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Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

Repblica Federativa do Brasil


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Ministro
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Chefe Adjunto de Administrao
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Chefe Adjunto de Comunicao e Negcios

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

ISSN 0103-0205
Agosto, 2006
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Centro Nacional de Pesquisa de Algodo

Documentos 147

Marcadores Moleculares como Ferramentas para


Estudos de Gentica de Plantas

Lcia Vieira Hoffmann


Paulo Augusto Vianna Barroso

Campina Grande, PB.


2006

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas


Exemplares desta publicao podem ser solicitados :
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Supervisor Editorial: Nvia Marta Soares Gomes
Reviso de Texto: Lcia Vieira Hoffmann
Tratamento das Ilustraes: Geraldo Fernandes de Sousa Filho
Capa: Flvio Trres de Moura/Maurcio Jos Rivero Wanderley
Editorao Eletrnica: Geraldo Fernandes de Sousa Filho
1 Edio
1 impresso (2006) 1.000 exemplares
Todos os direitos reservados
A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui
violao dos direitos autorais (Lei n 9.610)
EMBRAPA ALGODO (Campina Grande, PB)
Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de
Plantas, por Lcia Vieira Hoffmann e Paulo Augusto Vianna Barroso. Campina
Grande, 2006
35p. (Embrapa Algodo. Documentos, 147)
1.Plantas-Estudos-Gentica. 2. Marcadores Moleculares. I. Hoffmann, L.V.
II. Barroso , P.A.V. III. Ttulo. IV. Srie.
CDD575.1

Embrapa 2006

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

Autores
Lcia Vieira Hoffmann
D.Sc., Eng Agrn., da Embrapa Algodo, Rua Osvaldo Cruz, 1143, Centenrio, 58107-720,
Campina Grande, PB, CEP 58107-720. e-mail: hoff@cnpa.embrapa.br,

Paulo Augusto Vianna Barroso


D.Sc., Eng Agrn., da Embrapa Algodo, Rua Osvaldo Cruz, 1143, Centenrio, 58107-720,
Campina Grande, PB, CEP 58107-720. e-mail: pbarroso@cnpa.embrapa.br

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

Apresentao

Marcadores moleculares so uma importante ferramenta de biotecnologia


com ampla aplicao na agricultura. So grandes parceiros da gentica
clssica, pois se o desenvolvimento de conhecimento e suas aplicaes na
agricultura antes eram dificultados por um nmero relativamenete pequeno
de marcas genticas que podiam ser utilizadas, com os marcadores
moleculares um nmero tremendamente maior de caractersticas genticas
pode ser utilizado; entretanto, seu potencial s pode ser entendido como
ferramenta da gentica clssica, uma cincia que, mesmo que analisada
somente por suas aplicaes agrculas mais importantes, no de fcil
entendimento, pela quantidade de conceitos que envolve. Este documento
visa introduzir estudantes aos pincpios bsicos da biologia molecular mais
utilizados para obteno de marcadores moleculares, bem como ilustrar
algumas implicaes genticas de seu uso.

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

Sumrio
Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de
Gentica de Plantas .......................................................................11
1. Introduo .................................................................................11
2. Enzimas diferem quanto mobilidade eletrofortica .....................12
3. Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso .................................14
4. Microssatlites ou Seqncias Simples Repetidas .........................17
5. Marcadores diferem quanto habilidade de detectar polimorfismo.19
6. Dominncia e codominncia ........................................................20
7. Associando uma caracterstica de interesse a um marcador .........22
8. Mapas genticos : um exemplo utilizando marcadores RAPD.........24
9. Identificao de Gentipos (fingerprinting) e Estimativa da
Diversidade Gentica Utilizando Marcadores Moleculares .............27
10. Algumas populaes segregantes facilitam o mapeamento de
genes ......................................................................................29
11. Como otimizar a informao fornecida por marcadores
dominantes ..............................................................................30
Referncias Bibliogrficas ...............................................................33

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Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

Marcadores Moleculares
como Ferramentas para
Estudos de Gentica de
Plantas
Lcia Vieira Hoffmann
Paulo Augusto Vianna Barroso

1. Introduo
Em 1866, Mendel publicou trabalho cientfico onde postulou a taxa de
segregao de 3:1 de fentipos dominantes e recessivos (Primeira Lei de
Mendel) e de herana independente de diferentes caracteres (Segunda Lei
de Mendel). Estas inferncias foram feitas a partir da observao de dados
fenotpicos, entre eles cor do cotildone e textura da semente de ervilha
(WEIR, 1996).
A identificao do DNA como material gentico ocorreu na primeira
metade do sculo XX. Nos anos 70 desenvolveram-se algumas tcnicas,
uma delas a duplicao do DNA, in vitro, realizada pela DNA polimerase
extrada da bactria Thermus aquaticus que, por viver em fontes trmicas,
possui enzima que polimeriza a uma temperatura alta (72C) e mantm
atividade mesmo que submetida a 95C. Isto importante para a
automao do processo in vitro, onde a alta temperatura utilizada como
estratgia para separar as fitas de DNA, necessria para o processo de
duplicao. A duplicao do DNA in vitro conhecida por PCR, do ingls,
Polymerase Chain Reaction. Muitos procedimentos em biologia molecular
baseiam-se em PCR (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).
Esta e outras tcnicas transformaram o DNA, antes uma molcula de difcil

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acesso, em uma molcula de fcil manipulao. Marcadores moleculares


surgiram a partir destas tcnicas. Eles consistem em fragmentos discretos
de DNA obtidos por ferramentas da biotecnologia moderna que,
visualizadas em gis de eletroforese, servem como ferramenta para uma
srie de estudos genticos em plantas.
O DNA de organismos eucariotos possui tanto seqncias transcritas,
regulatrias e ainda outras sem funo conhecida. Em qualquer dos casos,
sua segregao tambm obedece as Leis de Mendel.
As diversas aplicaes de marcadores moleculares residem em prover
instrumentos para os mais diversos estudos j realizados pela gentica
clssica. A principal aplicao de estudos de gentica de plantas o
melhoramento gentico, isto , a seleo artificial de plantas na busca do
aprimoramento de suas caractersticas agronmicas ou de qualidade do
produto agrcola. Os trabalhos de melhoramento gentico vm
acrescentando grandes ganhos no rendimento agrcola. Por proverem um
nmero quase que ilimitado de possveis alelos, marcadores moleculares
ampliam em muito a possibilidade de investigao genmica nas diversas
espcies.
As tecnologias para obteno de marcadores moleculares sero abordadas
brevemente, tendo sido j descritas em maior detalhe em uma diversidade
de publicaes (NBREGA et al., 1999; FERREIRA e GRATTAPAGLIA,
1998; SOUZA, 2001). Aqui sero enfatizados aspectos genticos dos
marcadores mais utilizados em gentica de plantas.Os procedimentos
bsicos para obteno de marcadores sero abordados apenas para alguns
marcadores largamente utilizados em gentica de plantas, por serem
suficientes para discutir os tpicos aqui abordados quanto a caractersticas
de interesse agronmico como nmero de alelos por loco, dominncia ou
codominncia e polimorfismo.

2. Enzimas diferem quanto mobilidade eletrofortica


Entre os marcadores moleculares podem estar as isoenzimas, que no so

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DNA, mas sim protenas visualizadas em gel. Por isso alguns autores as
chamam de marcadores bioqumicos.
As enzimas so sintetizadas, como todas as protenas, a partir de um RNA
mensageiro, por sua vez transcrito a partir de uma seqncia de DNA, um
gene. Estes genes podem ter diferenas entre si, codificando enzimas que,
embora tenham as mesmas funes metablicas, diferem entre si em
algumas propriedades. Estas diferentes formas de uma enzima so
chamadas isoenzimas. Alm de, em um nico loco, poderem existir
diferentes alelos de um mesmo gene, codificando diferentes isoformas de
uma enzima, freqentemente em nico organismo existem vrios genes, em
vrios locos, que codificam a mesma enzima.
Enzimas, como outras protenas, tm carga eltrica. Quando em soluo,
podem ligar-se a ons e nions livres, modificando sua carga, por isso so
chamadas de substncias anfteras. Ento, se colocadas em um campo
eltrico, migram conforme seu peso molecular e sua carga eltrica lquida.
Como isoenzimas podem diferir quanto a estas caractersticas, a
eletroforese vem sendo a maneira usual de identificar suas diferentes
isoformas. Assim, protenas totais de um organismo so colocadas em um
gel com porosidade suficiente para que se movimentem e, ento, so
submetidas a um campo eltrico.
Ento, para verificar a presena de isoformas de uma enzima especfica,
aps o perodo de algumas horas de migrao no gel, utilizam-se substratos
especficos para a enzima, que forneam produtos coloridos. A presena de
cor utilizada como indicadora da presena da enzima.
Quando as isoformas observadas so produzidas a partir de genes de um
mesmo loco podem ser chamadas aloenzimas. Pode-se deduzir se duas ou
mais bandas so produzidas a partir de um ou mais locos a partir da
observao de gis de uma populao segregante. Se a segregao ocorre
de maneira independente, como postulado na Segunda Lei de Mendel,
infere-se serem produtos de genes de diferentes locos, no ligados. Haver
maior certeza do nmero de locos se esta populao for obtida a partir do
cruzamento de pais contrastantes, se o perfil eletrofortico dos pais for
tambm observado.

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Uma complicao na anlise de isoenzimas a possibilidade serem


compostas por duas ou mais subunidades, sendo estas codificadas por
alelos de um mesmo loco ou por genes de locos distintos. As enzimas
formadas por duas, trs ou quatro subunidades so chamadas,
respectivamente, dimricas, trimricas e tetramricas, e no so incomuns.
A maneira de proceder as anlises, nestes casos, foi descrita por Nbrega
et al. (1999), Alfenas et al. (1991) e Alfenas (1998).

3. Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso


O polimorfismo de DNA amplificado ao acaso conhecido principalmente
atravs da sigla de seu nome em ingls, Random Amplified Polymorphic
DNA, RAPD. Esta tcnica baseia-se na duplicao do DNA, in vitro,
utilizando PCR.
Na reao de PCR para obteno de marcadores RAPD so necessrios,
como em qualquer PCR, uma pequena seqncia do DNA complementar ao
DNA que se deseja estudar, conhecida como iniciador ou primer (ver Figura
1). O primer colocado em um pequeno tubo junto com o DNA em estudo
(molde para a duplicao de DNA), a enzima DNA polimerase termoestvel,
nucleotdeos, uma soluo tampo e magnsio. Esta mistura, ou mix,
submetida a 20 a 30 ciclos de temperatura de 95C, para denaturao do
DNA, uma temperatura mais baixa para anelamento dos primers, e 72C
para atividade da DNA polimerase e extenso das fitas.
Como em qualquer PCR, para que a amplificao ocorra exponencialmente
e o fragmento amplificado seja de tamanho constante, so necessrios dois
stios de anelamento dos primers, que devem anelar em locais que tm
entre si uma distncia amplificvel e cujas extremidades 3 (a direo de
duplicao do DNA sempre 5 em direo a 3) posicionem-se
internamente ao fragmento a ser amplificado (ver Figura 1). necessrio
que o primer no possua seqncia palindrmica1, ou a amplificao dar-seia, indiferenciadamente, para a regio entre os primers e externamente a
ela.
1

Seqncia palindrmica de DNA aquela que fornece a mesma leitura quando lida no sentido da posio
3 para a posio 5 ou vice-versa.

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Fig. 1. Os primers RAPD anelam-se nas duas fitas de maneiras opostas, ou seja,
com as posies 3 posicionando-se internamente regio a ser amplificada

O que diferencia a reao de PCR para obteno de marcadores RAPD de


outras reaes PCR o tamanho do primer. No RAPD o primer de 10
bases, tamanho suficientemente pequeno para que uma seqncia aleatria
encontre, em qualquer genoma, duas seqncias complementares na
posio necessria e haja duplicao do DNA (ver Quadro 1). Isto ocorre
normalmente de duas a dez vezes por genoma, resultando em uma a dez
bandas no gel. Devido ao menor tamanho do primer, menos pontes de
hidrognio sero formadas entre primer e DNA molde. A temperatura de
anelamento deve ser menor (cerca de 35C) que em PCR utilizando primers
especficos (quando seria de 40C a 60C).
Procedimentos semelhantes, com primers inespecficos, foram
desenvolvidos simultnea e independentemente por Willians et al. (1990) e
Welsh e McClelland (1990), sendo a denominao RAPD sugerida pelo
primeiro grupo.
Tambm preciso que primers com 10 bases contenham, pelo menos,
50% de guanina e citosina. Isto se justifica pelo maior nmero de pontes
de hidrognio responsveis pela ligao G-C (3 pontes) do que pela ligao
A-T (2). Assim, um hbrido primer-DNA com menos de 50% de GC,
provavelmente, no permanece anelado com a temperatura de
polimerizao (72oC), havendo separao antes da DNA polimerase
termoestvel iniciar a polimerizao.
Os segmentos de DNA amplificados atravs da tcnica RAPD so
separados em eletroforese de acordo com seu peso molecular, que reflete o
nmero de pares de base (pb), e visualizados sob luz ultravioleta aps
colorao com brometo de etdio. Cada produto de amplificao dever ser
visualizado como uma banda, portanto, espera-se encontrar normalmente

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Quadro 1: O tamanho do primer em RAPD e o nmero de fragmentos


esperados
O tamanho do primer RAPD, 10 pb, pequeno, fazendo com que a
chance de anelamento seja relativamente alta. No caso de um primer
maior, como os usados para amplificao de uma seqncia conhecida,
de 18pb a 24 pb, a chance de encontrar uma seqncia complementar
bem menor. Por isso o primer RAPD inespecfico, e um mesmo primer
pode ser utilizado para amplificao de seqncias nos mais diferentes
genomas. Enquanto que o primer de 18 pb especfico e amplifica s
uma seqncia, geralmente, o primer RAPD amplifica 2 a 10 bandas.
A probabilidade de uma seqncia ser complementar a uma seqncia
aleatria de 10 pb de 1 / 410, pois, como so 4 as bases que
compem o DNA (A, T, C e G), a probabilidade de a primeira ser, por
exemplo, A, e de . A probabilidade de a primeira ser A e a segunda G
de (1/4) x (1/4), e a probabilidade de se encontrar 10 determinadas
bases em seqncia de 1 / 410.
Porm, para que a amplificao de marcadores RAPD ocorra de maneira
exponencial e simultaneamente, o fragmento amplificado seja de
tamanho constante, so necessrios dois stios de anelamento dos
primers, distando entre si uma distncia amplificvel, ou seja, entre 500
e 2500 pb. Ou seja, cerca de 2000 posies de distanciamento entre os
primers so aceitveis. Ento, a probabilidade de que isto ocorra
p = 2000 x 1 / 420 = 1,819 . 10-9
No genoma da principal espcie cultivada de algodo, Gossypium
hirsutum, de tamanho estimado em 2,38 x 109pb, o nmero n esperado
de fragmentos RAPD, com base na probabilidade p calculada, seria
n = 2,38 x 109 p = 1,3
No entanto, verifica-se um nmero maior de bandas. Iqbal et al. (1997)
encontraram cerca de 7 bandas por primer. Isto provavelmente ocorra
devido a amplificaes a partir de seqncias no totalmente
complementares, ou seja, a complementariedade entre nove ou oito pares
de bases seja suficiente para que ocorra anelamento e duplicao de
DNA. O nmero de bandas maior do que o esperado verdadeiro para a
maioria das espcies estudadas. O pareamento de primers no totalmente
complementares deve ser maior quanto menor o tamanho do genoma,
pois nas mais diversas estudadas, mesmo o tamanho dos genomas
sendo muito varivel, o nmero de bandas permanece praticamente
constante (Ferreira e Gattapaglia, 1998).

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de 2 a 10 bandas. O polimorfismo entre dois indivduos verificado pela


comparao do perfil eletrofortico dos produtos de amplificao obtidos
pela utilizao dos mesmos primers e condies de reao.
Como na maioria dos marcadores moleculares, as informaes fornecidas
por um nico marcador RAPD so baixas, sendo necessrio analisar
diversos primers para que se obtenha resultados teis. Os dados obtidos a
partir de um conjunto de primers podem ser ampliados com a utilizao dos
primers isoladamente e em pares. Quando usados em pares, o padro de
amplificao apresenta novos produtos, enquanto alguns formados pela
utilizao isolada dos primers no so detectados (WILLIANS et al., 1993).
Os marcadores RAPD apresentam algumas vantagens em relao a outros
marcadores: um mesmo conjunto de primers pode ser usado em qualquer
espcie; permite analisar um maior nmero de amostras por unidade de
tempo; o investimento na instalao do laboratrio e o custo por amostra
so menores; os procedimentos so simples e no incluem radioistopos;
permite a automao do processo. A principal limitao do uso de RAPDs
sua dominncia, que ficar melhor compreendida aps a leitura do item 6.

4. Microssatlites ou Seqncias Simples Repetidas


Microssatlites ou Seqncias Simples Repetidas (SSR, do ingls, Simple
Sequence Repeats) ou so partes constituintes de DNAs de eucariotos
formado de seqncias de um a cinco nucleotdeos que se repetem. Essas
seqncias repetitivas so flanqueadas por seqncias nicas. Para que os
microsatlites sejam utilizados em biotecnologia como marcadores
moleculares, primers complementares s seqncias nicas que flanqueiam
os microsatlites so utilizados em PCRs Neste caso, os primers
constituem-se de 18 a 24 nucleotdeos, em nmero suficientemente grande
para que este primer no encontre outra seqncia complementar que no
a do microsatlite.
A maior dificuldade de se utilizar SSR justamente de se obter as

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seqncias a serem utilizadas como primers. Para obt-las, necessrio


fazer bibliotecas genmicas e selecionar clones, utilizando-se como sondas
seqncias repetitivas. Uma vez selecionados estes clones so
seqenciados. Nem todos os microssatlites localizados podero ser
utilizados para rotina como marcadores moleculares. Deseja-se que o
produto de amplificao no seja maior que 200pb para que os alelos sejam
efetivamente separados, no deve haver no primer seqncias repetitivas
para evitar anelamento inespecfico e deve haver um contedo mnimo de
40% C+G (REDDY et al., 2001). Deve-se ainda observar entre os
possveis primers, utilizando-se programas computacionais, os seguintes
itens: i) presena de grampos (anelamento do primer com ele mesmo,
quando dobrado) e dmeros (anelamento de dois primer). Estas estruturas
devem estar ausentes ou, se presentes, ter baixa estabilidade. ii)
temperatura de anelamento: ser tanto maior quanto menor a
porcentagem de A+T em relao a T+G. Um destes programas pode ser
encontrado em www.generunner.com .
Em mamferos, incluindo o genoma humano, os marcadores microssatlites
so os mais utilizados, porm em plantas parecem ser menos abundantes,
pois so encontrados a cada 29 ou 80 kb, enquanto que no genoma
humano existe em mdia uma seqncia SSR a cada 6 kb. Alm disso,
enquanto que em mamferos sabe-se que as seqncias mais freqentes
so dinucleotdeos CA e TG, facilitando sua localizao, em plantas h uma
variabilidade de tipos de deteces. Assim, h menor quantidade de
primers de SSR em plantas, dificultando seu uso (CARDLE et al., 2000).
Os segmentos de DNA amplificados so separados em eletroforese em gis
de acrilamida ou agarose de alta resoluo, que fornecem melhor distino
entre fragmentos que diferem pouco entre si quanto ao peso molecular.
Quando em gis de acrilamida, a colorao do DNA para visualizao de
bandas feita com prata.
As vantagens da utilizao de microssatlites em relao a outros
marcadores moleculares so a fcil exeqibilidade, uma vez disponveis
primers para a espcie em estudo, o alto polimorfismo e a boa distribuio
no genoma.

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5. Marcadores diferem quanto habilidade de detectar


polimorfismo
Se existe diversidade gentica em uma populao, ela deve ser detectada
pelo marcador molecular. Porem, esta habilidade pode ser maior ou
menor, dependendo das bases genticas deste marcador. Existe a
tendncia de que genes sejam mais conservados do que as regies de DNA
sem funo, como seqncias repetitivas, j que dependendo da alterao
no DNA do gene, a protena ou no seria codificada ou no teria funo,
tendendo a no serem selecionadas. Com efeito, verifica-se que
marcadores microssatlites, que detectam regies no codificadoras, so
muito mais polimrficos que isoenzimas. O RAPD, que amplifica igualmente
locos de regies repetitivas como genes, tem polimorfismo estimado maior
do que o marcador baseado no Polimorfismo no Fragmento de Fragmentos
de Restrio, mais conhecido como RFLP, do ingls, Restriction Fragment
Length Polimorphism (GARCIA et al., 1995), e especialmente adequado
na anlise de indivduos com baixa divergncia gentica (WILLIANS et al.,
1993).
O contedo de informao de polimorfismo, conhecido pela sigla PIC , de se
nome em ingls, Polymorphism Information Content, pode ser estimado por

onde fi a freqncia do isimo alelo. Calculado assim, o valor de PIC


reflete tanto o nmero de alelos como a freqncia de cada alelo, e ser
maior quanto maior for o nmero de alelos e quanto mais equivalentes as
freqncias allicas. Assim, com dois alelos, o valor de PIC ser mximo
quando a freqncia de cada um deles for 0,5. Com este clculo, PIC
torna-se sinnimo de heterozigosidade (ROBINSON, 1998) e diversidade
gentica (SENIOR et al., 1998).

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Tanto na seleo assistida como no mapeamento gentico (ver adiante) a


investigao feita com base na segregao de marcadores. S se
observa segregao se houver polimorfismo. Logo, o fato de um marcador
ser altamente polimrfico considerado vantajoso.

6. Dominncia e codominncia
Por terem diferentes bases genticas os marcadores moleculares diferem
quanto ao tipo de segregao esperada em F2. Se imaginarmos uma
enzima codificada em um nico loco com dois alelos, sabemos que os
homozigotos para cada loco, como codificam uma s isoforma,
apresentaro uma s banda, enquanto que os heterozigotos apresentaro
duas bandas (contanto, claro, que as isoformas possam ser distintas
entre si na eletroforese). Portanto, marcadores isoenzimticos so
considerados codominantes. O cruzamento de dois homozigotos
contrastantes entre si, resultaria em F2 numa segregao do tipo 1:2:1,
como o esperado no caso de codominncia gnica. Isto pode ser testado
atravs de um teste qui-quadrado.
No caso de marcadores RAPD, como comentado no tem 3, uma banda
reflete a amplificao de um segmento entre dois stios de anelamento do
primer. Algumas diferenas genticas entre indivduos sero detectadas
por marcadores RAPD. Para explicar quais so elas, vamos imaginar que
temos um gentipo, chamado selvagem, que produz uma banda, e um
gentipo alterado em relao a este, chamado mutante. O gentipo
mutante poder ser diferenciado do selvagem pelo RAPD quando
contiver:
(a) Substituio de uma ou mais bases no stio de anelamento.
(b) Deleo de um fragmento contendo 1 ou 2 stios de anelamento do
primer
(c) Insero de um segmento grande de DNA entre os 2 stios de
anelamento, conduzindo a um fragmento muito grande para ser
amplificado;

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(d) Insero ou deleo de um pequeno segmento de DNA entre os stios de


anelamento do primer.
Nos casos (a), (b) e (c), existe presena de banda no gentipo selvagem,
seja ele homozigoto ou heterozigoto para a presena dos dois stios de
anelamento. Indivduos homozigotos para o alelo mutante apresentaro
ausncia de banda. Nestas situaes, em F2, ocorrer segregao do tipo
3:1 para presena/ausncia de bandas e o marcador RAPD ser dominante.
No caso (d) o gentipo mutante tambm apresentar uma banda,
resultado da amplificao de um segmento, de maior ou menor mobilidade
eletrofortica do que banda do fentipo selvagem, decorrentes,
respectivamente, da deleo e da inserso de um fragmento. Indivduos
heterozigotos apresentaro duas bandas. Nesta situao apenas, o
marcador RAPD considerado codominante.
Quase na totalidade dos casos, os marcadores RAPD so dominantes,
impossibilitando a deteco de indivduos heterozigticos. A dominncia
pode restringir a possibilidade de sua utilizao em anlises genticas onde
seja importante diferenciar homozigotos de heterozigotos. Isto ser
particularmente importante em populaes de plantas algamas, onde a
porcentagem de locos em heterozigose alta. Nos casos onde os indivduos
avaliados so todos homozigotos, a segregao dominante dos RAPD no
representa limitao, como em selees dentro de variedades compostas
por uma mistura de linhas puras ou populaes locais onde os indivduos
embora heterogneos entre si, so homozigotos. Em estudos envolvendo
diversidade ou distncia gentica em plantas autgamas, como as plantas a
serem analisadas para a identificao e determinao da diversidade so
homozigotas, a segregao dominante dos marcadores RAPD no produz
menos informaes do que os marcadores codominantes. Assim, as
caractersticas de menor custo, maior rapidez e melhor explorao da
variabilidade molecular existente, fazem a tcnica RAPD ser especialmente
recomendada.
possvel ampliar a oportunidade de marcadores RAPD comportarem-se

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Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

como dominantes pela associao com metodologias que permitam a


identificao de pequenas variaes na seqncia de bases de duas bandas
aparentemente iguais, como o tratamento com enzimas de restrio e a
utilizao de gis com gradiente de condies desnaturantes (WEISING et
al., 1995).
Microssatlites tambm so considerados codominantes, uma vez que
alelos diferentes podem ser observados como bandas distintas e,
consequentemente, a segregao observada do tipo 1:2:1. Os
marcadores microssatlites podem eventualmente comportar-se como
dominantes, no caso de a diferena entre os gentipos que segregam
residir, no no nmero de seqncias repetitivas, mas no stio de
anelamento dos primers.

7. Associando uma caracterstica de interesse a um


marcador
Uma das dificuldades encontradas no melhoramento gentico o fato do
ambiente interferir na expresso genotpica. Um exemplo onde o ambiente
interfere drasticamente o caso de resistncia a doenas. A doena pode
no ocorrer por inexistncia de inculo ou condies climticas favorveis
para seu desenvolvimento, de forma que no existe incidncia ou
severidade da doena o suficiente para que se diferenciem plantas
suscetveis de plantas resistentes. Assim, seria altamente desejvel que a
seleo pudesse ser feita para a presena do gene em si, ao invs de se
fazer seleo para o fentipo, e isto seria facilmente executvel no caso de
se ter certeza do efeito de determinado gene num fentipo buscado pelo
melhoramento. No entanto, atualmente o conhecimento genmico da
grande maioria das espcies de plantas tal que raras so as
caractersticas de interesse agronmico para as quais a seqncia gnica
conhecida. Ento, existe a alternativa de identificar marcas gnicas ligadas
ao gene de interesse, que co-segreguem com ele.
Para encontrar marcadores para uma caracterstica, necessrio observar

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uma populao segregante, tanto para a caracterstica de interesse como


para o marcador. Normalmente, essa populao obtida a partir do
cruzamento de dois gentipos contrastantes para a caracterstica. Na
populao segregante observa-se cada indivduo tanto para a caracterstica
de interesse (por exemplo, resistncia ou suscetibilidade a uma doena)
como para uma srie de marcadores moleculares. A seguir, faz-se um teste
para verificar ligao de cada marcador com o gene de interesse (Figura 2).

Fig. 2. A) A identificao de um marcador ligado a uma caracterstica agronmica


de interesse, por exemplo resistncia de plantas a doenas, feita em uma
populao que segregue tanto para a caracterstica de interesse como para o
marcador. Normalmente, a populao segregante uma populao F2 obtida
pelo cruzamento de pais contrastantes (P1 x P2). Neste exemplo, a resistncia
doena dominante sobre suscetibilidade, pois plantas F1 so resistentes e
predominam em F2. Observando cada indivduo F2 simultaneamente para uma
caracterstica de interesse e uma srie de marcadores, espera-se encontrar pelo
menos um marcador ligado. B) Marcador dominante ligado in cis ao gene de
interesse, pois quase sempre est presente quando a caracterstica agronmica de
interesse est presente. Um marcador dominante ligado in trans estaria quase
sempre ausente quando a caracterstica de interesse estivesse presente. C)
Marcador codominante ligado caracterstica de interesse: plantas resistentes
doena contm o marcador ligado in cis resistncia (no exemplo, a banda de
menor mobilidade eletrofortica, pois ela est presente no parental resistente) em
homozigose ou em heterozigose.

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Como necessrio encontrar um marcador ligado caracterstica de


interesse, desejvel que os marcadores tenham boa distribuio no
genoma. RAPD e microssatlites tm melhor distribuio no genoma que
isoenzimas, mas quaisquer destes so muito mais freqentes e dispersos do
que os marcadores morfolgicos.
Marcadores ligados ao gene de interesse podem servir para seleo indireta
de indivduos no melhoramento de plantas. Este processo chama-se seleo
assistida por marcadores.
A seleo assistida particularmente importante quando realizada para
caracteres que se expressam em estgios de desenvolvimento avanado,
como caractersticas de frutos e sementes, quando o padro de herana
recessivo ou quando h necessidade e operaes especiais para que o gene
se expresse, como para resistncia pragas e doenas. Em doenas, a
seleo assistida evita erros devido a mtodos de inoculao inadequados
ou ineficientes e possibilita selecionar plantas resistentes a patgenos no
existentes na regio onde se realiza o programa de melhoramento, ou onde
a inoculao artificial represente riscos s lavouras comerciais.

8. Mapas genticos : um exemplo utilizando


marcadores RAPD
Construir um mapa gentico envolve: i) encontrar grupos de genes e
marcadores ligados, constituindo grupos de ligao ii) medir a distncia
gentica entre estes genes e marcadores, dada pela porcentagem de
gametas recombinantes.
Um mapa gentico pode auxiliar na localizao de genes ainda no
mapeados, j que fornece a distribuio genmica dos marcadores. Isto
importante particularmente quando se deseja mapear caractersticas
controladas por vrios genes, tambm chamadas caractersticas
quantitativas. Os locos mapeados recebem o nome de locos de
caractersticas quantitativas, mais conhecidos pela sigla do nome em ingls,
QTL (Quantitative Trait Loci).

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Quando a espcie j possui um mapa gentico molecular, procura-se


determinar a posio do marcador associado ao gene de interesse, atravs
da associao a marcadores j presentes no mapa.
Um trabalho preliminar produo do mapa a escolha dos progenitores a
serem utilizados. Os progenitores devem ser o mais divergentes possvel
para possibilitar a anlise de um grande nmero de marcadores segregantes
na populao. Em muitos casos, para explorar ao mximo a divergncia, o
mapa obtido a partir de um cruzamento entre uma espcie cultivada e
uma espcie selvagem, sendo, portanto, um mapa interespecfico.
A dominncia de um marcador, impossibilitando a deteco de indivduos
heterozigticos, no uma limitao para a construo de mapas em
populaes recombinantes homozigticos, como linhagens endogmicas
recombinantes ou de duplos haplides. Tampouco limita para populaes de
retrocruzamento.
Na construo de mapas moleculares para populaes F2 ou F3,
considerando dois marcadores (locos A e B) a dominncia dos marcadores
RAPD permite a deteco de apenas 4 classes fenotpicas havendo 10
gentipos possveis (Tabela 1)
Contudo, a estimativa da distncia entre marcadores pode ser realizada
sem a necessidade de teste de prognie, caso se considere que todos os

Tabela 1. Gentipos existentes dentro das classes fenotpicas detectadas em


uma populao F2, considerando 2 genes (A e B) ligados e supondo a existncia
de equilbrio entre os alelos.

Notas: * indivduos formados por apenas 1 gameta recombinante;


** indivduos formados por 2 gametas recombinantes.

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gametas so igualmente viveis dentro da populao. Se uma combinao


gnica resultar em viabilidade diferencial dos gametas, os resultados
obtidos podem conter erros grosseiros.
Um exemplo hipottico de construo de mapas a partir de F2 dado a
seguir. Considere que a populao foi obtida do cruzamento AB/AB X ab/
ab, e que a anlise por RAPD forneceu os resultados apresentados na
Figura 3:
Verifica-se na Figura 3 a existncia de ligao entre os marcadores A e B,
evidenciada pela segregao em F2. Supondo igual viabilidade gamtica, os
gentipos que compem cada classe fenotpica so os apresentados na
Tabela 1. Pode-se observar que, com exceo da IV, as classes so
compostas por mais de um gentipo, sendo as II e III compostas
unicamente por recombinantes e a I por recombinantes e no
recombinantes.

16%

Fig. 3. Anlise do cruzamento entre AB/AB e ab/ab, sendo A e B produtos de


amplificao RAPD, e a proporo de cada fentipo RAPD verificado em F2.Os
gentipos que compem as classes fenotpicas I, II, III e IV podem ser
observados no quadro 4.

Caso se considere x a freqncia de cada gameta recombinante e (0,5-x)


a freqncia de cada gameta parental, a proporo de cada gentipo
dada na Tabela 2.
Observa-se que o gentipo ab/ab tem proporo esperada (x2-x+0,25).
Como a classe IV composta exclusivamente por indivduos ab/ab,
possvel estimar a freqncia de cada gameta recombinante (x):

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Tabela 2. Propores esperadas de cada gentipo em uma populao F2, obtida
do cruzamento entre AB/AB e ab/ab, considerando que os genes A e B esto
ligados e que se recombinam a uma freqncia igual a 2x.

x2-x+0,25=0,16
x2-x+0,09=0
x=0,10
A distancia gentica entre os locos dada em unidades de recombinao e
igual, em nmero, porcentagem de gametas recombinantes formados
em F1. Conforme ilustrado na Tabela 2, em F1 so formados dois tipos de
gametas recombinantes, em iguais propores, x Ab e x aB. Portanto, a
porcentagem de gametas recombinantes ser 2x, que igual 20%. Como,
a rigor, a correspondncia entre porcentagem de recombinantes e distncia
de recombinao no exata, pode-se utilizar ferramentas, como a curva
de Haldane (STAUB et al., 1996). Tem-se que a distncia entre os 2
marcadores de 20 unidades de recombinao.

9. Identificao de Gentipos (fingerprinting) e Estimativa


da Diversidade Gentica Utilizando Marcadores
Moleculares
As caractersticas genticas de populaes ou cultivares podem ser
mensuradas por caracteres morfolgicos. Porm, marcadores moleculares
podem ampliar em muito o poder de deteco de diferenas entre e dentro
de populaes, particularmente se forem altamente polimrficos.

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Os marcadores moleculares permitem obter um padro de polimorfismo


nico na comparao de diferentes gentipos. Atravs da identificao
molecular de gentipos possvel realizar trabalhos de caracterizao de
variedades e cultivares, realizar controle de pureza de sementes, verificar a
taxa de fecundao cruzada existente, detectar variao somaclonal em
cultura de tecidos, constatar a obteno de hbridos somticos e reduzir o
nmero de geraes de retrocruzamento necessrias para a recuperao
do progenitor recorrente.
Uma vez estabelecida a identificao molecular de um conjunto de
gentipos, possvel avaliar a diversidade gentica entre eles. Caso os
gentipos avaliados sejam escolhidos por uma razo qualquer, a diversidade
verificada representa, unicamente, a existente entre estes materiais. A
diversidade estimada pode representar a existente dentro e entre
populaes diferentes, se cada populao estiver representada por uma
amostra de indivduos.
Em programas de melhoramento pode-se querer maximizar a divergncia
gentica em uma populao. A escolha de pais divergentes muito
importante quando se deseja iniciar um programa por hibridao, pois
permite a ocorrncia de um maior nmero de recombinaes nas
populaes segregantes. Ento, marcadores moleculares so usados para
medir a distncia gentica entre os pais, optando-se pelos cruzamentos
onde os pais so mais distantes entre si. Em contrapartida, progenitores
menos divergentes podem facilitar a recuperao do progenitor recorrente
em programas de retrocruzamento (ABDELNOOR, 1994).
Estimativas da diversidade podem ser obtidas por mtodos que verifiquem a
similaridade ou a distncia existente. Diversos coeficientes podem ser
empregados, entre os quais se destacam: Jaccard, Coincidncia Simples
(simple matching), cuja metodologia de clculo foi bem descrita por Fungaro
& Vieira (1998) e a distncia mdia euclidiana e a distncia generalizada
Mahalanobis (CRUZ e REGAZZI, 1997). Os resultados so agrupados em
uma matriz, utilizada na construo de dendogramas atravs de tcnicas de
agrupamento (CRUZ e REGAZZI, 1997), como o mtodo das mdias das

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distncias ou UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical


Averages) (FUNGARO e VIEIRA,1998). Os resultados obtidos pelos
diferentes coeficientes podem diferir entre si.

10. Algumas populaes segregantes facilitam o


mapeamento de genes
Para a obteno de marcadores associados a genes necessrio analisar
gentipos contrastantes. As populaes segregantes mais freqentemente
utilizadas so as linhagens quase isognicas, em ingls Near isogenic lines
(NIL), e plantas F2 em um procedimento conhecido como Bulked Segregant
Analysis (BSA).
As linhagens quase isognicas so linhagens que apresentam a mesma
constituio gentica, diferindo apenas em um carter. Elas so obtidas
atravs da hibridao entre duas linhagens contrastantes, seguida de
diversos ciclos de retrocruzamento, fazendo-se seleo para o carter que
se deseja estudar.
Um procedimento alternativo para a obteno de NILs foi desenvolvido por
Haley et al. (1994b), que ao invs de retrocruzamentos, utiliza um processo
que vincula o desenvolvimento de NILs aos mtodos convencionais de
desenvolvimento de cultivares e linhagens em plantas autgamas. Neste
procedimento, os processos de melhoramento so conduzidos normalmente
atravs de pedigree, pedigree modificado, bulk ou combinaes destes
mtodos. Atravs de NILs obtidas por este procedimento, os autores
encontraram um marcador RAPD intimamente ligado (2,23 1,33cM) ao
gene Ur-3, um gene maior que confere resistncia a algumas raas de
Uromyces appendiculatus, agente causal da ferrugem do feijoeiro.
BSA foi desenvolvido por Michelmore et al. (1991). Consiste em dividir uma
populao F2 em duas subpopulaes de acordo com a expresso da
caracterstica de interesse. De cada subpopulao retirada uma amostra
de 10 a 15 indivduos homozigotos, determinados atravs do teste de
prognie. Para cada amostra, o DNA das plantas extrado e misturado,

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formando um pool. Os dois pools obtidos, um de cada amostra, so


submetidos amplificao. Como as regies do genoma no associadas
caracterstica devem estar igualmente representadas nos pools, espera-se
que o polimorfismo observado entre os pools esteja ligado caracterstica
em estudo.
Uma variao do BSA foi desenvolvida por Choi e Skorupska (1995) que,
ao invs de utilizar uma populao F2 para formar pools contrastantes,
utiliza uma mistura de diferentes cultivares com resposta comum a
determinado carter para compor cada pool. Empregando esta estratgia
eles conseguiram observar polimorfismo RAPD entre pools de soja
contrastantes para resistncia ao nematide do cisto. Porm, os autores
no verificaram se os produtos de amplificao polimrficos estavam
ligados resistncia.
A escolha do tipo de material vegetal a ser empregado nos estudos, se
NILs derivados de retrocruzamento, NILs derivadas de um processo de
seleo, BSA ou combinaes destes processos, depende das condies e
facilidades locais.

11. Como otimizar a informao fornecida por marcadores


dominantes
A dominncia dos marcadores RAPD pode ser contornada pela utilizao
de dois marcadores em fases de ligao diferente, um in cis, isto ,
localizado no mesmo cromossomo que contem o gene de interesse, e outro
in trans, isto , localizado no cromossomo homlogo, que no contem o
gene de interesse (WILLIANS et al., 1990, (Figura 4). Os homozigotos para
o gene de interesse possuem apenas a banda do marcador in cis, e os
indivduos heterozigotos possuem as 2 bandas, uma correspondente ao
marcador in cis e uma correspondente ao marcador in trans. A eficcia
com que heterozigotos podem ser identificados depende da distncia entre
o par de marcadores, sendo tanto maior quanto menor for a distncia.
Para realizar seleo assistida em populaes de retrocruzamento, que so

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Fig. 4. Identificao de heterozigotos utilizando dois marcadores RAPD, um in


cis outro in trans.

sempre heterozigotas para os genes de interesse, marcadores ligados in cis


podem servir para selecionar os gentipos heterozigticos, que so aqueles
que contm o gene de interesse. Marcadores dominantes in trans no tm
o poder de identificar gentipos que contm o gene de interesse em
populaes de retrocruzamento, pois amplificariam bandas tanto nos
heterozigotos como nos homozigotos (Tabela 3).
Em populaes F2, marcadores in trans so os mais informativos. Como
pode ser observado na Tabela 4, os marcadores ligados a genes dominantes

Tabela 3. Em populaes de retrocruzamento marcadores ligados in cis


selecionam os gentipos heterozigticos. Os marcadores in trans no podem ser
utilizados em seleo assistida, pois o produto de amplificao estaria presente
nos dois gentipos formados.

+ plantas selecionadas

- plantas descartadas

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Tabela 4. Discriminao entre gentipos de uma populao F2 atravs de seleo
assistida por marcadores RAPD ligados a um gene de resistncia doena,
segundo a forma de ligao. No caso de o gene de interesse ser dominante, os
marcadores in trans selecionam apenas indivduos homozigotos para a
caracterstica, enquanto a seleo atravs de marcadores in cis resulta na seleo
de indivduos homo e heterozigotos.

+ plantas selecionadas

- plantas descartadas

in trans selecionam apenas indivduos homozigotos para a caracterstica,


enquanto a seleo atravs de marcadores in cis resulta na seleo de
indivduos homo e heterozigotos, sendo portanto menos eficiente. Como se
pode observar na Figura 5, marcadores in trans localizados a 20cM do
gene permite mais de 50% dos indivduos selecionados sejam
homozigticos para a caracterstica de interesse. J marcadores

Fig. 5. Composio terica da porcentagem de indivduos de uma populao F2


selecionados atravs de um marcador RAPD. A marcadores in trans localizados a
20cM do gene permite mais de 50% dos indivduos selecionados sejam
homozigticos para a caracterstica de interesse. J marcadores associados in cis
com ligao absoluta selecionam apenas 33% de homozigticos (Haley et al.,
1994a).

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associados in cis com ligao absoluta selecionam apenas 33% de


homozigticos (HALEY et al., 1994a).
Conclui-se que a informao obtida de marcadores dominantes depende da
forma de ligao do marcador caracterstica e do tipo de populao a ser
averiguada.

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