilenodioximetanfetamina
MDPA: 3,4-metilenodioxipropilanfetamina
NTF-IML/SP: Ncleo de Toxicologia Forense do Instituto Mdico Legal de So Paulo
PMA: para-metoxianfetamina
SPE: do ingls, solid phase extraction - extrao em fase slida
SPME: do ingls, solid-phase microextraction - microextrao em fase slida
t1/2: meia-vida eliminao
TCA: cido tricloroactico
Resumo
Resumo
COSTA, J. L. Determinao de 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA Ecstasy),
3,4-metilenodioxietilanfetamina
(MDEA
Eve)
3,4-
Abstract
COSTA, J. L. Determination of 3,4-methylenedioxymethamphetamine
(MDMA - Ecstasy), 3,4-methylenedioxyethylamphetamine (MDEA - Eve)
and 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA) in biological fluids by highperformance liquid chromatography: forensic aspect. So Paulo, 2004. 121p.
Dissertao de Mestrado - Faculdade de Cincias Farmacuticas - Universidade
de So Paulo.
There is a worldwide increase in the use of the synthetic drugs of abuse known
as designer drugs. The main representatives of this class are Ecstasy or
3,4-methylenodioxymethamphetamine
(MDMA)
and
Eve
or
3,4-
Introduo
1. INTRODUO
Introduo
Generalidades
2. GENERALIDADES
2.1. Histrico
tpicas.
Nesta
categoria
de
classificao
encontram-se
3,4-
CH3
H
NH
C
CH3
O
O
MDMA
CH
H 2 5
NH
C
CH3
O
O
MDEA
H
NH2
C
CH3
O
O
MDA
Generalidades
MDMA foi sintetizada em 1914 pelo laboratrio alemo Merck, com intuito de ser um novo
moderador de apetite (BEITIA et al., 2000; KALANT, 2001).
Nas dcadas de 1960 e 1970 a MDMA foi utilizada como parte do movimento New
Age para estimulao e elevao de experincias sensoriais. Entre o final da dcada de 1970 e
incio da dcada de 1980, foi sugerido o uso da MDMA como adjuvante na psicoterapia por
provocar um estado controlado de alterao da conscincia, auxiliando na diminuio das
barreiras psicolgicas e no estabelecimento de um vnculo entre o terapeuta e o paciente,
facilitando a comunicao entre eles (ALMEIDA; SILVA, 2003). Em julho de 1985, o U. S.
Drug Enforcement Administration (DEA) classificou a MDMA como substncia Schedule I,
que significa a sua presena na lista de substncias controladas consideradas de alto potencial
de abuso, sem benefcio teraputico/mdico e cujo uso apresenta riscos mesmo sob superviso
mdica, tornando seu uso ilegal no territrio norte-americano. Contriburam tambm para a
deciso do DEA o crescente nmero de artigos cientficos que atribuam ao seu anlogo,
MDA, significativa ao neurotxica (RICAURTE et al., 1985). Em 11 de fevereiro de 1986 a
Organizao Mundial da Sade e a Comisso de drogas entorpecentes da Organizao das
Naes Unidas seguiram a deciso do DEA, classificando internacionalmente a MDMA como
substncia pertencente a Scheudule I.
Generalidades
Estima-se que cerca de 0,2% da populao global com idade acima de 15 anos
consuma Ecstasy. Aproximadamente 40% do consumo mundial deste tipo de droga de abuso
ocorre na Europa, seguido pela Amrica do Norte onde cresce seu consumo, o mesmo
Generalidades
Generalidades
Tabela 1 Uso concomitante de Ecstasy com outras drogas de abuso por usurios da cidade
de So Paulo (n=52), entrevistados entre os meses de junho e agosto de 1999.
Maconha
43
82,7
Tabaco
32
61,5
LSD
16
30,8
Etanol
14
26,9
Cocana ou Crack
17,3
Anfetamina
5,8
5,8
7,7
Embora a produo de MDMA ocorra nos Estados Unidos, a maior parte da droga
consumida naquele pas ainda importada da Europa Ocidental. Estima-se que a Holanda,
Blgica e Luxemburgo sejam responsveis pela produo de 80% da MDMA consumida no
mundo (NIDA, 2001). Gimeno, Besacier e Chaudron-Thozet (2003), relataram que de acordo
com a Europol (European Police Office), durante o ano 2000 foram apreendidos 17,4 milhes
de comprimidos de Ecstasy nos pases membros da Unio Europia, o que corresponde a um
aumento de 50% quando comparado com o nmero de apreenses que aconteceram durante o
ano de 1999. Estes mesmo autores comentam ainda que este aumento apresenta-se de forma
mais pronunciada em pases como a ustria (420%), Finlndia (394%), Grcia (1803%),
Generalidades
Irlanda (163%), Itlia (86%), Holanda (50%), Espanha (64%) e Sua (152%) (GIMENO;
BESACIER; CHAUDRON-THOZET, 2003). A quantidade de comprimidos de Ecstasy
apreendidos pela polcia de Taiwan aumentou de 700 para 44650 gramas nos ltimos quatro
anos (SUE; LEE; HUANG, 2002).
Generalidades
Figura 2. Alteraes no consumo de metilenodioxianfetaminas (MDMA, MDEA, MDA) no mundo, 2001 (ou ltimo ano disponvel).
(Fonte: Global Illicit Drug Trends 2003 - Office on Drugs and Crime, United Nations, 2003) .
Generalidades
10
Generalidades
11
enzima CYP2D6, o que indica que a administrao concomitante dos dois frmacos pode
produzir efeitos adversos inesperados. Outros frmacos identificados durante as anlises dos
comprimidos incluem cafena, efedrina, pseudoefedrina e cido acetilsaliclico (NIDA, 2001).
Generalidades
12
Figura 3. Quantidade apreendida e tendncias do trfico mundial de metilenodioxianfetaminas (MDMA, MDEA, MDA) no binio
2001-2002. (Fonte: Global Illicit Drug Trends 2003 - Office on Drugs and Crime, United Nations, 2003).
Generalidades
13
A MDMA uma amina secundria, podendo ser encontrada na forma de base livre
(lquido de aspecto oleoso, insolvel em gua e solvel na maioria dos solventes orgnicos)
ou como sal de cidos (slido branco, hidrossolvel) (SHULGIN, 1986).
Generalidades
14
O
Safrol
Isosafrol
CH3CN
O
H3C
OH
NH
O
OH
N-acetil-MDA
Isosafrol glicol
Via III
LiAlH4
HBr
Via I
Via II
Piperonilmetilcetona
O
O
CH2H5
MDEA
O
N
CHO
H3C
N-formil-MDMA
CHO
MDPBP
N-formil-MDA
CH3NH2
O
Br
NH3
O
H
MDMA
CH3
MDA
Figura 4. Possveis vias de sntese da MDMA e seus anlogos a partir do safrol e isosafrol.
Generalidades
15
CH3
NH
CH3
5.
Posio
C2H5
NH
carbono
quiral
(asterisco
NH2
CH3
MDEA
do
CH3
MDMA
Figura
MDA
em
vermelho)
presente
nas
Toxicocintica
16
3. TOXICOCINTICA
Toxicocintica
17
Toxicocintica
18
NH
CH3
O
MDEA
3,4-metilenodioxietilanfetamina
N-desmetilao
CH3
NH2
N-desmetilao
CH3
NH
MDA
3,4-metilenodioxianfetamina
CH3
MDMA
3,4-metilenodioximetanfetamina
desmetilenao
desmetilenao
CH3
HO
HO
NH2
CH3
HO
HO
NH
CH3
HHMA
3,4-dihidroximetanfetamina
HMA
3,4-dihidroxianfetamina
O-metilao
O-metilao
CH3
CH3O
HO
NH2
CH3
HMA
4-hidroxi-3-metoxianfetamina
N-desmetilao
CH3O
HO
NH
CH3
HMMA
4-hidroxi-3-metoximetanfetamina
Toxicocintica
19
Toxicocintica
20
Toxicocintica
21
enzimas envolvidas neste processo: a manuteno de grupos metoxi nas posies 3 e 4 das
metilenodioxianfetaminas, promove aumento na afinidade destas molculas pela enzima
CYP2D6, quando comparado com os respectivos produtos O-desmetilados (GREEN et al.,
2003).
Toxicocintica
22
podem ocorrer at dois dias aps o uso. Alguns produtos de biotransformao da MDMA
possuem atividade farmacolgica, em especial a MDA, razo pela qual alguns efeitos do
Ecstasy podem durar mais do que o tempo de permanncia da MDMA no organismo
(KALANT, 2001). Ortuo et al. (1999), verificando a eliminao da MDMA e seus principais
produtos de biotransformao (MDA, HMMA, HMA), observaram que aproximadamente
50% da MDMA recuperada nas primeiras 24 horas, independente da dose administrada.
Enquanto a recuperao urinria da HMMA praticamente constante para todas as doses
estudadas, a recuperao da MDMA aumenta de maneira no-proporcional a dose
administrada, outro indicativo da no-linearidade da farmacocintica desta substncia
(GREEN et al., 2003). Como para todas as aminas, o pH urinrio influi decisivamente para a
excreo urinria, sendo que a acidificao da urina aumenta sua eliminao (FERIGOLO;
MEDEIROS; BARROS, 1998).
Estereoismeros so ismeros que diferem apenas pelo modo como seus tomos esto
dispostos no espao. Nesta categoria de isomerismo, encontra-se uma forma especial, que
ocorre quando um tomo individual, na maioria das vezes carbono, possui quatro substituintes
distintos. Neste caso, ocorrem duas espcies denominadas enantimeros, cujas estruturas
diferem apenas por serem imagens especulares no sobreponveis. Esses enantimeros
recebem denominaes distintas R ou S de acordo com sua configurao e (+) ou (-) devido
propriedade de promover a rotao de plano de luz polarizada para a direita ou esquerda,
respectivamente (ROMERO, 1998).
Toxicocintica
23
Toxicocintica
24
sangue, fgado, humor vtreo e bile de indivduos que morreram logo aps a ingesto de
Ecstasy.
Toxicodinmica
25
4. TOXICODINMICA
Toxicodinmica
26
H
C C NH2
H2
CH3
O
O
MDA
O
MDEA
OH
C C N CH3
H H2 H
HO
C2H5
H
C C NH
H2
CH3
MDMA
OH
HO
CH3
H
C C NH
H2
CH3
HO
HO
Adrenalina
C C NH2
H H2
HO
HO
Noradrenalina
H
C C NH2
H2
CH3
Anfetamina
C C NH2
H2 H2
Dopamina
CH3
H
C C NH
H2
CH3
Metanfetamina
Toxicodinmica
27
Toxicodinmica
28
relacionados aos efeitos alucingenos reportados, enquanto que o ismero S(+) estaria mais
relacionado com os efeitos semelhantes anfetamina. Os enantimeros diferem tambm
quanto a intensidade dos efeitos provocados, sendo que o ismero S(+) apresenta maior
potncia que o ismeros R(-). Neste aspecto a MDMA difere de outras anfetaminas
alucingenas, como a 2,5-dimetoxy-4-metilanfetamina (DOM), as quais invariavelmente so
mais ativas na forma levorotatria R(-) (GOWING et al., 2001).
Mesmo tendo reputao de droga segura, os efeitos agudos causados pelo uso do
Ecstasy (hipertermia, complicaes cardiovasculares, falncia renal e heptica) podem levar
morte (KRETH et al., 2000).
Toxicodinmica
29
Toxicodinmica
30
bizarros e repetitivos. Ocasionalmente estes sintomas podem levar a ataques de pnico, delrio
ou at episdios curtos de psicose (pouco freqentes) (FERIGOLO; MEDEIROS; BARROS,
1998; WEINMANN; BOHNERT, 1998; BAGGOTT; JEROME, 2001; KALANT, 2001).
Porquanto a MDMA seja considerado droga segura pelos usurios, este conceito
falso, pois alm de causar alteraes da percepo que comprometem a habilidade, por
exemplo, em dirigir, existem relatos de intoxicaes agudas envolvendo estas substncias,
etanol e outras drogas de abuso (WEINMANN; BOHNERT, 1998; TRAUB; HOFFMAN;
NELSON, 2002). O quadro clnico mais freqentemente associado intoxicao aguda por
Ecstasy caracterizado por leso heptica grave (podendo ocorrer necrose do tecido
heptico), hipertermia associada ou no rabdomilise, coagulao intravascular disseminada
e falncia renal. Outras complicaes freqentemente relatadas incluem hiponatremia, estupor
catatnico, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnide ou isquemia cerebral.
Concentraes sanguneas de MDMA superiores a 1000 g/mL so potencialmente fatais
enquanto que concentraes inferiores a 0,6 g/mL so capazes de levar a quadros de
intoxicao aguda (DE LETTER et al., 2004). As intoxicaes por MDMA ou MDEA no
podem ser diferenciadas clinicamente, mas apenas atravs de anlises toxicolgicas em
amostras de urina ou sangue (WEINMANN; BOHNERT, 1998).
Toxicodinmica
31
conhecidos. Interao com outras drogas ou adulterantes presentes nos comprimidos podem
interferir no metabolismo e nos efeitos txicos da MDMA. Finalmente, a farmacocintica
no-linear aumenta a possibilidade de que pequenos aumentos na dose de MDMA
administrada, venha a resultar num aumento desproporcional das concentraes sanguneas
posto que, como citado anteriormente, a eliminao no dose-dependente o que aumenta o
risco de intoxicaes (FREESE; MIOTTO; REBACK, 2002).
Outra ao da MDMA ocorre sobre a liberao hormonal, onde esta substncia leva a
um aumento dose-dependente da concentrao de cortisol, prolactina e do hormnio
adrenocorticotrfico, enquanto que as concentraes de hormnio do crescimento
permanecem inalteradas mesmo aps a administrao de 125 mg de MDMA (MAS et al.,
1999). Henry et al. (1998) demonstraram que mesmo em baixas doses (40 mg) a MDMA pode
induzir secreo de hormnio antidiurtico (vasopressina) em humanos, levando desta forma
a alteraes como aumento na reteno de fluidos, o que pode contribuir para a instalao do
quadro de hiponatremia (BAGGOTT; JEROME, 2001; SUE; LEE; HUANG, 2002).
Toxicodinmica
32
Toxicodinmica
33
Toxicodinmica
34
Toxicodinmica
35
Sue, Lee e Huang (2002) observaram ainda que, mulheres no perodo pr-menopausa
so mais susceptveis hiponatremia e a crises de epilepsia aps o uso de Ecstasy, uma vez
que os nveis de estrgeno parecem ter efeito sobre a resposta antidiurtica da vasopressina,
contribuindo para a eliminao de sdio. O quadro de hiponatremia pode ainda ser agravado
pelo consumo excessivo de gua que normalmente acompanha o uso de Ecstasy.
3.2.1. Hepatotoxicidade
O consumo de Ecstasy foi relatado como sendo a segunda causa mais freqente de
hepatotoxicidade na Espanha entre jovens de at 25 anos (ANDREU et al., 1998).
Toxicodinmica
36
As leses hepticas aparecem com maior freqncia entre os usurios que manifestam
quadro de hipertermia. Contudo, os danos hepticos nestes casos so causados em parte
devido ao efeito da temperatura corprea, e parte devido ao da MDMA e seus produtos de
biotransformao sobre o fgado. Estudos in vitro, conduzidos em condies experimentais
que simulavam a hipertermia com hepatcitos de camundongo, mostraram que a MDMA
aumenta a peroxidao lipdica e diminui a viabilidade das clulas hepticas (CARVALHO;
CARVALHO; BASTOS, 2001).
Toxicodinmica
37
estes autores observaram que a administrao repetida deste frmaco produziu quantidade
suficiente de radicais livres para causar depleo de glutationa, alm de observarem tendncia
na diminuio da atividade da enzima glutationa peroxidase. Durante o experimento de
administrao repetida de MDMA, os autores observaram ainda um aumento desproporcional
da atividade da enzima AST (aspartato aminotransferase) comparada com a atividade da ALT
(alanina aminotransferase). Este efeito freqentemente classificado como um importante
marcador de necrose celular (ELLIS et al., 1996; BEITIA et al., 2000).
3.2.2. Nefrotoxicidade
Nos ltimos anos, vrios casos de falncia renal secundria ao consumo de Ecstasy
tm sido relatados (BINGHAM et al., 1998; CARVALHO et al., 2002). A falncia renal
aguda pode ocorrer quando cogulos de fibrina/plaquetas ou de mioglobina, que so liberados
das clulas musculares lesadas, precipitam e bloqueiam os tbulos renais. A desidratao
facilita o desenvolvimento deste tipo de problema renal e pode levar ao acmulo de
substncias, que deveriam ser depuradas e eliminadas no sangue, podendo causar danos
secundrios a outros tecidos ou rgos (BAGGOTT; JEROME, 2001; CARVALHO et al.,
2002). Segundo Baggott e Jerome (2001), a falncia renal aguda ocorre em 24% dos usurios
de Ecstasy que apresentam quadro de hipertermia. Ocorre tambm nos casos onde ocorreu
rabdomilise, mas que no houve evidncia de hipertermia. Este processo pode culminar em
isquemia renal sbita e/ou necrose tubular aguda (CARVALHO et al., 2002).
Toxicodinmica
38
3.2.3. Neurotoxicidade
Toxicodinmica
39
seus
anlogos
possuam mecanismo
Toxicodinmica
40
Toxicodinmica
41
Aspectos Analticos
42
5. ASPECTOS ANALTICOS
Aspectos Analticos
43
material biolgico
analito
extrao
tcnica analtica
referncia
cabelo
SPME
CG/EM
saliva
SPME
CG/EM
urina
SPME
CG/FID
urina
EEL
CG/EM
sangue, urina
SPE
CG/EM e EC/DAD
cabelo
SPE
CG/EM
saliva, plasma
SPE
CG/EM
urina
SPME
CG/EM
plasma, soro
SPE
CG/EM e CG/DNP
plasma
MDMA, MDA, NA
SPE
CG/DNP
plasma, urina
SPE
CG/DNP
urina
SPME
CG/EM
comprimidos
diluo
CG/DNP e CG/EM
MDEA, MDMA
ELL; SPE
CG/EM
sangue total
ELL
CG/EM
cabelo
SPE
CG/EM
SPE
CG/EM e CG/DNP
Aspectos Analticos
44
Continua
urina
urina, sangue, fgado, bile,
humor vtreo
cabelo, unha
SPME
CG/EM
MDMA, MDA
ELL/SPE
CG/EM
ELL
CG/EM
HPLC/DAD e
CG/EM
plasma, urina
SPE
HPLC/DF
MDMA, MDA
ELL
HPLC/DF
sangue, crebro
SPE
HPLC/DF
SPE
HPLC/EM-EM
plasma
SPE
HPLC/DF
ELL
HPLC/DF
ELL
HPLC/DF
microssomas heptico
MDMA, MDA
injeo direta
HPLC/DF
soro, urina
ELL
comprimidos
plasma
urina
urina
urina
urina
plasma, urina
SPE
dissoluo
ELL
ELL
HPLC/DAD e
HPLC/EM
HPLC/DAD
HPLC/DAD
EC/DF
SPE, ELL
ELL
SPE
EC/DAD
EC/EM
EC/DAD
Aspectos Analticos
45
Aspectos Analticos
46
O contedo estomacal pode constituir amostra de anlise post-mortem, uma vez que
prevalece no estmago a forma inalterada (CHASIN, 1990) e ionizada (aprisionamento
farmacocintico) das metilenodioxianfetaminas, que podem estar presentes tanto na forma de
resduos da droga ingerida quanto pela possvel secreo gstrica, posto que base fraca e
passvel de ser secretada para o lmem estomacal, onde se ioniza e permanece at a posterior
reabsoro no duodeno (DE LETTER et al., 2002). Humor vtreo, fragmentos de tecido
muscular e vsceras como fgado, rins e crebro tambm so materiais utilizados nos casos de
necropsia (WEINMANN; BOHNERT, 1998; CLAUWAERT et al., 2000; DE LETTER et al.,
2002).
A verificao do uso de drogas de abuso por anlise de cabelo uma ferramenta til
para demonstrar ou excluir a suspeita de uso crnico. Como amostra biolgica, o cabelo
fornece vantagens particulares como facilidade de obteno, coleta no invasiva, sem violao
da privacidade, maior dificuldade para adulterao, janela de deteco ampla (vrios meses) e,
principalmente, dispensa cuidados especiais durante o transporte e armazenamento, o que
favorece a estabilidade dos analitos (KINTZ; SAMYN, 1999; SKENDER et al., 2002;
GENTILI; CORNETTA; MACCHIA, 2004). As principais desvantagens do uso de cabelo
como matriz biolgica para a verificao do uso de drogas de abuso com aspecto forense a
falta de correlao entre a dose e a concentrao do frmaco no cabelo, que impede qualquer
Aspectos Analticos
47
Aspectos Analticos
48
Somente esto disponveis para a difuso para a saliva os frmacos que no estiverem
livre na circulao sangunea, ou seja, aqueles que no estiverem ligados a protenas
plasmticas. Assim, a baixa taxa de ligao a protenas (aproximadamente 20%) da MDMA e
seus anlogos somado ao baixo peso molecular destes compostos, confere a estas substncias
passagem praticamente irrestrita entre o plasma e a saliva (NAVARRO et al., 2001).
semelhana do que acontece no contedo estomacal, e por serem estas substncias bases
fracas com elevado pKa e sendo o pH da saliva mais cido do que o pH sanguneo, o que
promove a ionizao dos compostos e impede a difuso para o plasma, resultando em
acmulo na saliva. Samyn et al. (2002), durante um estudo controlado onde foram
administrados 75 mg de MDMA a voluntrios, observaram que as concentraes de MDMA
na saliva geralmente so superiores s concentraes plasmticas, fato tambm observado por
Navarro et al. (2001). Estes autores observaram ainda que as concentraes do frmaco na
saliva apresenta grande variabilidade interindivdual e atribuem esta variao viscosidade e
volume da amostra, que podem ser diferentes mesmo intra-indivduo. Navarro et al. (2001)
observaram que o pico de eliminao da MDA na saliva ocorre entre 1,5-4 horas aps a
ingesto de MDMA e sua concentrao representa aproximadamente 5% da concentrao
salivaria do frmaco inalterado. J os nveis plasmticos deste produto de biotransformao
apresenta concentrao mxima entre 5-6 horas aps a administrao.
Aspectos Analticos
49
Aspectos Analticos
50
Aspectos Analticos
51
fase orgnica pode ser aumentada pelo ajuste de pH (que ir prevenir a ionizao das
substncias de interesse). As metilenodioxianfetaminas, por serem bases fracas (pKa maior do
que 8,5), so melhor extradas de fluidos biolgicos por solventes orgnicos se o pH da fase
aquosa for ajustado a valores em torno de 9,0. Muitos artigos na literatura internacional
mencionam a utilizao da ELL, principalmente devido sua simplicidade (CIRIMELE;
KINTZ; MANGIN, 1995; MOORE et al., 1996; WEINMANN; BOHNERT, 1998;
CLAUWAERT; BOCXLAER; LEENHEER, 2001; DE LETTER et al., 2002).
Aspectos Analticos
52
Aspectos Analticos
53
se
busque
compostos
similares
aos
analitos.
Durante
as
anlises
de
3,4-metilenodioxipropilanfetamina
(MDPA)
(CLAUWAERT;
BOCXLAER;
Aspectos Analticos
54
Estas tcnicas apresentam vrias limitaes como reaes cruzadas entre compostos
anfetamnicos, o alto valor de cut-off que permite deteco apenas do uso recente da droga de
abuso; possibilidade de resultados falso positivos com frmacos como efedrina e ranitidina,
(BOGUSZ; KALA; MAIER, 1997; BATTU et al., 1998; PELLEGRINI et al., 2002) e
Aspectos Analticos
55
finalmente, estes ensaios apresentam custo considervel o que inviabiliza sua utilizao na
rotina dos laboratrios forenses do Brasil.
Aspectos Analticos
tcnica
dispensa
56
etapa
prvia
de
derivao,
necessria
para
anlise
de
Nos ltimos anos, a eletroforese capilar (EC) vem ganhando espao e se consagrando,
semelhana da cromatografia em fase gasosa ou lquida, como tcnica de separao de
grande utilidade para anlises de frmacos em materiais biolgicos. Diferentemente das
tcnicas cromatogrficas, na eletroforese a separao dos compostos ocorre sob influncia de
um campo eltrico. Na EC, as separaes so conduzidas em tubos capilares com dimenses
de 15 a 100 m de dimetro e 30 a 100 cm de comprimento, preenchidos com um eletrlito
condutor e submetido ao de um campo eltrico elevado (THORMANN et al., 1998;
PIZARRO et al., 2002; LIMA, 2003).
57
Materiais e Mtodos
58
7. MATERIAIS E MTODOS
7.1. Material
- frascos mbar com capacidade de 2,0 mL, septos de silicone e tampas de rosca
Hewlett Packard;
Materiais e Mtodos
59
- conjunto para filtrao a vcuo composto de funil, base e tampa tubulada em vidro
borosilicato e garra de alumnio anodizado, Millipore;
Materiais e Mtodos
60
Eluente B: acetonitrila.
A fase mvel utilizada nas anlises foi composta de mistura isocrtica na proporo
60% (v/v) do eluente A e 40% do eluente B. A fase mvel foi filtrada atravs de filtro
Millipore 0,45 m e degaseificada sob vcuo antes do uso.
Materiais e Mtodos
61
7.1.4. Solues-padro
Solues-padro
de
3,4-metilenodioximetanfetamina
(MDMA),
3,4-
(MBDB,
padro
interno)
na
concentrao
de
1,0 mg/mL em metanol foram obtidas da Cerilliant, Round Rock, TX, USA.
Materiais e Mtodos
62
Materiais e Mtodos
63
O tratamento estatstico dos resultados obtidos foi feito atravs dos softwares
de computador Microsoft Excel 2000 e Microcal Origin 6.0.
7.2. Mtodos
Materiais e Mtodos
64
Materiais e Mtodos
65
Materiais e Mtodos
66
Materiais e Mtodos
67
k=
Materiais e Mtodos
68
k2
k1
Rs =
2 (dr2 - dr1)
wb1 + wb2
Onde: dr1 e dr2 representam a distncia ou tempo de reteno dos dois picos avaliados;
Materiais e Mtodos
69
Para as anlises em sangue total, este efeito foi avaliado pela adio de quantidades
crescente de NaCl (0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 gramas) em amostras referncia negativas
enriquecidas com os analitos na concentrao de 50 ng/mL. Para as anlises em urina, foi
verificado se havia diferena significativa entre a mdia das reas relativas obtidas aps a
extrao sem a adio de NaCl e a mdia das reas relativas obtidas quando foram
adicionados 2,0 g do sal. Para este estudo foram utilizadas amostras de urina referncia
negativas enriquecidas na concentrao de 500 ng/mL.
Nas anlises de sangue total foi avaliado o efeito da precipitao proteica pelo uso de
soluo aquosa de cido tricloroactico 20% (m/v) (TCA 20%). Estes estudos foram
conduzidos em amostras de sangue total referncia negativa enriquecidas, em triplicata, com
solues de trabalho dos analitos de tal forma que a concentrao final foi de 50 ng/mL.
A 2 mL destas amostras foi adicionado 1 mL da soluo de TCA 20%, sendo o tubo ento
agitado por 30 segundos em vortex e centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos. O
sobrenadante obtido neste processo (de aspecto lmpido e transparente) foi utilizado no
procedimento descrito no item 7.2.1.1..
Materiais e Mtodos
70
Amostras de urina que apresentaram resultado positivo para anfetaminas pela tcnica
de Imunofluorescncia Polarizada (FPIA) foram obtidas no Laboratrio de Anlises
Toxicolgicas do Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas/FCF/USP e submetidas
ao procedimento descrito no item 7.2.1.2..
As curvas analticas para os mtodos propostos foram feitas atravs das anlises de
amostras de sangue total e urina referncia negativa s quais foram adicionadas solues de
Materiais e Mtodos
71
Sangue total
Foi preparado um pool de amostras referncia negativa de sangue total e que, aps a
separao em alquotas, cada uma delas foi enriquecida com 50 L das solues de trabalho,
para a obteno dos calibradores nas concentraes 5, 10, 25, 50, 100 e 200 ng/mL (n=6 para
cada um dos calibradores). As alquotas foram submetidas aos procedimentos descritos no
item 7.2.1.1. A curva analtica foi obtida pela projeo das concentraes de cada um dos
analitos (MDMA, MDEA e MDA) no eixo das abscissas e das relaes de reas referentes a
cada um deles e padro interno (MBDB) no eixo das ordenadas, utilizando-se a regresso
linear pelo mtodo dos mnimos quadrados para a obteno da equao da reta. A linearidade,
definida como a capacidade do mtodo gerar resultados proporcionais da espcie em estudo,
foi avaliada atravs do coeficiente de determinao (r2) da curva (CHASIN et al., 1998).
Urina
Materiais e Mtodos
72
em estudo, foi avaliada atravs do coeficiente de determinao (r2) da curva (CHASIN et al.,
1998).
O limite de quantificao (LQ) foi determinado como a menor concentrao que pde
ser determinada com preciso e exatido adequada (coeficiente de variao < 20%)
(GOLDBERGER; HUESTIS; WILKINS, 1997; CHASIN et al., 1998).
Materiais e Mtodos
73
parmetro avalia a proximidade entre vrias medidas efetuadas em uma mesma amostra
(CAUSON, 1997; GOLDBERGER; HUESTIS; WILKINS, 1997; CHASIN et al., 1998).
Neste estudo, a preciso intra-ensaio foi determinada atravs da anlise, em um mesmo dia, de
seis replicatas de amostras de sangue total e urina enriquecidas e adicionadas de padro
interno. Para determinao da preciso inter-ensaio foram analisadas, em cinco dias
diferentes, trs replicatas de amostras de sangue total nas concentraes de 5, 50 e 200 ng/mL
e urina nas concentraes de 50, 500 e 2000 ng/mL. Em ambos os casos a impreciso foi
calculada atravs do coeficiente de variao (CV) das reas relativas (razo entre rea
absoluta dos analitos e a rea absoluta do padro interno).
Exatido
% Inexatido =
Materiais e Mtodos
74
Recuperao
Materiais e Mtodos
75
Materiais e Mtodos
76
As amostras de sangue total e urina descritas nos itens 7.1.5.2. e 7.1.6.2. foram
submetidas aos procedimentos descritos em 7.2.1.1. e 7.2.1.2. Os critrios adotados para as
amostras que eventualmente fornecessem concentraes fora dos valores pr-estabelecidos
para a curva analtica (intervalo dinmico) seria o de diluir com matriz biolgica referncia
negativa e proceder a re-anlise (CAUSON, 1997).
Resultados
77
8. RESULTADOS
Resultados
78
Tabela 3 - Tempo de reteno, reteno relativa, fator de reteno e simetria dos picos
cromatogrficos obtidos para os analitos e padro interno.
Analito
Tempo de reteno
(mim)
Reteno relativa*
Simetria
MDA
8,035
0,631
7,035
0,867
MDMA
9,768
0,767
8,768
0,781
MDEA
11,490
0,903
10,490
0,806
MBDB
12,729
1,000
11,729
0,867
Tempo de reteno do analito dividido pelo tempo de reteno do padro interno (MBDB).
Fator de separao ()
Resoluo (Rs)
MDA/MDMA
1,246
3,022
MDMA/MDEA
1,196
2,423
MDEA/MBDB
1,118
1,548
Resultados
79
Figura 11. Cromatograma de amostra de sangue total referncia negativa enriquecida com
MDMA, MDEA e MDA na concentrao de 50 ng/mL e padro interno (MBDB-100 ng/mL).
Resultados
80
Figura 12. Cromatograma de amostra de urina referncia negativa enriquecida com padro
interno MBDB na concentrao de 500ng/mL.
Figura 13. Cromatograma de amostra de urina referncia negativa enriquecida com MDMA,
MDEA, MDA e MBDB na concentrao de 500 ng/mL.
Resultados
81
Foi observado que a adio de 2,0 g de cloreto de sdio melhorou o rendimento dos
procedimentos de extrao dos analitos em sangue total (Figura 14) fornecendo valores de
rea relativa 20,7%, 12,3% e 14,1% para o MDMA, MDEA e MDA, respectivamente. A
adio de cloreto de sdio tambm melhorou o rendimento dos procedimentos de extrao dos
analitos presentes na urina, como pode ser observado na Tabela 5.
1,800
1,600
rea relativa
1,400
1,200
1,000
0,800
0,600
0
0,5
1,5
2,5
MDMA
MDEA
Figura 14. Efeito da adio de cloreto de sdio (NaCl) sobre o processo de extrao da
MDMA, MDEA e MDA em sangue total.
8.2.2. Avaliao da precipitao proteica sobre o rendimento da extrao
Resultados
82
Aumento no valor da
MDMA
0,930
1,004
8,0
MDEA
0,876
0,893
1,9
MDA
0,860
1,052
22,3
Tabela 6 - Mdias das reas absolutas e relativas obtidas aps anlise de amostras de sangue
total enriquecidas (concentrao de 50 ng/mL) que sofreram processo de precipitao ou
diluio antes do procedimento de extrao.
Diluio com soluo fisiolgica
Analito
rea absoluta
rea relativa*
rea absoluta
rea relativa*
MDMA
176,2
0,616
103,0
0,887
MDEA
191,3
0,668
99,9
0,860
MDA
150,3
0,525
62,5
0,536
MBDB
286,5
1,000
116,4
1,000
rea absoluta do analito dividida pela rea absoluta do padro interno (MBDB).
Resultados
83
As curvas analticas (Figuras 15, 16, 17) foram obtidas atravs dos dados apresentados
na Tabela 7. A equao de regresso linear foi estabelecida pelo mtodo dos mnimos
quadrados e ser utilizada na quantificao da MDMA, MDEA e MDA em amostras de
sangue total selecionadas para anlise.
Tabela 7 - reas relativas obtidas para a elaborao das curvas analticas dos analitos em
sangue total e respectivos coeficientes de variao (%CV).
rea relativa dos analitos
Concentrao (ng/ml)
MDA
MDEA
CV* (%)
0,041
18,98
0,042
10,77
0,038
18,74
10
0,130
6,53
0,156
12,12
0,109
5,22
25
0,335
4,52
0,384
5,55
0,290
5,03
50
0,585
3,41
0,626
6,74
0,499
3,23
100
1,211
3,56
1,312
3,77
1,050
3,38
200
2,246
2,08
2,610
3,00
2,119
0,74
Coeficiente de variao.
Resultados
84
Figura 16. Representao da curva analtica para a determinao de MDEA nas concentraes
sanguneas de 5 a 200 ng/mL.
Resultados
85
Figura 17. Representao da curva analtica para a determinao de MDA nas concentraes
sanguneas de 5 a 200 ng/mL.
As curvas analticas (Figuras 18, 19 e 20) foram obtidas atravs dos dados
apresentados na Tabela 8. A equao de regresso linear foi estabelecida pelo mtodo dos
mnimos quadrados e ser utilizada na quantificao da MDMA, MDEA e MDA em amostras
de urina selecionadas para anlise.
Resultados
86
Tabela 8 - reas relativas obtidas para a elaborao das curvas analticas dos analitos em
urina e respectivos coeficientes de variao (%CV).
rea relativa dos analitos
Concentrao (ng/mL)
MDA
50
0,140
8,96
0,149
16,21
0,124
12,74
100
0,256
8,82
0,248
7,18
0,233
10,26
200
0,475
8,58
0,440
7,32
0,407
5,52
500
1,140
6,30
1,044
5,77
0,937
4,24
1000
2,235
4,43
2,080
5,18
2,006
2,95
2000
3,350
6,08
3,566
4,09
3,638
2,98
Coeficiente de variao.
Resultados
87
Figura 19. Representao da curva analtica para a determinao de MDEA nas concentraes
urinrias de 50 a 2000 ng/mL.
Figura 20. Representao da curva analtica para a determinao de MDA nas concentraes
urinrias de 50 a 2000 ng/mL.
Resultados
88
O limite de deteco para a tcnica de extrao proposta para a anlise em sangue total
foi de 3 ng/mL para os trs analitos. Para a anlise em urina os valores de limite de deteco
foram de 10 ng/mL, 15 ng/mL e 20 ng/mL para a MDA, MDMA e MDEA, respectivamente.
Exatido
Recuperao
Resultados
89
Tabela 9 - Coeficientes de variao das concentraes sangneas e urinrias de MDMA, MDEA e MDA obtidos nos ensaios de preciso intra e
inter-ensaio.
Concentraes sanguneas
Concentraes urinrias
5 ng/mL
50 ng/mL
200 ng/mL
50 ng/mL
500 ng/mL
2000 ng/mL
MDMA
10,77
6,74
3,00
6,85
2,05
2,84
MDEA
18,74
3,23
0,74
12,03
3,53
2,07
MDA
12,98
3,41
2,08
6,69
2,49
3,74
MDMA
16,55
11,60
8,52
16,21
5,77
4,09
MDEA
15,78
9,75
4,65
12,74
4,24
2,98
MDA
14,45
13,10
7,82
8,96
3,00
6,08
Coeficiente de variao.
Resultados
90
Tabela 10 Exatido e recuperao dos mtodos propostos para anlise de MDMA, MDEA e MDA em amostras de sangue total e urina,
avaliados em diferentes concentraes.
Concentraes sanguneas
Concentraes urinrias
5 ng/mL
50 ng/mL
200 ng/mL
50 ng/mL
500 ng/mL
2000 ng/mL
MDMA
4,8
52,1
199,0
42,2
425,2
1860,0
MDEA
4,6
47,1
197,2
45,0
545,5
1916,0
MDA
5,0
49,9
199,2
48,5
541,0
2010,0
MDMA
67,77
72,11
71,35
86,88
87,11
91,14
MDEA
82,13
85,07
77,02
83,91
88,94
87,81
MDA
90,35
76,33
90,67
91,64
90,08
92,86
Exatido(ngml)
Recuperao (%)
Resultados
91
Resultados
92
0,25
0,23
0,21
rea relativa
0,19
0,17
0,15
0,13
0,11
0,09
0,07
0,05
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
tem po (dias)
MDA
MDMA
MDEA
Figura 21. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps
ciclos de congelamento.
Resultados
93
0,25
0,23
0,21
rea relativa
0,19
0,17
0,15
0,13
0,11
0,09
0,07
0,05
0
tempo (dias)
MDA
MDMA
MDEA
Figura 22. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps
armazenamento sob refrigerao (10C).
0,18
0,17
0,16
rea relativa
0,15
0,14
0,13
0,12
0,11
0,1
0,09
0,08
0
tempo (dias)
MDA
MDMA
MDEA
Figura 23. Representao grfica dos resultados obtidos nos estudos de estabilidade aps
armazenamento a temperatura ambiente (estabilidade de bancada).
Resultados
94
Discusso
95
9. DISCUSSO
Como j foi descrito anteriormente, este trabalho teve por objetivo apresentar
metodologia analtica que possibilite aos laboratrios de toxicologia forense, estabelecer um
diagnstico laboratorial inequvoco da utilizao de Ecstasy e Eve atravs da anlise de seus
princpios ativos MDMA e MDEA, respectivamente. Para complementar estas anlises,
optou-se ainda pela quantificao da MDA, produto de biotransformao originado pela
desmetilao dos frmacos citados acima e eliminado na urina na forma livre (sem
conjugao com radicais hidroflicos).
A relevncia deste trabalho reside no fato de que, conforme mostrado no relatrio
elaborado pela Organizao das Naes Unidas (ONU), ainda no existe no Brasil qualquer
informao sobre o consumo de metilenodioxianfetaminas (UNODC, 2003). O aumento no
nmero de apreenses de comprimidos de Ecstasy pela Polcia no Estado de So Paulo e no
Brasil so indicativos da tendncia de aumento na prevalncia e incidncia do consumo ilcito
de designer drugs (UNODC, 2003). A correspondente morbidade e at mesmo a mortalidade
relacionada a este consumo no pode ser verificada, a menos que o laboratrio forense tenha
disposio metodologia apropriada e criteriosamente validada para que o resultado emitido
seja inequvoco e conseqentemente incontestvel (CHASIN, 2001).
Assim, para no comprometer a exeqibilidade da anlise, os critrios utilizados na
escolha da metodologia a ser testada, aps reviso da literatura cientfica, procuraram na
medida do possvel se adequar s condies tcnicas, a serem disponibilizadas nos
laboratrios de toxicologia forense do pas.
As intoxicaes por MDMA ou MDEA no podem ser diferenciadas atravs da
sintomatologia clnica, rigorosamente semelhante para os dois frmacos. Esta diferena pode
ser estabelecida com relativa facilidade atravs de anlises toxicolgicas em amostras de urina
ou sangue onde se pesquise a presena dos frmacos inalterados. Se considerarmos que os
comprimidos vendidos como Ecstasy possuem apenas MDMA em sua composio e os
comercializados com Eve contenham apenas a MDEA, espera-se que durante a realizao dos
Discusso
96
Discusso
97
principalmente
de
doenas
cardacas
pr-existentes,
complicaes
desenvolvimento
da
metodologia
para
separao
identificao
das
Discusso
98
Discusso
99
Discusso
100
todos os analitos), podendo perfeitamente ser aplicada por qualquer laboratrio forense. As
principais desvantagens observadas durante o emprego deste tipo de extrao foram a
dificuldade de automao do processo, formao de emulses (principalmente com as
amostras de sangue total) o que demandou a insero de etapa de diluio do material
biolgico antes da partio com solvente orgnico, grande consumo de tempo e o emprego de
solventes orgnicos que apresentam riscos ao meio ambiente e a sade do analista caso as
anlises no sejam conduzidas de acordo com boas prticas de conduta e manipulao de
substncias txicas, como a utilizao de capela de exausto, luvas, mscara e culos de
proteo.
Discusso
101
Como j havia sido mencionado por outros autores, antes da etapa de concentrao do
extrato, foi necessria a acidificao da fase orgnica com soluo metanlica de cido
clordrico
para
que
ocorresse
converso
das
formas
bsicas
das
O padro interno utilizado nas anlises, o N-metil-1-(3,4-metilenodioxifenil)-2butamina (MBDB), mostrou-se adequado, pois apresenta grande semelhana estrutural e
fsico-qumica com os analitos. Mesmo sendo classificado como designer drug, o MBDB
raramente encontrado como adulterante dos comprimidos de Ecstasy e Eve (SHERLOCK et
al., 1999; BAGGOTT et al., 2000), e sua presena nunca foi detectada em comprimidos
apreendidos no Estado de So Paulo.
Discusso
102
quantidade mxima de 2,0 g do sal para a MDMA e 2,5 g para a MDA e MDEA, valores a
partir dos quais comea a haver diminuio do rendimento do procedimento.
Esta melhora no rendimento da extrao pela adio de cloreto de sdio ocorre porque
o sal diminui a solvatao dos analitos presentes no meio aquoso do material biolgico,
diminuindo sua solubilidade neste meio e facilitando sua partio para o solvente orgnico de
caractersticas apolares.
A diluio do sangue com soluo de cloreto de sdio 0,9% na proporo 1:1 (v/v)
conferiu maior fluidez matriz biolgica, permitindo maior contato desta com o solvente
orgnico durante a agitao e facilitando a separao entre as fases orgnica e aquosa aps a
centrifugao, que pode ser realizada a 2500 rpm durante 15 minutos. Alm disso, este
Discusso
103
procedimento mostrou melhores resultados do que a precipitao proteica, tendo em vista que
a precipitao das protenas presentes no sangue pelo uso de soluo TCA 20% forneceu
reas absolutas, tanto dos analitos como do padro interno, menores do que as reas obtidas
quando a matriz biolgica foi apenas diluda com soluo fisiolgica na proporo 1:1 (v/v).
Discusso
104
ainda menores do que os relatados por DE LETTER et al., (2002) e CLAUWAERT et al.,
(2000, 2001), que obtiveram LQ igual a 100 ng/mL.
Sempre que disponvel, a exatido de um mtodo analtico deve ser avaliada utilizando
amostras cuja concentrao dos analitos no material garantida por instituies
normatizadoras ou responsveis por programas de garantia da qualidade laboratorial
(amostras certificadas). Quando este tipo de material no disponvel, aceitvel que a
exatido do mtodo bioanaltico seja avaliada atravs do enriquecimento de amostras
Discusso
105
Embora seja o desejado que a recuperao do mtodo analtico seja o mais prximo
possvel de 100%, a obteno de valores inferiores no compromete o mrito do mtodo
desenvolvido, uma vez que se pode obter boa preciso e exatido mesmo que a recuperao
do mtodo seja moderada. Pelos resultados obtidos neste trabalho, pode-se afirmar que a
mistura n-hexano/acetato de etila (7:3, v/v) foi eficiente na extrao da MDMA, MDEA e
MDA presentes na matriz biolgica, fornecendo rendimentos sempre superiores a 67%,
mesmo durante a conduo das anlises em sangue total, matriz biolgica mais complexa e
difcil de ser manipulada em processos de extrao lquido-lquido.
Discusso
106
Discusso
107
achado coincide com os resultados obtidos durante dos estudos de Clauwaert, Bocxlaer e
Leenheer (2001), que citam que a MDMA possui boa estabilidade em amostras de sangue,
soro e urina, onde os pesquisadores no observaram degradao deste frmaco e seus
anlogos MDA e MDEA durante 13 semanas, quando os materiais foram armazenados em
baixas temperaturas (-20C).
Mesmo com o crescente aumento no consumo de Ecstasy no Brasil, fato que este uso
ainda muito inferior ao consumo de drogas como cocana e maconha. A no deteco de
metilenodioxianfetaminas nas amostras analisadas pode ser atribuda a fatores como pequeno
nmero de amostras, tanto em relao ao percentual no perodo estudado quanto em relao
ao nmero total de casos que do entrada ao laboratrio anualmente. Outra possibilidade seria
as circunstncias envolvidas nestes casos que so oriundos de exames de corpo de delito
(casos da clnica mdica) ou mortes a esclarecer. Nos casos de indivduos vivos poder-se-ia
conjeturar que as circunstncias normalmente associadas ao uso de Ecstasy (festas rave) no
apresentam relao pronunciada com episdios de envolvimento mdico-legal (situaes de
cunho policial). A aplicao de uma metodologia a um contingente maior de casos
provenientes da clnica mdica e ainda amostras oriundas de cadveres provenientes do
Instituto Mdico Legal, dever ser conduzida no sentido de se possibilitar inferncia sobre
este indicador populacional de uso.
Concluses
108
10. CONCLUSES
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