Sandra Mayumi Nishi FDFD

SANDRA MAYUMI NISHI
Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na

expresso de genes associados resposta
imune em tecidos de sunos
So Paulo
2004
SANDRA MAYUMI NISHI
Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de

genes associados resposta imune em tecidos de sunos
Tese apresentada ao Programa de Ps-graduao

em Epidemiologia Experimental e Aplicada s
Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinria
e Zootecnia da Universidade de So Paulo para a
obteno do ttulo de Doutor em Medicina
Veterinria
Departamento:
Medicina Veterinria Preventiva e Sade Animal
rea de Concentrao
Epidemiologia Experimental e Aplicada s
Zoonoses
Orientadora:
Profa. Dra. Solange Maria Gennari
So Paulo
2004
Autorizo a reproduo parcial ou total desta obra, para fins acadmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAO-NA-PUBLICAO

(Biblioteca da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo)
T. 1433
FMVZ
Nishi, Sandra Mayumi

Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de genes
associados resposta imune em tecidos de sunos / Sandra Mayumi Nishi.
So Paulo : S. M. Nishi, 2004.
149 f. : il.
Tese (doutorado) - Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina
Veterinria e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinria Preventiva
e Sade Animal, 2004.
Programa de Ps-graduao: Epidemiologia Experimental e Aplicada
s Zoonoses.
rea de concentrao: Epidemiologia Experimental e Aplicada s
Zoonoses.
Orientador: Profa. Dra. Solange Maria Gennari.
1. Sunos. 2. Toxoplasma gondii. 3. Imunologia.
gnica. 5. Real-Time RT-PCR. I. Ttulo.
4. Expresso
FOLHA DE AVALIAO
Nome da autora: NISHI, Sandra Mayumi
Ttulo: Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de genes associados
resposta imune em tecidos de sunos
Tese apresentada ao Programa de Ps-graduao em
Epidemiologia Experimental e Aplicada s Zoonoses
da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da
Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de
Doutor em Medicina Veterinria
So Paulo, 30 de novembro de 2004

Banca Examinadora
Prof. Dr. ________________________________
Instituio: ________________________
Assinatura: ______________________________
Julgamento: _______________________
Prof. Dr. ________________________________
Instituio: ________________________
Assinatura: ______________________________
Julgamento: _______________________
Prof. Dr. ________________________________
Instituio: ________________________
Assinatura: ______________________________
Julgamento: _______________________
Prof. Dr. ________________________________
Instituio: ________________________
Assinatura: ______________________________
Julgamento: _______________________
Prof. Dr. ________________________________
Instituio: ________________________
Assinatura: ______________________________
Julgamento: _______________________
Dedico esta tese aos meus queridos familiares,
minha av Toshiko Sakajiri ( in memorian),

Aos meus pais, Izabel e Tadahisa,
Aos meus irmos Augusto e Srgio,
minha cunhada Rivnia e a minha sobrinha Talita,
Aos meus tios Joo (in memorian) e Akiko,
Aos meus primos-irmos Priscila e Daniel,
Aos tios Edu, Akemi e Raquelzinha,
Pela pacincia aos meus caprichos...

Pela confiana, mesmo sem entender o que fao,
Pelo respeito s minhas decises,
Pelo carinho em todos os momentos e sem restries.
AGRADECIMENTOS
Os experimentos apresentados nesta tese fazem parte de um projeto

envolvendo equipes de pesquisadores do Animal and Natural Resources Institute
(ANRI) e Beltsville Human Nutrition Research Center (BHNRC) do Departamento de
Agricultura dos Estados Unidos da Amrica (USDA). Esta tese representa, desta
forma, somente uma pequena parte dos experimentos realizados e um reflexo do
esforo e do empenho de vrios profissionais.
uma tarefa difcil listar nomes e expressar em palavras minha gratido
a todos aqueles que de alguma forma participaram na execuo do experimento
e tambm queles que indiretamente contriburam para que esta tese pudesse ser
realizada. Com certeza haver aqueles que no foram aqui citados, mas no deixo
de estender meus sinceros agradecimentos a todas as pessoas responsveis para a
minha formao pessoal e profissional.
Agradeo Solange Maria Gennari, minha orientadora no curso de

Mestrado, por lanar a oportunidade de dar continuidade a minha formao
acadmica. Minha gratido por sempre abrir portas para novos horizontes, pela
confiana e pela terna amizade.
Joan K. Lunney, pesquisadora-chefe do antigo IDRL, atualmente
pesquisadora do Animal Parasitic Diseases Laboratory do ARS, USDA. Joan foi, sem
dvida, a grande incentivadora para a consolidao deste trabalho. Minha
gratido pela receptividade, abrindo as portas do IDRL e introduo ao mundo
da imunologia. Agradeo por todo apoio profissional e pessoal, pela confiana e
pelo carinho nos momentos mais difceis.
Harry Dawson, pesquisador do Nutrient Requirement & Function
Laboratory (NRFL), BHNRC, USDA, a mente idealizadora deste experimento.
Agradeo pelas inmeras sugestes, pela bem-humorada pacincia e pela
dedicao, sempre disposto a dividir o vasto e invejvel conhecimento no campo
da biologia molecular, da bioinformtica e da imunologia.
Terezinha Padilha, pelo incentivo e pela constante dedicao

formao de pesquisadores e o intercmbio entre as instituies. Minha especial
gratido, estendida tambm a David Bounds, pelo carinhoso apoio e pela ajuda
em todos os momentos que precisei.
Ao Joseph Urban Jr, pesquisador chefe do Nutrient Requirement &
Function Laboratory pelo planejamento, pela pacincia e pelo apoio indispensvel
para a execuo dos experimentos.
Ao JP Dubey, pesquisador do APDL, pelas palavras de apoio, pela
contribuio e pelas sugestes crticas para a conduo dos experimentos.
Ao Federico Zuckermann, do Departamento de Patobiologia da
Universidade de Illinois, pela pacincia e pelo suporte necessrio para a
concretizao do intercmbio.
Ethiopia Beshah pela amizade e pelo carinho. Obrigada por dividir os
conhecimentos tcnicos, pelas advertncias e pela viso criteriosa que foi
importante para a manuteno da boa qualidade dos resultados.
Gloria Solano-Aguilar, pesquisadora do NRFL, pela inspirao e
sugestes na realizao do experimento.
Ao Atabak Royaee, ps-doc do antigo IDRL, atualmente ps-doutorando
da Universidade de Massashussets, pelas sugestes teis para a anlise dos
resultados e pelo companheirismo.
Agradecimentos especiais a Daniel Kuhar e a Yi Chong, pela ajuda no
processamento das amostras, pela dedicao e pela amizade, imprescindveis
para a concluso dos experimentos e a manuteno de um alegre ambiente de
trabalho.
Aos colegas de laboratrio Alexander Rustico Domingo, Tonya Ledbetter,
Jenny Kessler, Jeremy Samon, Pat Boyd e Chika Obele pelo agradvel convvio e
pela ajuda, mesmo que involuntria, na manuteno da rotina laboratorial.
Ao Samuel Shen e ao Oliver Kwok por toda ateno dispensada e pelo

fornecimento dos isolados de Toxoplasma gondii, pela realizao das provas de
aglutinao modificada e auxlio na digesto das amostras para a prova de PCR.
Ao William Hare, mdico veterinrio responsvel pelo Servio Veterinrio
do ANRI-USDA, pela realizao das provas de avaliao heptica e do
hemograma.
Pat Allen e ao Eli Miramontes por permitir a utilizao do laboratrio e
auxlio na realizao das deteminaes de xido ntrico.
Ao Sreekumar Chirukandoth pelo auxlio nos exames histopatolgicos.
Dolores Hill por permitir a utilizao do laboratrio para a realizao
das provas de ELISA.
Alm do corpo cientfico agradeo s secretrias Ruth Flester e Judy Sirk
pela carinhosa dedicao e pela constante ateno aos procedimentos
burocrticos.
Aos queridos colegas Ricardo Arajo, Karen Tunin, Danielle Seipel da
Silva, Hilda F. J. Pena, Rodrigo Martins Soares, Joo L. Garcia, Manoella Vianna,
Jorge T. de Souza e Flora Piasentin pelo apoio, pela amizade e pelo
companheirismo durante o perodo nos EUA.
A todos os colegas cientistas e funcionrios do ANRI e do NRFL, USDA
pelo agradvel convvio dirio.
Meus agradecimentos ao prof. Silvio A. Vasconcellos pela ateno e

pela dedicao na conduo do curso de ps-graduao
Maria Cristina Paick, Ana Virgnia P. de Almeida Prado, Danival Lopes
Moreira e Tnia Delonero por toda a ateno dispensada e pelo empenho no bom
funcionamento do Departamento.
s secretrias Sandra, Cludia e Dayse do Servio de Ps-graduao e
bibliotecria Elza M. Faquim da Biblioteca Virginie Buff DApice da FMVZ-USP pela
simptica pacincia e pela ajuda nos procedimentos burocrticos.
Muito obrigada,
Sandra Nishi
Agradecimentos adicionais
Ao National Pork Producers (EUA) e ao USDA pela concesso da bolsa

durante todo o perodo de execuo dos trabalhos nos EUA e do suporte financeiro
para a realizao dos experimentos.
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES)

pela concesso da bolsa durante o perodo final de elaborao da tese.
Pr-reitoria de Ps-graduao da Universidade de So Paulo pela

concesso de uma das passagens.
RESUMO
NISHI, S. M. Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de genes associados
resposta imune em tecidos de sunos. [Effect of Toxoplasma gondii infection on immune
related tissue gene expression in pigs]. 2004. 149f. Tese (Doutorado em Medicina
Veterinria) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo,
So Paulo, 2004.
A toxoplasmose uma zoonose de ampla distribuio mundial afetando homens e diversas
espcies animais. Levantamentos sorolgicos indicam elevados ndices de infeco, porm
relatos de doena severa rara. A infeco pelo T. gondii induz uma intensa resposta imune
mediada pelo interferon-J (IFN-J) que rapidamente controla a multiplicao parasitria. Com
o objetivo de explorar a resistncia da espcie suna toxoplasmose como modelo de estudo
para a compreenso dos mecanismos de defesa a infeco, foram realizadas infeces orais
com 4,5 x 105 oocistos (cepa VEG) e colheitas de amostras de linfonodo hepato-esplnico
(LN HS), mesentrico (LN M) e leo-clico (LN IC), fgado, sangue, leo, jejuno, bao e timo
aos 2, 4, 7 e 14 dias ps-infeco (DPI). Analisou-se a expresso de 69 genes ligados a
resposta de defesa s infeces pela Real-Time RT-PCR*. LN M, LN HS e fgado foram as
amostras que apresentaram a maior quantidade de genes e maior intensidade de ativao
enquanto que clulas mononucleares de sangue perifrico (CMSP) e timo apresentaram
reduzida resposta infeco. A expresso e a produo de IFNG foram mais altas nas
amostras de LN M e LN HS comparadas s amostras de LN traqueo-bronquial e CMSP,
indicando diferentes nveis de resposta local. Intensa induo de resposta inata e inflamatria
foi observada em vrios tecidos, envolvendo os genes IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1,
MYD88, TLR2, TLR4; estimulao de resposta Th1, mediada por IFNG incluiu os genes
IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanceada pela expresso de
citocinas regulatrias IL10, TGFB1 e TGFB3. Uma proeminente induo de ARG1, INDO
and SLC11A1 indica ativao de mecanismos de proteo do hospedeiro envolvendo
metabolismo de aminocidos (arginina, triptofano) e ferro. A presena de parasitas foi

detectada no LN M aos 2DPI pela Real-Time PCR e pela imunohistoqumica. Aumento do
nmero de parasitas no 4DPI foi seguida de intensa resposta inflamatria, edema e necrose
tecidual no 7DPI principalmente no fgado e no LN M. Elevados nveis de AST srico no
7DPI confirmam a leso de hepatcitos. A diminuio da inflamao e da quantidade de
parasitas no 14DPI sugerem controle da proliferao parasitria. Elevados nveis de
haptoglobina e xido ntrico sricos detectados aos 4DPI (D=0,05) indicam respectivamente a
ativao de protenas de fase aguda e de macrfagos. A anlise de citometria de fluxo mostra
elevao da porcentagem de clulas CD2/CD16 DP sugerindo envolvimento de clulas NK e
no foram observadas alteraes na porcentagem de clulas CD4+/CD8+, CD3+/CD25+. A
estimulao na expresso gnica, a produo de IFN-J, as determinaes sricas e leses
histolgicas apresentam padro similar, com incio de resposta no 2DPI, elevao no 4DPI e
7DPI e diminuio no 14DPI. A anlise da expresso de mRNA nos tecidos revelou alguns
dos mecanismos de defesa do hospedeiro ativados durante a infeco pelo T. gondii.
Observou-se uma equilibrada ativao de citocinas pr- e anti-inflamatrias envolvendo uma
intrincada rede de mecanismos co-estimulatrios e regulatrios coordenando a resposta do
tipo Th1. *Siglas dos genes segundo o Human Gene Nomenclature Committee (HGNC).
Palavras-chave: Sunos. Toxoplasma gondii. Imunologia. Expresso gnica. Real-Time RTPCR
ABSTRACT
NISHI, S. M. Effect of Toxoplasma gondii infection on immune related tissue gene
expression in pigs. [Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de genes
associados resposta imune em tecidos de sunos]. 2004. 149f. Tese (Doutorado em Medicina
Veterinria) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo,
So Paulo, 2004.
Toxoplasmosis is a widespread zoonosis affecting humans and large range of animal species
worldwide. Serological surveillance indicates high infection rates, but rarely is associated to
severe disease. T. gondii (Tg) infection induces a strong IFN-J dominated immune response
that rapidly controls parasite replication. Pig resistance to toxoplasmosis was explored as an
experimental model to evaluate host defense mechanisms. Pigs were fed 4.5 x 105 oocysts
(VEG strain) and hepato-splenic (HS LN), mesenteric (MLN) and ileal lymph nodes (I LN),
liver, blood, ileum, jejunum, spleen and thymus samples were collected at 2, 4, 7 and 14 days
after infection (DAI). Gene expression analysis for a panel of 69 immune related genes were
performed by Real-Time RT-PCR*. Most intense response were detected in MLN, HS LN
and liver samples, whereas low changes were observed in periferic blood monocytes (PBMC)
and thymus. IFNG mRNA expression and protein production were higher in MLN and HSLN
cells than in tracheo-bronchial LN and PBMC, suggesting different levels of local response.
Intense innate and inflammatory induction were observed in most of the tissues involving
IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1, MYD88, TLR2, TLR4; stimulation of IFNG dominated Th1
response included IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanced
by expression of regulatory cytokines IL10, TGFB1 and TGFB3. Prominent ARG1, INDO
and SLC11A1 upregulation indicate activation of host amino acid (arginine and tryptophan)
and iron protective mechanisms. Tg parasites were detected by Real-Time PCR and
immunohistochemistry in MLN as early as 2DAI. Increase of parasite burden at 4DPI was
followed by an intense inflammatory response, edema and tissue necrosis in liver and LNM at
7DPI. Increased serum AST levels at 7DPI confirmed liver damage. Reduced parasite
numbers and inflammatory response suggest control of parasite replication at 14 DPI. High
serum haptoglobin and nitric oxide at 4DAI (D=0.05) indicate acute phase protein and
macrophage activation, respectively. Flow citometry analysis showed increased percentage of
CD2/CD16 DP suggesting involvement of NK cells, whereas no changes were observed at
CD4+/CD8+, CD3+/CD25+ cells. Gene expression stimulation, IFN-J production, serum
determinations and histological lesions showed similar pattern, of induction at 2DPI,
increasing at 4DPI and 7DPI and decreasing at 14DPI. Tissue mRNA expression analysis
revealed some of the host defense mechanisms activated during T. gondii infection. A balance
of pro- and anti-inflammatory cytokine activation, involving an intricated co-stimulatory and
regulatory mechanisms that coordinates Th1 response was observed.*Gene names according
to Human Gene Nomenclature Committee (HGNC).
Keywords: Pig. Toxoplasma gondii. Immunology. Gene expression. Real-Time RT-PCR
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1 -
Organograma de colheita e exame das amostras dos sunos

experimentais Beltsville 2003 ............................................... 50
Figura 3.2 -
Visualizao grfica da amplificao pela Real-Time PCR. O

ABI7700 detecta a emisso de fluorescncia - 'Rn (nas
ordenadas) ao longo dos 40 ciclos trmicos da reao (na
abscissa). Os resultados so expressos em valores de Ct que
indica o nmero de ciclos necessrios para que o sinal
fluorescente atinja o limiar de deteco - Beltsville 2003 ....... 63
Figura 4.1.1 -
Efeito da infeco pelo T. gondii na expresso gnica no

linfonodo mesentrico (LN M), no linfonodo hepato-esplnico
(LN HS), nas clulas mononucleares do sangue perifrico
(CMSP), no fgado, no bao e no timo de sunos mensurado pela
Real-Time RT-PCR. Aumento ou diminuio da expresso de
mRNA nos grupos infectados em relao ao controle noinfectado Beltsville 2003 ....................................................... 91
Figura 4.1.2 -
Efeito da infeco pelo T. gondii na expresso gnica no

linfonodo leo-clico (LN IC), no jejuno (JEJ) e no leo de
sunos mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento ou
diminuio da expresso de mRNA nos grupos infectados em
relao ao controle no-infectado Beltsville 2003 ................ 92
Figura 4.2.1 -
Efeito da infeco pelo T. gondii na expresso de genes no

linfonodo mesentrico (LN M), no linfonodo hepato-esplnico
(LN HS), no fgado, no leo e no jejuno de sunos mensurado
pela Real-Time RT-PCR. Aumento ou diminuio da expresso
de mRNA nos grupos infectados em relao ao controle noinfectado Beltsville 2003 ....................................................... 108
LISTA DE QUADROS
Quadro 3.1 -
Genes avaliados pela Real-Time RT-PCR nos sunos infectados

por T. gondii. Funo primria, siglas dos genes, nomes e
nomes alternativos, nmero de acesso no Genbank das
seqncias utilizadas para o desenho dos primers e sondas e
nmero do experimento (EXP) em que foi testado Beltsville 2003 ............................................................................................. 58
Quadro 4.1.1 - Deteco de T. gondii em tecidos de sunos nos diferentes dias

ps-infeco (DPI) pelas tcnicas de PCR e imunohistoqumica
(IHQ) - Beltsville 2003 ............................................................ 69
LISTA DE GRFICOS
Grfico 4.1.1 - Nveis de aspartato aminotransferase (AST) srico em sunos

dos grupos controle e infectados pelo T. gondii - Beltsville
2003 ............................................................................................. 71
Grfico 4.1.2 - Nveis de IFN-J srico em sunos dos grupos controle e
infectados pelo T. gondii medido pelo mtodo de ELISA Beltsville 2003 ........................................................................ 72
Grfico 4.1.3 - Produo de IFN-J por clulas mononucleares do sangue
perifrico (CMSP), do linfonodo mesentrico (LN M), do
linfonodo hepato-esplnico (LN HS) e do linfonodo traqueobronquial (LN TB) de sunos dos grupos controle e infectados
pelo T. gondii durante cultivo em ConA por 24 horas medida
pelo mtodo de ELISA - Beltsville 2003 ................................. 73
Grfico 4.1.4 - Nveis de xido ntrico (NO) no soro de sunos dos grupos
controle e infectados pelo T. gondii medido pelo mtodo de
Griess - Beltsville 2003 ............................................................. 74
Grfico 4.1.5 - Nveis de haptoglobina em sunos dos grupos controle e
infectados pelo T. gondii medido por mtodo colorimtrico Beltsville 2003 .......................................................................... 75
Grfico 4.2.1 - Variao dos nveis de aspartato aminotransferase (AST) srico
em sunos dos grupos Controle e infectados pelo T. gondii
Beltsville 2003 ......................................................................... 97
Grfico 4.2.2 - Produo de IFN-J por clulas mononucleares do sangue
perifrico (CMSP), clulas do linfonodo mesentrico (LN M) e
do linfonodo hepato-esplnico (LN HS) de sunos dos grupos
controle e infectados pelo T. gondii durante cultivo em ConA
por 24 horas medida pelo mtodo de ELISA - Beltsville 2003 . 99
Grfico 4.2.3 - Nveis de haptoglobina em sunos dos grupos controle e

infectados pelo T. gondii medido por mtodo colorimtrico.
Letras distintas entre grupos experimentais indicam diferena
estatstica significante (D=0,05) - Beltsville 2003 .................... 100
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1.1 -
Tabela 4.1.2 -
Tabela 4.1.3 -
Tabela 4.1.4 -
Tabela 4.1.5 -
Mdia e desvio-padro (DP) dos valores de aspartato

aminotransferase (AST), alanino aminotransferase (ALT),
gamaglutamil transferase (GGT), bilirrubinas totais (TBILI),
bilirrubina direta (DBILI), protenas totais (PT), globulinas
(GLOB), albumina (ALB) e proporo albumina/globulina
(A/G) das amostras de soro de sunos infectados com T. gondii e
controles no infectados. Diferena estatstica (Estat.) segundo
teste de Tukey-Kramer (D=0,05) - Beltsville 2003 .................
71
Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas do

linfonodo mesentrico em sunos aps a infeco por T. gondii.
Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio padro
(DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos
experimentais - Beltsville 2003 ................................................
77

linfonodo hepato-esplnico em sunos aps a infeco por T.
gondii. Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio
padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos
78

linfonodo traqueo-bronquial de sunos aps a infeco por T.
gondii. Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio
padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos
79
Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas

mononucleares do sangue perifrico de sunos aps a infeco
por T. gondii. Mdia das porcentagens relativas, respectivos
desvio padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os
grupos experimentais - Beltsville 2003 ....................................
80
Tabela 4.1.6 -
Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo

mesentrico dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e
respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e
infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii.
Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer
(D = 0,05) - Beltsville 2003 ....................................................
82

hepato-esplnico dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e
(D = 0,05) - Beltsville 2003 .....................................................
83
Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de clulas

mononucleares do sangue perifrico dos sunos do EXP I.
Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos
grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a
infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.) segundo o
teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 ................
84
Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de fgado dos

sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios
padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o
dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.)
segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003
85
Tabela 4.1.10 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de bao dos

86
Tabela 4.1.11 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de timo dos

87
Tabela 4.1.7 -
Tabela 4.1.8 -
Tabela 4.1.9 -
Tabela 4.1.12 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo

leo-clico dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e
(D = 0,05) - Beltsville 2003 .....................................................
88
Tabela 4.1.13 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de jejuno dos

89
Tabela 4.1.14 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de leo dos

90
Tabela 4.1.15 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.

gondii mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento (valores
positivos) ou diminuio (valores negativos) da expresso de
RNAm nos linfonodos mesentrico (LN M), hepato-esplnico
(LN HS) e clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP)
dos grupos infectados em relao ao controle no-infectado
Beltsville 2003 .........................................................................
93

RNAm em amostras de fgado, bao e timo dos grupos
infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville
2003 ............................................................................................
94

RNAm no linfonodo leo-clico (LN IC), no jejuno e no leo
dos grupos infectados em relao ao controle no-infectado
Beltsville 2003 .........................................................................
95
Tabela 4.2.1 -
Mdia e desvio-padro (DP) dos valores de aspartato

aminotransferase (AST), alanino aminotransferase (ALT),
gamaglutamil transferase (GGT), bilirrubinas totais (TBILI),
bilirrubina direta (DBILI), fosfatase alcalina (ALP), protenas
totais (PT), globulinas (GLOB), albumina (ALB) e proporo
albumina/globulina (A/G) em amostras de soro de sunos
infectados com T. gondii e controles no infectados. Diferena
estatstica (Estat.) segundo teste de Tukey-Kramer (D=0,05) Beltsville 2003 .........................................................................
97
Tabela 4.2.2 -
Mdia e desvio-padro (DP) da contagem do nmero total de

leuccitos (Leu), nmero total (T) e relativo (%) de neutrfilos
(Ne), linfcitos (Li), moncitos (Mo), Eosinfilos (Eo),
basfilos (Ba), nmero total de eritrcitos (He), concentrao de
hemoglobina (Hb), volume globular (Hct), volume corpuscular
mdio (MCV), hemoglobina corpuscular mdia (MCH) e
concentrao hemoglobnica corpuscular mdia (MCHC) em
sunos infectados com T. gondii e controle no-infectado.
Diferena entre os grupos experimentais (Estat.) segundo teste
de Tukey-Kramer, D=0,05 - Beltsville 2003 ............................ 101
Tabela 4.2.3 -

mesentrico dos sunos do EXP II. Valores mdios de Ct e
(D = 0,05) - Beltsville 2003 ...................................................... 103
Tabela 4.2.4 -

hepato-esplnico dos sunos do EXP II. Valores mdios de Ct e
(D = 0,05) - Beltsville 2003 ..................................................... 104
Tabela 4.2.5 -
Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de fgado dos

sunos do EXP II. Valores mdios de Ct e respectivos desvios
segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 105
Tabela 4.2.6 -
Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de leo dos

Tabela 4.2.7 -
Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de jejuno dos

Tabela 4.2.8 -
Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.

gondii, mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento (valores
RNAm nos linfonodos mesentrico (LN M), hepato-esplnico
(LN HS) e fgado dos grupos infectados em relao ao controle
no-infectado Beltsville 2003 ................................................ 109
Tabela 4.2.9 -
Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.

gondii, mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento (valores
RNAm no leo e no jejuno dos grupos infectados em relao ao
controle no-infectado Beltsville 2003 ................................. 110
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS1
Ac
Anticorpo
ALP
Fosfatase alcalina
ALT
Alanino aminotransferase
ANOVA
Anlise de varincia
ANRI
Animal and Natural Resources Institute
ARS
Agricultural Research Service
AST
Aspartato aminotransferase
BARC
Beltsville Agricultural Research Center
BHQ
Black Hole Quencher
CD
Antgeno de superfcie
cDNA
DNA complementar
CMSP
Clulas mononucleares do sangue perifrico
ConA
Concanavalin A, lectina da Conavalia ensiformis
CRP
Protena C-Reativa
CSF
Fator estimulador de colnia
DC
Clula dendrtica
DNA
cido desoxirribonuclico
DNase
Desoxirribonuclease
DP
Duplo positivos
DPI
Dias ps-infeco
EDTA
cido etileno diaminotetracetato sdico
ELISA
Ensaio imunoenzimtico
FAM
6-carboxifluorescena
FCM
Citometria de fluxo
FITC
Isotiocianato de fluorescena
HBSS
Hanks Balanced Salt Solution
HE
Hematoxilina e eosina
HEPES
N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid
Devido ao uso consagrado na literatura tcnica, algumas abreviaturas seguem as iniciais de sua grafia em
ingls.
HGNC
Human Gene Nomenclature Committee
HUGO
Human Genome Organization
IDRL
Immunology and Disease Resistance Laboratory
IFN
Interferon
Ig
Imunoglobulina
IHQ
Imunohistoqumica
IL
Interleucina
INDO
Indoleamine 2,3-dioxygenase
iNOS
NO sintase induzvel
ITS1
Internal Transcribed Spacer 1
LN
Linfonodo
LN HS
Linfonodo hepato-esplnico
LN IC
Linfonodo leo-clico
LN M
Linfonodo mesentrico
LN TB
Linfonodo traqueo-bronquial
MAT
Teste de aglutinao mofidicado
mRNA
RNA mensageiro
NCBI
National Center for Biotecnology Information
NK
Clula Natural Killer
NO
xido ntrico
NRFL
Nutrient Requirements and Functions Laboratory
PBESL
Parasite Biology, Epidemiology and Systematics Laboratory
PBS
Soluo salina tamponada
PCR
Reao em cadeia pela polimerase
PE
Ficoeritrina
PMA
Phorbol 12-myristate 13-acetate
RNA
cido ribonuclico
RNase
Ribonuclease
ROX
6-carboxy-x-rhodamine
RT
Transcrio reversa
SFB
Soro fetal bovino
SLA
Swine Leukocyte Antigen
STAg
Antgeno solvel de T. gondii
Linfcito T ou referente ao Linfcito T
TAMRA
5-(and 6)-carboxytetramethylrhodamine
Tc
Linfcito T citotxico
TET
Tetrachloro-6-carboxyfluorescein
TGF
Fator transformador de crescimento
Th
Linfcito T helper
TIGR
The Institute for Genomic Research
TLR
Receptor tipo Toll
TNF
Fator de necrose tumoral
USDA
The United States Department of Agriculture
LISTA DE SMBOLOS
D - alfa
E- beta
J - gama
G' - delta
P - micro
C - graus Celsius
SUMRIO
INTRODUO ........................................................................................ 30
REVISO DA LITERATURA .............................................................. 32
MATERIAL E MTODO ...................................................................... 45
3.1
LOCAL ..................................................................................................... 45
3.2
ANIMAIS .................................................................................................. 45
3.3
Toxoplasma gondii .................................................................................... 46
3.4
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL .................................................... 46
3.5
SACRIFCIO DOS SUNOS E COLHEITA DAS AMOSTRAS ............ 49
3.6
ISOLAMENTO E PREPARO DAS CLULAS ...................................... 50
3.6.1
Separao de Clulas Mononucleares do Sangue Perifrico ............... 51
3.6.2
Separao de Clulas dos Linfonodos ................................................... 51
3.7
CULTURA IN VITRO ............................................................................... 52
3.8
ANLISE DE SUBPOPULAES DE CLULAS ............................... 53
3.9
PREPARO DAS AMOSTRAS PARA A REAL-TIME RT-PCR ............ 53
3.9.1
Extrao de RNA ..................................................................................... 54
3.9.2
Quantificao de RNA por Espectrofotometria ................................... 54
3.9.3
Tratamento com DNase .......................................................................... 55
3.9.4
Determinao da Concentrao e da Qualidade do RNA .................... 55
3.9.5
Sntese de cDNA ...................................................................................... 56
3.10
REAL-TIME PCR ................................. 56
3.10.1 Genes ........................................................................................................ 57

3.10.2 Otimizao da Real-Time PCR .............................................................. 62
3.10.3 Condies da Reao e Anlise dos Resultados .................................... 62

3.11
DETERMINAO DE IFN-J .................................................................. 65
3.12
PERFIL HEPTICO E HEMOGRAMA .................................................. 65
3.13
DETERMINAO DE XIDO NTRICO ............................................. 66
3.14
DETERMINAO DE HAPTOGLOBINA ............................................ 66
3.15
DETECO DE ANTICORPOS ANTI-T. gondii ................................... 66
3.16
DETECO DE T. gondii ........................................................................ 67
3.17
ANLISE ESTATSTICA ....................................................................... 67
RESULTADOS ........................................................................................ 68
4.1
EXPERIMENTO I .................................................................................... 68
4.1.1
Exames Histo-Patolgicos e Parasitolgicos ......................................... 68
4.1.2
Pesquisa de Anticorpos Anti-T. gondii .................................................. 70
4.1.3
Perfil Heptico ......................................................................................... 70
4.1.4
Determinao de IFN-J ........................................................................... 72
4.1.4.1 IFN-J Srico .............................................................................................. 72

4.1.4.2 Produo de IFN-J .................................................................................... 73
4.1.5
Determinao de NO ............................................................................... 74
4.1.6
Determinao de Haptoglobina ............................................................. 75
4.1.7
Anlise de Subpopulaes de Clulas .................................................... 75
4.1.8
Expresso Gnica .................................................................................... 81
4.2
EXPERIMENTO II ................................................................................... 96
4.2.1
Pesquisa de Anticorpos Anti-T. gondii .................................................. 96
4.2.2
Perfil Heptico ......................................................................................... 96
4.2.3
Determinao de IFN-J ........................................................................... 98
4.2.3.1 IFN-J Srico ..............................................................................................
98
4.2.3.2 Produo de IFN-J ....................................................................................
98
4.2.4
Determinao de Haptoglobina .............................................................
99
4.2.5
Hemograma .............................................................................................
100
4.2.6
Expresso Gnica ....................................................................................
102
DISCUSSO ............................................................................................ 112
CONCLUSES .......................................................................................
133
REFERNCIAS ......................................................................................
135
APNDICES .............................................................................................. 145
30
1 INTRODUO
A toxoplasmose uma zoonose de ocorrncia mundial causada pelo protozorio

Toxoplasma gondii (NICOLLE; MANCEAUX, 1908). Este agente se destaca por possuir uma
ampla diversidade de hospedeiros incluindo vrias espcies de mamferos e aves. Inquritos
sorolgicos indicam um elevado nmero de infectados tanto na populao humana quanto nos
animais, entretanto relatos de quadros clnicos severos e infeces letais so pouco freqentes
(DUBEY; BEATTIE, 1988).
O T. gondii um parasita intracelular obrigatrio, capaz de invadir e se multiplicar no
interior de qualquer clula nucleada, sem predileo por tipo tecidual. A infeco se
caracteriza na maior parte dos casos por uma fase inicial aguda de intensa replicao do
parasita, seguida de uma fase crnica, assintomtica em que o parasita se reproduz
lentamente.
Os mecanismos de defesa do hospedeiro exercem um papel crucial no controle da
atividade do parasita. Na fase inicial da infeco ocorre o processo de reconhecimento
antignico e ativao do sistema de defesa especfica. A consolidao da resposta
imunolgica especfica inibe eficientemente a replicao do T. gondii, porm no capaz de
destru-lo. O T. gondii por sua vez possui mecanismos de evaso do sistema imune,
assumindo uma forma de baixa imunogenicidade formando cistos em tecidos onde se mantm
vivel por anos, provavelmente por toda vida do hospedeiro.
Alteraes na funo imunolgica do hospedeiro podem reativar a infeco crnica, o
que a caracteriza como uma doena oportunista. Quando associado a doenas debilitantes e
imunossupressoras produz leses intensas devido a reproduo descontrolada do parasita que
levam o indivduo a bito (DUBEY; BEATTIE, 1988).
31
O principal modelo experimental para o estudo da toxoplasmose a infeco em

camundongos. A manipulao gentica e os recursos de biologia molecular fornecem
informaes valiosas para a compreenso dos mecanismos biolgicos envolvidos na etiologia
da doena. Existem, entretanto, diferenas metablicas entre humanos e camundongos que
devero ser estudadas com a utilizao de espcies animais de grande porte como modelo
experimental (HEIN; GRIEBEL, 2003; MESTAS; HUGHES, 2004).
Em comparao aos camundongos, os sunos apresentam maior resistncia infeco
pelo T. gondii, comportando-se de modo parecido aos humanos. Os sintomas clnicos so
pouco intensos e similares aos observados em outras infeces sistmicas. Quando aparentes
os sintomas so observados nas primeiras semanas ps-infeco, incluindo febre,
linfoadenomegalia, hiporexia e apatia. Aps este breve perodo, a infeco controlada pelo
sistema imune e o parasita se mantm latente em cistos teciduais (DUBEY; BEATTIE, 1988;
DUBEY et al., 1996).
Apesar do grande nmero publicaes sobre o assunto, os mecanismos responsveis
pelo controle da multiplicao e da manuteno dos cistos teciduais em fase de latncia ainda
no foram completamente identificados. O presente trabalho explora a resistncia da espcie
suna toxoplasmose como modelo de estudo para a compreenso dos mecanismos de defesa
envolvidos durante a fase aguda da infeco. Foram quantificados a expresso de 69 genes em
diferentes tecidos do hospedeiro, obtendo-se assim a variao da expresso dos genes em
diferentes dias aps a infeco e tambm o padro de resposta nos diferentes tecidos.
Paralelamente expresso gnica nos tecidos, a resposta imunolgica foi abordada por
indicadores sricos, cultura de clulas e histopatologia.
32
2 REVISO DE LITERATURA1
Infeces experimentais em camundongos so o ponto inicial para o estudo dos

mecanismos de defesa toxoplasmose. A facilidade de manuteno de linhagens isognicas,
aliada possibilidade de manipulao gentica, a obteno de vrias geraes em um curto
espao de tempo e a elevada suscetibilidade da espcie infeco pelo T. gondii tornou o
camundongo o modelo padro para esse tipo de estudo. A supresso ou a introduo de genes
em camundongos geneticamente modificados permitiu determinar o papel fisiolgico da
protena por eles codificada frente a diversas condies experimentais.
Por outro lado, infeces em culturas de clulas mostraram a capacidade de resposta
de diferentes isolados de clulas ao parasitismo. Tipos celulares de origens e de funes
variadas como clulas epiteliais (DENNEY; ECKMANN; REED, 1999), fibroblastos
(BLADER; MANGER; BOOTHROYD, 2001; BRENIER-PINCHART et al., 2002;
CHANNON et al., 2002), clulas dendrticas e macrfagos (CHAUSSABEL et al., 2003;
ROBBEN et al., 2004), esplencitos (GAZZINELLI et al., 1993; ROBBEN et al., 2004)
responderam infeco pelo T. gondii por meio de liberao de diferentes fatores ligados
quimiotaxia, induo de resposta inflamatria e com efeito microbicida.
Ambos modelos experimentais, camundongos e cultivo em clulas, tm sido
intensamente explorados no estudo da interao hospedeiro-parasita. Ao considerar diferenas
biolgicas entre espcies e condies laboratoriais artificiais torna-se difcil a extrapolao de
1
Nota da autora: Na reviso de literatura foram utilizadas as siglas e abreviaturas adotadas na publicao
original. No experimento da tese, foram utilizadas as siglas de genes conforme o Human Gene Nomenclature
Committee (HGNC) do Human Genome Organization (HUGO) apresentandas no site
<http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature> em janeiro de 2004. Devido a constantes atualizaes na
nomenclatura, eventuais diferenas podem ser notadas entre as siglas aqui publicadas e siglas atualmente
vigentes. As protenas seguem a nomenclatura do The Journal of Immunology Standard Abbreviations
<http://www.jimmunol.org/misc/authorabbrev.shtml>. Desta maneira, IFNG, TNF, IL12A, NOS2A
referem-se aos genes e IFN-JTNF-D, IL12p35, iNOS referem-se s respectivas protenas.
33
dados experimentais para a compreenso de fenmenos reais. A defesa contra a infeco pelo
T. gondii formada por uma cascata de eventos, envolvendo componentes da imunidade
inata que iro exercer importante papel na consolidao da resposta especfica
A resposta inata pode ser observada em diferentes tipos celulares, independente de sua
origem ou funo primria (YAP; SHER, 1999). Embora inespecfica, possui componentes
importantes para a ativao, a diferenciao celular e a consolidao da defesa especfica.
O controle efetivo da infeco pelo T. gondii feito pela imunidade mediada por
clulas. A defesa celular envolve a ativao escalonada de tipos celulares especializados que
se interagem atravs da expresso de antgenos de superfcie, da secreo de mediadores
especficos, conhecidos como citocinas, e sua interao sobre receptores prprios. Desta
maneira, a avaliao do perfil das citocinas produzidas durante uma dada infeco, fornece
importantes pistas a respeito do grau e da forma de ativao da imunidade celular. Na
literatura as citocinas so tambm encontradas sob as designaes quimiocinas, linfocinas e
fatores de crescimento (PAUL, 1999).
A imunidade humoral representada pela produo de anticorpos especficos o
principal indicador para o diagnstico da toxoplasmose na populao. Possui grande valia
para a deteco dos indivduos infectados, porm no fornece informaes sobre o estado
imune ou a resistncia do hospedeiro (DUBEY; BEATTIE, 1988; FILISETTI; CANDOLFI,
2004).
As citocinas so molculas proteicas, produzidas e secretadas pelas clulas em
resposta a um estmulo, isto , sua produo induzida em um dado momento e cessa to logo
o fator estimulatrio seja eliminado ou reprimido. Exercem funo local sobre os tecidos e
podem possuir atividade autcrina, agindo sobre as prprias celulas produtoras, ou parcrina,
isto , agindo sobre diferentes alvos celulares (PAUL, 1999).
34
Diferentes padres de citocinas so secretados em resposta a diferentes formas de

infeco, resultando em diferentes respostas efetoras. A partir destas observaes,
desenvolveu-se o conceito do paradigma das respostas do tipo Th1/Tc1 e tipo Th2/Tc2. A
resposta Th1/Tc1, envolveria as clulas T helper e citotxicas mediadas por citocinas como o
interferon gama (IFN-J e fator de necrose tumoral alfa (TNF-D que so induzidas por
infeces intracelulares, como por exemplo vrus e bactrias. A resposta Th2/Tc2 por sua vez,
estaria associada s citocinas interleucina-4 (IL-4), IL-5 e IL-13 produzidas em resposta a
infeces extracelulares, por exemplo helmintos. As respostas Th1 e Th2 so contrabalanceadas por mecanismos de inibio, desta forma, citocinas Th1 inibem a expresso de
citocinas Th2 e a ausncia de estimulao Th1 levaria a produo de resposta Th2
(JANKOVIC; LIU; GAUSE, 2001; PEARCE; SCOTT; SHER, 1999; SZABO et al., 2003).
No que se refere toxoplasmose, a citocina-chave para o estudo da resistncia o
IFN-Jenvolvendo a atividade de clulas Th1. Infeces experimentais em camundongos
revelam que a produo de IFN-J um passo crtico para a proteo do hospedeiro contra a
infeco pelo T. gondii. A ausncia do gene ou a deficincia na produo de IFN-J ou de seu
respectivo receptor leva replicao descontrolada do parasita e o hospedeiro evolui
rapidamente para a morte (FUJIGAKI et al., 2002; SCHARTON-KERSTEN et al., 1996b;
YAP; SHER, 1999).
A produo de IFN-J por linfcitos T e clulas NK responsvel pela ativao de
macrfagos e das prprias clulas NK (FILISETTI; CANDOLFI, 2004) e est fortemente
associado a induo da converso de taquizotos para bradizotos (BOHNE; HEESEMANN;
GROSS, 1993; JONES; BIENTZ; ERB, 1985).
Este efeito protetor do IFN-J deve, entretanto, possuir mecanismos regulatrios
visando impedir efeitos imunopatolgicos. Ao comparar de linhagens de camundongos
suscetveis e resistentes toxoplasmose aguda observou-se, de forma intrigante, nveis de
35
IFN-J sricos mais elevados nas linhagens sucetveis que nas resistentes. Esta elevada
concentrao de IFN-J foi associada a um processo inflamatrio agudo com edema e necrose
tecidual bastante intensas no fgado e no linfonodo mesentrico (MCLEOD et al., 1989). A
produo exacerbada de IFN-J foi tambm observada nas infeces letais causadas por
isolados de T. gondii altamente virulentos (GAVRILESCU; DENKERS, 2001; MORDUE et
al., 2001).
Para melhor compreender a cascata de ativao da resposta Th1 e tomando o IFN-J
como referncia, diversos trabalhos buscam identificar os mediadores resposveis pela
induo da produo de IFN-J, a sinalizao intracelular e as vias efetoras ativadas pelo IFNJ.
Ao longo da infeco a ativao do sistema imune ocorre por mecanismos mltiplos.
Alm de reconhecimento de antgenos do T. gondii, a leso celular e citlise geram sinais no
especficos que alertam as clulas fagocitrias da presena do agressor (SCOTT; HUNTER,
2002).
Os mecanismos de defesa ativados nesta fase precoce da infeco so mecanismos
inespecficos porm importantes para a organizao da resposta especfica. Nesta fase inicial,
clulas fagocitrias como as clulas dendrticas (DC), moncitos e macrfagos desempenham
um papel essencial no reconhecimento do agente invasor, na apresentao antignica e
gerao sinais especficos para as clulas efetoras (PAUL, 1999).
Nos camundongos a IL-12 a principal citocina indutora da produo de IFN-J. As
DCs controlam a magnitude e a qualidade da resposta Th1 com a produo de interleucina-12
(IL-12) (SCOTT; HUNTER, 2002). A ausncia de IL-12 aumenta a suscetibilidade
infeco, com menor produo de mediadores inflamatrios, maior replicao parasitria e
morte em menor espao de tempo (ARAUJO et al., 2001). Tanto parasitas ntegros quanto
antgenos solveis so capazes de induzir IL-12 e desta forma, estimular clulas efetoras
36
como linfcitos T e clulas Natural Killer (NK) a produzir IFN-J(GAZZINELLI et al., 1994).
Nas clulas NK a sntese de IFN-J dependente de IL-12 e pode ser aumentada pelo IFN-J,
pelo TNF-D e pela IL-2 (GAZZINELLI et al., 1993). Acredita-se que na fase inicial da
infeco, as clulas NK e os macrfagos so os principais responsveis pela resistncia inata,
no-especfica (FILISETTI; CANDOLFI, 2004).
A IL-12 tambm citada como importante citocina na manuteno da resistncia
contra a toxoplasmose crnica. Camundongos IL-12 deficientes conseguiram responder
infeco quando tratados com IL-12 exgena. Ao redor de trs semanas aps a interrupo do
tratamento observou-se um intenso aumento do nmero de cistos imaturos no crebro,
associadas a reas de necrose e morte por encefalite aguda (YAP; PESIN; SHER, 2000).
Da mesma maneira que as DCs e as clulas NK, os macrfagos tambm contribuem na
modulao da imunidade pela secreo de IL-12 e se destacam por exercer funes efetoras
anti-microbianas. A produo de reagentes oxidativos, xido ntrico e atividade de enzimas
lisossomais constituem alguns dos vrios mecanismos microbicidas dos macrfagos
(STAFFORD; NEUMANN; BELOSEVIC, 2002).
O mecanismo de ativao do sistema imune controlado por uma intrincada rede de
citocinas. Parte destes mecanismos j so bem definidos no modelo experimental dos
camundongos, mas alguns experimentos em sunos sugerem possveis diferenas na resposta
entre as espcies. Um exemplo a via de ativao da produo de IFN-J pela ao da IL-12.
Solano-Aguilar et al. (2002) no obtiveram xito ao estimular a produo de IFN-J em
linfcitos de sunos in vitro utilizando IL-12 recombinante (rIL-12) espcie especfica. O
mesmo experimento utilizando linfcitos de bovinos, a rIL-12 suna mostrou-se ativa,
estimulando a produo de IFN-J.
Ao comparar a induo de mRNA em culturas de clulas mononucleares do sangue
perifrico de sunos e bovinos, observa-se um aumento da expresso de IL12RE2 nos bovinos,
37
mas no nas clulas de sunos, o que leva a supor que a baixa resposta dos sunos IL-12
esteja ligada reduzida quantidade de receptores prprios (SOLANO-AGUILAR et al.,
2002).
Este fato leva a considerar a possibilidade de vias alternativas de induo da produo
de IFN-J independentes da IL-12. Sabe-se que camundongos infectados e tratados com
anticorpos monoclonais (mAc) anti-IL12 so capazes de produzir IFN-J (SCHARTONKERSTEN et al., 1996a).
O estudo da atividade das citocinas deve portanto englobar todo um conjunto de
citocinas que apresentam funes similares, pois sabe-se que diferentes citocinas so capazes
de produzir o mesmo efeito final e agindo muitas vezes em sinergismo (LUNNEY, 1998). Um
exemplo deste efeito observado na ao sinrgica da IL-18 em relao IL-12, aumentando
a produo de IFN-J (CAI; KASTELEIN; HUNTER, 2000).
Camundongos deficientes de STAT4, protena envolvida na sinalizao intracelular da
IL-12, so muito sensveis a infeco pelo T. gondii por apresentar baixos nveis de IFN-J. A
administrao associada de IL-2 e IL-18 foi capaz de induzir a produo de IFN-J e aumentar
a sobrevida dos camundongos (CAI et al., 2000).
Este mesmo efeito foi observado em camundongos portadores de uma deficincia na
sinalizao da IL-12 que conseguiram recuperar a produo de IFN-J quando tratados com
IL-18 (YAP et al., 2001).
Ao pensar em similaridades estruturais, a IL-23 se assemelha IL-12 ao compartilhar
a mesma a subunidade p40. Ambas so citocinas heterodimricas, diferindo entre si pela
associao das subunidades p19 e p35, respectivamente.
Infeces experimentais em camundongos e estimulao de DCs in vitro indicaram
uma elevao da expresso de mRNA para IL23, levantando uma possvel via alternativa de
ativao do IFN-J. Entretanto, em camundongos geneticamente modificados, a supresso dos
38
genes p40 e p35 geraram maiores prejuzos resposta contra o T. gondii do que a do gene p19
(LIEBERMAN et al., 2004).
Em infeces in vivo fica evidente que juntamente com o IFN-J outras citocinas
inflamatrias agem na proteo contra o T. gondii. A deficincia de receptores para o TNF-D
e a enzima iNOS tambm levam a uma maior suscetibilidade a infeco por T. gondii (YAP et
al., 1998; YAP; SHER, 1999).
Em humanos os mecanismos de ativao associados a taquizotos vivos, mortos e
antgenos solveis de T. gondii (STAg) so distintos. Parasitas vivos induzem a produo de
IL-12 por DC humanas envolvendo vias ligadas a interao de antgenos CD40 e seu
respectivo ligante, o CD40L, o que no observado em estudos com lisados do T. gondii
(SUBAUSTE; WESSENDARP, 2000). Nos camundongos esta interao CD40-CD40L no
essencial resposta imune, pois DCs de camundongos deficientes em CD40 so capazes de
produzir IL-12 em resposta a STAg e infeco com parasitas vivos (REICHMANN et al.,
2000).
A interao CD40-CD40L citada como uma das possveis vias que substituem a via
de sinalizao do TNF (PEARCE; SCOTT; SHER, 1999).
Na imunidade inata a molcula adaptadora MyD88 est vinculada a ativao dos
receptores Toll-like (TLR). Sabe-se que esta via dos TLRs tambm est envolvida na resposta
infeco, pois camundongos deficientes do gene MYD88 apresentam baixos nveis de IL-12
srico e uma multiplicao descontrolada do T. gondii (SCANGA et al., 2002).
Em oposio ao raciocnio anterior em que diferentes citocinas levam ao mesmo efeito
final, importante ressaltar que uma citocina pode possuir funes mltiplas, isto , uma
nica citocina capaz de induzir diversas vias efetoras. O estudo de uma nica citocina
fornece uma lista de possveis formas de controle da infeco pelo T. gondii, entretanto no
possvel afirmar qual a via mais importante.
39
Ao se falar em clula efetora e atividade anti-microbiana sabe-se que no somente

clulas derivadas da medula ssea, mas tambm clulas somticas de origem nohematopoitica respondem ao estmulo do IFN-J e do TNF-Disto , potencialmente vrios
tipos celulares podem responder s citocinas. O mecanismo efetor responsvel pelo controle
do T. gondii ainda no foi elucidado, existindo vrias teorias sobre os possveis fatores
envolvidos.
A produo de reagentes txicos como o xido ntrico (NO) um dos mecanismos
envolvidos no controle das infeces intracelulares por bactrias. A enzima responsvel pela
produo de NO pelas clulas a NO sintase (NOS). Esta enzima encontrada em diversas
isoformas, sendo a iNOS a forma expressa em clulas imunes ativadas (STAFFORD;
NEUMANN; BELOSEVIC, 2002). A induo da iNOS observada em vrios tipos celulares,
entretanto a funo microbicida do xido ntrico (NO) parece estar restrita aos moncitos e
macrfagos (NATHAN; XIE, 1994).
Em camundongos a induo da iNOS e a produo de NO importante na defesa
macrofgica contra o T. gondii, porm acredita-se que no seja o nico mecanismo envolvido
(HAYASHI et al., 1996; YAP; SHER, 1999). Infeces no-letais em camundongos normais
tornam-se letais em camundongos deficientes do gene para a iNOS (DENKERS, 1999). Nos
humanos, esta atividade ainda controversa.
Ativao de mecanismos de depleo de nutrientes ao parasita a outra hiptese para
a diminuio da atividade dos taquizotos. O IFN-J induz uma intensa produo de
indoleamine 2,3-dioxigenase (INDO) nos macrfagos. Esta enzima que seria responsvel pela
depleo de triptofano necessrio para a replicao do T. gondii (PFEFFERKORN, 1984).
Porm somente a depleo de triptofano no suficiente para garantir a inibio da
multiplicao do parasita (MACKENZIE et al., 1999).
40
A interao entre as diversas vias efetoras podem levar a resultados diferentes do

esperado. A produo de NO pode inibir a expresso de INDO em macrfagos ativados por
IFN-J (ALBERATI-GIANI et al., 1997).
A ativao da enzima arginase leva a depleo de arginina. A ausncia de arginina,
substrato para a enzima NO sintase, levaria a uma baixa produo de NO favorecendo o
crescimento parasitrio (VINCENDEAU et al., 2003).
Conforme avanam os conhecimentos acerca das citocinas observa-se uma
necessidade de uma maior compreenso das mltiplas interaes que regem a resposta imune.
Partindo-se do conceito de que o equilbrio entre citocinas pro e anti-inflamatrias seria
fundamental para assegurar o combate da infeco sem levar a auto-destruio de tecidos do
organismo, a ativao de fatores reguladores cumprem um importante papel na fase de
recuperao e regenerao celular (DENKERS, 1999). A atividade regulatria
desempenhada tanto no meio extracelular por meio da secreo de citocinas regulatrias ou no
intracelular pela ao de supressores da sinalizao.
O efeito da hiperativao inflamatria e imunolgica foi descrito em camundongos
com infeces letais. Foram observadas excessiva produo de citocinas como IFN-J e TNFD associada a leses intensas em tecido heptico e cerebral (MORDUE et al., 2001).
Dentre as citocinas regulatrias a IL-10 e o TGF-E so as provveis citocinas
envolvidas no controle do efeito Th1 durante a toxoplasmose aguda. Embora primariamente
classificada como uma citocina Th2, trabalhos recentes tm sugerido associar a IL-10 a
clulas T regulatrias (COUSINS; LEE; STAYNOV, 2002; VOLK et al., 2001). Sabe-se que
a IL-10 possui efeito inibitrio sobre as citocinas IL-2, IFN-JTNF-D e fator estimulador de
colnia granuloctica-macrofgica (GM-CSF), inibindo a resposta Th1, por supresso da IL12 (LEONARD, 1999).
41
A leso mais severa observada em camundongos deficientes em IL-10 infectados por

T. gondii foi a necrose aguda de segmentos intestinais e do fgado. Interessantemente o
bloqueio do efeito do IFN-J, da IL-12 ou das clulas CD4+ por meio de anticorpos
monoclonais prolongou a sobrevida destes camundongos (SUZUKI et al., 2000).
O TGF-E inibe a atividade macrofgica induzida pelo IFN-J por meio da inibio da
produo de TNF-D (LANGERMANS et al., 2001).
O efeito inibitrio pode ocorrer no meio intracelular. Normalmente a juno da
citocina em seu receptor produz uma sinalizao intracelular que envolve a ativao de
molculas intracelulares como JAKs (Janus family kinases) e STATs (Signal transducers and
activators of transcription). Cabe aos supressores da sinalizao das citocinas (suppressors of
cytokine signaling - SOCS) regular a sinalizao intracelular (FUJIMOTO; NAKA, 2003).
SOCS1 foi inicialmente descrito como uma molcula induzida por STAT (STATinduced STAT inhibitor). Atualmente sabe-se que induzida tambm pela insulina,
lipopolissacardeos (LPS), CpG DNA e outras molculas que no ativam STATs. um
regulador negativo da sinalizao de vrias citocinas, entre elas IFN-J, IL-6 e IL-4
(FUJIMOTO; NAKA, 2003).
A ausncia do gene SOCS1 em camundongos causa morte antes de trs semanas de
vida, com retardo no crescimento, linfocitopenia, doena heptica e falncia mltipla de
rgos. Os linfcitos destes camundongos apresentam-se ativados, mesmo quando criados em
condies specific-pathogen-free (SPF). Camundongos SOCS1 e IFNG duplo negativos no
apresentam as leses inflamatrias observadas nos somente SOCS1 negativos e possuem uma
sobrevida maior (FUJIMOTO; NAKA, 2003).
O padro da resposta contra diferentes agentes indica que ocorrem diferentes
mecanismos de ativao da imunidade adaptativa. Moncitos e clulas dendrticas humanas
infectadas in vitro apresentaram padres de expresso gnica distintos quando incubadas com
42
Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major, Leishmania donovani, T. gondii e Brugia

malayi (CHAUSSABEL et al., 2003).
Frente a complexidade de fatores envolvidos na resposta a infeco pelo T. gondii e
considerando a possibilidade da ativao de vias distintas a aquelas observadas nos
camundongos, a espcie suna foi escolhida como modelo de estudo para o presente
experimento.
A compilao das informaes at aqui reunidas foi empregada para listar os
principais genes de interesse no estudo da infeco pelo T. gondii. A compreenso dos fatores
envolvidos na resistncia dos sunos a toxoplasmose aguda poder no futuro apontar novos
caminhos para o desenvolvimento de adjuvantes de vacinas, imunoestimulantes e de terapias.
A tcnica da Real-Time PCR foi escolhida por permitir a quantificao do produto da
PCR de uma forma bastante acurada e de uma maneira bastante simples quando comparada s
provas de PCR competitivo (BUSTIN, 2000; ZARLENGA; HIGGINS, 2001). Robustez, boa
linearidade e capacidade de deteco de pequenas variaes de DNA a tornaram uma boa
alternativa para os estudos de resistncia a doenas, resposta a drogas e funes metablicas.
Visando o emprego da espcie suna como modelo para o estudo de resistncia a
doenas e afeces nutricionais, Dawson et al. (2001) catalogaram seqncias de sunos
publicadas em diferentes bancos de acesso pblico (Genbank, TIGR), desenvolveram e
testaram primers e sondas espcie especficos.
Os primeiros testes da Real-Time RT-PCR em sunos avaliaram o padro de resposta
de 24 genes infeco por T. gondii e por Ascaris suum. Os resultados mostraram-se bastante
consistentes com o esperado, revelando uma tendncia a induo de citocinas Th1 na
toxoplasmose e citocinas Th2 na infeco pelo A. suum (DAWSON et al., 2002a).
A boa performance da Real-Time RT-PCR levou ampliao da lista de genes a
serem testados. Um outro experimento avaliou-se 12 genes em amostras de linfonodo
43
mesentrico e fgado de sunos infectados por T. gondii. Em ambos os tecidos houve forte
induo dos genes IFNG e IRF1. Alm destes dois genes, no fgado observou-se alteraes
tambm em outros genes associados induo da resposta Th1, como HLX1, MYD88,
STAT1, TBX21, CD8A, CD8B e CD28 (DAWSON et al., 2004).
Nos experimentos iniciais de Dawson et al. (2002a) os sunos foram necropsiados aps
7 e 14 dias ps-infeco (DPI) pelo T. gondii e observou-se uma forte induo de IFNG no
dia 7 e uma diminuio da resposta no dia 14, sugerindo uma tendncia a resoluo do
processo aps este perodo. No presente experimento as necrpsias foram realizadas em dias
mais precoces de infeco e avaliados um maior nmero de genes.
Os genes foram selecionados com base em dados registrados em publicaes recentes
a respeito dos fatores ligados resistncia e imunopatologia da toxoplasmose e foram
categorizados segundo a funo primria em: 1) genes housekeeping (constitutivo); 2) defesa
inata e inflamatria; 3) resposta Th1; 4) resposta Th2; 5) efetor; 6) regulatrio; 7) coestimulatrio e 8) apoptose.
44
Os principais objetivos deste trabalho foram:

-
a quantificao da expresso gnica em tecidos de sunos infectados pelo T. gondii,
a avaliao da variao da expresso em diferentes perodos durante a infeco aguda,
a observao do padro de resposta local em diferentes tecidos e desta forma,
identificar possveis genes associados a resistncia a infeco.

Complementando a avaliao da expresso gnica, a resposta imune dos sunos foi
tambm acompanhada por meio de determinaes sricas de IFN-J, xido ntrico e

haptoglobina; anlise de subpopulaes de clulas por citometria de fluxo e cultura de clulas
para mensurao de produo de IFN-J. A presena do T. gondii foi confirmada pela
identificao do parasita nos tecidos e associado a leses histopatolgicas.
45
MATERIAL E MTODO
3.1 LOCAL
O experimento foi realizado nas instalaes do Departamento de Agricultura dos

Estados Unidos da Amrica (USDA), na cidade de Beltsville, Estado de Maryland, EUA. Os
sunos experimentais foram mantidos em instalaes prprias da Unidade de Parasitologia
Animal (APU) seguindo as Normas de Biosegurana do USDA. Todo material biolgico foi
processado nos Laboratrios: Immunology and Disease Resistance Laboratory (IDRL),
Parasite Biology, Epidemiology and Systematics Laboratory (PBESL)1, pertencentes ao
Animal and Natural Resources Institute (ANRI) e Nutrient Requirements and Functions
Laboratory (NRFL), do Beltsville Human Nutrition Research Center, Agricultural Research
Service (ARS), USDA.
3.2 ANIMAIS
Sunos Poland China x Landrace provenientes da fazenda experimental do USDA,

foram alojados em instalaes apropriadas com rao comercial balanceada e gua ad libitum.
O manejo dirio dos animais assim como todo procedimento experimental foram executados
pelo pessoal tcnico responsvel seguindo as normas de conduta aprovadas pelo Beltsville
Area Animal Care and Use Committee do ANRI, USDA.
1
Atualmente IDRL foi incorporado ao PBESL e denominado Animal Parasitic Diseases Laboratory.
46
Antes do incio do experimento, amostras de sangue foram colhidas para deteco de

anticorpos sricos anti-T. gondii por meio da prova de aglutinao modificada (MAT).
3.3 Toxoplasma gondii
Foram utilizadas amostras de T. gondii das cepas VEG e RH fornecidas pelo PBESL.
Oocistos de T. gondii da cepa VEG foram isolados de fezes de gatos
experimentalmente infectados (DUBEY et al., 1996). Aps a esporulao, a infectividade e a
viabilidade dos oocistos foram testados em camundongos (DUBEY et al., 1998) e utilizados
como inculo nas infeces experimentais.
A cepa VEG foi primariamente isolada de um paciente humano portador de HIV,
caracterizada como um isolado avirulento para camundongos e genotipicamente classificada
como do tipo III baseada em anlise do gene SAG (DUBEY et al., 1996; HOWE et al., 1997).
Taquizotos de T. gondii da cepa RH foram isolados e purificados do lquido asctico
de camundongos experimentalmente infectados e utilizados como controle positivo nas
reaes de PCR.
3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Foram realizados dois experimentos similares, utilizando sunos com idades variando
de trs a cinco meses de idade infectados oralmente com 4,5 x 105 oocistos de T. gondii (cepa
47
VEG). Os animais infectados foram necropsiados aps dois, quatro, sete e 14 dias de
infeco. Para cada dia de infeco, foi necropsiado um animal controle.
Os grupos experimentais foram denominados 2DPI, 4DPI, 7DPI e 14DPI de
acordo com o tempo de infeco em dias ps-infeco e Controle para o grupo de animais
no-infectados.
EXPERIMENTO I
No primeiro experimento (EXP I) foram utilizados doze animais. Os grupos 2DPI e

4DPI eram constitudos por trs animais, enquanto que os grupos Controle, 7DPI e 14DPI
eram formados por dois animais.
A resposta de defesa dos animais foi avaliada por meio de:
- Mensurao da expresso gnica em amostras de linfonodos mesentrico (LN M),
hepato-esplnico (LN HS), leo-clico (LN IC), clulas mononucleares do sangue perifrico
(CMSP), fgado, bao, timo, jejuno e leo por meio de transcrio reversa seguida de reao
em cadeia pela polimerase em tempo real (Real-Time RT-PCR).
- Mensurao dos nveis sricos de IFN-J, de xido ntrico (NO) e de haptoglobina.
- Produo de IFN-J pelas clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP) e
linfonodos.
- Anlise de subpopulaes de clulas por citometria de fluxo (FCM).
A presena do T. gondii e as leses teciduais foram avaliadas por meio de:

- Deteco de T. gondii em amostras de LN M, fgado, pulmo, bao e leo por meio
da Real-Time PCR.
48
- Exames histopatolgicos corados pela Hematoxilina e Eosina (HE) e

imunohistoqumica (IHQ).
- Funo e leso heptica foi avaliada por meio de mensurao srica de enzimas
hepticas, protenas totais, albumina, globulinas, bilirrubinas total e direta.
A partir dos resultados preliminares do EXP I, procedeu-se um segundo experimento

(EXP II), em que foram testados um painel distinto de genes na Real-Time RT-PCR. Foram
mantidos 30 genes do painel anterior, excludos 18 e includos 18 novos genes.
EXPERIMENTO II
No segundo experimento (EXP II) foram utilizados 16 animais, quatro controles e trs
animais para cada grupo infectado (2DPI, 4DPI, 7DPI e 14DPI).
A resposta imune destes animais foi acessada por meio de:
- Mensurao da expresso gnica em linfonodos mesentrico e hepato-esplnico,
fgado, jejuno e leo utilizando Real-Time RT-PCR.
- Mensurao dos nveis sricos de haptoglobina.
- Produo de IFN-J pelas CMSP, clulas dos LN M e LN HS.
A infeco e a leso causada pelo T. gondii foi avaliada por meio de:
- Exames histopatolgicos corados pela HE e IHQ.
- Perfil heptico por meio de mensurao srica de enzimas hepticas, protenas totais,
albumina, globulinas, bilirrubinas total e direta.
49
3.5 SACRIFCIO DOS SUNOS E COLHEITA DAS AMOSTRAS
Animas foram sacrificados por superdosagem de anestsicos e imediatamente

necropsiados. Amostras de tecidos e sangue foram separados e adequadamente
acondicionados para cada prova a ser realizada (Figura 3.1):
1) Colheita de tecidos para mensurao de expresso mRNA: Fragmentos de
linfonodos mesentrico, traqueo-bronquial, leo-clico e hepato-esplnico; jejuno, leo,
fgado, bao e timo foram colhidos e imediatamente congelados em nitrognio (N2) lquido,
transportados ao laboratrio e mantidos em freezer 70C at o processamento.
2) Sangue total em tubos contendo anti-coagulante (cido etileno diaminotetracetato
sdico - EDTA) para separao das CMSP e hemograma.
3) Linfonodos (hepato-esplnico, traqueo-bronquial, mesentrico) em meio de colheita
(Apndice A) para separao de clulas mononucleares para FCM e cultivo em meio para
avaliao da produo de IFN-J.
4) Amostras de LN M, fgado, bao, pulmo e leo foram mantidas em gelo e enviadas
ao laboratrio para extrao de DNA para deteco de T. gondii.
50
5) LN M, fgado, bao, pulmo e leo foram fixados em formol tamponado para exame
histopatolgico.
6) Sangue para separao de soro para deteco de anticorpos sricos anti-T. gondii,
avaliao do perfil heptico, IFN-J srico, NO e haptoglobina.
Todos os animais e material descartvel utilizados foram incinerados aps a colheita

das amostras.
Sunos infectados por T. gondii

TECIDOS
CLULAS
LN M, LN HS, LN TB
Fgado, Bao, Sangue
Jejuno, leo, Timo
CMSP, LN M,
LN HS, LN TB
SORO
DNA
mRNA
Cultura
FCM
Ac a-T. gondii
Real-Time PCR
T. gondii
Real-Time RT-PCR
expresso de genes
Produo de IFN-J
Ag de superfcie
MAT
Histologia
H&E
IHQ
IFN-J
ELISA
SANGUE TOTAL
NO
Hemograma
Contagens de
eritrcitos e
leuccitos
Funo heptica
AST, ALP, ALT
PT, Alb, Glob,
Bilirrubina
Haptoglobina
Figura 3.1 - Organograma de colheita e exame das amostras dos sunos experimentais
Beltsville - 2003
3.6 ISOLAMENTO E PREPARO DAS CLULAS
Procedeu-se o isolamento de clulas do sangue perifrico e dos linfonodos

mesentrico, hepato-esplnico e traqueo-bronquial para a realizao das culturas in vitro (item
51
3.7), anlise fenotpica de subpopulaes por citometria de fluxo (item 3.8) e extrao de
RNA (item 3.9.1).
3.6.1 Separao de Clulas Mononucleares do Sangue Perifrico
Clulas mononucleares circulantes no sangue perifrico foram separadas por meio de

gradiente de densidade. Para isto, foram colhidos 15 a 20 ml de sangue total em tubos
contendo EDTA e imediatamente enviados ao laboratrio para o processamento.
Clulas mononucleares foram separadas utilizando o meio para separao de linfcitos
(Lymphocyte Separation Medium, LSM, Cappel, Aurora, EUA)2 conforme instrues da bula.
As clulas recuperadas foram lavadas em meio PBL (Apndice B) e ressuspensas em meio
blastognico (Apndice C).
A determinao do nmero total de clulas e a estimativa da porcentagem de clulas
vivas foram feitas por microscopia ptica utilizando Azul de Trypan e hemocitmetros de
Neubauer.
3.6.2 Separao de Clulas dos Linfonodos
A separao das clulas dos linfonodos foi realizado segundo Solano-Aguilar (2000).
(SOLANO-AGUILAR et al., 2000). As amostras de linfonodo removidas durante a necrpsia
Composio LSM=6,2g Ficoll e 9,4 Na diatrizoate / 100ml; Densidade = 1.0770-1.0800 g/ml a 20C.
52
foram imediatamente colocadas em tubos cnicos contendo meio de colheita (Apndice A) e

mantidas em recipientes contendo gelo.
Aps a remoo tecido conjuntivo e adiposo adjacente, o linfonodo foi delicadamente
cortado em pequenos fragmentos em placas de Petri contendo meio de colheita, liberando as
clulas do tecido. A suspenso de clulas foi filtrada em malhas de nylon estreis de 210 Pm.
As clulas foram lavadas em HBSS (Hanks Balanced Salt Solution, Gibco, EUA) ou
RPMI-1640 (Invitrogen, Calsbad, EUA) e ressuspensas em meio blastognico. A contagem
do nmero total de clulas e da porcentagem de viabilidade foi realizada seguindo o mesmo
procedimento descrito acima.
3.7 CULTURA IN VITRO
Para avaliao da atividade das CMSP e das clulas dos LN, estas foram incubadas a
2,5 x 106/ml em meio de cultura completo (Apndice D) estimuladas com Concanavalin A
(ConA - Sigma, Saint Louis, EUA) a 10 Pg/ml por 48 horas a 37C e 5% de CO2. Ao trmino
do perodo de incubao o sobrenadante foi separado por centrifugao e mantido a 20C
para posterior mensurao de IFN-J.
53
3.8 ANLISE DE SUBPOPULAES DE CLULAS
A caracterizao fenotpica de sub-populaes de CMSP e clulas isoladas dos LN M,

HS e TB foi realizada por citometria de fluxo aps a identificao por meio de anticorpos
monoclonais anti: CD45 (clone 74-9-3), SLAI (clone PT85), CD2 (clone MSA4), CD16
(clone G7), CD3 (clone BB23 8E6), CD25 (clone 231-3B2), CD4 (clone 74-12-4), CD8
(clone 76-2-11), SLAII DQ (clone TH16), SWC3 (clone 74-22-15B) e CD21 (clone CC51)
(SAALMUELLER et al., 1998). Aps incubao com anti-Ig especfico (IgG1, G2a ou G2b)
conjugado a isotiocianato de fluorescena (FITC) ou ficoeritrina (PE), a proporo relativa das
sub-populaes foi estimada aps a leitura de dez mil clulas por citometria de fluxo no
EPICS-XL MCL (Beckman-Coulter, EUA). Foram tambm realizadas as determinaes de
populaes de clulas duplo-positivas (DP) para CD2/CD16, CD3/CD25, CD4/CD8 e
SWC3/SLADQ. (SOLANO-AGUILAR et al., 2001; SOLANO-AGUILAR et al., 2000).
3.9 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA A REAL-TIME RT-PCR
As amostras de tecidos e clulas foram conservadas em freezer 70C para a

determinao da expresso gnica. Foram realizadas extraes do RNA, determinao da
concentrao do RNA, remoo de possveis resduos de DNA genmico, verificao da
qualidade e da concentrao do RNA aps o tratamento com DNase e sntese de cDNA.
54
3.9.1 Extrao de RNA
Amostras de clulas ou de tecido foram homogenizadas no reagente Trizol

(Invitrogen, Carlsbad, EUA). Foram empregadas as propores de: 1x107 clulas em 1 ml de
reagente Trizol ou at 50 mg de tecido em 1 ml de reagente Trizol. Os tecidos congelados
foram inicialmente macerados com cadinho e pistilo em nitrognio lquido e imediatamente
homogenizadas em Trizol utilizando homogenizador de tecidos (Polytron, EUA).
O RNA foi extrado seguindo protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, EUA) e
mantido em freezer 70C.
3.9.2 Quantificao de RNA por Espectrofotometria
Amostras de RNA foram diludas em tampo TrisEDTA (10mM Tris-HCl, 1mM

EDTA pH 8,0). A concentrao do RNA foi estimada aps leitura da absorvncia a 260 e 280
nm em espectrofotmetro (DU640, Beckman Coulter, EUA).
55
3.9.3 Tratamento com DNase
Com intuito de remover possveis resduos de DNA genmico, todas as amostras de

RNA foram adsorvidas em colunas RNeasy (Qiagen, Valencia, EUA) e incubadas com DNase
(RNase-free DNase set, Qiagen, Valencia, EUA).
3.9.4 Determinao da Concentrao e da Qualidade do RNA
A concentrao e a integridade do RNA foram mensuradas pelo RNA 6000 nano

Assay utilizando o equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto,
EUA). A quantificao do RNA foi determinado baseado no padro RNA 6000 Ladder
(Ambion, Austin, EUA).
56
3.9.5 Sntese de cDNA
cDNA foi sintetizado por transcriptase reversa a partir de 10 Pg de RNA total

utilizando Superscript II RnaseH- Reverse Transcriptase e Oligo(dT)12-18 (Invitrogen,
Carlsbad, EUA) em presena de inibidores de ribonucleases (RNaseOUT recombinant
ribonuclease inhibitor, Invitrogen, Carlsbad, EUA), seguindo as recomendaes do fabricante.
As amostras de cDNA foram mantidas em freezer 20C at a realizao das provas
de Real-Time PCR.
3.10 REAL-TIME PCR
Reagentes espcie especficos foram desenvolvidos para a realizao da Real-Time

PCR. Antes do incio dos experimentos, a capacidade de deteco das variaes na expresso
dos genes foi testado em sunos submetidos a diferentes infeces (DAWSON et al., 2002b).
57
3.10.1 Genes
A seleo dos genes foi realizada a partir de dados obtidos da literatura referente a
defesa contra a toxoplasmose em camundongos. Foi dada nfase resposta associada ao IFNJ, genericamente conhecida como resposta Th1 e tambm includos genes ligados induo,
modulao, apoptose e resposta inflamatria conforme apresentado no quadro 3.1. Os genes
podem possuir funes diferentes das aqui listadas porm foram arbitrariamente organizados
segundo a funo primria pela qual foi testado.
As siglas seguem a nomenclatura oficial adotada para genes humanos conforme o
Human Gene Nomenclature Committee (HGNC) do Human Genome Organization (HUGO).
Devido a constantes atualizaes na nomenclatura, possveis diferenas podem ser notadas
entre as siglas aqui adotadas e as atualmente vigentes. As informaes do quadro referem-se
s publicadas em janeiro de 2004 no site <http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature> e foram
mantidos os nomes originais em ingls.
58
(continua)
Funo
primria
Gene
Nome e nomes alternativos
Nmero de
acesso
EXP
Housekeeping
RPL13A
Ribosomal protein L13a
Z84103
Housekeeping
RPL32
Ribosomal protein L32
F14630
I e II
Inato /
Inflamatrio
IFNA1
Interferon, alpha 1
X57191
I e II
Inato /
Inflamatrio
IL1B
Interleukin 1, beta
X74568
I e II
Inato /
Inflamatrio
IL6
Interleukin 6, interferon beta 2
M86722
I e II
Inato /
Inflamatrio
ORM1
OrosomucoidD-acid glycoprotein
M35990
Inato /
Inflamatrio
TNF
Tumor necrosis factor; TNF superfamily,

member 2, TNFA
X54001
I e II
Inato /
Inflamatrio
TNFRSF1A
Tumor necrosis factor receptor superfamily,

member 1A, TNFR p55, TNFR1
U19994
Inato /
Inflamatrio
TLR2
Toll-like receptor 2
BF442348
I e II
Inato /
Inflamatrio
TLR4
Toll-like receptor 4
TC43435
I e II
Inato /
Inflamatrio
CRP
C-Reactive protein, pentraxin-related
AB005545
II
Inato /
Inflamatrio
MYD88
Myeloid differentiation primary response

gene 88, MyD88
AY435217
II
Inato /
Inflamatrio
FCGR3A
Fc fragment of IgG, low affinity IIIa,

receptor , CD16
AF372453
II
Inato /
Inflamatrio
IL8
Interleukin 8, CXCL8
M86923
II*
Inato /
Inflamatrio
CCL2
Chemokine (C-C motif) ligand 2, MCP-1
Z48479
II*
Inato /
Inflamatrio
CCL5
Chemokine (C-C motif) ligand 5, RANTES
F14636
II*
Quadro 3.1 Genes avaliados pela Real-Time RT-PCR nos sunos infectados por T. gondii. Funo
primria, siglas dos genes, nomes e nomes alternativos, nmero de acesso no Genbank
das seqncias utilizadas para o desenho dos primers e sondas e nmero do
experimento (EXP) em que foi testado Beltsville - 2003
59
(continua)
Funo
primria
Gene
Nmero de
acesso
EXP
Th1
IFNG
Interferon gamma
X53085
I e II
Th1
IFNR1
Interferon gamma receptor 1, CDw119
IL12A
Interleukin 12A (Natural killer cell

stimulatory factor 1, cytotoxic lymphocyte
maturation factor 1, p35)
L35765
I e II
Th1
IL12B
Interleukin 12B (Natural killer cell

stimulatory factor 2, cytotoxic lymphocyte
maturation factor 2, p40)
U08317
I e II
Th1
IL12RB2
Interleukin 12 receptor, beta 2
AF448143
I e II
Th1
IL15
Interleukin 15
U58142
I e II
Th1
IL18
Interleukin 18, interferon-gamma-inducingfactor
AF176949
I e II
Th1
IL18R
Interleukin 18 receptor
AB079258
II
Th1
IL23A
Interleukin 23, alpha subunit p19, SGRF
AB030002
Th1
IRF1
Interferon regulatory factor 1
TC86234
I e II
Th1
HLX1
H2.0-like homeo box 1
TC98154
II**
Th1
ICSBP1
IFN consensus sequence binding protein 1
AY435218
II**
Th1
TBX21
T-bet
AY435216
II**
Th1
LEP
Leptin
F167719
Th1
LEPR
Leptin Receptor
AF203034
Th1
STAT1
Signal transducer and activator of

transcription 1, 91kDa
TC95137
I e II
Th1
STAT4

transcription 4
AB020984
I e II*
Th1
SOCS1
Suppressor of cytokine signalling 1, STATinduced STAT inhibitor 1, SSI1
TC63788
Th1
SOCS2
BE031084
Th1
II
60
(continua)
Funo
primria
Gene
Nmero de
acesso
EXP
Th2
IL4
Interleukin 4
X68330
I e II
Th2
IL5
Interleukin 5, colony-stimulating factor,

eosinophil
SSC010088
I e II*
Th2
IL13
Interleukin 13
AF385626
I e II
Th2
GATA3
GATA binding protein 3
TC62266
II
Th2
STAT6

transcription 6
TC56734
Th2
SOCS3
BM485092
Efetor
INDO
Indoleamine-pyrrole 2,3 dioxygenase, IDO
TC38943
I e II
Efetor
NOS2A
Nitric oxide synthase 1, inducible, iNOS
U59390
I e II
Efetor
ARG1
Arginase 1, liver
AYO39112
I e II
SLC11A1
Solute carrier family 11, proton-coupled

divalent metal ion transporters, member 1
(Natural Resistance Associated Macrophage
Protein, NRAMP1)
AF132037
I e II
Efetor
SLC11A2
Solute carrier family 11, proton-coupled

divalent metal ion transporters, member 2
(Natural Resistance Associated Macrophage
Protein, NRAMP2)
AW417353
Efetor
IGM
IgM, Immunoglobulin M constant region
M92050
I e II
Efetor
IGG
IgG, Immunoglogulin G constant region
AF062384
I e II
Efetor
IGA
IgA, Immunoglobulin A constant region
U12594
I e II
Efetor
CD19
B-lymphocyte antigen
AF466765
Regulatrio
IL2
Interleukin 2
X56750
Regulatrio
IL2RA
Interleukin receptor, alpha; CD25
U78317
Regulatrio
IL10
Interleukin 10
L20001
I e II
Efetor
61
(concluso)
Funo
primria
Gene
Nmero de
acesso
EXP
Regulatrio
TGFB1
Transforming growth factor, beta 1
M23703
I e II
Regulatrio
TGFB2
X70142
Regulatrio
TGFB3
X14150
Regulatrio
CSF2
GM-CSF, Colony stimulating factor 2,

granulocyte-macrophage
D21074
Regulatrio
MHC2TA
MHC class II transactivator, CIITA
AY084053
I e II
Coestimulatrio
ICOS
Inducible T-cell co-stimulator
BE015025
II
Coestimulatrio
CD3E
CD3E antigen, epsilon polypetide (TiT3

complex)
U08270
I e II
Coestimulatrio
CD28
CD28 antigen, (Tp44)
AY435219
II**
Clulas T /
Coestimulatrio
CD69
CD69 antigen, p60, early T-cell activation

antigen
AF484233
I e II
Coestimulatrio
CTLA4
Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein

4, CD152
AF220248
II
Coestimulatrio
TNFRSF5

member 5, CD40
AF248545
II
Coestimulatrio
TNFSF5
Tumor necrosis factor (ligand) superfamily,

member5, CD40L, CD154
AF263915
II
Coestimulatrio
CD80
B7-1, CD28 antigen ligand 1, B7-1 antigen
AB049760
II
Coestimulatrio
CD86
B7-2, CD28 antigen ligand 2, B7-2 antigen
L76099
II
Apoptose
TNFRSF6

member 6; CD95; Fas
SSJ001202
II**
Apoptose
CASP1
Caspase, Apoptosis-related cysteine protease
AB027296
II
*somente em amostras de jejuno do EXP II, ** exceto as amostras de jejuno do EXP II
62
3.10.2 Otimizao da Real-Time PCR
As seqncias dos genes a serem testados foram obtidas de bancos de dados pblicos
do National Center for Biotechnology Information (Genbank, NCBI) e do The Institute for
Genomic Research (TIGR). Os primers e as sondas foram desenhados utilizando o software
Primer Express verso 1.5a (PE Applied Biosystems, Foster City, EUA). Os critrios para
desenho de primers e sondas esto listados no apndice E. Primers e sondas foram
sintetizados por Biosource (Biosource International Inc., Camarillo, EUA).
O processo de padronizao da reao e a avaliao dos primers e sondas foram
apresentadas em encontros por Dawson et al. (2002b) e os resultados enviados para
publicao. No apndice F est um resumo dos principais passos seguidos para a avaliao de
cada conjunto de primers e sonda.
A lista completa contendo as seqncias e as concentraes timas dos primers e das
sondas estaro disponibilizadas na homepage do USDA <http://www.anri.barc.usda.gov>.
3.10.3 Condies da Reao e Anlise dos Resultados
Os ensaios foram realizados no ABI Prism 7700 Sequence Detection System (PE
Applied Biosystems, Foster City, EUA) e os resultados analisados utilizando o software
Sequence Detection System verso 1.7a (SDS 1.7a, PE Applied Biosystems).
Para cada reao foram utilizados 100ng de cDNA (quantidade de cDNA calculado a
partir da quantidade de RNA, item 3.9.5).
63
As reaes foram preparadas utilizando o Brilliant Quantitative PCR Core Reagent

kit (Stratagene, La Jolla, EUA) segundo as recomendaes do fabricante. A concentrao de
cloreto de magnsio (MgCl2) foi ajustado para 5,5mM e volume final da reao foi 25Pl.
Os pares de corantes fluorescentes, indicador e de extino, foram respectivamente
FAM-TAMRA e TET-BHQ1. Para todas as reaes utilizou-se o corante ROX como
referncia.
O termo-ciclador foi programado para realizar 50C por 2 minutos; 95C por 10
minutos e 40 repeties de 95C por 15 segundos e 60C por um minuto.
Ao final da reao todas as curvas de amplificao foram analisadas e os resultados da
Real-Time PCR expressos em valores de Ct (nmero de ciclos necessrios para atingir o
limiar de deteco). O limiar de deteco foi determinado a partir dos nveis basais de
fluorescncia detectados nos ciclos iniciais (entre os ciclos trs e dez) mais 20 vezes o desvio
padro (Figura 3.2).
Figura 3.2 - Visualizao grfica da amplificao pela Real-Time PCR. O ABI7700 detecta a emisso
de fluorescncia - 'Rn (nas ordenadas) ao longo dos 40 ciclos trmicos da reao (na
abscissa). Os resultados so expressos em valores de Ct que indica o nmero de ciclos
necessrios para que o sinal fluorescente atinja o limiar de deteco - Beltsville - 2003
64
Todas as amostras foram testadas em duplicatas. Para a anlise quantitativa foi adotada
a mesma quantidade de cDNA (100ng) em todas as reaes e utilizou-se as mdias dos
valores de Ct obtidos das duplicatas. Os resultados mdios foram agrupados em Controle,
2DPI, 4DPI, 7DPI e 14DPI e submetidos a anlise de varincia (ANOVA). Utilizou-se o
Teste de Tukey-Kramer para comparaes mltiplas entre os grupos infectados e controle
com significncia de 0,05 (JMP 5.0.1.2, SAS Institute Inc, Cary, EUA). Os resultados foram
expressos em aumento ou diminuio da expresso gnica comparando-se os grupos
infectados ao controle.
Para o clculo da variao da expresso gnica utilizou-se a diferena absoluta entre as
mdias do grupo infectado e controle elevado ao logaritmo de base dois.
Variao da expresso gnica = 2 |CmCti -CmCtc |
Onde:
mCti = mdia dos valores de Ct dos animais do grupo infectado (2, 4, 7 ou 14 DPI) e
mCtc = mdia dos valores de Ct dos animais do grupo controle
Os valores numricos foram convertidos em representao grfica utilizando os

softwares Treeview verso 1.60 e GeneCluster v. 2.20 (Stanford University, 1998). Foi
estabelecido a cor vermelha para diminuio da expresso gnica e verde para aumento da
expresso. A intensidade da cor indica a magnitude da resposta, isto , quanto maior induo
ou inibio, maior a intensidade da cor. Variao menor a 1,5 entre controle e infectados
indicada em branco (DAWSON et al., 2002b)
65
3.11 DETERMINAO DE IFN-J
A deteco de IFN-J presente no sobrenadante dos meios de cultura foi feito pelo
mtodo de ELISA. Utilizou-se os monoclonais produzidos pelo clone P2G10 para a captura e
P2C11 para a deteco de IFN-J (MATEU DE ANTONIO et al., 1998).
A determinao de IFN-J srico foi medido por um ELISA comercial que utiliza os
monoclonais 5B8 e 13C5, para a captura e para a deteco, respectivamente (Cytosets,
Biosource, Camarillo, CA, EUA).
3.12 PERFIL HEPTICO E HEMOGRAMA
Determinao do perfil heptico (valores sricos de aspartato aminotransferase (AST),

alanino aminotransferase (ALT), gama glutamil transferase (GGT), bilirrubinas totais
(TBILI), bilirrubina direta (DBILI), protenas totais (PT), globulinas (GLOB), albumina
(ALB) e proporo albumina/globulina (A/G)) e do hemograma (contagem do nmero total
de leuccitos (Leu), nmero total (T) e relativo (%) de neutrfilos (Ne), linfcitos (Li),
moncitos (Mo), eosinfilos (Eo), basfilos (Ba), nmero total de eritrcitos (He),
concentrao de hemoglobina (Hb), volume globular (Hct), volume corpuscular mdio
(MCV), hemoglobina corpuscular mdia (MCH) e concentrao hemoglobnica corpuscular
mdia (MCHC)) foram realizados pelo servio veterinrio do ARS, USDA.
66
3.13 DETERMINAO DE XIDO NTRICO
xido ntrico (NO) foi medido pelo mtodo de Griess (VERDON; BURTON; PRIOR,
1995) em soro previamente centrifugado em filtro Centricon YM 30kDa, (Millipore Corp,
Beveryl, MA) a 5000 xg durante uma hora. NO3- foi reduzido a NO2- com nitrato reductase e
mensurado colorimetricamente contra curvas padro de NO3 e NO2 (0,5 a 0,0156 PM).
3.14 DETERMINAO DE HAPTOGLOBINA
Determinao dos nveis haptoglobina srica foi realizada utilizando o kit Haptoglobin
(TP801, Tri-Delta Development Ltd., Kildare, Irlanda) de acordo com as instrues do
fabricante.
3.15 DETECO DE ANTICORPOS ANTI-T. gondii
Anticorpos sricos anti-T. gondii foram detectados pela prova de aglutinao

modificada - MAT (DUBEY, 1997; DUBEY; DESMONTS, 1987). Foram consideradas
positivas todas as amostras de soro reagentes a partir da diluio 1:25.
67
3.16 DETECO DE T. gondii
Pesquisa de T. gondii em fragmentos de fgado, pulmo, linfonodo mesentrico, leo e

bao foi realizada por meio de Real-Time PCR. Tecidos foram previamante digeridos em
tripsina (DUBEY, 1998) e DNA foi extrado utilizando proteinase K e DNeasy (Qiagen,
Valencia, EUA). A concentrao de DNA foi estimada em espectrofotmetro (Beckman
Coulter DU640, EUA) com leituras a 260 e 280 nm. Real-Time PCR foi realizado utilizando
TaqMan buffer (Applied Biosystems, Foster City, EUA) e conjunto de primers e sonda
especficos ITS1 para a deteco de T. gondii (JAUREGUI et al., 2001) e primers 18S
(TaqMan Ribosomal control, Applied Biosystems, Foster City, EUA) para a deteco de gene
housekeeping. Como controle positivo utilizou-se DNA de taquizotos de T. gondii.
3.17 ANLISE ESTATSTICA
Os grupos controle e infectados foram comparados por anlise de varincia (ANOVA)

e teste de Tukey-Kramer com comparaes mltiplas entre os grupos infectados e controle e
valor de D=0,05 (JMP verso 5.0.1a, SAS Institute, Cary, EUA).
68
4 RESULTADOS
A anlise preliminar dos resultados de expresso gnica medida pela tcnica da RealTime RT-PCR revelou diferenas no tempo de resposta entre os animais infectados dos EXP I
e EXP II. A resposta tecidual dos animais do EXP I tende a uma maior intensidade no 4DPI,
enquanto que no EXP II, o pico da resposta parece estar aos 7DPI.
No EXP I foram utilizados leites mais jovens, com idade mdia de trs meses,
enquanto que no EXP II, a idade mdia dos animais era de quatro e meio a cinco meses.
Utilizou-se o mesmo lote de oocistos de T. gondii em ambos experimentos, calculando-se a
quantidade de oocistos viveis aps testes em camundongos. O intervalo entre os EXP I e
EXP II de 11 meses.
Considerando estas diferenas na resposta tecidual os resultados foram mantidos em
separado.
4.1 EXPERIMENTO I
4.1.1 Exames Histo-Patolgicos e Parasitolgicos
A presena de T. gondii nos tecidos foi detectada por mtodos moleculares (PCR) e
imunolgicos (IHQ) conforme mostra o quadro 4.1.1. No 2DPI o parasita foi detectado
somente em amostras de LN M. No 4DPI foi encontrado em todos os tecidos testados e em
quantidades maiores. No 7DPI h um destacado aumento das leses histopatolgicas
69
principalmente no LN M e fgado, com intenso infiltrado inflamatrio, acompanhado de reas

difusas de edema e necrose. Em um animal foram detectados grande nmero de parasitas e no
outro, no foi detectado nenhum parasita, mas ambos com leses similares. No 14DPI, houve
menor isolamento de parasitas e alteraes menos intensas nos tecidos. No foi detectado T.
gondii nas amostras dos sunos do grupo controle.
Mtodo
Grupo
Animal
PCR*
IHQ**
LNM Fgado Pulmes Bao leo
LNM Fgado Pulmes Bao leo
2DPI
1
2
3
++
+
-
+
+
4DPI
4
5
6
+++
+++
++
++
++
-
++
++
-
++
++
+
++
++
+
+++
+
+
+
-
+
+
+
-
7DPI
7
8
+++
++
++
NT
NT
NT
NT
14DPI
9
10
+
-
NT
NT
NT
NT
* PCR +++ = Ct < 25; PCR ++ = Ct entre 25 e 35; PCR + = Ct > 35

** IHQ +++ elevado nmero de parasitos, ++ moderada quantidade de parasitos, + poucos parasitos,
- parasitos no detectados
NT = no testado
Quadro 4.1.1 - Deteco de T. gondii em tecidos de sunos nos diferentes dias ps-infeco
(DPI) pelas tcnicas de PCR e imunohistoqumica (IHQ) - Beltsville 2003
Tabela resumida listando a presena de T. gondii juntamente com os valores sricos

individuais de aspartato aminotransferase (AST), xido ntrico (NO), haptoglobina e IFNJassim como a produo de IFN-J pelas CMSP e clulas dos LN M, LN HS e LN TB dos
animais experimentais encontra-se no apndice G.
70
4.1.2 Pesquisa de Anticorpos Anti-T. gondii
Todos os animais apresentavam-se soronegativos antes da inoculao de T. gondii. A

prova de MAT no detectou anticorpos especficos nos animais dos grupos Controle, 2DPI,
4DPI e 7DPI. Os dois animais do grupo 14DPI apresentaram reao positiva diluio 1:50.
4.1.3 Perfil Heptico
A tabela 4.1.1 apresenta os valores mdios de aspartato aminotransferase (AST),

alanino aminotransferase (ALT), gamaglutamil transferase (GGT), bilirrubinas totais (TBILI),
bilirrubina direta (DBILI), fosfatase alcalina (ALP), protenas totais (PT), globulinas (GLOB),
albumina (ALB) e proporo albumina/globulina (A/G) no soro dos animais experimentais.
No foram observadas alteraes estatisticamente significantes nos testes de avaliao
heptica em relao ao grupo Controle.
Foi detectado um discreto aumento de AST srico no grupo 4DPI e uma maior
elevao no 7DPI, entretanto sem diferena estatstica significante (Grfico 4.1.1).
71
Tabela 4.1.1 - Mdia e desvio-padro (DP) dos valores de aspartato aminotransferase (AST),
alanino aminotransferase (ALT), gamaglutamil transferase (GGT),
bilirrubinas totais (TBILI), bilirrubina direta (DBILI), protenas totais (PT),
globulinas (GLOB), albumina (ALB) e proporo albumina/globulina (A/G)
das amostras de soro de sunos infectados com T. gondii e controles no
infectados. Diferena estatstica (Estat.) segundo teste de Tukey-Kramer
(D=0,05) - Beltsville 2003
Determinao
Controle
2DPI
4DPI
7DPI
14DPI
srica
Mdia DP Estat. Mdia DP Estat. Mdia DP Estat. Mdia
DP Estat. Mdia DP Estat.
AST (U/l)
28,0
7,1
28,3
0,6
57,7
1,5
30,0
9,9
ALT (U/l)
21,5
3,5
AB
22,7
3,1
AB
18,3
2,1
28,5
2,1
21,5
2,1
AB
GGT (U/l)
38,5
2,1
33,7
3,2
35,0 12,2
25,0
0,0
17,0
5,7
0,1
0,0
0,1
0,0
0,3
0,1
0,2
0,1
TBILI (mg/dl)
0,2
0,1
102,0 100,4
DBILI (mg/dl)
0,1
0,0
0,1
0,0
0,1
0,1
0,2
0,1
0,1
0,0
PT (g/dl)
5,9
1,0
5,8
0,3
6,0
0,5
5,2
0,8
5,4
0,8
GLOB (g/dl)
2,8
0,6
2,6
0,1
3,2
0,5
2,9
0,4
3,4
0,5
ALB (g/dl)
A/G
3,1
1,1
0,4
0,1
A
A
3,1
1,2
0,2
0,0
A
A
2,5
0,6
0,5
0,5
A
A
2,3
0,8
0,4
0,0
A
A
2,0
0,6
0,3
0,0
A
AB
DPI - dias ps-infeco, letras distintas na mesma linha indicam diferena estatstica
200
AST (U/l)
150
100
50
0
Controle
2DPI
4DPI
7DPI
14DPI
Grfico 4.1.1 - Nveis de aspartato aminotransferase (AST) srico em sunos dos grupos
controle e infectados pelo T. gondii - Beltsville - 2003
72
4.1.4 Determinao de IFN-J
O limiar de deteco da tcnica de ELISA descrito por Mateu de Antonio et al. (1998)
foi de 1,2 ng/ml. O IFN-J do sobrenadante do cultivo de clulas foi adequadamente
mensurado por esta tcnica, porm no foi possvel determinar a quantidade de IFN-J presente
no soro.
As amostras de soro foram ento testadas utilizando o kit Cytosets (Biosource,
Camarillo, EUA) que utiliza um par de monoclonais distinto e apresentou o limiar de deteco
de 400 pg/ml.
4.1.4.1 IFN-J Srico
No foi detectado IFN-J srico nos animais dos grupos Controle e 14DPI. O pico de
produo de IFN-J foi detectado no 4DPI (Grfico 4.1.2). Estatisticamente esta elevao dos
nveis de IFN-J srico no foi significante.
20000
IFN-J (pg/ml)
15000
10000
5000
0
Controle
2DPI
4DPI
7DPI
14DPI
Grfico 4.1.2 - Nveis de IFN-J srico em sunos dos grupos controle e infectados pelo T. gondii
medido pelo mtodo de ELISA - Beltsville 2003
73
4.1.4.2 Produo de IFN-J
Com intuito de avaliar a produo de IFN-J procedeu-se o isolamento e o cultivo de

clulas dos LN e PBMC in vitro. A quantificao de protenas presentes no sobrenadante
destas clulas demonstra que clulas dos LN M e HS isoladas dos animais do 7DPI
produziram maior quantidade de IFN-J que as clulas do LN TB e PBMC (Grfico 4.1.3).
Todavia esta elevao na produo, no foi estatisticamente significante.
CMSP
100
IFN-J (ng/ml)
LN M
LN HS
LN TB
50
0
Controle
2DPI
4DPI
7DPI
14DPI
Grfico 4.1.3 - Produo de IFN-J por clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP),
do linfonodo mesentrico (LN M), do linfonodo hepato-esplnico (LN HS) e
do linfonodo traqueo-bronquial (LN TB) de sunos dos grupos controle e
infectados pelo T. gondii durante cultivo em ConA por 24 horas medida pelo
mtodo de ELISA - Beltsville - 2003
74
4.1.5
Determinao de NO
O grfico 4.1.4 representa os nveis de NO presentes no soro dos animais

experimentais. Foram detectados valores significantemente maiores de NO srico no 4DPI.
200
D=0,05
NO (PM)
150
100
50
0
Controle
2DPI
4DPI
7DPI
14DPI
Grfico 4.1.4 - Nveis de xido ntrico (NO) no soro de sunos dos grupos controle e
infectados pelo T. gondii medido pelo mtodo de Griess - Beltsville 2003
75
4.1.6
Determinao de Haptoglobina
O grfico 4.1.5 apresenta os resultados de haptoglobina srica dos animais

experimentais. Foi detectado um aumento significante dos nveis de haptoglobina nos animais
dos grupos 4DPI, 7DPI e 14DPI em relao ao grupo Controle.
Haptoglobina (mg/ml)
* D= 0,05
7DPI
14DPI
5
4
3
2
1
0
Controle
2DPI
4DPI
Grfico 4.1.5 Nveis de haptoglobina em sunos dos grupos controle e infectados pelo T.
gondii medido por mtodo colorimtrico - Beltsville - 2003
4.1.7
Anlise de Subpopulaes de Clulas
As tabelas 4.1.2 a 4.1.5 apresentam a proporo fenotpica de subpopulaes de

clulas dos LN M, LN HS, LN TB e CMSP.
No LN M foi observado uma tendncia de aumento na concentao relativa de clulas
CD2/CD16 duplo positivos (DP) referente populao de clulas NK no 4DPI e 7DPI. No
76
14DPI esta elevao foi estatisticamente significante. No foram observadas alteraes dignas
de nota na proporo das demais subpopulaes de clulas.
No LN HS a variao da populao de CD2/CD16 DP tambm apresentou uma ligeira,
porm no significativa elevao no 4DPI e 14DPI. Aumento significante na porcentagem
(%) clulas NK foi detectada no 7DPI. No foram detectadas alteraes dignas de nota nas
demais subpopulaes de clulas.
No LN TB detectou-se uma elevao signficativa da proporo de clulas NK nos
grupos 4DPI, 7DPI e 14DPI. No foram detectadas alteraes estatiticamente significativas
nas demais subpopulaes de clulas.
Nas CMSP a variao na proporo de clulas NK no foi estatisticamente significante
quando comparada aos valores do grupo Controle, entretanto observa-se uma elevao na %
de clulas NK no 4DPI e 14DPI, com pico no 7DPI.
Ainda nas CMSP h uma elevao no significativa na % de SWC3 / SLA DQ DP no
4DPI e 7DPI e de CD21 no 7DPI.
Mdia
89,5
98,0
81,5
5,5
4,5
69,5
15,5
9,5
38,0
39,0
11,0
51,0
5,5
5,5
19,0
Controle
DP
9,2
1,4
12,0
0,7
0,7
13,4
2,1
0,7
2,8
8,5
0,0
0,0
0,7
0,7
4,2
Estat.
A
A
A
B
B
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
AB
Mdia
69,3
97,0
75,7
6,7
5,7
62,0
13,7
9,0
34,0
33,0
8,7
47,3
6,0
5,3
24,3
2DPI
DP
27,0
1,7
4,6
1,2
1,2
6,2
3,1
1,0
1,7
7,0
1,5
5,5
1,0
1,2
5,7
Estat.
A
A
A
B
B
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
Mdia
89,0
94,3
72,7
11,3
10,7
48,3
13,3
7,7
24,0
25,3
6,3
55,7
11,0
9,3
13,3
4DPI
DP
6,9
2,1
7,1
2,5
2,5
1,5
1,2
1,2
1,7
1,2
0,6
5,7
1,7
2,5
2,5
Estat.
A
A
A
AB
AB
A
A
A
A
B
A
A
A
A
AB
Mdia
85,0
72,0
68,5
16,0
15,0
52,5
9,5
5,5
28,0
33,0
10,0
46,0
8,0
7,5
11,0
7DPI
DP
2,8
0,0
3,5
4,2
4,2
2,1
7,8
3,5
2,8
7,1
4,2
9,9
2,8
2,1
4,2
Estat.
A
A
A
AB
AB
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
B
Mdia
92,5
83,0
75,0
19,0
18,0
63,5
9,5
6,0
36,0
47,0
13,5
53,0
8,0
7,5
6,0
14DPI
DP
7,8
xx
7,1
5,7
5,7
10,6
4,9
2,8
11,3
4,2
9,2
1,4
2,8
2,1
0,0
Estat.
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas do linfonodo mesentrico em sunos aps a infeco por T. gondii .
Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos experimentais Beltsville - 2003
DPI - dias ps-infeco, Letras distintas na mesma linha indicam diferena estatstica (D=0,05), duplo positivos
CD45
SLA I
CD2
CD16
CD2/CD16 DP
CD3
CD25
CD3/CD25 DP
CD4
CD8
CD4/CD8 DP
SLA II DQ
SWC3
SWC3/SLADQ DP
CD21
Antgeno
Tabela 4.1.2 -
Mdia
67,5
90,5
67,5
6,0
5,0
55,0
13,0
8,0
28,0
31,5
6,5
45,0
6,5
6,0
19,0
Controle
DP
30,4
12,0
7,8
1,4
0,0
2,8
4,2
1,4
1,4
6,4
0,7
9,9
2,1
1,4
8,5
Estat.
A
A
A
B
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
75,0
86,3
50,7
6,7
5,0
50,3
17,7
10,7
27,7
22,7
7,7
48,7
7,3
6,7
22,0
2DPI
DP
15,1
19,4
16,6
2,1
1,7
11,6
3,5
2,1
8,6
7,8
3,2
12,5
0,6
0,6
3,5
Estat.
A
A
A
B
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
76,0
87,5
55,5
8,0
7,0
54,0
11,5
7,0
23,0
27,3
5,7
51,0
8,7
6,0
17,0
4DPI
DP
28,3
17,7
10,6
1,4
1,4
17,0
2,1
1,4
2,0
4,5
1,2
2,0
1,2
3,5
1,0
Estat.
A
A
A
B
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
70,0
93,0
74,0
15,5
13,5
61,5
12,0
7,0
35,5
36,0
12,5
56,5
9,0
8,0
15,5
7DPI
DP
xx
2,8
2,8
3,5
3,5
3,5
8,5
4,2
0,7
9,9
4,9
0,7
2,8
2,8
0,7
Estat.
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
77,5
95,5
76,5
10,0
7,5
68,5
14,0
8,5
37,0
33,5
9,5
43,0
5,5
5,0
15,0
14DPI
DP
26,2
4,9
4,9
2,8
3,5
0,7
2,8
2,1
0,0
7,8
4,9
5,7
0,7
0,0
0,0
Estat.
A
A
A
AB
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas do linfonodo hepato-esplnico em sunos aps a infeco por T.
gondii . Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos
experimentais - Beltsville - 2003
CD45
SLA I
CD2
CD16
CD2/CD16 DP
CD3
CD25
CD3/CD25 DP
CD4
CD8
CD4/CD8 DP
SLA II DQ
SWC3
SWC3/SLADQ DP
CD21
Antgeno
Tabela 4.1.3 -
78
Mdia
78,4
98,4
43,5
3,1
2,0
41,0
7,7
4,9
46,3
48,5
12,7
40,1
5,2
5,0
6,8
Controle
DP
23,1
0,8
60,2
1,3
1,6
56,6
7,5
5,8
0,4
9,2
5,2
1,3
3,1
2,8
7,4
Estat.
A
A
A
C
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
82,6
98,5
54,8
6,2
4,4
42,6
13,7
9,3
44,7
29,3
14,0
46,7
7,3
7,3
22,3
2DPI
DP
15,6
0,5
36,9
0,7
1,1
36,1
9,2
7,3
3,5
4,2
2,0
8,5
1,5
1,5
3,1
Estat.
A
A
A
C
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
89,7
96,3
80,0
9,7
8,7
72,0
17,0
13,7
46,3
33,7
13,3
45,0
6,7
6,0
15,7
4DPI
DP
7,8
2,5
6,0
0,6
0,6
8,2
1,0
1,5
8,5
1,2
1,5
12,2
1,5
1,0
5,8
Estat.
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
97,0
94,5
64,0
13,0
12,0
49,5
10,0
5,5
35,0
42,0
14,0
57,0
11,0
11,0
20,5
7DPI
DP
1,4
3,5
14,1
1,4
1,4
12,0
8,5
3,5
11,3
15,6
1,4
12,7
4,2
4,2
4,9
Estat.
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
89,0
99,0
76,5
14,0
12,3
63,5
15,5
9,0
37,0
35,0
10,5
47,5
7,5
6,5
20,5
14DPI
DP
11,3
0,0
0,7
1,4
1,1
0,7
0,7
0,0
2,8
1,4
2,1
6,4
0,7
0,7
3,5
Estat.
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas do linfonodo traqueo-bronquial de sunos aps a infeco por T.
gondii . Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos
CD45
SLA I
CD2
CD16
CD2/CD16 DP
CD3
CD25
CD3/CD25 DP
CD4
CD8
CD4/CD8 DP
SLA II DQ
SWC3
SWC3/SLADQ DP
CD21
Antgeno
Tabela 4.1.4 -
79
Controle
Mdia DP Estat.
A
88,5
0,7
A
95,0
5,7
A
55,5
3,5
A
15,0
2,8
AB
12,5
3,5
A
19,5
26,2
A
5,5
6,4
A
2,0
1,4
A
15,5
0,7
A
32,5
3,5
A
3,5
0,7
A
37,0
7,1
A
4,5
2,1
A
3,5
2,1
16,0
1,4
A
2DPI
Mdia DP Estat.
A
93,3
2,5
A
99,3
1,2
A
48,7
9,0
A
14,0
2,6
B
11,7
3,2
A
25,0
20,9
A
3,3
2,1
A
1,7
0,6
A
15,0
2,6
A
25,0
8,5
A
3,3
2,1
A
48,0
7,2
A
5,3
1,5
A
4,3
1,5
14,0
2,6
A
Mdia
72,3
93,3
52,3
29,3
22,0
33,7
5,3
2,3
15,3
23,0
3,0
58,3
24,3
20,0
5,3
4DPI
DP Estat.
A
22,9
A
5,1
A
5,8
A
8,1
AB
5,0
A
3,2
A
0,6
A
0,6
A
3,2
A
1,7
A
0,0
A
3,8
A
6,4
A
5,2
0,6
A
Mdia
82,0
93,5
64,5
42,5
35,0
34,5
10,0
2,0
29,5
34,5
9,5
58,0
34,0
29,0
32,0
7DPI
DP Estat.
A
22,6
A
6,4
A
13,4
A
23,3
A
14,1
A
36,1
A
7,1
A
0,0
A
4,9
A
20,5
A
0,7
A
25,5
A
43,8
A
36,8
29,7
A
14DPI
Mdia DP Estat.
A
68,0
32,5
A
83,5
12,0
A
52,5
31,8
A
18,0
4,2
AB
16,5
6,4
A
43,0
39,6
A
6,5
0,7
A
2,5
0,7
A
19,0
12,7
A
35,0
17,0
A
6,5
6,4
A
34,0
5,7
A
4,0
1,4
A
3,0
0,0
8,5
6,4
A
Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas mononucleares do sangue perifrico de sunos aps a infeco por T.
gondii. Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos
CD45
SLA I
CD2
CD16
CD2/CD16 DP
CD3
CD25
CD3/CD25 DP
CD4
CD8
CD4/CD8 DP
SLA II DQ
SWC3
SWC3/SLADQ DP
CD21
Antgeno
Tabela 4.1.5 -
80
81
4.1.8
Expresso Gnica
Os resultados do Real-Time RT-PCR so expressos em Ct. Este nmero utilizado na

quantificao das seqncias-alvo amplificadas pela reao da polimerase. Os genes expressos
em altas quantidades possuem valores de Ct baixos, enquanto que os genes de baixa expresso,
apresentam valores de Ct elevados.
As tabelas 4.1.6 a 4.1.14 mostram os valores mdios de Ct, respectivos desvios padres e
a diferena estatstica entre grupos experimentais pelo teste de Tukey-Kramer (D=0,05).
Baseados nos valores Ct, calculou-se a variao da expresso gnica comparando os
grupos infectados (2DPI, 4DPI, 7DPI ou 14DPI) frente ao grupo controle. As figuras 4.1.1 e 4.1.2
ilustram o aumento ou a diminuio da expresso de mRNA nos diferentes tecidos pelo RealTime RT-PCR. Foram testados 48 genes nas amostras de LN M, LN HS, CMSP dos grupos
2DPI, 4DPI, 7DPI e 14DPI. As amostras de fgado, bao e timo foram somente colhidas nos
grupos 2DPI e 4DPI. Foram testados 24 genes em amostras de jejuno, leo e linfonodo IC.
As tabelas 4.1.15 a 4.1.17 referem-se s figuras 4.1.1 e 4.1.2 e mostram a variao da
expresso de mRNA em valores numricos, permitindo a observao da magnitude da resposta
de forma mais pormenorizada.
82
Tabela 4.1.6 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo mesentrico dos sunos do EXP I. Valores
mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia
aps a infeco com T. gondii . Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05)
- Beltsville 2003
Gene
RPL13A
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
ORM1
TNF
TNFRSF1A
TLR2
TLR4
IFNG
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
LEP
LEPR
STAT1
STAT4
SOCS1
SOCS2
IL4
IL5
IL13
STAT6
SOCS3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
SLC11A2
IGM
IGG
IGA
CD3E
CD19
CD69
IL2
IL2RA
IL10
TGFB1
TGFB2
TGFB3
CSF2
MHC2TA
Controle
2DPI
Mdia DP Estat. Mdia DP Estat.
21,4
16,4
30,5
29,7
26,1
28,7
26,3
22,0
23,5
22,6
27,2
33,3
28,0
33,2
29,4
20,2
36,3
19,3
29,5
26,9
20,6
24,0
28,4
23,2
32,1
32,9
30,2
26,9
30,4
21,4
35,4
33,5
35,0
24,6
22,4
21,0
22,2
19,4
27,2
21,4
28,8
25,8
30,1
26,2
23,0
29,3
29,2
21,9
0,6
1,1
1,9
0,8
0,1
0,2
1,6
1,6
1,4
1,0
1,2
1,2
1,3
2,8
0,2
0,1
0,1
1,1
1,3
1,2
1,7
1,6
1,4
1,8
2,3
1,8
0,4
1,8
1,4
2,0
1,6
2,1
2,2
0,1
1,3
0,2
0,5
0,4
0,6
0,8
1,9
1,9
0,9
1,3
0,8
0,4
1,5
1,1
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
AB
A
A
A
A
AB
A
A
A
AB
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
20,2
17,2
29,1
25,2
22,6
26,7
26,4
20,7
22,8
22,7
23,1
30,9
27,6
32,2
26,2
20,6
37,1
18,4
33,0
28,9
18,5
22,9
26,2
23,1
29,2
30,6
27,6
26,5
27,2
20,6
34,3
35,3
30,0
24,6
21,5
21,1
20,5
19,3
26,1
20,5
27,1
24,5
27,6
25,0
23,1
28,8
28,4
20,8
1,0
0,4
0,6
0,7
1,0
1,3
0,5
0,1
1,0
0,3
1,0
1,5
0,6
1,0
0,6
0,6
1,1
0,3
1,6
1,2
1,4
1,3
0,2
0,3
2,0
0,6
0,8
0,7
0,7
0,4
0,6
2,1
0,2
0,5
1,1
1,2
0,8
0,5
1,2
0,4
0,3
1,7
1,3
0,8
0,2
0,3
0,8
0,5
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
B
A
B
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
AB
A
A
B
B
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
Mdia
22,7
16,4
29,6
24,7
23,4
25,1
24,2
23,3
23,8
23,4
23,1
33,0
31,5
31,6
29,2
21,0
31,7
17,2
28,6
28,7
20,5
25,2
23,7
21,6
31,6
34,7
28,6
24,8
28,6
17,3
34,3
25,8
27,1
24,6
21,7
22,4
21,9
20,4
29,0
22,8
30,7
26,2
28,6
26,3
24,7
28,7
26,9
22,1
4DPI
DP Estat.
1,1
0,7
5,5
2,5
1,1
2,8
0,6
1,0
1,4
1,2
1,2
1,0
1,1
2,9
2,0
1,0
5,1
0,5
4,1
1,2
1,2
1,3
0,6
0,3
2,9
1,1
0,8
1,6
1,3
0,5
1,4
3,3
1,0
0,4
0,5
1,2
1,7
1,1
1,0
1,3
1,2
0,9
1,0
0,5
1,3
0,8
1,5
1,2
Mdia
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
B
A
A
A
AB
A
A
B
A
B
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
20,4
16,8
29,8
29,9
25,5
27,6
26,7
21,7
22,9
23,4
25,8
31,8
27,8
32,3
29,7
20,1
35,5
18,4
29,9
27,3
20,0
23,4
27,9
22,5
31,6
32,0
30,9
25,3
29,5
21,9
34,2
33,5
32,2
24,4
21,1
21,3
20,8
19,1
26,4
21,2
28,7
24,7
28,8
24,6
23,1
29,5
29,2
21,5
7DPI
DP Estat.
0,8
0,8
0,3
0,7
0,8
1,3
1,1
0,5
0,6
0,4
1,0
0,4
0,1
0,4
1,6
0,5
0,7
0,4
0,2
0,9
0,6
0,6
0,6
1,3
1,1
0,8
1,5
0,4
0,1
0,2
0,6
3,0
1,0
0,1
1,3
1,4
1,1
0,1
0,8
0,4
0,8
0,0
0,6
0,8
0,3
0,2
0,2
0,2
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
AB
A
B
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
AB
AB
A
A
A
A
AB
AB
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
20,4
17,4
31,2
26,5
23,1
28,2
27,1
21,1
22,4
22,3
24,1
31,7
28,0
29,8
27,5
19,7
35,4
19,1
32,0
29,1
19,4
23,7
28,3
23,0
30,6
32,2
31,3
26,7
30,0
21,9
34,8
31,1
27,3
22,7
20,7
17,2
21,6
19,5
27,6
21,7
29,2
26,3
28,6
25,4
23,4
26,1
28,9
20,7
14DPI
DP Estat.
1,6
1,0
0,8
4,3
1,0
1,1
1,4
2,4
1,6
1,7
1,7
1,9
1,8
4,0
0,8
0,5
2,2
0,2
1,0
1,8
2,4
2,4
1,8
1,6
2,8
1,6
1,8
0,3
2,9
1,3
0,6
0,7
3,7
2,0
0,2
0,8
1,5
0,5
0,7
2,0
2,0
2,3
2,7
1,9
1,7
2,1
1,0
0,1
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
AB
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
AB
B
A
A
B
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
B
A
A
83
Tabela 4.1.7 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo hepato-esplnico dos sunos do EXP I.
Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com
o dia aps a infeco com T. gondii . Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D =
0,05) - Beltsville 2003
Gene
RPL13A
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
ORM1
TNF
TNFRSF1A
TLR2
TLR4
IFNG
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
LEP
LEPR
STAT1
STAT4
SOCS1
SOCS2
IL4
IL5
IL13
STAT6
SOCS3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
SLC11A2
IGM
IGG
IGA
CD3E
CD19
CD69
IL2
IL2RA
IL10
TGFB1
TGFB2
TGFB3
CSF2
MHC2TA
Controle
2DPI
19,7
17,0
28,1
26,7
24,8
23,9
27,0
20,6
21,8
21,8
26,1
31,3
26,3
31,8
32,1
20,2
37,1
19,9
29,7
28,5
20,0
22,8
28,8
23,0
31,1
32,3
30,2
27,0
29,3
21,7
34,9
32,4
32,9
25,1
20,3
19,3
20,9
20,1
25,8
21,0
28,9
24,4
28,9
24,8
22,6
28,9
29,8
20,9
1,2
0,8
1,8
1,6
1,0
5,6
0,6
1,1
0,9
1,7
1,3
1,3
1,4
0,6
3,2
1,2
1,9
1,4
0,4
0,7
1,5
1,6
1,6
0,6
1,3
1,8
1,5
1,4
1,4
0,7
2,3
1,7
3,3
1,2
1,1
1,8
1,5
1,6
0,8
1,3
1,6
1,2
0,8
1,8
1,0
1,0
0,8
1,1
A
A
A
AB
A
AB
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
AB
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
19,9
17,1
28,9
27,0
24,4
22,7
26,3
20,5
21,9
21,8
26,3
30,9
26,7
31,6
31,4
20,4
36,4
19,4
30,2
28,5
19,0
23,4
27,8
23,0
31,3
32,5
29,1
26,7
28,7
21,3
34,4
33,7
32,9
25,4
20,1
19,5
21,8
20,5
25,8
21,2
29,1
24,2
27,7
25,1
22,5
28,7
29,2
20,5
0,4
0,4
0,7
0,4
0,5
1,8
0,4
0,5
0,3
0,5
0,4
0,6
0,5
1,1
1,7
0,2
0,9
0,6
0,4
0,7
0,7
0,4
1,1
0,6
0,7
0,9
0,8
0,3
1,1
0,7
0,7
2,1
0,9
0,4
0,3
0,7
1,4
0,8
0,1
0,6
0,3
0,7
0,6
0,9
0,5
0,6
0,2
0,5
A
A
A
AB
A
AB
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
AB
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
A
Mdia
19,4
17,1
27,6
25,9
23,3
20,1
25,2
19,7
21,2
20,9
24,3
30,1
28,6
30,5
28,6
20,1
35,0
18,4
30,4
28,1
17,6
22,9
25,6
23,0
30,6
33,0
30,3
25,9
27,1
19,1
33,3
29,0
29,6
24,7
19,5
18,6
21,2
19,9
25,8
20,5
29,4
24,5
25,6
24,8
22,4
28,3
29,6
20,0
4DPI
DP Estat.
0,2
0,2
0,4
0,8
0,7
1,3
0,5
0,1
0,1
0,1
0,4
0,8
1,0
0,9
1,8
0,4
0,7
0,2
0,9
1,7
0,3
0,2
0,6
0,0
0,4
0,6
0,8
0,7
0,5
0,2
0,9
1,1
0,8
0,2
0,4
0,5
0,8
0,2
0,6
0,1
0,2
0,1
0,2
0,7
0,4
0,4
0,4
0,3
A
A
A
B
A
B
B
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
B
A
A
A
AB
A
A
B
A
B
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
B
A
A
A
AB
A
Mdia
19,5
16,8
28,6
29,1
24,9
27,9
26,4
20,7
21,9
22,9
25,1
30,9
26,3
31,2
31,0
20,2
36,6
19,2
31,0
28,9
19,1
22,4
28,1
23,1
30,4
31,3
32,8
27,5
29,1
21,5
33,6
34,1
32,4
24,4
20,0
19,3
22,6
19,5
26,0
20,6
28,4
24,0
28,8
24,3
22,9
28,8
30,8
20,8
7DPI
DP Estat.
0,4
0,4
0,1
0,1
0,4
0,3
0,1
0,4
0,4
0,4
0,7
0,1
0,1
0,6
1,0
0,4
0,3
0,8
1,3
0,2
0,7
0,4
0,2
0,5
0,6
0,0
0,5
1,6
0,5
0,1
0,2
0,1
0,5
0,7
0,1
0,8
0,1
0,6
0,3
0,4
0,3
0,5
0,6
0,8
0,2
0,7
0,1
0,5
A
A
A
A
A
AB
AB
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
19,1
16,5
28,3
28,8
24,1
28,0
26,1
20,3
21,5
22,5
24,8
30,2
26,1
30,1
30,6
19,7
36,7
18,7
32,6
29,5
18,5
22,0
28,1
22,9
29,8
31,1
29,7
26,4
28,6
21,0
33,4
33,7
30,8
24,3
18,9
16,6
21,7
19,2
25,6
20,3
28,2
24,3
27,8
23,6
22,7
28,8
30,2
20,1
14DPI
DP Estat.
0,1
0,2
0,8
0,5
0,6
0,3
0,1
0,5
0,5
0,5
0,1
0,1
0,4
0,0
0,4
0,7
0,6
0,6
0,5
0,3
0,4
0,1
0,1
0,5
0,6
0,5
0,8
0,3
0,2
0,0
0,9
0,4
0,6
0,5
0,4
0,2
1,6
0,4
0,6
0,5
0,1
0,1
1,0
1,0
0,6
0,6
0,3
0,9
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
84
Tabela 4.1.8 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de clulas mononucleares do sangue perifrico dos sunos
do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de
acordo com o dia aps a infeco com T. gondii . Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de TukeyKramer (D = 0,05) - Beltsville 2003
Gene
RPL13A
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
ORM1
TNF
TNFRSF1A
TLR2
TLR4
IFNG
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
LEP
LEPR
STAT1
STAT4
SOCS1
SOCS2
IL4
IL5
IL13
STAT6
SOCS3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
SLC11A2
IGM
IGG
IGA
CD3E
CD19
CD69
IL2
IL2RA
IL10
TGFB1
TGFB2
TGFB3
CSF2
MHC2TA
Controle
2DPI
21,5
17,1
32,5
25,4
32,2
29,4
28,3
22,0
23,5
23,4
25,4
33,1
37,1
31,2
29,9
26,7
37,9
19,4
34,0
28,3
20,0
23,6
28,7
21,3
33,1
31,3
xx
27,1
29,8
21,6
34,3
22,4
28,6
26,0
23,0
23,6
23,6
19,8
29,1
21,4
33,1
28,0
28,3
26,4
24,8
34,3
34,6
24,1
1,3
0,3
2,0
0,6
1,2
0,4
0,6
1,1
1,0
1,0
2,4
1,9
2,2
1,1
1,9
0,2
0,9
1,3
1,0
1,3
1,6
1,3
0,9
1,9
2,2
2,0
xx
1,0
1,5
3,8
1,7
1,6
1,9
1,1
1,8
1,6
1,5
0,6
1,6
1,7
1,5
1,2
1,1
1,7
1,0
0,8
1,2
1,2
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
xx
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
20,7
17,5
32,3
24,1
31,0
29,2
28,4
21,0
22,1
22,5
25,9
32,4
36,5
30,8
29,0
25,9
37,6
19,0
35,3
29,2
18,5
22,7
29,4
22,7
34,0
30,9
xx
27,6
27,7
21,7
34,5
24,5
27,3
25,4
21,7
22,1
21,9
19,6
27,3
20,3
31,6
26,5
27,6
25,3
24,7
33,5
35,5
22,7
0,7
0,4
1,4
2,0
0,4
0,6
0,4
0,9
0,8
0,7
1,0
1,1
0,6
1,5
1,0
0,3
2,0
0,7
2,5
0,8
0,7
0,8
1,3
0,2
1,7
0,3
xx
0,5
0,9
1,0
2,1
1,9
0,2
0,5
0,8
1,0
1,5
0,9
1,7
0,4
1,3
0,5
0,6
0,7
0,6
0,5
2,2
0,6
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
xx
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
22,0
18,2
32,8
25,0
29,7
29,5
28,1
21,6
23,1
22,9
25,9
33,8
36,9
31,5
29,2
26,5
37,4
19,4
36,3
30,5
19,6
24,1
30,0
23,4
34,2
32,4
xx
27,5
28,8
22,6
33,9
22,5
26,5
25,4
23,2
23,2
23,2
20,6
28,7
21,8
32,7
28,0
28,2
26,5
24,2
33,5
36,5
23,1
4DPI
DP Estat.
1,0
0,8
1,1
1,5
3,8
0,9
1,7
1,0
1,8
2,2
1,3
1,7
1,5
1,4
2,4
1,4
1,8
1,7
1,6
1,4
1,6
1,2
1,8
0,9
1,1
1,2
xx
1,8
1,3
5,4
0,6
1,9
3,4
0,5
0,8
1,1
1,0
0,9
0,9
1,2
2,6
1,3
2,1
1,1
1,9
1,2
1,6
1,1
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
xx
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
20,6
17,4
31,5
23,9
30,4
28,4
27,3
20,6
22,0
22,2
24,7
32,3
34,6
29,5
27,9
25,8
37,1
19,2
32,9
30,4
18,4
22,9
28,9
22,5
32,2
30,7
xx
27,4
28,0
21,8
33,2
22,3
26,0
24,7
22,3
22,3
22,4
19,6
28,0
20,5
32,1
27,1
26,8
25,0
22,1
32,6
36,4
22,6
7DPI
DP Estat.
0,4
0,1
0,7
0,9
1,0
0,5
2,0
1,1
1,3
1,9
0,8
0,4
1,4
0,8
2,0
0,9
0,9
1,1
xx
1,8
1,5
0,1
0,6
0,6
0,3
1,4
xx
0,3
1,2
5,0
0,6
1,9
2,5
0,6
1,0
1,1
0,5
0,4
0,5
0,6
0,7
0,4
1,3
0,5
1,6
0,6
0,4
0,6
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
xx
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
DPI - dias ps-infeco, letras distintas na mesma linha indicam diferena estatstica, xx = no detectado
Mdia
21,3
17,5
32,3
25,0
31,4
28,5
27,7
21,7
23,3
23,5
24,7
33,5
37,4
31,3
29,2
26,7
38,4
19,4
36,3
30,1
19,7
23,3
30,4
23,5
33,5
31,5
xx
27,7
28,5
25,5
34,1
22,1
27,6
24,1
22,6
23,1
24,0
19,1
29,3
20,5
32,0
27,7
27,4
26,0
23,6
33,7
36,5
23,6
14DPI
DP Estat.
0,2
0,1
0,8
1,2
1,0
1,6
1,2
0,4
0,7
0,7
1,0
0,2
0,6
1,2
0,8
0,6
1,1
0,6
0,1
0,6
0,4
0,7
1,1
0,6
0,1
0,8
xx
0,8
0,4
0,9
1,4
1,1
1,4
1,0
0,7
0,9
0,4
0,7
0,4
0,3
0,4
0,5
0,2
0,1
0,9
0,7
0,3
0,5
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
xx
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
85
Tabela 4.1.9 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de fgado dos sunos do EXP I.
Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e

infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica
(Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003
Gene
RPL13A
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
ORM1
TNF
TNFRSF1A
TLR2
TLR4
IFNG
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
LEP
LEPR
STAT1
STAT4
SOCS1
SOCS2
IL4
IL5
IL13
STAT6
SOCS3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
SLC11A2
IGM
IGG
IGA
CD3E
CD19
CD69
IL2
IL2RA
IL10
TGFB1
TGFB2
TGFB3
CSF2
MHC2TA
Mdia
24,8
18,3
34,4
31,8
28,0
14,1
30,1
26,9
28,0
24,3
33,8
36,5
34,1
37,5
31,2
23,3
39,2
23,0
36,4
22,6
25,5
32,0
29,7
23,0
38,1
32,1
32,3
27,9
36,1
29,4
37,7
22,4
32,3
25,0
28,9
24,9
26,4
25,1
33,1
27,3
34,5
35,3
34,9
30,6
25,0
29,2
33,8
25,6
Controle
DP Estat.
2,3
2,1
1,8
4,0
1,6
0,0
1,7
1,0
3,5
1,3
1,4
xx
0,8
1,1
1,1
0,0
xx
1,1
xx
2,5
3,6
2,2
2,6
4,5
2,1
1,2
0,4
1,6
4,0
2,8
0,8
2,6
0,7
0,6
2,9
1,3
1,1
1,5
1,8
1,0
0,6
3,5
2,4
3,7
1,3
1,0
0,1
0,2
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
24,7
17,6
33,3
30,5
30,2
14,3
28,0
25,1
26,9
25,4
30,9
37,2
37,1
37,8
32,3
23,2
38,0
20,1
33,9
20,9
22,2
30,9
28,3
21,4
37,3
34,4
30,5
27,5
33,2
24,1
39,4
20,5
31,0
26,4
27,8
27,7
28,3
25,8
34,0
27,6
36,1
33,2
30,8
29,9
26,6
30,9
32,1
26,2
2DPI
DP Estat.
0,7
1,2
1,1
0,4
0,0
0,1
1,4
1,3
0,3
0,5
0,1
1,0
0,8
1,8
0,4
0,1
2,1
1,1
3,3
2,1
1,2
0,4
1,6
1,6
0,3
0,1
2,8
1,4
1,5
2,7
0,0
4,2
0,3
0,8
0,8
1,4
0,6
0,3
0,8
0,2
1,0
1,3
1,7
0,1
0,6
0,8
0,8
0,2
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
24,2
17,9
29,7
29,6
27,8
14,3
27,1
22,8
25,5
23,2
29,3
34,9
34,5
35,0
30,4
21,7
36,1
18,5
33,4
20,7
20,3
29,7
26,2
22,0
35,2
34,7
32,6
26,5
30,8
20,7
37,5
18,5
27,7
24,1
26,4
25,8
27,6
24,5
33,4
26,8
35,2
31,5
29,5
29,1
25,7
29,3
31,4
23,3
4DPI
DP Estat.
3,2
1,5
1,6
3,8
0,7
0,5
1,0
3,4
3,2
1,1
3,7
1,9
2,1
3,6
1,4
1,3
1,8
0,7
2,5
1,0
3,4
3,0
0,7
1,9
2,8
1,6
2,2
1,3
3,4
2,0
1,0
1,5
0,8
0,8
2,7
1,9
1,1
1,3
1,2
0,2
0,8
2,7
1,7
3,4
1,1
0,9
1,1
0,6
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
86
Tabela 4.1.10 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de bao dos sunos do EXP I. Valores
mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de

acordo com o dia aps a infeco com T. gondii . Diferena estatstica (Estat.) segundo
o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003
Gene
RPL13A
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
ORM1
TNF
TNFRSF1A
TLR2
TLR4
IFNG
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
LEP
LEPR
STAT1
STAT4
SOCS1
SOCS2
IL4
IL5
IL13
STAT6
SOCS3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
SLC11A2
IGM
IGG
IGA
CD3E
CD19
CD69
IL2
IL2RA
IL10
TGFB1
TGFB2
TGFB3
CSF2
MHC2TA
Mdia
21,2
15,6
30,0
28,5
23,9
22,0
24,4
22,3
24,5
21,5
29,2
33,0
31,7
31,6
28,7
19,5
34,4
19,3
30,7
25,3
22,1
25,6
26,6
20,6
33,7
34,0
32,4
25,2
30,9
22,4
35,2
21,7
25,6
24,7
19,2
20,9
24,7
19,4
26,8
24,2
31,5
27,4
30,1
26,0
23,7
27,6
30,3
21,5
Controle
DP Estat.
1,8
0,1
0,1
2,3
0,3
2,0
0,1
2,3
2,5
1,3
2,1
1,3
0,7
0,2
0,3
0,3
3,5
1,0
3,5
0,6
2,8
2,5
1,3
0,8
1,6
1,1
0,7
1,8
2,7
0,1
2,3
0,0
2,3
0,9
1,8
0,7
2,3
0,1
1,1
2,0
0,6
1,7
1,6
2,1
0,3
0,6
0,6
0,8
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
21,7
16,1
31,5
28,1
24,6
21,4
23,7
22,1
23,7
21,7
28,4
32,3
32,7
31,1
30,3
21,4
35,8
18,4
32,1
26,5
19,8
25,4
26,5
21,8
34,5
34,9
33,5
26,0
29,5
21,0
37,5
23,5
28,6
26,4
18,7
22,0
25,7
20,9
27,7
24,0
33,2
27,5
29,8
26,6
25,4
29,3
32,3
22,1
2DPI
DP Estat.
1,1
1,2
1,8
1,6
0,7
1,9
1,6
1,7
1,5
1,0
1,7
0,9
1,9
3,1
0,9
0,8
0,6
0,6
1,9
1,8
1,5
1,7
2,0
1,0
1,3
1,7
0,4
0,9
1,2
2,1
1,2
2,2
0,4
1,1
1,2
1,8
1,0
0,8
1,3
0,9
1,6
1,8
0,9
0,8
0,8
1,2
2,5
1,0
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
21,0
16,1
29,5
27,3
24,0
20,9
24,5
20,5
22,3
20,7
26,7
31,4
33,1
31,6
27,2
19,6
34,9
17,9
31,3
26,0
18,1
23,6
26,0
21,6
34,2
33,8
32,8
25,5
28,8
17,5
35,7
25,2
24,7
24,8
17,5
19,9
25,7
19,5
27,9
23,3
32,9
27,7
27,5
25,1
25,0
28,0
31,6
21,2
4DPI
DP Estat.
2,0
0,6
1,4
0,9
1,2
1,5
1,5
1,4
1,4
1,1
1,0
1,4
0,8
3,4
0,9
0,6
0,7
0,7
0,4
1,2
1,5
1,8
0,3
0,6
1,6
2,7
0,6
0,2
1,5
1,0
0,8
1,1
1,4
0,6
1,8
1,4
1,4
0,8
1,3
1,4
1,3
2,0
1,5
1,8
0,7
0,9
1,2
1,0
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
87
Tabela 4.1.11 -
Gene
RPL13A
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
ORM1
TNF
TNFRSF1A
TLR2
TLR4
IFNG
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
LEP
LEPR
STAT1
STAT4
SOCS1
SOCS2
IL4
IL5
IL13
STAT6
SOCS3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
SLC11A2
IGM
IGG
IGA
CD3E
CD19
CD69
IL2
IL2RA
IL10
TGFB1
TGFB2
TGFB3
CSF2
MHC2TA
Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de timo dos sunos do EXP I.

infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii . Diferena
estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003
Mdia
19,3
17,1
28,4
26,2
26,9
23,5
27,9
20,7
23,7
23,4
29,6
29,1
28,0
30,8
30,9
22,7
36,7
20,8
33,2
28,0
20,2
23,9
28,1
21,4
31,0
31,0
30,3
26,7
29,4
22,8
35,6
28,2
31,6
24,6
24,8
22,5
22,9
18,1
30,2
21,0
28,5
25,0
30,9
25,2
25,0
29,3
29,1
22,7
Controle
DP Estat.
0,3
0,1
0,7
0,6
0,3
1,2
0,1
0,3
0,0
0,2
0,2
0,2
0,2
0,1
0,0
0,3
0,1
0,1
0,0
0,5
0,1
0,4
0,4
0,1
0,0
0,2
0,3
0,7
0,0
0,8
1,1
0,2
0,7
0,2
0,3
0,3
1,5
0,0
0,2
0,3
0,1
0,2
0,5
0,2
0,2
0,1
0,6
0,4
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
A
B
A
AB
B
A
C
A
A
Mdia
20,0
16,4
27,7
26,5
27,6
24,0
26,1
21,5
24,4
24,5
29,1
29,7
28,5
30,3
31,2
22,1
35,2
20,8
31,2
27,6
21,0
24,5
26,9
20,7
31,1
32,1
30,0
26,6
29,6
21,8
36,0
27,5
33,0
25,2
25,0
22,8
23,2
17,9
30,3
21,4
29,3
25,7
31,8
25,8
25,5
29,6
28,5
23,5
2DPI
DP Estat.
0,4
1,4
1,6
0,6
0,2
0,9
1,8
0,7
0,4
0,7
1,4
0,5
0,3
0,2
0,7
1,0
0,8
0,2
0,4
1,5
0,4
0,5
1,2
1,4
0,7
0,5
0,3
0,9
0,8
1,7
1,2
2,9
1,3
0,6
0,2
1,2
0,1
0,4
0,0
0,5
0,8
0,7
0,8
0,4
0,4
0,0
1,0
0,6
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
A
AB
A
A
AB
A
B
A
A
Mdia
20,9
17,5
28,4
26,2
28,0
23,5
26,3
21,6
23,9
23,6
29,8
29,5
29,6
30,8
32,0
22,6
34,5
20,2
30,7
27,4
20,6
25,3
27,4
22,6
31,9
32,3
31,0
25,8
30,2
21,9
36,1
26,5
30,5
26,1
25,7
23,7
25,1
19,2
31,2
21,3
31,0
26,2
29,5
26,3
25,9
30,3
28,8
23,4
4DPI
DP Estat.
0,7
1,1
1,2
0,6
0,3
0,6
1,8
0,3
0,1
0,0
0,5
0,3
1,2
0,4
0,9
0,2
5,3
1,5
4,1
1,6
0,0
0,1
2,2
1,3
1,3
0,4
0,2
1,8
0,3
1,0
0,5
1,9
0,8
0,7
0,0
0,5
0,9
0,2
0,0
0,6
0,2
0,1
0,2
0,1
0,3
0,0
2,0
0,3
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
A
B
A
A
A
A
A
88
Tabela 4.1.12 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo leo-clico dos
sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos

grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii .
Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) Beltsville 2003
Gene
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
TNF
IFNG
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
STAT1
SOCS1
IL4
IL5
IL13
SOCS3
INDO
NOS2A
SLC11A1
IL10
TGFB1
TGFB3
Mdia
15,4
28,4
28,5
25,3
27,0
23,9
25,7
31,4
28,3
19,7
36,4
20,6
19,3
28,6
30,9
29,2
30,1
29,1
22,1
34,5
34,8
26,8
24,2
29,9
Controle
DP Estat.
0,2
1,0
0,1
0,2
0,0
0,1
1,0
0,4
0,9
0,4
0,0
0,3
0,1
0,5
1,1
0,1
0,1
0,1
0,0
0,1
0,4
0,4
0,1
0,5
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
15,3
28,6
27,9
24,9
25,9
23,6
25,7
30,0
27,9
19,7
37,1
19,8
18,9
27,9
30,7
29,3
29,4
27,1
22,0
33,3
34,0
25,9
23,6
27,4
2DPI
DP Estat.
0,1
0,2
0,2
0,2
0,4
0,2
0,0
2,9
0,4
0,6
0,2
0,4
0,3
0,4
0,5
0,5
0,4
1,3
0,2
2,8
1,0
0,1
0,6
2,6
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
AB
AB
A
A
A
A
AB
A
A
A
AB
A
A
Mdia
15,4
28,0
24,0
22,9
24,7
20,9
26,2
28,5
26,0
19,7
34,1
19,3
18,0
25,7
30,1
29,7
29,0
26,5
19,0
32,7
27,9
24,6
23,2
27,3
4DPI
DP Estat.
0,2
1,0
2,8
1,9
0,5
2,6
1,4
2,9
0,9
0,4
1,2
0,4
0,5
1,3
2,1
0,7
2,7
0,3
1,5
1,0
2,4
0,9
0,8
1,4
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
B
B
B
A
A
A
A
B
A
A
B
B
A
A
89
Tabela 4.1.13 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de jejuno dos sunos do EXP I.

infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena
estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville
2003
Gene
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
TNF
IFNG
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
STAT1
SOCS1
IL4
IL5
IL13
SOCS3
INDO
NOS2A
SLC11A1
IL10
TGFB1
TGFB3
Controle
Mdia DP Estat.
16,2
29,3
27,0
30,2
29,9
24,8
29,6
31,9
27,4
20,9
38,6
20,8
20,1
29,2
32,1
28,3
31,7
31,5
27,3
33,8
35,0
29,8
26,4
30,1
0,1
0,6
0,0
0,1
0,6
0,5
0,1
0,3
0,2
0,0
0,3
0,1
0,1
0,1
1,0
0,3
0,3
0,6
1,1
0,6
0,6
0,4
0,6
0,1
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
2DPI
Mdia DP Estat.
16,1
29,3
25,8
27,5
28,3
22,9
28,6
31,5
27,0
21,3
36,8
18,9
18,7
26,9
29,6
28,6
29,1
29,3
24,7
29,5
32,9
27,4
25,6
29,1
0,4
0,8
0,4
1,2
0,5
1,1
0,6
0,4
0,5
0,4
0,6
0,9
0,8
1,6
1,9
1,0
3,6
1,0
0,6
2,0
0,5
1,0
0,6
0,2
A
A
AB
AB
AB
A
A
A
A
A
A
B
AB
AB
A
A
A
AB
B
B
B
B
A
B
Mdia
15,6
28,6
24,1
26,0
26,8
20,7
28,6
30,6
25,6
21,4
34,9
18,1
17,8
24,5
28,7
29,6
27,9
27,3
20,3
26,3
27,5
26,1
24,8
28,1
4DPI
DP Estat.
0,1
1,4
1,4
0,8
1,5
0,6
0,5
1,0
0,2
0,2
2,2
0,2
0,3
1,3
1,0
0,1
1,0
1,0
0,8
1,1
0,7
0,5
0,7
0,4
A
A
B
B
B
B
A
A
B
A
A
B
B
B
A
A
A
B
C
B
C
B
A
C
90
Tabela 4.1.14 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de leo dos sunos do EXP I.

infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica
(Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003
Gene
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
TNF
IFNG
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
STAT1
SOCS1
IL4
IL5
IL13
SOCS3
INDO
NOS2A
SLC11A1
IL10
TGFB1
TGFB3
Controle
Mdia DP Estat.
15,7
28,4
26,1
26,8
27,7
24,2
27,7
31,6
28,1
20,9
36,2
20,3
19,1
27,7
31,5
29,0
32,1
29,6
23,5
31,0
34,1
27,0
24,8
29,1
0,4
0,3
0,0
0,8
0,4
0,1
0,6
0,4
1,6
0,2
0,1
0,0
0,1
0,0
1,1
0,4
0,0
0,3
0,2
0,9
0,4
0,4
1,1
0,3
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
2DPI
Mdia DP Estat.
16,2
27,8
25,5
25,6
26,9
23,4
28,1
30,4
28,7
20,9
36,1
20,5
19,2
27,1
31,2
28,5
28,6
28,7
24,0
30,1
33,4
26,7
23,4
29,3
0,5
1,4
1,1
1,6
1,1
0,2
0,5
2,2
3,0
0,7
2,3
0,3
0,5
1,2
1,2
1,2
4,4
0,6
0,7
0,7
1,2
0,5
2,7
0,4
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
AB
A
A
A
A
Mdia
15,6
28,4
23,7
23,7
25,9
21,6
27,6
30,6
26,1
20,1
34,6
18,5
17,7
24,7
29,6
29,3
28,8
27,0
19,6
27,7
27,7
25,4
24,1
27,5
4DPI
DP Estat.
0,3
0,6
1,9
1,6
0,9
1,2
0,7
0,7
2,0
0,3
2,2
0,4
0,4
1,4
1,4
0,3
1,6
1,1
1,5
1,1
1,9
0,7
1,1
1,2
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
B
B
A
A
A
A
B
B
B
B
A
A
A
91
92
93
Tabela 4.1.15 -Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T. gondii mensurado pela Real-Time RT-PCR.
Aumento (valores positivos) ou diminuio (valores negativos) da expresso de mRNA nos linfonodos
mesentrico (LN M), hepato-esplnico (LN HS) e clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP) dos
grupos infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville - 2003
Gene
RPL13A
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
ORM1
TNF
TNFRSF1A
TLR2
TLR4
IFNG
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
LEP
LEPR
STAT1
STAT4
SOCS1
SOCS2
IL4
IL5
IL13
STAT6
SOCS3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
SLC11A2
IGM
IGG
IGA
CD3E
CD19
CD69
IL2
IL2R
IL10
TGFB1
TGFB2
TGFB3
CSF2
MHC2TA
CX2
LN M
CX4
CX7
2,3
-2,5
-1,6
0,0
2,6
1,8
22,1 32,7
11,6
6,5
3,9 12,0
0,0
4,0
2,5
-2,4
1,6
0,0
0,0
-1,7
18,1 17,7
5,4
0,0
0,0 -11,6
2,0
3,0
9,6
0,0
-1,4
-1,8
-1,8 24,0
1,9
4,2
1,8 -11,1
-4,0
-3,7
4,2
0,0
2,1
-2,3
4,7 26,6
0,0
3,0
7,5
0,0
4,6
-3,5
6,1
3,0
0,0
4,0
9,2
3,4
1,8 16,8
2,1
2,0
-3,5 203,2
30,2 230,7
0,0
0,0
1,8
1,6
0,0
-2,7
3,2
0,0
0,0
-2,1
2,1
-3,4
1,8
-2,6
3,1
-3,8
2,3
0,0
5,5
2,8
2,4
0,0
-9,1
-2,9
0,0
1,5
1,6
4,9
2,2
0,0
xx = no detectado
CX14
CX2
LN HS
CX4
CX7
CX14
CX2
CMSP
CX4
CX7
CX14
1,9
1,9
0,0
-2,0
1,6
-1,7
0,0
9,5
1,5
8,0
2,1
0,0
0,0
-1,8
0,0
1,9
1,6
2,2
-1,7
0,0
2,7
8,8
3,0
3,2
0,0
0,0
1,8 10,2
0,0
3,9
0,0
0,0
1,7
1,9
1,9
0,0
0,0
-5,7
0,0
-4,8
1,6
2,3
1,5
0,0
0,0
0,0
1,6
0,0
0,0
2,8
1,9
1,6
-1,6
-2,1
3,0
0,0
1,9
0,0
0,0
0,0
2,2
1,5
0,0
5,3
6,7 200,9
0,0
3,6
2,4
3,2
0,0 13,9
2,5
1,5
0,0
0,0
1,7
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
2,1
0,0
2,4
2,8
3,0
1,8
-11,1
-9,0
0,0
9,2
0,0
0,0
0,0
2,4
0,0
0,0
-1,8
0,0
0,0
2,3
1,6
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
1,5
0,0
1,6
0,0
0,0
0,0
1,9
-1,6
1,9
0,0
0,0
0,0
2,1
0,0
1,6
0,0
0,0
-2,5
0,0
0,0
0,0
0,0
-1,9
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
2,3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
1,7
2,8
13,8
3,3
1,9
1,5
1,8
3,5
2,2
-5,1
2,3
10,7
0,0
4,1
2,9
-1,7
0,0
5,1
0,0
9,1
0,0
1,4
0,0
0,0
2,2
4,6
6,1
3,0
10,8
9,6
0,0
1,6
1,6
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
9,6
0,0
0,0
1,5
0,0
1,8
1,5
0,0
0,0
-4,1
1,7
-17,8
1,9
0,0
0,0
-1,6
2,5
2,1
0,0
3,1
2,8
0,0
0,0
2,3
-7,2
-2,0
2,8
1,7
1,6
0,0
2,5
2,3
0,0
1,5
1,7
1,6
2,9
-2,4
4,3
1,7
2,5
6,7
-1,7
1,8
0,0
1,7
1,6
0,0
2,1
2,3
-2,0
0,0
0,0
1,7
1,7
0,0
0,0
2,5
2,3
0,0
0,0
2,1
2,6
1,9
0,0
1,6
1,5
0,0
1,9
1,7
0,0
0,0
-2,4
-1,9
2,8
1,9
-1,6
-2,6
-1,9
0,0
xx
0,0
4,2
0,0
0,0
-4,2
2,4
1,6
2,5
2,8
3,2
0,0
3,6
2,2
2,9
2,8
1,6
2,1
0,0
1,7
-1,9
2,6
0,0
-2,1
0,0
0,0
5,7
0,0
0,0
0,0
0,0
1,5
0,0
-1,6
0,0
0,0
1,6
0,0
0,0
0,0
-4,9
-4,5
0,0
0,0
-2,5
-4,1
-2,2
-2,0
xx
0,0
1,9
-1,9
0,0
0,0
4,2
1,5
0,0
0,0
0,0
-1,8
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
1,6
1,7
-3,6
1,9
0,0
0,0
0,0
0,0
1,7
1,9
1,5
0,0
0,0
0,0
1,7
0,0
0,0
0,0
1,6
0,0
0,0
0,0
-4,9
-3,5
0,0
0,0
-3,2
-4,6
0,0
0,0
xx
-1,5
2,5
-14,2
0,0
0,0
2,0
3,7
0,0
0,0
0,0
1,5
0,0
1,9
2,1
0,0
1,8
0,0
2,4
1,5
-3,6
0,0
0,0
0,0
-1,5
-5,1
0,0
-16,6
1,5
0,0
0,0
-2,1
2,0
0,0
0,0
1,5
2,1
0,0
0,0
1,6
-2,5
0,0
1,8
0,0
1,6
0,0
1,6
1,9
-6,1
0,0
1,2
0,0
2,5
-3,2
1,5
1,6
0,0
0,0
-3,4
1,5
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
-2,1
0,0
1,8
0,0
2,0
2,9
3,4
2,0
2,0
2,6
2,8
2,4
1,7
1,7
5,6
3,3
3,9
1,9
1,8
0,0
2,1
-4,3
3,0
1,6
0,0
-2,3
1,8
1,5
xx
0,0
3,4
0,0
2,1
0,0
5,9
2,5
1,6
2,4
2,2
0,0
2,2
1,9
2,1
1,8
2,8
2,7
6,5
3,1
-3,4
2,8
Tabela 4.1.16 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T. gondii mensurado
pela Real-Time RT-PCR. Aumento (valores positivos) ou diminuio (valores

negativos) da expresso de mRNA em amostras de fgado, bao e timo dos grupos
infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville - 2003
Gene
RPL13A
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
ORM1
TNF
TNFRSF1A
TLR2
TLR4
IFNG
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
LEP
LEPR
STAT1
STAT4
SOCS1
SOCS2
IL4
IL5
IL13
STAT6
SOCS3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
SLC11A2
IGM
IGG
IGA
CD3E
CD19
CD69
IL2
IL2RA
IL10
TGFB1
TGFB2
TGFB3
CSF2
MHC2TA
Fgado
CX2
Bao
Timo
CX4
CX2
CX4
CX2
CX4
0,0
1,6
1,7
0,0
2,1 25,0
2,6
4,6
-4,6
0,0
0,0
-1,2
4,3
7,8
3,4 16,7
2,2
5,9
-2,0
2,3
7,5 23,1
-1,6
3,0
-7,6
0,0
0,0
5,3
-2,2
1,8
0,0
3,1
2,3
8,6
7,4 22,7
5,7
7,8
3,3
3,6
9,9 36,1
2,2
5,1
2,7 11,1
3,1
2,0
1,6
7,0
-5,9
-4,7
3,6
0,0
0,0
2,5
7,2 39,1
40,0 430,3
-3,2
0,0
3,8 15,3
2,6 24,3
-2,7
1,8
2,2
5,8
-7,0
-2,0
-3,6
-2,3
-1,6
0,0
-1,8
0,0
0,0
0,0
-2,9
-1,6
4,1 14,2
17,5 41,2
1,6
3,0
-3,1
-1,7
-3,2
0,0
3,5
5,6
-1,5
4,9
0,0
0,0
2,1
0,0
-1,6
0,0
1,6
1,1
1,6
0,0
1,7
1,6
-2,0
0,0
-3,0
-3,8
-2,6
1,8
-2,7
-2,2
4,9
0,0
0,0
-2,3
-1,8
-2,0
-2,1
-1,8
2,7
2,5
-4,8
-11,1
-8,5
-3,4
0,0
-2,1
-2,0
-2,9
-1,8
0,0
-3,3
0,0
0,0
-1,5
-3,3
-3,4
-4,0
0,0
1,6
0,0
25,0
2,4
0,0
2,1
0,0
3,5
4,5
1,7
5,7
2,9
-2,6
5,3
2,8
0,0
0,0
2,6
-1,6
-1,6
15,1
3,9
1,5
-2,0
0,0
0,0
0,0
0,0
4,4
29,5
0,0
-3,6
1,8
0,0
3,2
2,0
-2,1
0,0
-2,1
1,9
-2,7
0,0
5,9
1,9
-2,5
0,0
-2,5
0,0
-1,6
2,1
1,5
0,0
-1,6
0,0
3,3
-1,7
-1,6
-2,2
0,0
-1,5
0,0
0,0
0,0
1,5
2,8
0,0
3,9
0,0
-1,8
-1,6
2,2
1,6
0,0
-2,1
0,0
0,0
0,0
2,0
0,0
1,6
-2,5
1,9
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
-1,8
-1,6
-1,9
-1,6
0,0
0,0
1,6
-1,8
-3,1
0,0
0,0
0,0
-2,2
0,0
2,8
-1,8
0,0
0,0
0,0
0,0
-3,0
0,0
-2,2
0,0
4,8
0,0
5,6
0,0
0,0
-2,7
1,6
-2,2
-1,9
-2,4
-1,7
1,8
-1,7
1,9
0,0
3,1
2,2
0,0
-1,9
-2,4
-4,5
-2,2
-2,1
0,0
-6,0
-2,3
2,6
-2,3
-1,8
-2,0
0,0
-1,6
94
95
Tabela 4.1.17 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T. gondii
mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento (valores positivos) ou

diminuio (valores negativos) da expresso de mRNA no linfonodo leoclico (LN IC), no jejuno e no leo dos grupos infectados em relao ao
controle no-infectado Beltsville - 2003
Gene
RPL32A
IFNA1
IL1B
IL6
TNF
IFNG
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL23A
IRF1
STAT1
SOCS1
IL4
IL5
IL13
SOCS3
INDO
NOS2A
SLC11A1
IL10
TGFB1
TGFB3
LN IC
CX2
CX4
0,0
0,0
0,0
0,0
1,5 21,9
0,0
5,0
2,1
5,0
0,0
7,9
0,0
0,0
2,6
7,2
0,0
4,9
0,0
0,0
-1,6
5,5
1,7
2,5
0,0
2,5
1,6
7,0
0,0
1,7
0,0
0,0
1,6
2,1
4,1
5,9
0,0
8,8
2,3
3,4
1,7 112,7
1,9
4,3
0,0
1,9
5,7
5,9
Jejuno
CX2
leo
CX4
CX2
CX4
0,0
0,0
0,0
1,6
2,2
7,5
6,3 18,1
3,0
8,8
3,5 16,2
1,9
2,0
0,0
2,4
0,0
3,4
0,0
0,0
3,6 13,3
3,6
6,5
2,6
4,9
5,0 26,6
5,7 10,3
0,0
-2,5
5,9 14,2
4,5 17,3
6,2 130,7
20,2 176,9
4,2 176,9
5,3 12,7
1,8
3,0
1,9
3,8
0,0
1,5
1,5
2,2
1,7
1,7
0,0
2,2
-1,5
0,0
0,0
0,0
0,0
1,5
0,0
0,0
11,6
1,9
0,0
1,8
1,5
0,0
2,5
0,0
0,0
0,0
5,4
8,5
3,6
5,9
0,0
2,0
4,0
1,7
3,0
3,6
2,6
7,8
3,6
0,0
9,6
6,2
14,0
9,5
79,7
2,9
1,5
3,0
96
4.2 EXPERIMENTO II
4.2.1 Pesquisa de Anticorpos Anti-T. gondii
Todos os animais apresentavam-se soronegativos antes da inoculao de T. gondii. A

prova de MAT no detectou anticorpos especficos nos animais dos grupos Controle, 2DPI e
4DPI. Duas amostras de soro do grupo 7DPI apresentaram reao diluio 1:40 e um a 1:80.
Todos sunos do 14DPI foram reagentes diluio 1:80.
4.2.2 Perfil Heptico
A tabela 4.2.1 apresenta os valores de aspartato aminotransferase (AST), alanino

aminotransferase (ALT), gamaglutamil transferase (GGT), bilirrubinas totais (TBILI), bilirrubina
direta (DBILI), fosfatase alcalina (ALP), protenas totais (PT), globulinas (GLOB), albumina
(ALB) e a proporo albumina/globulina (A/G) no soro dos animais experimentais.
Elevao dos valores de AST sricos so observados nos sunos do 7DPI, sem diferena
estatstica significante (Grfico 4.2.1).
97
Tabela 4.2.1 - Mdia e desvio-padro (DP) dos valores de aspartato aminotransferase (AST), alanino
aminotransferase (ALT), gamaglutamil transferase (GGT), bilirrubinas totais (TBILI), bilirrubina

direta (DBILI), fosfatase alcalina (ALP), protenas totais (PT), globulinas (GLOB), albumina (ALB)
e proporo albumina/globulina (A/G) em amostras de soro de sunos infectados com T. gondii e
controles no infectados. Diferena estatstica (Estat.) segundo teste de Tukey-Kramer (D=0,05) Beltsville - 2003
Determinao
Controle
2DPI
srica
Mdia DP Estat. Mdia DP
38,3 9,0
AST (U/l)
44,3 31,7 A
ALT (U/l)
30,3 5,9 AB
37,7 5,7
GGT (U/l)
37,0 16,7 A
39,3 16,2
TBILI (mg/dl)
0,2 0,1 A
0,2 0,1
DBILI (mg/dl)
0,2 0,1 A
0,1 0,1
ALP (U/l)
193,3 78,6 A
230,0 95,0
PT (g/dl)
6,0 0,6 A
5,6 0,5
GLOB (g/dl)
2,8 0,7 B
2,5 0,3
ALB (g/dl)
3,3 0,2 A
3,1 0,3
A/G
1,3 0,4 A
1,3 0,1
4DPI
Estat. Mdia DP
A
43,7 4,9
A
29,0 3,0
A
31,0 6,0
A
0,2 0,1
A
0,2 0,1
A
150,0 40,7
A
6,2 0,5
B
3,4 0,5
A
2,8 0,1
A
0,9 0,1
7DPI
14DPI
Estat. Mdia
DP Estat. Mdia DP Estat.
A
155,3 121,6 A
66,7 4,0 A
AB
21,7
9,6 B
23,7 3,5 AB
A
22,0
1,0 A
26,7 8,5 A
A
0,2
0,0 A
0,2 0,1 A
A
0,1
0,1 A
0,1 0,1 A
A
63,7 17,6 A
89,7 42,2 A
A
6,1
0,4 A
6,2 0,9 A
AB
3,6
0,2 AB
4,1 0,3 A
AB
2,5
0,2 AB
2,1 0,7 B
AB
0,7
0,0 AB
0,5 0,2 B
250
AST (U/L)
200
150
100
50
0
Controle
2DPI
4DPI
7DPI
14DPI
Grfico 4.2.1 Variao dos nveis de aspartato aminotransferase (AST) srico em sunos dos
grupos Controle e infectados pelo T. gondii Beltsville 2003
98
4.2.3 Determinao de IFN-J
A determinao de IFN-J no sobrenadante das culturas de clulas e das amostras de soro

foram realizadas pelo mtodo de ELISA. As curvas padro apresentaram variao nos limiares de
deteco de uma leitura para a outra.
Desta maneira, o limiar de deteco foi de 2,5 ng IFN-J/ml para as amostras do
sobrenadante das clulas do LN HS e 7,5 ng/ml para as amostras de CMSP e LN M.
4.2.3.1 IFN-J Srico
No foi possvel determinar a quantidade de IFN-J das amostras de soro, pois

apresentaram valores abaixo do limite de deteco do teste.
4.2.3.2 Produo de IFN-J
Clulas dos LN M e LN HS produziram quantidades significativamente (D=0,05) maiores

de IFN-J que as CMSP no 7DPI. Esta diferena na produo de IFN-J foi somente observada no
7DPI (Grfico 4.2.2).
99
* D=0,05
300
CMSP
IFN-J (ng/ml)
LN M
200
LN HS
100
0
Controle
2DPI
4DPI
7DPI
14DPI
Grfico 4.2.2 - Produo de IFN-J por clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP),
clulas do linfonodo mesentrico (LN M) e do linfonodo hepato-esplnico (LN
HS) de sunos dos grupos controle e infectados pelo T. gondii durante cultivo em
ConA por 24 horas medida pelo mtodo de ELISA - Beltsville 2003
4.2.4 Determinao de Haptoglobina
Foi observado um aumento significante (D=0,05) dos nveis de haptoglobina srica nos
animais dos grupos 4DPI, 7DPI e 14DPI em relao ao grupo Controle (Grfico 4.2.3). Os
valores detectados nos grupos 7DPI e 14DPI apresentam-se acima do limite de deteco do teste.
Devido a falta de reagente para realizao de diluies para determinao da concentrao real
destas amostras, os valores de haptoglobina dos grupos 7DPI e 14DPI foram indicados como
>10mg/dl.
100
Haptoglobina (mg/ml)
12
7DPI
14DPI
AB
9
6
BC
C
3
0
Controle
2DPI
4DPI
Grfico 4.2.3 - Nveis de haptoglobina em sunos dos grupos controle e infectados pelo T. gondii
medido por mtodo colorimtrico. Letras distintas entre grupos experimentais
indicam diferena estatstica significante (D=0,05) - Beltsville - 2003
4.2.5
Hemograma
A tabela 4.2.2 apresenta os resultados do hemograma dos animais experimentais. No

foram observadas alteraes significantes nas contagens do nmero total de leuccitos (Leu),
nmero total (T) e relativo (%) de neutrfilos (Ne), linfcitos (Li), moncitos (Mo), eosinfilos
(Eo), basfilos (Ba), nmero total de eritrcitos (He), concentrao de hemoglobina (Hb), volume
globular (Hct), volume corpuscular mdio (MCV), hemoglobina corpuscular mdia (MCH) e
concentrao hemoglobnica corpuscular mdia (MCHC).
101
Tabela 4.2.2 - Mdia e desvio-padro (DP) da contagem do nmero total de leuccitos (Leu), nmero total (T) e
relativo (%) de neutrfilos (Ne), linfcitos (Li), moncitos (Mo), Eosinfilos (Eo), basfilos (Ba),
nmero total de eritrcitos (He), concentrao de hemoglobina (Hb), volume globular (Hct), volume
corpuscular mdio (MCV), hemoglobina corpuscular mdia (MCH) e concentrao hemoglobnica
corpuscular mdia (MCHC) em sunos infectados com T. gondii e controle no-infectado. Diferena
entre os grupos experimentais (Estat.) segundo teste de Tukey-Kramer, D=0,05 - Beltsville - 2003
Valores do
hemograma
Controle
Mdia
Leu (103/ml)
Ne
Li
Mo
Eo
DP Estat. Mdia
4DPI
DP Estat. Mdia
7DPI
DP Estat. Mdia
17,7 3,0
7,2 2,6
AB
A
10,9 2,1
5,5 1,1
AB
A
15,5 5,0
9,9 4,7
AB
A
12,1
4,8
%
T
40,3 10,0
9,3 2,1
A
AB
50,5 0,6
4,9 0,7
A
AB
62,5 14,6
4,5 2,8
A
B
%
T
52,9 10,8
0,5 0,1
A
A
45,3 2,0
0,3 0,1
A
A
30,3 15,6
0,3 0,1
A
A
%
T
%
2,8 0,1
0,7 0,3
A
A
2,8 0,0
0,2 0,2
A
A
1,7 0,1
0,7 0,2
A
A
4,1
1,2
3,8 0,8
0,0 0,0
A
A
1,3 1,3
0,0 0,0
A
A
5,1 2,0
0,1 0,1
A
A
0,2 0,2
6,6 1,0
11,6 0,5
A
A
A
0,1 0,1
9,4 0,4
11,2 0,7
A
A
A
0,4 0,4
7,6 1,4
11,3 1,2
33,1 2,1
51,0 4,5
B
A
43,2 0,6
46,2 2,8
A
A
17,9 2,0
35,0 0,9
A
A
12,0 1,3
26,0 1,2
A
B
T
%
Ba
2DPI
He (10 /ml)
Hb (g/dl)
Hct (%)
MCV (fl)
MCH (pg)
MCHC (g/dl)
14DPI
DP Estat. Mdia
5,1
0,8
DP Estat.
B
A
24,9 5,8
11,1 4,0
A
A
44,1 17,3
5,4 3,0
A
AB
43,8 5,4
11,9 2,4
A
A
42,0 13,0
0,6 0,5
A
A
48,4 4,8
0,8 0,2
A
A
2,1
1,1
A
A
3,2 0,5
0,9 1,0
A
A
8,4
0,2
5,7
0,3
A
A
4,0 4,8
0,1 0,1
A
A
A
A
A
1,5
7,4
10,7
1,4
1,0
0,3
A
A
A
0,6 0,5
6,7 0,4
9,6 1,1
A
A
A
38,3 4,5
50,6 3,3
AB
A
35,0
47,7
3,4
2,2
AB
A
33,5 2,7
49,7 1,9
B
A
15,1 2,1
29,7 2,7
A
AB
14,7
30,6
2,1
3,1
A
AB
14,3 1,6
28,6 2,5
A
AB
102
4.2.6
Expresso Gnica
No EXP II foram testados cinco amostras de tecidos diferentes: LN M, LN HS, fgado,

jejuno e leo. Foram avaliados 48 genes, 30 genes previamente testados no EXP I e incorporados
18 novos genes:
As amostras de jejuno foram testadas separadamente e possuem um painel distinto de
genes.
Os genes MYD88, ICSBP1, TBX21, CD28 e TNFRSF6 foram avaliadas no LN M, LN
HS, fgado e leo, mas no no jejuno.
Os genes IL8, CCL5, CCL2, STAT4, IL5 foram avaliados no jejuno, mas no no LN M,
LN HS, fgado e leo.
O gene IL23A foi testado em todas as amostras de tecido, mas somente as amostras de
jejuno apresentaram resultados positivos.
As tabelas 4.2.3 a 4.2.7 mostram os valores mdios de Ct, respectivos desvios padres e a
diferena estatstica entre grupos experimentais pelo teste de Tukey-Kramer (D=0,05).
A figura 4.2.1 ilustra o aumento ou a diminuio da expresso de mRNA nos diferentes
tecidos pela Real-Time RT-PCR.
As tabelas 4.2.8 e 4.2.9 referem-se figura 4.2.1 e mostram a variao da expresso de
mRNA em valores numricos, permitindo a observao da magnitude da resposta de forma mais
pormenorizada.
103
Tabela 4.2.3 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo mesentrico dos sunos do EXP II.
Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo
com o dia aps a infeco com T. gondii . Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de TukeyKramer (D = 0,05) - Beltsville 2003
Gene
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
TNF
TLR2
TLR4
CRP
MYD88
FCGR3A
IFNG
IFNGR
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL18R
IL23A
IRF1
HLX1
ICSBP1
TBX21
STAT1
IL4
IL13
GATA3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
IGM
IGG
IGA
IL10
TGFB1
MHC2TA
ICOS
CD3E
CD28
CD69
CTLA4
TNFRSF5
TNFSF5
CD80
CD86
TNFRSF6
CASP1
Controle
2DPI
16,6
29,2
28,7
25,6
27,3
23,1
23,1
32,0
21,6
18,7
25,4
21,4
30,2
25,9
31,3
30,3
20,7
24,2
xx
20,1
29,7
27,0
27,9
20,3
28,0
31,4
23,1
22,6
33,7
35,5
35,6
20,5
21,9
21,0
25,6
24,9
21,6
21,0
19,9
23,2
21,6
24,9
20,7
23,3
23,7
21,5
22,9
22,8
0,4
4,0
0,7
0,7
0,6
0,4
0,3
1,1
0,5
0,3
1,0
0,6
1,6
1,0
2,7
1,3
0,4
0,5
xx
0,5
0,5
0,5
0,4
0,8
0,9
0,8
0,5
0,8
0,6
1,6
0,9
0,6
0,7
1,2
0,6
0,2
0,2
0,6
0,7
0,7
0,8
0,5
0,6
0,6
0,5
0,6
0,7
1,1
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
B
A
AB
A
A
xx
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
17,0
30,3
26,7
24,4
27,3
23,3
23,9
32,5
21,6
18,8
22,7
21,9
31,3
26,7
32,8
29,8
21,6
24,2
xx
19,2
29,8
27,5
27,7
19,0
26,3
28,2
23,7
22,0
34,1
34,8
33,4
22,3
21,9
21,6
25,2
24,8
21,7
21,6
19,9
23,0
21,8
25,0
21,1
23,8
23,9
21,6
23,2
22,4
0,2
0,5
1,3
0,1
0,2
0,7
0,2
1,0
0,3
0,4
0,9
0,7
0,0
0,4
0,6
2,0
1,1
0,4
xx
0,4
0,2
0,1
0,4
0,5
0,6
1,0
0,5
0,7
0,1
2,0
1,2
1,1
1,6
1,6
0,6
0,4
0,3
0,5
0,1
0,0
0,2
0,7
0,8
0,3
0,6
0,3
0,2
0,2
A
A
AB
AB
A
A
A
A
A
A
BC
A
A
AB
A
AB
A
A
xx
AB
A
A
A
AB
A
B
A
AB
A
AB
AB
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
Mdia
16,8
30,7
24,4
23,1
26,9
22,4
22,2
31,8
21,1
18,5
21,4
21,4
30,5
27,8
31,7
28,5
20,7
24,3
xx
18,9
29,8
27,4
27,9
18,9
26,3
28,9
23,9
19,8
33,7
29,9
31,0
21,1
21,7
20,3
24,5
24,7
21,3
20,9
20,1
23,3
21,6
24,0
20,4
24,0
24,0
21,7
23,2
21,8
4DPI
DP Estat.
0,1
0,2
3,0
1,6
0,6
0,7
0,7
0,7
0,3
0,3
1,1
0,3
0,7
0,6
0,9
0,8
0,5
0,2
xx
0,1
0,7
0,6
0,7
0,2
1,4
1,3
0,3
1,1
0,6
3,5
1,8
0,2
0,6
0,8
0,8
0,5
0,1
0,2
0,4
0,1
0,3
0,7
0,6
0,3
0,1
0,9
0,5
0,6
A
A
B
B
A
A
B
A
A
A
C
A
A
AB
A
AB
A
A
xx
B
A
A
A
B
A
AB
A
BC
A
BC
BC
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
Mdia
17,0
29,2
24,3
23,8
27,0
22,1
20,9
31,0
20,8
17,6
22,2
20,9
29,5
28,7
28,6
27,9
20,6
23,8
xx
19,5
29,4
26,2
27,3
19,4
27,3
32,0
23,5
19,1
30,0
26,5
27,2
17,1
19,4
19,4
24,7
24,3
21,9
21,5
20,4
23,6
22,4
23,5
20,4
24,3
24,2
21,3
23,3
20,9
7DPI
DP Estat.
0,3
2,7
0,3
0,3
0,8
0,1
0,1
0,9
0,5
0,2
1,0
0,3
1,6
1,5
2,9
2,6
0,4
0,5
xx
0,8
0,2
1,9
0,6
0,6
1,3
1,6
0,9
1,4
1,9
0,5
1,4
2,0
2,5
1,6
0,8
1,1
0,6
1,2
1,0
1,1
1,1
1,4
0,8
0,8
0,5
0,4
0,7
0,7
A
A
B
AB
A
A
C
A
A
B
C
A
A
A
A
B
A
A
xx
AB
A
A
A
AB
A
A
A
C
B
C
C
B
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
Mdia
17,3
30,9
28,5
26,0
28,4
23,4
22,8
32,5
21,9
18,4
24,7
21,5
32,1
27,5
31,5
32,4
21,6
23,8
xx
20,3
30,4
27,1
27,4
20,5
28,6
31,5
23,9
22,9
33,4
34,1
32,6
21,6
19,4
21,9
26,2
25,3
22,3
21,8
20,6
23,9
22,7
25,2
21,6
24,2
24,6
22,4
23,3
22,9
14DPI
DP Estat.
0,5
1,3
1,0
0,8
0,8
0,5
0,5
0,2
0,4
0,3
0,5
0,6
0,9
1,1
0,6
1,1
0,8
0,9
xx
0,4
0,8
0,8
0,1
0,5
0,6
1,0
0,6
0,9
1,1
2,6
1,9
0,3
1,7
0,7
0,7
0,5
0,2
0,6
0,7
0,8
1,0
0,3
0,6
0,9
0,6
0,5
0,5
0,4
A
A
A
A
A
A
B
A
A
AB
AB
A
A
AB
A
A
A
xx
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
AB
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
104
Tabela 4.2.4 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo hepato-esplnico dos sunos do EXP II.
Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo
com o dia aps a infeco com T. gondii . Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de TukeyKramer (D = 0,05) - Beltsville 2003
Gene
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
TNF
TLR2
TLR4
CRP
MYD88
FCGR3A
IFNG
IFNGR
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL18R
IL23A
IRF1
HLX1
ICSBP1
TBX21
STAT1
IL4
IL13
GATA3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
IGM
IGG
IGA
IL10
TGFB1
MHC2TA
ICOS
CD3E
CD28
CD69
CTLA4
TNFRSF5
TNFSF5
CD80
CD86
TNFRSF6
CASP1
Controle
2DPI
16,5
28,5
27,1
25,6
27,4
22,5
22,6
29,9
21,9
16,7
25,6
21,0
30,1
24,6
27,4
31,5
20,8
23,5
xx
20,2
28,9
26,4
27,9
20,6
28,7
31,3
22,2
22,2
34,2
32,9
34,8
20,7
20,5
22,8
26,4
25,5
21,5
21,6
20,1
23,3
21,8
25,5
20,8
23,5
23,6
21,8
23,5
23,1
0,2
2,5
0,4
0,5
0,5
0,4
0,3
2,2
0,3
4,8
0,1
0,1
1,3
0,9
7,7
0,6
0,4
0,2
xx
0,2
0,3
0,8
0,6
0,5
0,6
0,7
0,4
0,8
0,5
2,1
0,7
1,0
0,8
1,7
0,4
1,9
0,2
0,8
0,3
0,4
0,4
0,2
0,5
0,3
0,3
0,5
0,6
0,6
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
xx
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
AB
A
A
A
AB
A
A
A
A
16,6
29,5
27,7
25,3
27,3
22,6
22,9
28,2
21,8
19,1
26,1
21,0
30,7
25,1
31,9
31,1
20,6
23,8
xx
19,9
28,6
26,1
27,6
20,0
29,1
30,6
22,6
21,9
33,7
31,6
34,9
20,9
19,9
23,4
26,0
24,7
21,3
22,0
20,5
23,7
22,0
25,5
20,7
23,6
23,3
21,5
23,6
22,9
0,5
1,0
0,6
0,5
0,4
0,4
1,0
2,0
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,7
0,8
2,2
0,5
0,2
xx
0,9
0,7
0,8
0,7
1,1
0,6
0,8
0,4
1,0
1,2
2,2
1,7
0,9
1,0
0,5
0,3
1,5
0,6
0,5
0,4
0,5
0,5
0,3
0,5
0,3
0,5
0,6
0,6
0,7
A
A
AB
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
xx
AB
A
A
A
AB
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
Mdia
17,0
29,4
27,3
25,2
27,2
22,7
22,4
25,2
21,7
18,8
25,2
21,3
30,7
26,3
31,4
30,1
20,6
24,5
xx
19,6
28,7
26,3
27,7
19,3
28,5
31,2
22,9
20,9
34,0
31,2
31,5
20,5
20,1
22,4
24,8
24,2
21,1
21,8
20,7
24,3
22,0
25,5
21,0
24,1
23,8
21,5
23,5
22,3
4DPI
DP Estat.
0,5
0,5
0,9
0,9
0,8
0,7
0,9
4,3
0,8
0,8
1,2
0,7
0,5
0,7
1,0
0,4
1,0
0,6
xx
0,7
0,8
0,7
1,0
0,6
1,8
1,5
0,6
0,8
0,7
4,2
0,6
1,5
1,7
2,9
1,4
1,7
0,6
0,9
0,6
0,8
0,4
0,8
0,6
0,4
0,4
0,9
1,0
0,9
A
A
AB
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
xx
AB
A
A
A
AB
A
A
A
AB
A
A
B
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
Mdia
16,3
31,3
25,4
24,1
26,5
21,8
21,2
29,5
20,5
17,5
22,0
20,8
29,8
26,5
29,2
28,9
20,1
22,5
xx
18,7
28,7
26,7
25,4
18,7
26,6
31,8
21,6
18,9
32,6
33,3
28,1
19,5
21,1
23,4
24,0
24,4
21,2
20,3
19,2
22,5
21,6
22,9
19,8
22,7
23,2
20,6
23,0
21,0
7DPI
DP Estat.
0,3
0,7
1,3
0,8
0,7
0,7
0,6
1,9
0,3
0,4
0,9
0,3
0,1
1,5
0,6
0,2
0,2
0,5
xx
0,3
0,5
0,4
0,2
0,2
1,3
1,7
0,4
0,9
0,1
4,5
1,2
1,5
1,7
1,1
1,2
0,2
0,0
0,8
0,4
0,4
0,5
1,2
0,2
0,2
0,3
0,4
0,2
0,2
A
A
B
A
A
A
A
A
B
A
B
A
A
A
A
A
A
C
xx
B
A
A
B
B
A
A
B
B
A
A
C
A
A
A
B
A
A
A
B
B
A
B
A
B
A
A
A
B
Mdia
16,5
29,9
28,7
25,4
27,5
22,7
22,9
27,5
21,7
19,0
24,7
21,1
30,3
25,8
31,3
29,2
20,7
23,7
xx
20,1
29,0
26,3
26,8
20,0
28,6
31,8
22,8
21,5
34,2
31,7
33,3
20,3
18,4
24,6
26,2
25,2
21,5
21,0
20,2
23,4
21,8
25,1
20,8
23,4
23,4
21,8
23,3
23,1
14DPI
DP Estat.
0,5
0,2
1,0
0,6
0,6
0,8
0,9
2,5
0,7
0,4
0,7
0,8
1,1
1,0
0,1
1,1
0,3
0,3
xx
0,6
0,2
0,6
0,1
0,6
0,6
1,3
0,1
0,7
1,0
0,5
1,0
0,7
0,5
0,9
0,4
0,2
0,7
0,6
0,3
0,4
0,8
0,7
0,5
0,4
0,4
0,6
0,4
0,9
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
xx
AB
A
A
AB
AB
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
AB
A
A
A
AB
AB
A
A
A
AB
A
A
A
A
105
Tabela 4.2.5 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de fgado dos sunos do EXP II. Valores mdios de Ct
e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a
infeco com T. gondii . Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) Beltsville 2003
Gene
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
TNF
TLR2
TLR4
CRP
MYD88
FCGR3A
IFNG
IFNGR
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL18R
IL23A
IRF1
HLX1
ICSBP1
TBX21
STAT1
IL4
IL13
GATA3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
IGM
IGG
IGA
IL10
TGFB1
MHC2TA
ICOS
CD3E
CD28
CD69
CTLA4
TNFRSF5
TNFSF5
CD80
CD86
TNFRSF6
CASP1
Controle
2DPI
4DPI
7DPI
14DPI
Mdia DP Estat. Mdia DP Estat. Mdia DP Estat. Mdia DP Estat. Mdia DP Estat.
18,2
32,4
29,7
29,9
31,9
25,6
25,3
20,0
24,0
21,7
29,9
23,7
35,1
33,5
35,1
32,3
24,2
28,1
xx
23,0
32,9
31,1
32,5
22,7
33,1
33,8
27,4
30,0
38,3
22,0
33,0
25,4
26,4
28,3
28,9
28,5
26,3
28,9
26,8
30,5
28,4
33,4
25,3
30,0
28,8
25,3
27,1
24,9
0,4
0,7
0,5
1,1
0,8
0,3
0,4
1,6
0,5
0,4
0,8
0,5
1,0
1,1
0,8
0,8
0,4
0,3
xx
0,6
0,5
0,2
0,1
0,6
1,0
1,3
0,3
0,4
0,2
1,5
0,6
0,6
0,3
1,1
1,0
0,8
0,2
0,7
0,6
1,0
0,4
0,6
0,4
0,5
0,4
0,3
0,7
0,5
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
xx
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
17,5
31,9
29,0
28,8
30,1
24,7
24,9
19,2
23,2
20,9
28,9
23,3
34,0
33,4
34,9
30,8
23,6
27,9
xx
21,6
32,5
29,9
32,2
21,0
32,6
32,0
27,4
27,3
37,2
21,8
32,0
24,8
25,8
28,2
27,3
28,1
24,8
28,5
26,4
30,7
27,6
32,5
24,7
29,2
28,2
24,6
26,4
23,7
0,3
1,1
0,2
0,4
1,5
1,1
0,8
1,2
0,2
0,5
2,0
0,2
1,6
1,2
0,7
3,4
0,9
0,7
xx
1,0
1,1
1,5
0,8
1,1
0,6
1,9
0,5
2,7
2,0
1,8
1,7
1,1
2,0
0,9
0,9
1,5
1,1
1,0
0,6
0,6
1,0
1,1
0,6
1,1
0,2
0,6
0,2
0,6
A
A
AB
AB
AB
ABC
A
AB
AB
A
A
AB
AB
AB
A
A
AB
A
xx
AB
AB
A
AB
BC
A
A
A
AB
AB
A
A
A
A
AB
AB
A
BC
A
AB
A
A
AB
A
AB
A
AB
AB
A
17,7
32,8
27,6
27,7
29,7
23,5
23,1
15,9
21,7
19,6
28,0
22,4
32,9
33,9
35,4
31,4
22,3
27,7
xx
20,0
32,4
29,9
31,0
19,0
32,2
33,3
27,2
21,7
37,6
20,2
29,0
24,8
25,6
28,6
25,3
27,7
24,0
27,7
25,8
30,3
27,3
30,7
23,3
28,7
28,0
23,5
23,4
22,3
0,4
0,4
1,7
0,7
0,4
0,6
0,4
0,1
0,6
0,4
0,5
0,6
0,1
1,5
0,9
2,2
0,6
0,5
xx
0,5
0,8
0,4
0,4
0,3
0,4
0,6
0,1
0,1
0,5
0,7
0,5
0,7
0,5
0,3
0,9
0,1
0,6
0,3
0,2
0,2
0,8
0,2
0,2
0,4
0,4
0,1
0,8
0,3
A
A
AB
B
B
BC
B
C
C
A
A
B
AB
A
A
A
B
A
xx
B
AB
A
B
D
A
A
A
C
AB
A
B
A
A
AB
B
A
C
A
AB
A
A
B
B
AB
AB
BC
C
B
17,9
30,1
26,5
27,4
29,0
23,0
22,9
16,4
21,9
15,8
24,7
22,4
31,4
30,9
31,1
31,8
22,8
26,4
xx
20,6
31,2
29,5
29,2
19,9
29,5
33,2
25,6
21,2
35,3
20,5
28,9
22,2
23,7
25,7
25,9
27,5
23,6
24,8
23,5
27,0
26,4
26,6
22,7
26,3
26,8
23,1
24,4
22,2
0,4
2,9
1,2
1,1
0,6
0,8
0,5
0,0
0,5
5,5
0,8
0,6
1,4
0,5
2,3
2,9
0,8
0,5
xx
0,9
0,7
0,5
0,4
0,7
1,6
1,5
0,3
1,1
1,2
1,6
0,4
0,9
1,4
1,2
0,3
1,0
0,2
0,8
0,8
0,7
0,9
1,3
0,6
0,2
0,8
0,5
0,9
0,3
A
A
B
B
B
C
B
BC
BC
A
B
B
B
B
B
A
AB
B
xx
B
B
A
C
CD
B
A
B
C
B
A
B
B
A
B
B
A
C
B
C
B
A
C
B
C
B
C
BC
B
18,2
33,6
29,4
29,4
30,8
25,4
24,8
18,4
23,6
20,8
28,2
23,9
33,6
33,2
33,7
33,4
24,2
27,5
xx
22,4
33,3
31,4
30,9
22,5
32,9
33,6
27,3
26,5
36,4
21,5
33,4
25,3
23,9
29,1
28,0
29,4
25,6
27,7
25,3
29,6
28,1
31,7
25,3
27,8
28,8
25,1
26,8
24,3
0,4
1,4
0,9
0,3
0,6
1,1
0,7
1,6
0,7
0,4
0,1
0,4
2,0
1,0
1,4
1,0
0,6
0,3
xx
0,3
0,4
0,4
0,6
0,6
0,6
1,3
0,8
0,6
1,1
1,3
0,9
1,1
0,9
1,8
2,1
1,2
0,2
0,6
0,2
0,4
0,9
0,2
0,2
0,3
0,5
0,5
1,1
0,8
A
A
A
AB
AB
AB
A
ABC
A
A
A
A
AB
AB
AB
A
A
AB
xx
A
A
A
B
AB
A
A
A
B
AB
A
A
A
A
A
AB
A
AB
A
B
A
A
AB
A
B
A
A
A
A
106
Tabela 4.2.6 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de leo dos sunos do EXP II. Valores
mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo
com o dia aps a infeco com T. gondii . Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de
Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003
Gene
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
TNF
TLR2
TLR4
CRP
MYD88
CD16
IFNG
IFNGR
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL18R
IL23A
IRF1
HLX1
ICSBP1
TBX21
STAT1
IL4
IL13
GATA3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
IGM
IGG
IGA
IL10
TGFB1
MHC2TA
ICOS
CD3E
CD28
CD69
CTLA4
TNFRSF5
TNFSF5
CD80
CD86
TNFRSF6
CASP1
Controle
2DPI
4DPI
7DPI
14DPI
Mdia
DP Estat. Mdia
DP Estat.
Mdia
DP Estat.
Mdia
DP Estat.
Mdia
DP
Estat.
17,5
29,6
26,0
28,3
28,8
25,0
24,6
31,3
21,8
19,8
24,5
20,3
30,9
28,4
30,9
32,0
22,1
24,3
xx
19,7
29,7
28,2
29,7
19,2
28,3
31,7
23,9
25,9
29,5
33,4
33,4
21,0
21,8
19,3
27,3
27,2
23,7
24,2
21,9
26,7
23,2
27,4
23,0
25,4
25,9
22,7
24,1
20,6
0,4
1,6
0,9
1,1
0,6
0,8
0,5
1,2
0,4
0,4
2,2
0,4
1,7
0,6
2,8
2,1
0,9
0,8
xx
0,3
0,3
0,7
1,1
0,1
0,4
1,2
1,0
1,5
0,6
1,9
2,9
1,0
0,5
2,3
0,5
0,3
0,8
0,8
2,2
1,4
0,2
0,7
0,5
0,7
0,7
0,5
0,5
0,5
0,4
0,9
1,3
0,8
0,5
1,0
0,6
1,0
0,4
0,5
1,8
0,7
2,4
2,0
4,5
3,4
0,8
0,3
xx
0,7
0,8
0,5
0,7
0,4
0,7
0,4
1,0
1,6
1,0
1,1
2,1
0,9
0,3
2,2
2,3
0,3
0,5
0,7
0,3
0,6
0,8
1,1
0,6
0,4
0,4
1,2
0,9
0,8
17,6
30,6
25,4
27,9
29,9
24,8
24,6
31,3
22,1
20,3
25,0
20,8
32,5
30,5
33,5
28,4
22,6
25,5
xx
19,6
30,6
27,7
30,3
19,1
28,4
32,3
25,5
23,8
29,2
32,9
33,3
22,2
22,1
20,2
26,8
27,0
23,9
24,6
21,6
27,2
23,9
27,1
23,3
26,0
26,6
22,3
23,8
19,8
0,6
0,5
1,4
1,6
1,2
0,7
1,4
0,4
0,9
0,9
1,2
0,6
1,2
0,6
1,2
0,7
0,7
0,8
xx
0,8
0,7
0,5
0,7
1,1
1,3
1,2
0,9
2,1
0,9
2,1
1,4
0,5
0,2
1,4
0,9
0,9
1,2
0,6
0,2
1,5
0,7
1,1
1,3
0,6
1,0
1,3
1,5
0,6
16,8
28,8
20,7
23,7
25,0
22,0
21,5
27,3
20,6
17,9
23,4
19,9
27,7
27,7
27,3
30,8
20,2
24,0
xx
18,5
28,0
27,1
27,7
18,2
26,7
30,5
22,8
19,7
27,7
26,7
25,9
18,7
21,3
18,5
23,9
24,9
21,9
22,3
21,2
25,2
22,6
24,0
20,3
24,2
24,5
21,0
23,0
19,4
0,6
4,1
2,9
2,7
1,4
1,2
1,4
3,5
0,9
1,2
1,8
0,3
2,5
1,3
3,0
0,4
1,1
1,6
xx
0,6
0,5
1,6
0,3
0,9
0,9
1,6
1,0
2,1
1,4
2,5
0,4
2,7
1,8
2,2
1,3
0,5
1,1
0,8
2,0
1,9
0,9
1,9
1,2
1,1
1,3
1,1
1,5
0,2
17,3
31,6
26,5
28,1
29,5
24,8
24,3
31,3
22,1
19,6
25,2
20,9
31,6
29,2
32,3
31,4
21,9
24,5
xx
20,1
30,1
28,7
29,9
19,9
29,1
32,1
24,9
25,1
31,9
33,9
33,2
20,8
20,7
20,1
27,6
27,4
23,6
24,7
21,8
26,7
24,0
27,7
22,9
25,4
26,2
22,7
24,3
20,3
0,6
0,8
1,1
0,8
0,9
1,1
0,8
1,2
0,9
0,6
0,6
1,0
0,8
1,1
0,2
3,2
0,7
0,8
xx
0,9
1,0
0,9
0,7
1,5
0,8
0,7
1,0
1,0
2,0
0,7
0,4
2,3
1,7
2,1
1,0
0,7
0,7
1,3
1,2
1,0
1,0
1,2
0,9
0,8
0,9
1,1
1,2
0,6
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
AB
A
xx
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
xx
A
A
A
A
A
AB
A
AB
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
16,9
31,6
25,6
27,3
28,7
24,4
23,7
30,5
21,1
19,0
24,6
19,9
30,2
29,1
32,6
34,3
21,8
24,3
xx
18,8
29,6
28,4
29,6
18,2
27,5
30,5
24,2
23,9
29,9
31,9
34,0
21,8
22,9
21,0
28,5
27,1
22,9
23,8
21,0
26,2
23,0
27,2
22,1
24,7
25,2
21,9
23,6
19,4
A
A
A
AB
A
AB
AB
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
AB
A
xx
A
AB
A
AB
A
AB
A
AB
AB
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
AB
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
xx
A
A
A
A
A
AB
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
AB
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
A
A
B
A
A
A
A
A
A
B
A
xx
A
B
A
B
A
B
A
B
B
B
B
B
A
A
A
B
B
A
B
A
A
A
B
B
A
A
A
A
A
107
Tabela 4.2.7 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de jejuno dos sunos do EXP II. Valores mdios de Ct
e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a
infeco com T. gondii . Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) l ill
Gene
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
IL8
CCL5
CCL2
TNF
TLR2
TLR4
CRP
FCGR3A
IFNG
IFNGR
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL18R
IL23A
IRF1
HLX1
STAT1
STAT4
IL4
IL5
IL13
GATA3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
IGM
IGG
IGA
IL10
TGFB1
MHC2TA
ICOS
CD3E
CD69
CTLA4
TNFRSF5
TNFSF5
CD80
CD86
CASP1
Controle
2DPI
17,6
30,3
26,2
29,3
20,8
19,3
21,4
29,9
26,2
24,3
31,0
19,4
26,5
19,9
33,0
30,8
33,5
28,0
21,0
22,9
38,9
19,9
30,2
19,7
25,7
28,6
29,1
31,7
24,5
26,0
33,8
30,0
34,0
20,9
21,9
19,3
30,0
27,0
23,5
22,8
21,0
23,0
27,9
23,7
25,1
25,9
22,2
19,6
0,4
0,5
1,1
0,7
0,8
0,5
0,9
0,7
0,7
0,5
0,8
0,8
0,8
0,6
1,0
0,7
0,8
0,4
1,4
1,5
1,2
0,7
0,5
0,6
0,7
0,4
0,8
0,6
0,4
0,7
1,3
0,2
1,1
0,4
0,6
1,2
0,7
0,4
0,7
0,8
0,5
0,6
0,7
1,6
0,9
0,5
0,9
0,9
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
AB
AB
A
A
AB
AB
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
17,2
30,7
25,5
28,5
20,4
18,5
20,8
29,7
25,7
24,4
29,9
19,0
25,4
19,4
31,9
30,3
32,5
27,6
21,0
22,7
38,9
19,0
30,2
18,7
25,1
28,1
28,4
31,4
23,8
25,5
31,8
29,7
33,4
20,0
22,6
19,4
29,6
26,7
22,8
22,4
20,3
23,0
27,5
23,6
24,7
25,2
21,3
18,8
0,1
0,8
0,4
0,7
0,1
0,6
0,6
0,4
0,1
0,6
1,3
0,7
0,9
0,1
1,4
1,4
1,7
0,6
0,3
0,5
0,6
0,4
0,7
0,4
0,7
0,4
0,5
0,5
0,7
1,2
1,0
1,3
1,4
0,7
0,5
1,1
0,4
0,3
0,6
0,5
0,6
0,4
0,3
1,4
0,5
0,3
0,1
0,5
A
A
A
ABC
A
A
A
AB
A
A
A
A
AB
B
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
AB
A
AB
B
AB
A
A
BC
AB
AB
A
A
A
AB
A
AB
AB
A
A
A
A
A
AB
AB
A
Mdia
17,2
30,7
25,6
27,3
20,4
19,6
20,4
29,3
24,4
23,2
30,5
19,1
24,4
19,8
32,3
32,4
32,7
27,4
21,8
23,6
37,9
18,3
29,9
17,9
25,3
26,8
30,0
30,7
24,4
22,1
30,6
30,4
31,0
20,4
22,1
19,1
28,4
26,8
22,3
21,9
20,8
22,4
25,6
22,8
24,6
25,4
20,6
18,7
4DPI
DP Estat.
0,2
0,4
0,8
0,4
0,2
0,4
0,6
1,1
0,4
0,8
0,5
0,3
0,9
0,2
0,4
0,8
0,9
0,1
0,5
0,3
0,3
0,1
0,7
0,2
0,3
1,4
0,5
0,8
0,2
0,8
0,2
0,5
1,3
0,4
0,3
0,3
0,9
0,3
0,2
0,5
0,3
0,5
0,5
1,0
0,2
0,3
0,4
0,3
A
A
A
C
A
A
A
AB
BC
AB
A
A
AB
AB
A
A
A
A
A
A
A
B
A
B
A
B
AB
B
A
B
C
AB
BC
A
A
A
B
A
B
AB
A
A
B
A
A
AB
B
A
Mdia
17,7
30,4
24,9
27,9
20,5
19,4
20,4
28,5
23,3
22,7
31,3
18,8
23,8
20,4
32,2
31,1
31,7
28,1
21,5
23,8
38,8
19,2
29,6
18,6
24,7
27,4
30,3
31,8
23,9
20,5
31,0
28,1
28,8
20,5
22,0
19,4
28,4
25,4
22,3
21,3
20,8
23,3
24,6
23,0
24,5
25,0
21,2
19,5
7DPI
DP Estat.
0,2
0,3
1,0
0,4
0,3
0,9
0,5
0,3
0,5
0,5
0,7
0,6
0,7
0,4
0,1
1,2
1,0
0,4
0,2
0,3
0,2
0,5
0,2
0,3
0,3
0,8
0,6
0,2
0,4
0,5
0,2
1,5
0,3
0,7
1,5
0,7
0,2
0,5
0,1
0,3
0,3
0,2
0,4
0,3
0,4
0,2
0,3
0,4
A
A
A
BC
A
A
A
B
C
B
A
A
B
AB
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
B
A
AB
A
AB
A
B
C
B
C
A
AB
A
B
B
B
B
A
A
B
A
A
B
AB
A
Mdia
17,6
30,5
26,6
29,0
21,6
19,8
21,4
30,3
25,2
24,2
30,4
19,7
25,1
20,5
33,3
30,9
33,2
28,4
22,2
23,7
39,2
20,2
30,3
19,8
25,7
29,0
29,6
32,6
24,5
24,3
34,8
30,8
33,4
20,3
19,9
19,4
30,1
26,5
23,1
22,8
21,4
23,1
27,4
24,4
24,8
25,7
22,1
19,9
14DPI
DP Estat.
0,2
0,8
0,8
0,6
0,5
0,3
0,4
0,2
0,3
0,2
2,2
0,3
1,1
0,4
0,9
0,5
0,2
0,7
0,4
0,6
0,3
0,4
0,6
0,3
0,5
0,7
0,9
0,3
0,2
0,4
1,3
0,2
1,4
0,4
0,5
0,4
0,3
0,2
0,3
0,4
0,2
0,0
0,2
0,3
0,1
0,3
0,2
0,4
A
A
A
AB
A
A
A
A
AB
AB
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
AB
A
B
A
A
A
AB
A
A
A
A
A
A
AB
A
A
108
109
Tabela 4.2.8 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T. gondii , mensurado pela Real-Time RT-
PCR. Aumento (valores positivos) ou diminuio (valores negativos) da expresso de mRNA nos
linfonodos mesentrico (LN M), hepato-esplnico (LN HS) e fgado dos grupos infectados em relao ao
controle no-infectado Beltsville - 2003
Gene
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
TNF
TLR2
TLR4
CRP
MYD88
FCGR3A
IFNG
IFNGR
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL18R
IL23A
IRF1
HLX1
ICSBP1
TBX21
STAT1
IL4
IL13
GATA3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
IGM
IGG
IGA
IL10
TGFB1
MHC2TA
ICOS
CD3E
CD28
CD69
CTLA4
TNFRSF5
TNFSF5
CD80
CD86
TNFRSF6
CASP1
CX2
LN M
CX4
CX7
CX14
CX2
0,0
-2,2
4,0
2,3
0,0
0,0
-1,8
0,0
0,0
0,0
6,5
0,0
-2,1
-1,9
-2,8
0,0
-1,9
0,0
xx
1,9
0,0
0,0
0,0
2,4
3,3
9,4
0,0
1,6
0,0
1,6
4,6
-3,5
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
-1,5
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
-2,8
0,0
19,7 22,5
5,6
3,6
0,0
0,0
1,6
2,0
1,9
4,4
0,0
2,1
0,0
1,7
0,0
2,1
15,7
9,4
0,0
0,0
0,0
1,7
-3,7
-7,1
0,0
6,2
3,3
5,2
0,0
0,0
0,0
0,0
xx
xx
2,5
1,6
0,0
0,0
0,0
1,8
0,0
1,6
2,6
1,9
3,1
3,1
5,7
0,0
-1,7
0,0
7,1 11,5
0,0 13,0
48,2 516,6
23,8 330,5
0,0 10,9
0,0
5,4
1,6
3,1
2,1
1,9
0,0
1,6
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
-1,7
1,8
2,5
0,0
0,0
-1,6
-1,9
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
2,0
3,6
-1,6
-3,3
0,0
0,0
-2,1
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
1,6
0,0
-3,6
-3,2
0,0
-4,4
-1,9
0,0
xx
0,0
-1,6
0,0
0,0
0,0
-1,6
0,0
-1,7
0,0
0,0
2,7
7,9
-2,2
5,6
-1,8
0,0
0,0
-1,7
-1,8
-1,7
-1,7
-2,1
0,0
-1,9
-1,8
-1,8
-1,8
0,0
0,0
0,0
-2,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
3,3
0,0
-5,5
0,0
0,0
-1,5
0,0
-22,5
0,0
0,0
0,0
xx
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
1,7
0,0
0,0
0,0
2,5
0,0
0,0
0,0
-1,6
0,0
1,7
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
xx = no detectado
LN HS
CX4
CX7
0,0
-1,8
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
26,2
0,0
-4,4
0,0
0,0
-1,6
-3,2
-15,5
2,7
0,0
-2,0
xx
0,0
0,0
0,0
0,0
2,4
0,0
0,0
-1,6
2,4
0,0
3,4
9,2
0,0
0,0
0,0
3,0
2,5
0,0
0,0
-1,5
-2,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
1,8
0,0
-6,9
3,3
2,7
1,8
1,7
2,6
0,0
2,7
-1,8
12,0
0,0
0,0
-3,8
-3,4
6,0
1,6
2,0
xx
2,7
0,0
0,0
5,6
3,8
4,2
0,0
0,0
9,9
3,1
0,0
99,6
2,4
-1,6
-1,6
5,4
2,1
0,0
2,5
1,8
1,8
0,0
5,9
2,0
1,7
0,0
2,3
0,0
4,3
CX14
0,0
-2,5
-3,0
0,0
0,0
0,0
0,0
5,2
0,0
-5,1
1,9
0,0
0,0
-2,3
-14,4
4,9
0,0
0,0
xx
0,0
0,0
0,0
2,2
0,0
0,0
0,0
-1,5
1,6
0,0
2,3
2,7
0,0
4,2
-3,5
0,0
0,0
0,0
1,5
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Fgado
CX4
CX7
CX14
1,7
0,0
0,0
0,0
0,0
4,7
1,6
4,2
9,0
2,1
4,6
5,5
3,6
4,5
7,5
1,9
4,3
6,4
0,0
4,4
5,3
1,8 17,5 12,4
1,8
5,0
4,4
1,7
4,3 58,6
2,0
3,7 35,3
0,0
2,5
2,5
2,2
4,6 12,8
0,0
0,0
5,9
0,0
0,0 16,7
2,8
1,9
0,0
1,6
3,8
2,7
0,0
0,0
3,2
xx
xx
xx
2,8
8,0
5,5
0,0
0,0
3,1
2,3
2,2
3,0
0,0
2,9 10,1
3,4 12,6
7,1
0,0
1,9 12,0
3,5
0,0
0,0
0,0
0,0
3,6
6,6 314,7 436,4
2,2
1,6
8,1
0,0
3,4
2,8
2,0 16,4 16,8
0,0
0,0
8,8
1,6
1,8
6,8
0,0
0,0
6,1
3,0 12,3
8,0
0,0
1,8
2,0
2,9
5,2
6,7
0,0
2,3 16,8
0,0
1,9
9,5
0,0
0,0 10,7
1,7
2,2
4,0
1,8
6,1 108,4
1,5
4,0
5,9
1,7
2,4 13,0
0,0
1,8
3,9
1,6
3,5
4,5
1,7 12,7
7,8
2,2
5,8
6,4
0,0
-2,3
0,0
0,0
2,2
0,0
0,0
3,1
0,0
1,9
3,2
0,0
2,7
0,0
2,8
-2,1
0,0
0,0
xx
1,5
0,0
0,0
3,0
0,0
0,0
0,0
0,0
11,7
3,7
0,0
0,0
0,0
5,8
-1,8
1,9
-1,9
1,7
2,2
2,7
1,9
0,0
3,2
0,0
4,5
0,0
0,0
0,0
0,0
CX2
110
Figura 4.2.9 Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T. gondii, mensurado pela
Real-Time RT-PCR. Aumento (valores positivos) ou diminuio (valores negativos) da
expresso de mRNA no leo e no jejuno dos grupos infectados em relao ao controle noinfectado Beltsville 2003
(continua)
Gene
RPL32
IFNA
IL1B
IL6
IL8
CCL5
CCL2
TNF
TLR2
TLR4
CRP
MYD88
FCGR3A
IFNG
IFNGR
IL12A
IL12B
IL12RB2
IL15
IL18
IL18R
IL23A
IRF1
HLX1
ICSBP1
TBX21
STAT1
STAT4
CX2
leo
CX4
CX7
0,0
-3,8
0,0
2,1
NT
NT
NT
0,0
1,6
1,8
1,8
1,6
1,8
0,0
0,0
1,6
-1,6
-3,1
-4,9
0,0
0,0
xx
1,9
0,0
0,0
0,0
2,0
NT
0,0
-2,0
0,0
0,0
NT
NT
NT
-2,2
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
-3,0
-4,3
-6,0
12,4
0,0
-2,3
xx
0,0
-1,8
0,0
0,0
0,0
NT
1,6
1,8
37,3
23,9
NT
NT
NT
13,6
8,4
8,5
15,9
2,2
3,9
2,2
0,0
9,3
1,6
11,8
2,2
3,8
0,0
xx
2,4
3,3
2,2
4,1
2,1
NT
CX14
CX2
0,0
-3,9
0,0
0,0
NT
NT
NT
-1,7
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
-1,6
-1,6
-1,6
-1,8
-2,6
0,0
0,0
0,0
xx
0,0
0,0
0,0
0,0
-1,6
NT
0,0
0,0
1,6
1,8
0,0
1,7
1,6
0,0
0,0
0,0
2,2
NT
0,0
2,2
0,0
2,1
1,5
2,0
0,0
0,0
1,6
0,0
1,9
0,0
NT
NT
2,0
1,5
Jejuno
CX4
CX7
0,0
0,0
1,5
4,0
0,0
0,0
2,1
1,5
3,4
2,2
1,5
NT
0,0
4,3
0,0
1,6
-2,9
1,8
1,6
-1,7
0,0
2,0
3,0
0,0
NT
NT
3,4
0,0
0,0
0,0
2,4
2,7
0,0
0,0
2,0
2,6
7,4
3,2
0,0
NT
1,6
6,6
0,0
1,8
0,0
3,6
0,0
0,0
0,0
0,0
1,6
1,5
NT
NT
2,1
1,9
CX14
0,0
0,0
0,0
0,0
-1,7
0,0
0,0
0,0
2,0
0,0
1,5
NT
0,0
2,7
-1,5
0,0
0,0
0,0
0,0
-2,2
0,0
0,0
0,0
0,0
NT
NT
0,0
0,0
111
Figura 4.2.9 Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T. gondii, mensurado pela
Real-Time RT-PCR. Aumento (valores positivos) ou diminuio (valores negativos) da
expresso de mRNA no leo e no jejuno dos grupos infectados em relao ao controle noinfectado Beltsville 2003
(concluso)
Gene
IL4
IL5
IL13
GATA3
INDO
NOS2A
ARG1
SLC11A1
IGM
IGG
IGA
IL10
TGFB1
MHC2TA
ICOS
CD3E
CD28
CD69
CTLA4
TNFRSF5
TNFSF5
CD80
CD86
TNFRSF6
CASP1
CX2
leo
CX4
CX7
CX14
CX2
Jejuno
CX4
CX7
1,7
NT
2,3
0,0
4,0
0,0
2,8
-1,6
-1,8
-2,2
-3,2
-2,2
0,0
1,8
0,0
1,9
0,0
0,0
0,0
1,9
1,7
1,6
1,7
0,0
2,3
0,0
3,0
NT
NT
-1,5
2,3
-3,1
2,1
4,5 76,4
0,0
3,5
0,0 103,5
0,0 177,8
-2,3
4,7
0,0
0,0
-1,8
1,8
0,0 10,7
0,0
4,8
0,0
3,5
0,0
3,7
0,0
1,7
0,0
2,9
-1,6
1,6
0,0 10,6
0,0
6,5
0,0
2,3
-1,6
2,5
0,0
3,1
0,0
2,2
1,7
2,3
-1,8
NT
0,0
-2,1
1,8
-5,2
0,0
0,0
0,0
2,1
-1,7
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
-1,7
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
1,6
0,0
1,7
1,5
4,1
0,0
1,5
1,9
-1,6
0,0
0,0
0,0
1,6
0,0
1,6
NT
0,0
0,0
0,0
0,0
1,6
1,8
NT
1,7
3,3
-1,8
2,0
0,0
15,6
9,3
0,0
7,7
0,0
0,0
0,0
3,0
0,0
2,4
1,8
0,0
NT
1,5
5,1
1,8
1,5
1,5
2,9
NT
1,9
NT = no testado, xx = no detectado
2,2
-2,3
0,0
1,6
45,1
7,3
3,6
37,0
0,0
0,0
0,0
3,0
3,1
2,3
2,8
0,0
NT
0,0
9,7
1,6
1,5
1,9
2,0
NT
0,0
CX14
0,0
0,0
-1,9
0,0
15,6
-1,9
-1,8
1,5
1,5
3,8
0,0
0,0
1,5
0,0
0,0
0,0
NT
0,0
1,5
-1,7
0,0
0,0
0,0
NT
0,0
112
5 DISCUSSO
A infeco oral a via de infeco que melhor simula a evoluo da toxoplasmose na

espcie suna, retratando desta forma os mecanismos ativados durante uma infeco em
condies reais. Ao considerar as atuais condies de criao da suinocultura comercial os
oocistos esporulandos so a principal forma infectante. A probabilidade de acesso a restos
teciduais, possvel fonte de cistos e taquizotos, bastante remota. Os taquizotos, por sua vez,
apresentam baixo risco por serem sensveis digesto pptica cida e facilmente destrudos pelas
enzimas digestivas (DUBEY, 1998; DUBEY; BEATTIE, 1988).
Comparativamente aos estudos que utilizam parasitas mortos ou somente antgenos
especficos de T. gondii, as infeces experimentais com organismos vivos indicam a existncia
de mltiplos mecanismos de ativao (SUBAUSTE; WESSENDARP, 2000). No caso do T.
gondii sabe-se que a atividade parasitria, a invaso celular e a multiplicao de taquizotos
geram sinais que so reconhecidos pela imunidade inata. Assim, as diferenas na virulncia e na
patogenicidade entre as diferentes cepas de T. gondii geram diferentes nveis de resposta no
hospedeiro (ROBBEN et al., 2004).
Sunos experimentalmente infectados com oocistos de T. gondii da cepa VEG no
apresentaram sintomas clnicos, mas desenvolveram infeco crnica com formao de cistos
teciduais mesmo quando receberam doses infectantes equivalentes a um nico oocisto (DUBEY
et al., 1996; SOLANO-AGUILAR et al., 2001).
Em camundongos existe uma evidente variao de resposta a infeco pelo T. gondii nas
diferentes linhagens, levando a variados nveis de resistncia. No existem entretanto publicaes
113
referentes a variaes de resistncia toxoplasmose entre as raas de sunos. Em experimento

utilizando mini-porcos com hapltipos conhecidos, Solano-Aguilar et al. (2001) no observaram
variaes de resposta infeco entre os hapltipos SLAa/a, SLAc/c e SLAd/d.
A deteco de organismos de T. gondii nos diversos tecidos aps a inoculao dos
oocistos fornece indcios da dinmica da infeco. No 2DPI os parasitas foram encontrados
somente no LMN. No 4DPI foram detectados em todos os tecidos testados e em maior
quantidade, indicando a disseminao sistmica e a proliferao dos taquizotos. No 7DPI alm
da presena dos parasitas, foi observada uma intensa resposta local caracterizada por um intenso
infiltrado de clulas inflamatrias, focos mltiplos de edema e necrose tecidual. No 14DPI foram
encontrados um menor nmero de organismos e um menor grau de leso tecidual que sugerem a
inibio da atividade parasitria e a reorganizao do tecido.
Ao mesmo tempo, com intuito de avaliar a magnitude da leso celular, foram realizadas
determinaes das enzimas hepticas. Dentre estas enzimas a aspartato aminotransferase (AST)
foi a que apresentou maior variao. Em condies normais ela encontrada em elevadas
concentraes no citoplasma de clulas hepticas. O aumento dos nveis de AST no soro
utilizado como um indicador de lise celular e pode ser detectado por at 24 a 36 horas aps a
injria (COLES, 1986; DUNCAN; PRASSE, 1987). O aumento de AST srico foi observado no
4DPI, atingindo valores mximos no 7DPI, resultados coerentes aos focos de necrose observados
nos exames histopatolgicos.
Os valores de alanino aminotransferase (ALT) embora apresentem variaes
estatisticamente significantes, no representam alteraes patolgicas, pois apresentam-se dentro
dos valores de normalidade para a espcie animal. A ausncia de alteraes nos valores sricos de
gamaglutamil transferase (GGT), bilirrubinas totais (TBILI), bilirrubina direta (DBILI), fosfatase
alcalina (ALP), protenas totais (PT), globulinas (GLOB), albumina (ALB) e proporo
114
albumina/globulina (A/G) mostram que tais leses no foram suficientes para afetar a funo do
rgo.
A produo de reagentes nitrogenados txicos um processo induzido em fagcitos
ativados com intuito de destruir microrganismos invasores (PAUL, 1999). Em camundongos este
um importante fator de inibio microbiana. No presente experimento, os sunos infectados pelo
T. gondii apresentaram uma significante elevao de NO srico no 4DPI.
A haptoglobina uma protena de fase aguda associada a diversas afeces que acometem
os animais. Tanto no EXP I quanto no EXP II foram observadas elevaes significantes dos
nveis de haptoglobina srica nos grupos 4DPI, 7DPI e 14DPI.
A deteco do parasita nos tecidos, a elevao de AST, somado ao aumento de NO e
haptoglobina so concordantes s variaes detectadas pela Real-Time RT-PCR. J no 2DPI
foram observadas induo de alguns genes, seguida de um aumento no 4DPI e no 7DPI e
diminuio de resposta no 14DPI. A combinao destes achados permitiu associar a leso e a
reao tecidual presena do T. gondii.
Os resultados listados no apndice G indicam a possibilidade de variaes de resposta de
um animal para o outro. Esta variao individual pde ser notada nos animais do 7DPI que
apresentaram diferentes nveis de infeco pelo T. gondii e diferentes valores de IFN-J, NO e
AST sricos. Infelizmente no foi possvel traar uma comparao individual entre o perfil de
induo de mRNA nos tecidos com a quantidade de parasitas em multiplicao. Portanto embora
sujeito a estas variaes de ordem individual, os dados foram simplesmente reunidos e analisados
em grupo.
A anlise estatstica indicou portanto a diferena entre grupos onde houve baixa variao
de resposta entre os indivduos do grupo, isto , onde houve baixo desvio-padro. Em algumas
ocasies foram observadas grande elevao ou induo de uma determinada varivel, mas
115
estatisticamente no foi possvel comprovar uma diferena significante entre grupos. As

principais limitaes encontradas esto relacionadas ao pequeno nmero de animais por grupo e a
ocorrncia destas variaes de resposta individual.
Enfocando o IFN-J como a citocina-chave no estudo da resistncia contra a infeco pelo
T. gondii foram realizadas avaliaes da expresso de IFNG nos tecidos e determinaes de
produo de IFN-J por clulas. Similarmente aos camundongos e aos humanos, o gene IFNG
fortemente induzido nos sunos infectados pelo T. gondii. A elevao da expresso de mRNA foi
detectada pela Real-Time RT-PCR em praticamente todos os tecidos e possvel afirmar que esta
induo gnica foi traduzida em protena, dada pela observao de aumento de IFN-J circulante
no soro e tambm pela determinao da produo de IFN-J pelas clulas cultivadas in vitro.
A tcnica da Real-Time RT-PCR no permite quantificar o nvel de produo de IFN-J
nos diferentes tecidos, entretanto o isolamento e o cultivo in vitro de CMSP e clulas dos LN M,
LN HS e LN TB demonstra diferentes nveis de ativao das clulas pela determinao de IFN-J
no sobrenadante. Ao observar que clulas dos LN M e LN HS produziram maior quantidade de
IFN-J que as CMSP e clulas do LN TB, torna-se claro que a estimulao de clulas ocorre de
forma diferenciada e localizada, mesmo se tratando de uma infeco de distribuio sistmica.
A variao das sub-populaes de clulas dos LN M, LN HS, LN TB e CMSP indica uma
possvel participao das clulas NK no processo de resposta contra o T. gondii. Dentre as
subpopulaes analisadas, as clulas CD2 / CD16 DP foram as nicas que apresentaram variao
estatisticamente significante em todas as amostras testadas a partir do 4DPI, com tendncia de
valores mximos no 7DPI.
116
Em perodos precoces da infeco as clulas NK agiriam em conjunto com os macrfagos

na produo de IFN-J e seriam estimuladas pela presena de citocinas como a IL-12 e o TNF-D
(FILISETTI; CANDOLFI, 2004).
No presente experimento, as propores relativas de clulas CD4+, CD8+ e CD4/CD8 DP
no apresentaram variaes estatisticamente significantes no decurso da infeco, entretanto
sabe-se que controle da infeco pelo T. gondii dependente de ambas as populaes de
linfcitos T CD4+ e CD8+ (CASCIOTTI et al., 2002; GAZZINELLI et al., 1991). Em infeces
experimentais em mini-porcos induzidas com cerca de 1000 oocistos por via oral, Solano-Aguilar
et al. (2001) observaram aumento das sub-populaes de CD8+ no 10o dia ps-infeco e de CD4
/ CD8 DP no 10o e 17o DPI. Embora utilizando uma quantidade de inculo maior no presente
experimento em relao ao estudo de Solano-Aguilar, a variao nas sub-populaes foi menor,
provavelmente a anlise foi prejudicada pelo pequeno nmero de animais avaliados por grupo.
No foram detectadas variaes nas propores relativas das sub-populaes de clulas T
ativadas (CD3/CD25 DP) e de moncitos e macrfagos (SWC3/SLAII DQ DP).
Infelizmente a repetio do exame de FCM nos animais do EXP II, assim como a
marcao de IFN-J intracelular, no apresentaram bons resultados e foram omitidos na anlise
final dos dados. Entretanto os valores registrados no EXP I podero ser futuramente explorados
para o delineamento de novos estudos das populaes celulares e a produo de IFN-J.
No hemograma no foram observadas alteraes sugestivas de patologia nas contagens do
nmero total de eritrcitos e leuccitos, assim como na contagem diferencial de leuccitos
circulantes no sangue perifrico. A perda dos dados de FCM do EXP II impossibilitou a
comparao do nmero absoluto de leuccitos e a proporo de sub-populao de clulas pela
FCM.
117
Os resultados obtidos pela Real-Time RT-PCR confirmam a boa aplicabilidade desta

metodologia para este tipo de estudo. A reprodutibilidade dos resultados do EXP I no EXP II
refora a consistncia e a robustez da prova, contornando em parte a fragilidade estatstica dada
pelo baixo nmero de animais testados em cada grupo experimental.
Blader, Mangers e Boothroyd (2001) analisaram ao redor de 22 mil genes e ESTs em
microarranjos e observaram predominantemente a induo de genes associados ao metabolismo
de carboidratos, lipdios e aminocidos, controle transcripcional, sntese e degradao de
protenas, sinalizao intracelular, inflamao, ciclo celular e apoptose nas primeiras 24 horas
ps-infeco pelo T. gondii em culturas de fibroblastos.
Chaussabel et al. (2003) avaliaram a expresso 4057 genes em macrfagos e DCs
expostas a diferentes patgenos utilizando microarranjos e descrevem padres de resposta
distintos para cada agente infeccioso e expresso diferenciada de genes entre macrfagos e DCs.
Comparativamente ao microarranjo, a tcnica da Real-Time RT-PCR apresenta vantagens
por permitir a quantificao da expresso de genes de uma forma mais refinada. A desvantagem
da prova est na limitao do nmero de genes a serem testados o que obriga a uma prvia
seleo dos genes-alvo.
Ao analisar os resultados da Real-Time RT-PCR, a constncia na amplificao de genes
housekeeping um indicador da adequada extrao do RNA, sntese de cDNA e reao de PCR.
Variaes na deteco de gene housekeeping poderiam sugerir degradao da amostra ou falhas
na realizao das reaes de RT ou da PCR. Em ambos os experimentos, observou-se uma baixa
variao nos genes housekeeping. No EXP I a variao na expresso do gene RPL13A foi de
3,1 a +2,3 e do gene RPL32 foi de 2,1 a +2,1. No EXP II a variao na expresso do gene
RPL32 foi de 1,6 a +1,7.
118
Em oposio aos genes housekeeping apresentando expresso de forma constante ou com

baixa variao, genes induzidos ao longo da infeco indicam os mecanismos ativados em
resposta ao patgeno.
Na literatura freqente o uso dos genes housekeeping para a normalizao dos dados de
expresso gnica (BUSTIN, 2000; 2002; THELLIN et al., 1999). Nestes casos o clculo da
variao da expresso gnica utiliza o gene housekeeping como referncia. No presente trabalho,
entretanto, optou-se pelo uso do valor de RNA total, sem normalizao pelo housekeeping,
devido a evidncias de influncia das infeces por diferentes agentes e de diferentes estmulos
na expresso dos genes constitutivos (HAMALAINEN et al., 2001; SCHMITTGEN;
ZAKRAJSEK, 2000; TRICARICO et al., 2002).
A variao de resposta entre os tecidos foi marcante. Dos nove diferentes tipos de tecido
testados no EXP I, as amostras dos linfonodos, do fgado e dos segmentos intestinais foram as
que apresentaram a maior intensidade de resposta, enquanto que CMSP, bao e timo sofreram
poucas mudanas na expresso de mRNA.
As CMSP e os esplencitos so bastante utilizados em experimentos com camundongos e
em testes in vitro, mas revelaram baixo potencial informativo quando comparados aos demais
tecidos do presente trabalho. Teoricamente as CMSP seriam o material de escolha para o estudo
da evoluo clnica de pacientes, possibilitando a obteno de amostras seriadas do mesmo
animal ao longo da infeco. No entanto, os resultados observados do EXP I em CMSP foram
particularmente frustrantes devido a baixa variao na expresso dos genes.
O timo foi includo no EXP I para avaliar a variao da resposta em um tecido em que
hipoteticamente houvesse baixa ou ausncia de variao. A baixa magnitude de resposta
observada no timo , portanto, concordante com o esperado.
119
Dentre os tecidos que apresentaram intensa resposta infeco, o fgado destaca-se pela
intensidade de estimulao e pela quantidade de genes ativados. Esta observao evidencia a
importncia do rgo no desenvolvimento da resposta contra o T. gondii e enfatiza a necessidade
de estudos mais aprofundados sobre a funo imune deste rgo.
Embora parte desta resposta detectada no fgado possa estar associada ao infiltrado de
leuccitos atrados ao local da leso, os hepatcitos tambm so capazes de produzir quimiocinas
e protenas de fase aguda, expressam receptores para citocinas e molculas co-estimulatrias
possuindo a capacidade de modular a resposta inata e a especfica (MOCHIZUKI et al., 1997;
WICK; LEITHUSER; REIMANN, 2002).
O parnquima heptico tambm responsvel pela sntese e pela liberao das protenas
de fase aguda. Estas protenas plasmticas so produzidas em resposta a processos infecciosos,
inflamatrios, neoplsicos e agresses de ordem qumica ou mecnica, possuindo vrias funes
biolgicas que envolvem o transporte de outras protenas, a coagulao e a modulao da
imunidade, e de uma forma geral, todas participam da restaurao da homeostase ps-infeco ou
ps-injria.
As concentraes plasmticas das protenas de fase aguda so, por este motivo,
intensamente estudadas para o acompanhamento da resposta a terapias e vacinas, embora noespecficas so indicadores sensveis e precoces de inflamao e mais recentemente tm sido
propostos para programas de monitoramento na inspeo de animais para consumo humano
(HISS et al., 2003; PYORALA, 2003; SKINNER, 2001).
Alm do aumento dos nveis de haptoglobina srica nos grupos 4DPI, 7DPI e 14DPI, os
sunos infectados por T. gondii apresentaram elevao na expresso de outras protenas de fase
aguda. O gene ORM1 apresentou induo de 12 a 13 vezes respectivamente em amostras de LN
120
M e LN HS no 4DPI e o gene CRP apresentou induo de 26 e 17 vezes respectivamente em

amostras de LN HS e fgado no 4DPI e de 16 e 12 vezes no leo e fgado no 7DPI.
A estimulao da produo das protenas de fase aguda pode ser ativada pelas citocinas
IL-1, IL-6, TNF-D e TGF-E (CASTELL et al., 1988; MACKIEWICZ et al., 1990;
MACKIEWICZ et al., 1991; SZALAI et al., 2000) que tambm apresentaram-se estimuladas nos
sunos experimentais.
A funo exata de cada uma destas protenas ainda no est completamente elucidada. O
efeito imunomodulatrio tem sido descrito na interao da haptoglobina com clulas T, inibindo
a proliferao celular e a liberao de citocinas Th2, favorecendo a ativao da resposta Th1
(ARREDOUANI et al., 2003).
A induo destas protenas associada s citocinas pr-inflamatrias e ativao do
sistema complemento sugerem sua participao nos mecanismos inespecficos de defesa. A
deficincia de ORM1 em camundongos foi associada a baixa resistncia a infeces por bactrias
Gram-negativas (HOCHEPIED et al., 2000).
Os TLR so capazes de reconhecer padres antignicos especficos associados a
microrganismos e levam a ativao de sinais atravs da molcula adaptadora MYD88 (AKIRA,
2003). Dentre os 10 TLRs descritos at o momento em clulas de mamferos, o TLR2 e o TLR4
parecem estar envolvidos no reconhecimento do T. gondii. Em camundongos, a deficincia de
TLR2 aumenta a suscetibilidade infeco pelo T. gondii (MUN et al., 2003). Nos sunos do
presente experimento a expresso de ambos os TLRs testados apresentou elevao (variando de
quatro a seis vezes) no fgado e nos segmentos intestinais.
Neutrfilos estimulados por IFN-J e antgenos solveis de T. gondii (STAg) produzem
CCL2 envolvendo a participao de TLR2 (DEL RIO et al., 2004). A variao da expresso de
121
CCL2 foi somente testada em amostras de jejuno do EXP II apresentando uma discreta induo
(duas vezes) nos grupos 4DPI e 7DPI. A CCL2 possui efeito de quimiotaxia sobre moncitos,
linfcitos T, basfilos e mastcitos, alm de ao direta contra o parasita e pode
contraditoriamente estimular a produo de IL-4 (KARPUS et al., 1997).
A deficincia de MYD88 em camundongos gera alteraes fenotpicas similares
deficincia de IL12 e IFNG (SCANGA et al., 2002), revelando importante pista sobre os
mecanismos de ativao da imunidade inata. Nos animais do presente experimento houve uma
estimulao significativa (2,7 a cinco vezes) do gene MYD88 no LN HS e no fgado.
Na infeco pela via oral, os tecidos intestinais, o fgado, o LN M e o LN HS representam
a primeira barreira de defesa contra a invaso pelo T. gondii e conforme foi observado, so os
tecidos com maior intensidade de resposta inflamatria. Os sinais gerados durante esta resposta
inicial so importantes peas na gerao da resposta celular especfica e a ativao dos genes
IL1B, IL6, TNF, TLR2, TLR4, CRP, MYD88 e FCGR3A reforam a necessidade de mais
investigaes sobre a imunidade inata.
Como esperado os genes associados resposta inflamatria e relacionados ao IFNG foram
os que apresentaram maiores variaes ao longo da infeco pelo T. gondii. Entretanto, dentre os
genes indutores da resposta Th1, os genes IL12A, IL12B e IL12RB2 no apresentaram a mesma
estimulao observada em camundongos, e so concordantes aos resultados observados por
Solano-Aguilar et al. (2001) em sunos.
A IL12 deve estar de alguma maneira ligada a elevada produo de TNF-D, IFN-J e NO
em camundongos, causando leso heptica e elevada taxa de mortalidade. Camundongos IL12
deficientes infectados com T. gondii e Schistosoma mansoni apresentaram maior quantidade de
IL5 e IL10, sobreviveram por mais tempo e apresentaram menos leses no fgado quando
comparados aos camundongos normais (ARAUJO et al., 2001).
122
STATs so fatores de ativao da transcrio encontrados no citosol que quando ativados

so mobilizados para o ncleo da clula. Ao se ligar com o DNA-alvo, iniciam o processo de
transcrio. Ainda existem vrias dvidas acerca da forma de ao e da especificidade destes
fatores sobre a ativao da transcrio de citocinas, mas sabe-se que a estimulao de citocinas
como IL-12 e IFN-J est fortemente associada ativao de STAT4 e STAT1 (CAI et al., 2000;
LEONARD, 1999).
importante manter em mente que, para que estas protenas possam exercer a sua
atividade e funcionar como ativadores da transcrio, necessrio que sofram um processo de
fosforilao e se apresentem na forma de dmeros (LEONARD, 1999). O estudo da variao da
expresso gnica destas protenas deve ser portanto, feita de forma associada a outros indicadores
da atividade dos STATs.
Dentre os STATs avaliados no presente experimento, o STAT1 foi o que apresentou
maior estimulao durante a infeco pelo T. gondii. A maior induo foi observada em amostras
de fgado, variando de 3,4 a 9,9 vezes no 2DPI, atingindo valores mximos de 12,6 a 36,1 vezes
no 4DPI e diminuindo a 7,1 vezes no 7DPI. Variaes foram detectadas tambm em amostras dos
LN HS, LN M e jejuno.
A induo do IFNG e da via do STAT1 foi tambm observada por Chaussabel et al.
(2003) em macrfagos e DCS infectados por T. gondii, interessantemente a estimulao do
STAT1 no foi detectada em infeces por outros patgenos.
Camundongos deficientes do gene STAT4 produzem baixos nveis de IFN-J e morrem em
poucos dias aps a infeco pelo T. gondii (CAI et al., 2000). Nos sunos do presente
experimento, a maior induo de STAT4 foi observada em amostras de fgado (5,1 vezes) e bao
(3,9 vezes).
123
A descrio inicial dos genes SOCS foi associada atividade dos STATs. Os genes SOCS
seriam induzidos pelos STATs e teriam funo inibitria sobre a sinalizao dos STATs
(FUJIMOTO; NAKA, 2003). Observou-se elevao na expresso de SOCS1 e SOCS3 nos sunos
do EXP I, principalmente nas amostras de fgado, linfonodos e segmentos intestinais.
A induo do IFN-J nos sunos experimentais pode ser resultante da ao sinrgica entre
diferentes citocinas. Apesar de pouco intensa, a induo do IL12 est acompanhada da
estimulao do IL23A no EXP I (24 vezes no LN M; 13,3 vezes no jejuno e 8,6 vezes no fgado)
e do IL18 no EXP II (3,8 vezes no fgado e no leo). Lieberman et al. (2004) e Cai, Kastelein e
Hunter (2000) referem respectivamente IL-23 e IL-18 como citocinas importantes na
resistncia toxoplasmose aguda em camundongos. Embora possam estimular a produo de
IFN-J, a IL-23 e a IL-18 dependem da presena de IL-12.
O grau de induo de alguns genes associados aos mecanismos efetores da resposta imune
so bastante marcantes, atigindo valores superiores a 100 vezes de aumento.
O gene SLC11A1 apresentou uma elevao de 200 vezes no LN M no 4DPI e no 14 DPI;
aumento de 110 vezes no LN IC no 4DPI e de 170 vezes no jejuno no 4DPI. O gene SLC11A1
est associado a resistncia macrofgica s infeces e provavelmente estaria envolvido na
remoo de ons de ferro necessrios ao metabolismo parasitrio (STAFFORD; NEUMANN;
BELOSEVIC, 2002). A mobilizao de ons ferro do citoplasma e a alterao da acidez
intracitoplasmtica afetariam tambm a funo de fatores de transcrio. Em camundongos a
ativao do gene SLC11A1 aumenta a expresso do gene NOS2A e a produo de NO,
envolvendo tambm os genes IRF1 e STAT1 (FRITSCHE et al., 2003).
A produo da enzima INDO induzida pelo IFN-J e estaria possivelmente associada a
depleo de triptofano dos tecidos (FUJIGAKI et al., 2002). A remoo de triptofano por si s
124
no efetivo para combater a multiplicao do parasita (MACKENZIE et al., 1999), mas a

destacada induo da expresso deste gene levanta um ponto para futuras investigaes. Em
amostras de fgado dos sunos infectados pelo T. gondii registrou-se um aumento de 430 vezes
na expresso de INDO no 4DPI.
Um outro fator a ser ponderado a gerao de metablitos intermedirios com ao prapopttica durante o processo de degradao do triptofano. O acmulo destes metablitos em
estados de imune ativao persistente afetam a manuteno e a proliferao de linfcitos T
(GROHMANN; FALLARINO; PUCCETTI, 2003).
O ARG1 o gene associado enzima responsvel pela degradao da arginina.
Apresentou um pico de induo no 4DPI no EXP I e no 7DPI no EXP II. A estimulao foi de
200 vezes em amostras de LN M do EXP I e de 516 vezes no LN M e 100 vezes no leo e LN HS
do EXP II. A induo deste mecanismo refora a hiptese da inibio da replicao do parasita
atravs da depleo de nutrientes.
A induo da enzima arginase pode tambm ser interpretada como uma condio
favorecedora ao parasita, pois a enzima NO sintase utiliza a L-arginina como substrato para a
produo de NO, que possui ao txica sobre o parasita (VINCENDEAU et al., 2003).
Do ponto de vista da regenerao tecidual, ambas as enzimas (arginase e NO sintase)
exercem papis importantes. A produo de NO inibiria a multiplicao parasitria e favoreceria
a vasodilatao, enquanto que a arginase criaria condies favorveis para a proliferao de
fibroblastos e produo de colgeno (SHEARER et al., 1997).
Alm do balano NO sintase e arginase, existe tambm influncia da NO sintase sobre a
INDO. A presena de altos nveis de NO capaz de inibir a expresso de INDO (ALBERATIGIANI et al., 1997).
125
O gene NOS2A apresentou induo em amostras de jejuno (aumento de 20 vezes no 2DPI

e 176 vezes no 4DPI) e leo (9,5 vezes no 4DPI) do EXP I e em amostras do LN M (13 vezes no
7DPI), fgado (oito vezes no 7DPI), jejuno (quatro vezes no 2DPI; 9,3 vezes no 4DPI e 7,3 vezes
no 7DPI) e leo (3,5 vezes no 7DPI) do EXP II. A elevao da expresso do gene concordante
com a determinao de NO srico no EXP I (Grfico 4.1.4) que atingiu de valores mximos no
4DPI.
Ao analisar o efeito da infeco pelo T. gondii em culturas de fibroblastos utilizando
microarranjos, Blader, Manger e Boothroyd (2001) observaram induo de genes ligados
sntese e degradao de protenas, sntese de colesterol e gliclise, mostrando a interferncia da
infeco sobre outras vias metablicas alm destas testadas no presente experimento.
Alm dos genes ligados a resposta Th1, alguns genes associados a resposta Th2 tambm
apresentaram estimulao. Esta observao refora a teoria de que a resposta do tipo Th1 ou Th2
seria a resultante do predomnio de um conjunto de citocinas, isto , no a simples presena ou
a ausncia de uma dada citocina que determina a resposta. A induo da resposta Th1 seria,
portanto, observada na predominncia de sinais Th1 inibindo o desenvolvimento da resposta Th2
(JANKOVIC; LIU; GAUSE, 2001; SZABO et al., 2003).
A estimulao da expresso de genes Th2 durante o desenvolvimento da resposta imune
contra o T. gondii ocorreria por mecanismos inespecficos de ativao. O gene GATA3 foi
primariamente associado a clulas do tipo Th2, entretanto sua expresso j foi observada em
clulas T virgens no-ativadas e em clulas Th1, apresentando-se aumentada nas clulas Th2
(COUSINS; LEE; STAYNOV, 2002).
No presente experimento o GATA3 apresentou induo no 7DPI. Aumento no
significativo de 1,6 vezes no jejuno e de 2,1 vezes no leo e variao significativa de 3,6 vezes no
fgado. Nos demais grupos experimentais apresentou-se inalterado ou reprimido.
126
Apesar de estar classicamente associada a resposta Th2, alguns autores tm citado a

participao da IL-4 na induo da resposta imune agindo em conjunto com o IFNG e a IL-12.
Camundongos IL4 deficientes apresentaram menor grau de hemorragia e necrose intestinal,
refletindo em menor taxa de mortalidade aps a infeco oral por T. gondii, observou-se porm
um aumento de leso heptica, com presena de trombos de fibrina e necrose isqumica
secundria (NICKDEL et al., 2004; NICKDEL et al., 2001).
Nos sunos infectados com T. gondii houve aumento da expresso de IL4 no LN M, LN
HS, jejuno, leo e fgado. Neste ltimo, a variao de IL4 atingiu induo de sete vezes no 4DPI
no EXP I e de 12 vezes no 7DPI no EXP II.
Em camundongos a IL5 (NICKDEL et al., 2001) foi associada a uma maior resistncia
infeco oral por T. gondii. Este gene apresentou uma discreta induo no LN M nos grupos
7DPI e 14DPI e no LN HS no 7DPI e 14DPI, mas manteve-se reprimido ou inalterado nos
demais tecidos. No LN M excepcionalmente observou-se induo de 4,6 vezes.
A hiperativao dos mecanismos inflamatrios e de defesa Th1 pode, entretanto, gerar
auto-destruio de clulas do hospedeiro. Seguindo este raciocnio, fatores reguladores da
inflamao e da resposta imune cumprem um importante papel no perodo de recuperao.
A IL-10 possui efeito inibitrio sobre a produo de NO, compostos oxidativos nos
macrfagos e assim como o TGF-E inibe a produo de citocinas inflamatrias como o IFN-J, o
TNF-D e a IL-2 reduzindo os efeitos imunopatolgicos nos tecidos intestinais e cerebral
(GAZZINELLI et al., 1992; ROSENBERG; GALLIN, 1999; SUZUKI et al., 2000).
Suzuki et al. (2000) observaram severas leses necrticas nos intestinos e no fgado de
camundongos IL10-deficientes infectados por T. gondii. O bloqueio da atividade do IFN-J, da IL12 ou das clulas CD4, foi capaz de prevenir a formao das leses e aumentar a sobrevida dos
127
camundongos. Nos sunos infectados por T. gondii observou-se elevao na expresso de IL10
em amostras de fgado, jejuno e linfonodos.
Em mamferos o TGF-E encontrado em trs isoformas, E1, E2 e E3, que apresentam ao
redor de 70 a 76% de homologia entre si. A atividade biolgica in vitro praticamente idntica
entre estas trs isoformas, entretanto existem diferenas no padro de expresso durante a
embriognese e diferenas fenotpicas em camundongos geneticamente deficientes sugerindo
possveis diferenas funcionais. Acredita-se que a isoforma E1 esteja ligada a funes
imunolgicas e as isoformas E2 e E3 sejam reguladoras da diferenciao celular e embriognese
(KRAKAUER; VILCEK; OPPENHEIM, 1999).
No EXP I a expresso do TGFB1 e do TGFB3 apresentaram induo durante a infeco
pelo T. gondii. A isoforma TGFB2 apresentou induo somente nas CMSP e apresentou-se
inibida nas demais amostras de tecido. A atividade do TGF-E1 depende de uma srie de
circunstncias, variando de acordo com o local, o tipo celular e o grau de ativao das clulas
envolvidas. De um modo geral, tende a um efeito supressor a nvel sistmico e efeito inflamatrio
local em tecidos, auxiliando tambm no processo de reparao tecidual (KRAKAUER; VILCEK;
OPPENHEIM, 1999). O efeito modulatrio parece envolver a IL-6 inibindo a produo de
algumas protenas de fase aguda e de fibrinognio (MACKIEWICZ et al., 1990).
primeira vista, os dados do EXP II so concordantes ao do EXP I. Como anteriormente
mencionado h uma discreta diferena no tempo de resposta local dos tecidos detectada pela
Real-Time RT-PCR que poderia estar relacionada a diferena de idade dos animais dos EXP I e
EXP II e diferena nas condies do inculo. Entretanto ao analisar o tipo de resposta que
produzida, possvel observar padres em comum.
128
A resposta tecidual dos sunos do EXP I tende a apresentar valores mximos no 4DPI
enquanto que no EXP II, o pico de resposta parece estar no grupo 7DPI. A observao de um
nmero maior de genes apresentando variao estatisticamente significante no EXP II, pode ser
explicado pelo aumento do nmero de animais testados por grupo.
No EXP II, da mesma forma que no EXP I, h uma intensa induo da resposta
inflamatria, envolvendo os genes IL1B, IL6, TNF, TLR2 e TLR4. Alm destes, os genes CRP,
MYD88 e FCGR3A testados somente no EXP II tambm apresentaram estimulao.
Quanto aos genes ligados a resposta Th1, houve similar estimulao dos genes IFNG,
IRF1 e STAT1 e tambm de IFNGR, HLX1 e TBX21 no testados no EXP I.
O TBX21 um fator de transcrio recentemente descrito que est envolvido em eventos
precoces do desenvolvimento da resposta Th1 e na induo da produo de IFN-J por clulas Th1
e NK (SZABO et al., 2000).
A primeira citao de induo do TBX21 durante a toxoplasmose em sunos foi publicada
por Dawson et al. (2004). Neste trabalho, realizou-se a amplificao e o seqenciamento de
CD28, ICSBP1, MYD88 e TBX21 da espcie suna e a avaliao da expresso em amostras de
LN M e fgado. Foi observada a induo da expresso de TBX21, IFNG, CD28, HLX1, IRF1,
MYD88, STAT1 no fgado.
De forma similar, foram detectadas variaes significativas na expresso de TBX21 em
amostras de fgado, LN HS e leo dos animais do presente experimento.
interessante notar uma induo marcante de genes ligados aos mecanismos regulatrios
e co-estimulatrios (IL10, MHC2TA, ICOS, CD3E, CD28, CTLA4, TNFRSF5, TNFSF5, CD80
e CD86) no tecido heptico e intestinal, porm uma baixa estimulao nas amostras de linfonodo.
Os mecanismos co-estimulatrios so principalmente ativados por parasitas vivos.
Subauste e Wessendarp (2000) compararam a resposta induzida por taquizotos vivos e mortos
129
em DCs humanas e observaram que DCs infectadas por parasitas vivos apresentaram induo da
expresso de TNFRSF5, CD80 e CD86 e foram capazes de estimular uma produo maior de
IFN-J em linfcitos T do que as DCs que somente fagocitaram parasitas mortos. Esta produo
de IFN-J foi associada a estimulao de IL-12 e envolveu a sinalizao co-estimulatria do CD28
e TNFSF5.
A sinalizao gerada via interao do CD80/CD86-CD28 e do TNFRSF5-TNFSF5
tambm capaz de induzir a produo de IFN-J independente da presena do IL-12 (SUBAUSTE;
WESSENDARP, 2000).
A elevao da expresso do gene IGG foi detectada em amostras de LN M (13,9 vezes) e
LN HS (6,7 vezes) no 14DPI no EXP I e em amostras de LN M (5,4 vezes no 7DPI e 5,6 vezes
no 14DPI), LN HS (4,2 vezes no 14DPI) e fgado (6,8 vezes no 7DPI e 5,8 no 14DPI) do EXP II.
Aumento na expresso de IGM foi detectada em amostras de LN M (10,9 vezes) e fgado (8,8
vezes) do EXP II no 7DPI. Estes resultados so concordantes com os observados na prova do
MAT. Anticorpos especficos anti-T. gondii foram detectados no 14DPI no EXP I e nos 7DPI e
14DPI no EXP II e so concordantes com os resultados sorolgicos observados na literatura
(DUBEY; BEATTIE, 1988).
A expresso de gene CASP1 ligado a apoptose apresentou um aumento significante nos
linfonodos do grupo 7DPI e no fgado do 4DPI e 7DPI, indicando a ativao de mecanismos de
morte celular programada.
A necrose heptica tambm pode ser resultante da citotoxicidade envolvendo TNFRSF6
(CD95) mediada por clulas T, NK, DC e pelos prprios hepatcitos CD95L+ (WICK;
LEITHUSER; REIMANN, 2002) ou pela ao hepatotxica da IL4 (GUILLOT et al., 2001).
130
O efeito final da ao das citocinas depende do conjunto e do equilbrio das molculas

envolvidas. O TNF-D possui efeito citotxico para os hepatcitos, produzindo leses intensas
quando associado ao IFN-J Nveis elevados do TNF-Dso detectados em infeces letais em
camundongos (MATSUSHITA et al., 1999), entretanto, esta citocina participa da regenerao
heptica quando associado IL6 (WICK; LEITHUSER; REIMANN, 2002).
A tcnica da Real-Time RT-PCR permitiu avaliar a diversidade da resposta a infeco
pelo T. gondii indicando no somente quais os genes induzidos, mas tambm o grau de induo
destes genes. Alm disso, a variao da intensidade da resposta de um tecido para o outro sugere
a importncia da adequada seleo da amostragem tecidual.
Em continuidade aos resultados aqui observados, o isolamento e o estudo das populaes
de clulas presentes no fgado e nos segmentos intestinais torna-se uma necessidade para a
compreenso dos mecanismos de interao entre a imunidade inata e a especfica e os
mecanismos de diferenciao dos linfcitos T (ABO, 2001).
O enfoque a tipos celulares especficos fornecem importantes contribuies para a
compreenso da dinmica das populaes de clulas, assim como a quimiotaxia e a avaliao dos
mecanismos da resposta local e sistmica. As clulas com capacidade de reconhecimento de
patgenos so as peas-chave para a compreenso das vias de diferenciao da resposta celular.
Utilizando a tcnica dos microarranjos, Chaussabel et al. (2003) descreveram a
capacidade de DCs e macrfagos de expressar diferentes padres de resposta infeco pelo T.
gondii, Leishmania major, L. donovani, Mycobacterium tuberculosis e Brugia malayi.
Similarmente aos resultados aqui observados, detectaram forte induo de genes relacionados ao
IFNG, como o STAT1, STAT4, IRF4 e envolvimento da via dos TLRs, IL1R, MYD88 e TNF na
resposta contra o T. gondii.
131
Os mastcitos presentes no tecido conjuntivo adjacente a vasos e em mucosas so capazes

de interagir com taquizotos de T. gondii e induzir a migrao de neutrfilos, macrfagos e
linfcitos para o local da leso (FERREIRA et al., 2004). Sabe-se tambm que a depleo de
neutrfilos em camundongos diminui a resistncia infeco pelo T. gondii (BLISS et al., 2001).
O conjunto dos resultados aqui observados incentiva o estudo da interao hospedeiroparasita de uma forma holstica. O estudo da funo das citocinas leva invariavelmente a uma
intrincada rede de sinais estimulatrios e inibitrios regulatrios, justificando o investimento na
composio de painis cada vez mais complexos para a determinao de diferentes citocinas.
De forma concordante, a reviso de Burger e Dayer (2002) enfatiza a importncia do
estudo em conjunto dos mecanismos de sinergismo e de inibio para a correta interpretao dos
dados experimentais, desencorajando estudos em que so realizados a determinao dos nveis de
uma nica citocina.
Ao estudar a influncia de diferentes citocinas na produo de protenas de fase aguda em
clulas de origem heptica, Mackiewics et al. (1991) chegam concluso de que a produo das
protenas reflexo da combinao de citocinas e no o efeito de uma nica citocina.
Durante o desenvolvimento da resposta de defesa imune contra o T. gondii observou-se
induo tanto de citocinas pr-inflamatrias quanto de citocinas anti-inflamatrias sugerindo
ativao escalonada de diversos mecanismos resultando no controle da infeco. A fase de
recuperao depende de um bom equilbrio entre os mecanismos efetores de proteo e de
mecanismos de controle da resposta imune.
Comparado aos camundongos, a espcie suna apresenta caractersticas de resistncia
toxoplasmose bastante similares espcie humana, fortalecendo a importncia dos resultados
aqui obtidos.
132
Em continuidade ao estudo da genmica, a identificao de protenas ou de fatores de

transcrio envolvidos na induo e na modulao da resposta de defesa podero no futuro ser
aplicados em imunoterapias e no desenvolvimento de vacinas.
O estudo da genmica funcional em animais de produo permitir tambm a
identificao de genes candidatos para programas de melhoramento animal visando selecionar
qualidades at ento pouco estudadas como por exemplo a maior resistncia a doenas.
A seleo de marcadores genticos de resistncia a doenas deve considerar genes
associados no somente induo da resposta imune, mas tambm de genes ligados a inibio da
resposta e recuperao tecidual. Alm da melhora da qualidade do rebanho animal, estudos
comparativos contribuiro para a compreenso dos mecanismos comuns de resposta a doenas e a
identificao de pontos de convergncia entre a fisiologia humana e a dos animais.
133
6 CONCLUSES
A utilizao da tcnica da Real-Time RT-PCR permitiu a quantificar a variao da

expresso de genes em tecidos de sunos infectados pelo T. gondii revelando a ativao de
diversos mecanismos de defesa do hospedeiro.
A avaliao conjunta de 69 genes ao longo da infeco pelo T. gondii revela uma ativao
coordenada da resposta inata, induo de mecanismos inflamatrios, gerao de um padro de
resposta do tipo Th1, envolvendo mecanismos co-estimulatrios e regulatrios que levaram ao
controle da infeco.
A induo da reposta imune local ocorreu de forma e de intensidade diferentes de acordo
com a localizao e do tipo de tecido. As amostras de fgado, LN M, LN HS e segmentos
intestinais foram as que apresentaram maior intensidade de variao, enquanto que amostras de
CMSP e timo apresentaram baixa variao na expresso de genes.
De forma concordante, clulas dos LN M e LN HS apresentaram maior produo de IFN-
J que clulas do LN TB e CMSP quando cultivadas in vitro revelando um padro de resposta

localizada e diferenciada frente a uma infeco sistmica.
A adequada escolha da amostra tecidual um importante fator para a observao da
resposta local. Embora sejam alvo de inmeras publicaes, as CMSP apresentaram baixa
variao na expresso de genes.
A ativao da imunidade inata um importante passo no desenvolvimento da defesa
contra o T. gondii, produzindo molculas com ao txica anti-microbiana e gerando sinais para a
formao da resposta imune especfica.
134
Foi possvel detectar a ativao de alguns genes j no 2DPI, com aumento de intensidade
nos dias 4 e 7 ps-infeco. A diminuio da quantidade de parasitas nos tecidos sugerem xito
no controle da multiplicao parasitria ao redor do 14DPI.
Os genes IL1B, IL6, TNF, TLR2, TLR4, CRP, MYD88 ligados a mecanismos inatos e
inflamatrios apresentaram ativao durante a infeco pelo T. gondii.
A induo de genes associados resposta Th1 IFNG, IFNGR, IL12A, IL12RB2, IL18,
IL18R, IL23A, IRF1, TBX21, STAT1 revelam as possveis vias de ativao da resposta imune
especfica.
A expresso de genes associados resposta Th2 (IL4, GATA3), assim como a
estimulao de genes ligados a mecanismos regulatrios (IL10 e TGFB1) indicam uma resposta
balanceada, inibindo a exacerbao da resposta Th1.
A intensa ativao de genes da resposta inflamatria, regulatria e co-estimulatria nos
tecidos intestinais e fgado sugerem um importante papel desses rgos na defesa inata e na
gerao de sinais para o desenvolvimento da resposta tardia especfica.
Alm da produo de componentes txicos, mecanismos de depleo de nutrientes e
alterao do meio intracitoplasmtico podem estar ligados ao controle da multiplicao
parasitria. A marcante induo dos genes ARG1, INDO e SLC11A1, ligados ao metabolismo de
aminocidos e ferro evidencia a importncia destas vias efetoras.
A infeco experimental com organismos vivos revelam mltiplas vias de ativao e ao
do sistema imune. A correta interpretao dos resultados deve, portanto, considerar a intrincada
rede de interaes de sinais estimulatrios e inibitrios.
135
REFERNCIAS1
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145
APNDICE A - MEIO DE COLHEITA

500 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) sem Ca e Mg (Gibco BRL)
5 ml Gentamicina 50% (Sigma)
2,5 ml Penicilina-estreptomicina (2000UI e 2mg em 100 ml, Sigma)
5 ml N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid 1M (HEPES, Gibco)
Filtrado a 0,22Pm, pH7,4
APNDICE B - MEIO PBL

50 ml 10X HBSS sem Ca e Mg
25 ml cido etileno diamino tetracetato sdico 0,2M (EDTA)
5 ml HEPES 1M (Gibco)
420 ml gua destilada
Filtrado a 0,22Pm.
APNDICE C MEIO BLASTOGNICO

870 ml RPMI-1640
100 ml soro fetal bovino (SFB)
10 ml L-glutamina
10 ml Pen/Strep (10,000 U.I. penicilina/10,000Pg estreptomicina)
10 ml HEPES 1M
1 ml 2-Mercaptoetanol (2-ME)
Filtrado a 0,22Pm.
146
APNDICE D - MEIO COMPLETO PARA CULTIVO DE CLULAS MONONUCLEARES

1000 ml RPMI-1640
100 ml SFB
20 ml HEPES
10 ml L-Glutamina
1 ml 2-ME (55mM)
10 ml Pen/Strep
0,5 ml Gentamicina (50mg/ml)
10 ml NEAA
10 ml Piruvato
Concanavalin A (soluo estoque a 500 ug/ml em PBS)
Uso: 10Pl/ml (Usar 125 Pg/flasco = 250 ul em 12,5 ml media)
Cultivo: 3,12 x 107 clulas em 12,5 ml (volume final).
147
APNDICE E - CRITRIOS ADOTADOS PARA DESENHO DE PRIMERS E SONDAS

As seqncias de referncia (RefSeq) foram obtidas do Genbank (NCBI) e do TIGR. Na
ausncia de seqncias completas, foram utilizadas as seqncias parciais de publicao recente
contendo o maior nmero de informaes e anotaes sobre introns e exons.
As seqncias foram testadas (BLAST <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>) em
diferentes databases, em busca de variaes que pudessem representar erros de seqenciamento
ou reas de polimorfismo.
Para o desenho de primers e sondas foi utilizado o software Primer Express verso 1.5a
(PE Applied Biosystems, Foster City, EUA) que parte integrante do pacote que acompanha o
equipamento ABI Prism 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Foster City,
EUA). Maiores informaes podem ser obtidas no site <http://www.appliedbiosystems.com>
O passo inicial foi a escolha da sonda. Foram evitadas seqncias de nucleotdeos
idnticos, especialmente quatro ou mais guaninas (Gs). O contedo de citosina (C) e G foi
mantido entre 30 e 80%, com predomnio de Cs em relao s Gs. Evitando-se sempre a
finalizao da extremidade 5 com G.
Primers senso e anti-senso possuem Tm (temperatura de fuso) iguais, tamanho de 15 a 30
bases e contedo de C + G entre 30 a 80%.
Foram evitadas seqncias de nucleotdeos repetidos, especialmente Gs. Regies com
quatro ou mais Gs seguidos foram eliminados.
A soma de Cs e Gs nos ltimos cinco nucleotdeos da extremidade 3 no superior a dois.
Tamanho mximo do amplicon no ultrapassa 400 bp (sempre que possvel buscando o
tamanho ideal entre 50 e 150 bases).
Quando possvel, os primers esto sobre as junes de exons e introns.
Os primers possuem Tm de 58 a 60C e sondas com valor de Tm 10C superior aos
primers.
As seqncias de cDNA da regio de hibridizao dos primers e da sonda foram testadas
(BLAST) nas databases para ESTs e NRs. As sondas foram redesenhadas quando houve
homologia a outras seqncias que no a seqncia-alvo.
148
APNDICE F - ETAPAS DA PADRONIZAO DA REAL-TIME PCR

Referncia bsica: Bulletin #2 e Bulletin #5 (Applied Biosystems, Foster City, EUA)
Os primers e sondas foram sintetizados por Biosource (Biosource International Inc.,
Camarillo, EUA) <www.keydna.com>
Solues estoque de primers foram preparados a 90 Pm e as sondas a 25 Pm em tampo
TE (pH 8,0) e mantidos em freezer 20C protegidos da luz.
Fonte de cDNA: Foram testados cDNAs sintetizados a partir de RNA de clulas de suno
estimuladas 24 a 72 horas com ConA (Concanavalin A, lectina da Conavalia ensiformis, Sigma,
EUA) ou PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma, EUA).
Primers (senso e anti-senso) foram testados a 50, 300 e 900 nM frente a concentraes
constantes de cDNA e sondas.
Concentraes adequadas de primers foram definidas considerando os melhores valores
de Ct e 'Rn, onde Ct o nmero de ciclos necessrios para a deteco da reao e 'Rn a
intensidade da fluorescncia.
Aps a escolha da melhor concentrao de primers, testou-se diferentes concentraes de
sondas: 50, 100, 150, 200 e 250 nM.
Foi escolhida a concentrao que apresentasse boa intensidade de fluorescncia nas
reaes positivas e baixa ou ausncia de rudo nas reaes negativas, sem alterao do valor de
Ct.
Definidas as concentraes timas de primers e sondas foram realizadas diluies seriadas
de cDNA para clculo de linearidade e eficincia da reao para cada um dos genes testados.
Todas as seqncias testadas apresentaram linearidade superior a 0,950 dada pelo valor de
RQUAD (R2) e valores de inclinao entre -3,404 r 0,2 calculadas em planilha MS Excel
(Microsoft, EUA) (DAWSON et al., 2002b).
Aps o processo de otimizao, o produto da reao do Real-Time RT-PCR foi submetido
a eletroforese em gel de agarose a 4%, corado com brometo de etdio e visualizado sob luz ultravioleta (UV) para confirmar a formao de banda nica em tamanho compatvel com o esperado.
149
APNDICE G Deteco de T. gondii nos tecidos, valores de aspartato aminotransferase (AST),

xido ntrico (NO) haptoglobina (Hp) e IFN-J sricos e produo de IFN-J por
clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP), linfonodo mesentrico
(LN M), hepato-esplnico (LN HS) e traqueo-bronquial (LN TB) nos sunos do
EXP I - Beltsville - 2003
Grupo Animal T. gondii
AST
(U/L)
23
33
28,0
7,1
NO
(PM)
13,5
11,1
12,3
1,7
Hp
(mg/ml)
1,0
0,6
0,6
Soro
0
0
0,0
0,0
Interferon-J
CMSP LN M LN HS
1,01
0,95
0,75
0,2
0,29
0,14
0,6
0,6
0,4
0,6
0,5
0,4
LN TB
0,64
0,24
0,4
0,3
1C
2C
Mdia
DP
(-)
(-)
2DPI
1-2
2-2
3-2
Mdia
DP
(++)
(+)
(+)
28
29
28
28,3
0,6
37,3
22,9
20,4
26,9
9,1
0,8
1,3
0,5
0,9
0,4
424
0
452
292,0
253,3
0,56
0,47
0,49
0,5
0,0
1,02
1,02
5,54
2,5
2,6
0,28
0,31
1
0,5
0,4
0,26
0,2
0,82
0,4
0,3
4DPI
1-4
2-4
3-4
Mdia
DP
(+++)
(+++)
(++)
59
58
56
57,7
1,5
173,2
168,9
149,6
163,9
12,6
4,0
6,9
4,5
5,1
1,5
11700
12200
1472
8457,3
6054,6
2,15
10,74
4,51
5,8
4,4
9,8
11,62
16,19
12,5
3,3
1,68
1,72
0,57
1,3
0,7
0,47
0,32
0,34
0,4
0,1
7DPI
1-7
2-7
Mdia
DP
(-)
(+++)
31
173
102,0
100,4
56,9
104,3
80,6
33,5
3,5
5,3
4,4
1,3
80
1920
1000,0
1301,1
9,58
1,75
5,7
5,5
5,21
98
51,6
65,6
13,41
127
70,2
80,3
4,24
8,15
6,2
2,8
14DPI
1-14
2-14
Mdia
DP
(+)
(+)
37
23
30,0
9,9
90,3
45,9
68,1
31,4
4,9
4,6
4,8
0,2
0
0
0,0
0,0
0,83
14,35
7,6
9,6
2,59
27,31
15,0
17,5
1,19
18,52
9,9
12,3
0,96
13,11
7,0
8,6
Controle
0,1
Deteco de T. gondii : (-) ausente, (+) pouca, (++) moderada, (+++) elevada quantidade
IFN-J srico pg/ml, IFN-J no sobrenadante ng/ml

Sandra Mayumi Nishi FDFD

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SANDRA MAYUMI NISHI

Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na

SANDRA MAYUMI NISHI

Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de

Tese apresentada ao Programa de Ps-graduao

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAO-NA-PUBLICAO

Nishi, Sandra Mayumi

So Paulo, 30 de novembro de 2004

Prof. Dr. ________________________________

Prof. Dr. ________________________________

Prof. Dr. ________________________________

Prof. Dr. ________________________________

Dedico esta tese aos meus queridos familiares,

minha av Toshiko Sakajiri ( in memorian),

Pela pacincia aos meus caprichos...

Os experimentos apresentados nesta tese fazem parte de um projeto

Agradeo Solange Maria Gennari, minha orientadora no curso de

Terezinha Padilha, pelo incentivo e pela constante dedicao

Ao Samuel Shen e ao Oliver Kwok por toda ateno dispensada e pelo

Meus agradecimentos ao prof. Silvio A. Vasconcellos pela ateno e

Ao National Pork Producers (EUA) e ao USDA pela concesso da bolsa

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES)

Pr-reitoria de Ps-graduao da Universidade de So Paulo pela

metabolismo de aminocidos (arginina, triptofano) e ferro. A presena de parasitas foi

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Organograma de colheita e exame das amostras dos sunos

Visualizao grfica da amplificao pela Real-Time PCR. O

Efeito da infeco pelo T. gondii na expresso gnica no

Efeito da infeco pelo T. gondii na expresso gnica no

Efeito da infeco pelo T. gondii na expresso de genes no

Genes avaliados pela Real-Time RT-PCR nos sunos infectados

Quadro 4.1.1 - Deteco de T. gondii em tecidos de sunos nos diferentes dias

Grfico 4.1.1 - Nveis de aspartato aminotransferase (AST) srico em sunos

Grfico 4.2.3 - Nveis de haptoglobina em sunos dos grupos controle e

Mdia e desvio-padro (DP) dos valores de aspartato

Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas do

Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas do

Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas do

Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas

Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo

Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo

Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de clulas

Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de fgado dos

Tabela 4.1.10 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de bao dos

Tabela 4.1.11 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de timo dos

Tabela 4.1.12 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo

Tabela 4.1.13 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de jejuno dos

Tabela 4.1.14 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de leo dos

Tabela 4.1.15 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.

Tabela 4.1.16 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.

Tabela 4.1.17 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.

Mdia e desvio-padro (DP) dos valores de aspartato

Mdia e desvio-padro (DP) da contagem do nmero total de

Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo

Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo

Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de fgado dos

Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de leo dos

Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de jejuno dos

Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.

Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS1

Animal and Natural Resources Institute