Qualificação Final

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS UFMG
INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS ICEX

DEPARTAMENTO DE QUMICA
Aplicao de estatstica multivariada no

desenvolvimento e validao de mtodos para a
determinao de parmetros de qualidade em
produtos derivados de leite utilizando espectroscopia
no infravermelho prximo
Exame de qualificao
Admisso no programa: 2/2010
Aluno: Bruno Gonalves Botelho

Orientador: Marcelo Martins de Sena
Belo Horizonte, 2012
Sumrio
1. INTRODUO ............................................................................................... 1
1.1 MOTIVAES DO TRABALHO
1.2 OBJETIVOS GERAIS E ESPECFICOS
2. REVISO BIBLIOGRFICA .......................................................................... 3

2.1 INTERAO LUZ/MATRIA
2.2 ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL
2.2.1 OSCILAO HARMNICA E ANARMNICA ......................................................... 4

2.3 ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO PRXIMO (NIR)
2.4 QUIMIOMETRIA
2.4.1 CALIBRAO MULTIVARIADA .......................................................................... 7

2.4.2 MNIMOS QUADRADOS PARCIAIS (PLS)........................................................... 8
2.4.3 QUIMIOMETRIA APLICADA ANLISE DE ALIMENTOS ......................................... 9
2.5 VALIDAO ANALTICA MULTIVARIADA
10
2.5.1 DETECO DE AMOSTRAS ANMALAS (OUTLIERS) ......................................... 10

2.5.2 SINAL ANALTICO LQUIDO (NAS) E CURVA PSEUDOUNIVARIADA ..................... 11
2.5.3 FIGURAS DE MRITO (FOM) ........................................................................ 12
2.5.4 MONITORAMENTO PS-MODELO .................................................................. 17
3. DETERMINAO DE UMIDADE E GORDURA EM QUEIJOS MUARELA
UTILIZANDO NIR E PLS ................................................................................. 18
3.1 INTRODUO
18
3.2 OBJETIVOS
20
3.3 MATERIAL E MTODOS
20
3.3.1 EQUIPAMENTOS E SOFTWARES .................................................................... 20

3.3.2 MATERIAIS, REAGENTES E AMOSTRAS .......................................................... 21
3.3.3 PROCEDIMENTOS ....................................................................................... 21
3.4 RESULTADOS E DISCUSSO
22
3.4.1 DESENVOLVIMENTO DO MODELO PLS .......................................................... 22
3.4.2 OTIMIZAO DOS MODELOS PELA DETECO DE AMOSTRAS ANMALAS .......... 25

3.4.3 VALIDAO ANALTICA ................................................................................ 26
3.4.4 CONCLUSES ............................................................................................ 36
4. DETERMINAO DE UMIDADE EM QUEIJOS MINAS ARTESANAL
UTILIZANDO NIR E PLS ................................................................................. 38
4.1 INTRODUO
38
4.2 OBJETIVOS
39
39
4.3.1 EQUIPAMENTOS E SOFTWARES ................................................................... 39

4.4 RESULTADOS E DISCUSSO
40
4.4.1 DESENVOLVIMENTO DO MODELO PLS .......................................................... 40

4.4.2 DETECO DE AMOSTRAS ANMALAS E OTIMIZAO DO MODELO ................... 42
4.4.3 VALIDAO ANALTICA ................................................................................ 42
4.4 CONCLUSO
48
5. MODELOS EM DESENVOLVIMENTO ........................................................ 49

5.1 INTRODUO
50
51
5.2.1 EQUIPAMENTOS E SOFTWARES ................................................................... 51

5.3 DESENVOLVIMENTO DO MODELO PLS
51
5.3.1 DETECO DE AMOSTRAS ANMALAS E OTIMIZAO DO MODELO ................... 53

5.4 CONCLUSES PARCIAIS
55
6. CONCLUSES GERAIS ............................................................................. 56

7. ATIVIDADES FUTURAS.............................................................................. 56
8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................. 58
9 ANEXOS ....................................................................................................... 58
ndice de Figuras
Figura 1 Representao esquemtica do comportamento harmnico e
anarmnico......................................................................................................... 5
Figura 2 Representao vetorial do NAS ...................................................... 11
Figura 3 Butirmetro de Gerber..................................................................... 19
Figura 4 Espectros das 123 amostras de queijo muarela ............................ 22
Figura 5 Coeficientes de regresso para o modelo de determinao de
gordura em queijo muarela ............................................................................. 24
Figura 6 - Coeficientes de regresso para o modelo de determinao de
umidade em queijo muarela ........................................................................... 24
Figura 7 Grfico de resduos vs. valores preditos para o modelo de
determinao de gordura amostras de calibrao () e de validao () ..... 27
Figura 8 - Grfico de resduos vs. valores preditos para o modelo de
determinao de umidade amostras de calibrao () e de validao () .... 27
Figura 9 Curva de valores de referncia vs. norma do NAS para o modelo de
determinao de gordura - amostras de calibrao () e de validao () ...... 29
Figura 10 - Curva de valores de referncia vs. norma do NAS para o modelo de
determinao de umidade - amostras de calibrao () e de validao () ..... 29
Figura 11 Erros relativos das amostras de validao para o modelo de
determinao de gordura ................................................................................. 30
Figura 12 - Erros relativos das amostras de validao para o modelo de
determinao de umidade ................................................................................ 31
Figura 13 Efeitos do teste de robustez, de acordo com um planejamento 22 32
Figura 14 - Erro amostral especfico de predio para as amostras de validao
para o modelo de determinao de gordura - valores de referncia () e valores
preditos (*) ........................................................................................................ 34
para o modelo de determinao de umidade - valores de referncia () e
valores preditos (*) ........................................................................................... 34
Figura 16 Carta de controle para estabilidade do modelo de determinao de
gordura ............................................................................................................. 35
Figura 17 - Carta de controle para estabilidade do modelo de determinao de

umidade ........................................................................................................... 36
Figura 18 Espectros das amostras de queijo minas artesanal ...................... 40
Figura 19 Espectros de queijo minas artesanal pr-tratados ........................ 41
umidade em queijo minas artesanal ................................................................. 41
determinao de umidade amostras de calibrao () e de validao () .... 44
determinao de umidade - amostras de calibrao () e de validao () ..... 45
determinao de umidade ................................................................................ 46
Figura 24 Erro amostral especfico de predio para as amostras de
validao valores de referncia () e valores preditos (*) ............................. 47
Figura 25 Carta de controle da estabilidade do modelo para determinao de
Figura 26 Espectros das amostras de doce de leite pastoso e em barra ...... 52
Figura 27 Espectros de doce de leite pr-tratados usando MSC .................. 52
ndice de tabelas
Tabela 1 - Otimizao dos modelos PLS pela deteco de amostras anmala
(modelos finais esto destacados em negrito) ................................................. 25
Tabela 2 - Figuras de mrito, estimadas para os modelos PLS de determinao
de gordura e umidade ...................................................................................... 28
Tabela 3 - Otimizao dos modelos PLS para determinao de umidade em
queijo minas artesanal pela deteco de amostras anmalas (modelo final est
destacado em negrito)...................................................................................... 42
Tabela 4 - Figuras de mrito estimadas para o modelo PLS de determinao de
Tabela 5 Otimizao do modelo PLS para determinao de umidade em doce
de leite pela deteco de outliers (modelo final est destacado em negrito) ... 53
umidade em doce de leite ................................................................................ 54
Lista de siglas e abreviaes

ANN Redes Neurais Artificiais (Artificial Neural Networks)
BF Teste de Brown-Forsythe
CLS Mnimos quadrados clssicos (Classical Least Squares)
DL Doce de leite
DLP Doce de Leite Pastoso
DPR Desvio Padro Relativo
DW Teste de Durbin-Watson
EAEP Erro amostral especfico de predio
FOM Figuras de mrito (Figures of Merit)
ICS International Chemometrics Society
IMA Instituto Mineiro de Agropecuria
LAFA Laboratrio de Anlises Fsico-qumicas
MAPA Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
MIR Infravermelho mdio (Mid Infrared)
MSC Correo de espalhamento multiplicativo (Multiplicatve Scatter
Correction)
NAS Sinal analtico lquido (Net Analyte Signal)
NIR Infravermelho prximo (Near Infrared)
NIRS Espectroscopia no Infravermelho prximo (Near Infrared Spectroscopy)
PCR Regresso por componentes principais (Principal Components
Regression)
PLS Minimos quadrados parciais (Partial Least Squares)
RJ Teste de Ryan-Joiner
RLM Regresso Linear Mltipla
RMSEC Erro quadrtico mdio de calibrao (Root Mean Square Error of
Calibration)
RMSECV - Erro quadrtico mdio de validao cruzada (Root Mean Square
Error of Cross Validation)
RMSEP - Erro quadrtico mdio de predio (Root Mean Square Error of
prediction)
RPD Relao de desempenho do desvio (Residual Prediction Deviation)
SDV Desvio padro dos erros de validao (Standart Deviation of Validation
Errors)
SEL Seletividade
SEN Sensibilidade
SVM Mquina de suporte de vetores (Support Vector Machine)
VIM Vocabulrio Internacional de Metrologia
VL Variveis latentes
DLB Doce de Leite em Barra
1. Introduo
1.1 Motivaes do trabalho
O presente projeto originou-se atravs de uma parceria firmada com IMA
(Instituto Mineiro de Agropecuria), o qual possua um equipamento de
infravermelho prximo adquirido com a inteno de se desenvolver e aplicar
algumas tcnicas quimiomtricas nas anlises de rotina do laboratrio. O IMA
um rgo estadual responsvel pela anlise de alimentos, bebidas, solos, entre
outros. No que diz respeito analise de alimentos, o IMA analisa,
semanalmente, um grande nmero de amostras, dos mais diferentes tipo,
como queijos, linguias, doces, iogurtes, mel, cachaa e leite fluido
pasteurizado.
A grande maioria das anlises fiscais exigidas pela legislao dizem
respeito composio fsico-qumica dos alimentos (umidade, gordura,
protena e cinzas). Essas determinaes so realizadas por mtodos
consagrados na Bromatologia, como dessecao em estufa, mtodo de Gerber
e mtodo de Kjeldahl. Estes mtodos tm como principalmente vantagem o seu
amplo uso, no demandarem equipamentos sofisticados, nem conhecimentos
avanados, sendo facilmente executados por pessoal pouco experiente.
Porm, estes mtodos so demorados e, em alguns casos, uma anlise pode
durar por at 6 horas ou mais, como no caso da determinao de umidade em
queijos muarela. Adicionalmente, esses mtodos normalmente envolvem a
utilizao de reagentes e solvente perigosos, como H2SO4 concentrado,
solues de NaOH em elevadas concentraes (50% p/p) e solventes
orgnicos, o que, alm de oferecer riscos aos operadores, ainda gera resduos
de difcil tratamento ao trmino das anlises.
A substituio de alguns mtodos clssicos por modelos quimiomtricos
tem como objetivo aperfeioar o processo de anlise das amostras, reduzindo
o seu tempo, alm de diminuir o seu custo e reduzir a gerao de resduos.
1.2 Objetivos gerais e especficos

O presente trabalho tem como objetivos gerais o desenvolvimento de
modelos quimiomtricos para determinao de parmetros fiscais de qualidade
em produtos de origem animal, utilizando principalmente a espectroscopia no
infravermelho prximo (NIRS) conjuntamente com o mtodo dos mnimos
quadrados parcias (PLS, do ingls Partial Least Squares), visando o seu uso
na rotina do Laboratrio de Analises Fsico-qumicas (LAFA) do IMA. Os
objetivos especficos deste trabalho so:
Desenvolver
modelos
de
calibrao
multivariada
para
determinao de parmetros fiscais em produtos de origem

animal, principalmente derivados de leite;
Validar estes modelos multivariados de acordo com a legislao

vigente, propondo maneiras de harmoniz-los com a realidade
univariada dos guias de validao;
Implementar os modelos desenvolvidos nas anlises de rotina do

IMA.
2. Reviso bibliogrfica
2.1 Interao luz/matria
A interao entre luz e matria tem despertado a curiosidade dos
homens ao longo da historia. Por volta de 130 a.C, Ptolomeu descreveu a
refrao da luz por uma gama de materiais transparentes e, em 1305, Von
Freiburg simulou a estrutura do arco-ris utilizando esferas de vidro preenchidas
com gua. Por todo o sculo XVIII, a interao luz-matria foi estudada, e
pesquisadores como Snell, Huyguens, Newton, Bradley e Priestly formularam
leis sobre a refrao e a reflexo da luz, assim como a proposio de sua
natureza dual (partcula/onda). Porm, a descoberta da radiao no
infravermelho creditada ao cientista ingls William Herschell [1], em 1800. A
teoria moderna sobre a luz, baseada na ondulao de um campo
eletromagntico, foi desenvolvida por JC Maxwell (1831 1879) [2].
Os
primeiros
experimentos
modernos
utilizando
tcnicas
espectroscpicas foram realizados por W. W. Coblentz, em 1905. Coblentz

obteve o espectro de 19 compostos entre 800 e 2800 nm, com um
espectrmetro equipado com cristal de quartzo e um detector caseiro. A partir
destes primeiros espectros, foi possvel concluir que cada substncia possui
um espectro caracterstico e que grupos qumicos idnticos presentes em
molculas diferentes exibem absores nos mesmos comprimentos de onda
[2].
O desenvolvimento de mtodos analticos utilizando a NIRS s comeou
em 1949, quando o Departamento da Agricultura dos Estados Unidos (USDA)
lanou um projeto para avaliar a qualidade de ovos. O primeiro estudo
relacionado a anlise quantitativa de um composto foi publicada em 1962, por
Hart et al.[3], descrevendo um mtodo para a determinao de umidade em
sementes utilizando espectroscopia no infravermelho prximo [2].
2.2 Espectroscopia vibracional
Os movimentos vibracionais das molculas induzem absoro na
regio do infravermelho. Essas absores tm sido utilizadas de forma
qualitativa e quantitativa para diversas anlises e para a atribuio das bandas
3
de absoro a grupos qumicos especficos. De forma geral, o movimento

vibracional de dois tomos de uma molcula diatmica pode ser considerado
como a compresso e extenso de uma mola, aonde os tomos se atraem e se
repelem [1].
2.2.1 Oscilao harmnica e anarmnica
A oscilao harmnica o modelo mais simples de vibrao, aonde
massas vibrantes m1 e m2 variam a distancia internuclear em at 10%. Nesse
caso, a lei de Hooke aplicvel, e a energia potencial, V, pode ser
representada como
=
1
2
1
2
onde k a fora da ligao, r a distncia internuclear durante a vibrao, re

a distncia internuclear de equilbrio. A curva da energia potencial de tal
oscilador parablica e simtrica de acordo com re. Este modelo leva a uma
frequncia vibracional
=
1
2
k
2
m
onde a massa reduzida m dada por

=
A partir das equaes 2 e 3 possvel verificar que a frequncia

vibracional depende da estrutura do composto analisado, e essa a base da
grande utilizao da espectroscopia no infravermelho para a elucidao de
compostos.
A interao da radiao com a molcula, entretanto, s possvel se o
vetor eltrico da radiao oscilar com a mesma frequncia que o momento de
dipolo molecular, . Ento, uma vibrao s ativada por infravermelho se o
momento de dipolo molecular for modulado pela vibrao e se /q for
diferente de zero. O requerimento de uma mudana no momento de dipolo
durante a vibrao faz do infravermelho mdio (MIR) especialmente sensvel a
grupos funcionais polares.
4
Entretanto, o modelo do oscilador harmnico no adequado a maiores

amplitudes de vibraes, devido s foras repulsivas entre os tomos vibrantes
e a possibilidade de dissociao, quando a ligao muito estendida. Diferente
da oscilao harmnica, os nveis de energia no so equidistantes, e a regra
de seleo estrita (n=1) expandida para mais de um nvel energtico. Com
isso, a curva de energia potencial representada por uma funo de Morse
assimtrica (Figura 1).
Figura 1 Representao esquemtica do comportamento harmnico e

anarmnico
Normalmente, uma molcula no linear contendo N tomos ter 3N-6
graus de liberdade vibracionais, enquanto uma molcula linear possui 3N-5. O
nmero de graus de liberdade vibracional representa o nmero de frequncias
vibracionais da molcula. Para uma determinada molcula, um modo de
vibrao normal corresponde ao movimento atmico no qual todos os tomos
se movem com a mesma frequncia, mas com amplitudes diferentes.
Adicionalmente s vibraes normais, transies correspondentes a n=2,
3... so agora permitidas e so chamadas de sobretons, que ocorrem na
regio do infravermelho prximo [1].
Alm dos sobretons, combinaes de diferentes transies vibracionais
(soma e diferena de vibraes fundamentais) tambm podem ser observadas.
Entretanto, a probabilidade dessas transies diminui significativamente com a
sua ordem, e geralmente a banda de absoro correspondente a transies de
sobretom
ou
combinao
tem
intensidade
inferior
suas
anlogas
5
fundamentais. Ao contrrio do MIR, a regio do NIR contm quase que

exclusivamente bandas de absoro que podem ser atribudas vibrao de
sobretons e combinaes. Infelizmente, a sobreposio dessas bandas de
sobretons e combinaes diminuem significativamente a especificidade do NIR,
o que uma das principais razes pelas quais esta regio foi subestimada por
espectroscopistas durante muito tempo [1].
2.3 Espectroscopia no Infravermelho prximo (NIR)

A espectroscopia no infravermelho prximo (NIR, do ingls near infrared)
um tipo de espectroscopia vibracional, a qual emprega energia do fton (hv)
no intervalo de 2,65x10-19 a 7,96x10-20 J, que corresponde faixa de
comprimento de onda de 750 a 2500 nm (nmeros de onda: 13300 a
4000 cm-1). Esta faixa de energia maior do que a necessria para promover
as molculas somente para seu estado vibracional excitado de menor energia
(atravs de uma transio vibracional fundamental) e menor que os valores
necessrios para a excitao de eltrons em molculas (com exceo de
alguns compostos de terras raras) [4].
A combinao da energia da radiao com a diferena de energia entre
dois nveis vibracionais provoca uma resposta seletiva do sistema molecular
radiao incidente. Isso significa que em um determinado comprimento de
onda, algumas frequncias sero absorvidas, outras (que no correspondem a
nenhuma das diferenas de energia possveis para essa molcula) no sero
absorvidas, enquanto algumas sero parcialmente absorvidas. Esta figura
complexa da intensidade de absoro versus comprimento de onda constitui o
espectro de absoro de uma substncia ou amostra. O principal objetivo do
uso da espectroscopia NIR sondar uma amostra, a fim de adquirir dados
qualitativos
e/ou
quantitativos
provenientes
da
interao
de
ondas
eletromagnticas no infravermelho prximo com seus componentes [4].

Os mtodos analticos resultantes do uso da regio espectroscpica NIR
propiciam anlises rpidas (um minuto ou menos, por exemplo), no
destrutivas, no invasivas, com alta penetrao do feixe de radiao de
sondagem, adequadas para uso em linha, de aplicao quase universal
6
(qualquer molcula contendo C-H, N-H, S-H ou ligaes O-H) e, na maioria dos
casos, com uma preparao mnima da amostra [4].
Desde os primrdios, o uso das informaes dos espectros do
infravermelho NIR para efeitos de anlise baseou-se na abordagem
multivariada para a calibrao. Hoje essa interdependncia ainda mais
importante, devido ao crescente poder dos microcomputadores e da qualidade
dos espectrofotmetros NIR, que permitem que milhares de dados sejam
obtidos em questo de segundos. Como a tecnologia NIR prope uma medida
direta da amostra sem pr-tratamento, ela tambm no apresenta nenhum fator
inibitrio para aquisio de dados, contribuindo para a gerao de grandes
conjuntos durante a fase de calibrao [4].
2.4 Quimiometria
De acordo com a definio da ICS (International Chemometrics Society),
a quimiometria a disciplina qumica que emprega mtodos matemticos e
estatsticos para planejar ou selecionar experimentos de forma otimizada e
para fornecer o mximo de informao qumica com a anlise dos dados
obtidos. O crescimento e desenvolvimento da quimiometria esto intimamente
relacionados
com
desenvolvimento
popularizao
dos
microprocessadores, na dcada de 1980, que resultou em equipamentos

analticos que permitiam a aquisio de uma grande quantidade de informao
sobre uma amostra em pouqussimo tempo, como, por exemplo, espectros de
UV/Visvel, de infravermelho mdio e prximo, e at dados mais complexos,
como superfcies de fluorescncia [4, 5].
De maneira geral, podemos classificar as tcnicas quimiomtricas em
trs grandes grupos: planejamentos e otimizao de experimentos, calibrao
multivariada e reconhecimento de padres, o qual envolve mtodos de anlise
exploratria e de classificao [5].
2.4.1 Calibrao multivariada
A principal atribuio da calibrao multivariada estabelecer um
modelo de regresso relacionando os sinais analticos medidos para uma
7
amostra (um espectro de NIR, por exemplo), com uma propriedade especifica.
Existem alguns mtodos consagrados na literatura, como a regresso linear
mltipla (MLR), regresso de componentes principais (PCR), quadrados
mnimos parciais (PLS), redes neurais artificiais (ANN) e mquinas de suporte
de vetores (SVM).
Dentre estes mtodos, os que mais se destacam so o PCR e o PLS,
devido principalmente sua ampla gama de aplicaes e sua facilidade de
uso. Ambos os mtodos so capazes de lidar com grande colinearidade e
rudos, assim como conseguem trabalhar com mais variveis que amostras,
superando as principais limitaes da RLM, no tratamento quantitativo de
dados espectrais [6, 7].
A nica diferena entre esses dois mtodos a forma pela qual as
componentes principais so calculadas. O PLS relaciona a informao contida
no bloco Y , das variveis independentes (concentrao do analito ou outras
propriedades), com o bloco X, das variveis dependentes (espectrais), durante
a decomposio dos dados, utilizando os dois simultaneamente. Isto leva a
uma pequena perda da ortogonalidade das componentes principais, e com
isso, elas recebem a denominao especfica de variveis latentes. O PCR
decompe X separadamente e depois correlaciona seus escores com Y [6].
2.4.2 Mnimos quadrados parciais (PLS)

Para o clculo do modelo PLS, X e Y so decompostas simultaneamente
em uma soma de h variveis latentes. X uma matriz n x p; sendo n o nmero
de amostras e p o nmero de variveis medidas (absoro em determinados
comprimentos
de
onda,
intensidade
relativa
em
determinada
razo
massa/carga ou valores de diferentes propriedades) Y pode ser um vetor (y) n

x 1, quando o modelo PLS prediz apenas uma propriedade (PLS1), ou n x k,
quando o PLS prediz k propriedades simultaneamente (PLS2). importante
ressaltar que a denominao PLS1 ou PLS2 no est relacionada com a
quantidade de propriedades preditas, e sim com a ordem do tensor dos valores
de referncia.
! = "# + $ =
+ 4
% & + $ 5
Onde T e U so as matrizes de escores das matrizes X e Y,

respectivamente, e P e Q so as matrizes de pesos (loadings) de X e Y,
respectivamente, e E e F so os resduos de X e Y, respectivamente. O
coeficiente de regresso linear b correlaciona os blocos X e Y de forma linear,
para h variveis latentes, de acordo com a equao abaixo:
% =(
Os valores de (* so agrupados na matriz diagonal B, que contm os
coeficientes de regresso entre as matrizes de escores T de X e U de Y. A
melhor relao linear possvel entre os escores desses dois blocos obtida
atravs de pequenas rotaes das variveis latentes dos blocos de X e Y. Os
valores preditos para novas amostras (Y) podem ser ento calculados de
acordo com a equao 4, com base nos escores T*.
! =
,# 7
Uma etapa crucial nesse processo a definio de h (nmero de

variveis latentes). Normalmente, utilizada a validao cruzada, um processo
de reamostragem, que define o nmero de variveis latentes com o qual o
modelo apresenta menor erro de predio.
2.4.3 Quimiometria aplicada anlise de alimentos

Uma alternativa promissora para superar as desvantagens dos mtodos
clssicos de anlise de alimentos a utilizao conjunta da espectroscopia no
infravermelho prximo (NIRS) e calibrao multivariada. Esta combinao pode
fornecer mtodos que so rpidos, no destrutivos, livres de solventes e
reagentes, com baixa ou nenhuma gerao de resduos. Alm disso, estes
mtodos utilizam um mnimo de pr-tratamento da amostra e tem suficiente
preciso e sensibilidade com menos interveno humana. A nica restrio
com relao utilizao da NIRS para anlise de alimentos diz respeito ao
limite de deteco da tcnica, que , em geral, prximo de 0,1% (p/p) [4], o que
9
torna invivel a utilizao do NIR para a determinao de microcontaminantes,

como resduos de drogas veterinrias, pesticidas, toxinas e outros compostos
em baixas concentraes.
A quimiometria aliada espectroscopia no infravermelho em anlise de
alimentos pode ser usada, por exemplo, para o controle de qualidade online,
para separar frutos defeituosos de sadios [8], na quantificao de diversos
parmetros nas mais variadas matrizes, como frutas e vegetais [9], azeite [10],
mel [11] e cervejas [12]. Alm de quantificao, a quimiometria pode ser til
para deteco de adulteraes [13-15], determinao de denominao de
origem e classificao de diversas matrizes [16-18].
2.5 Validao analtica multivariada

2.5.1 Deteco de amostras anmalas (outliers)
Amostras anmalas so amostras que so muito diferentes do resto do
conjunto de dados, e sua deteco crucial no desenvolvimento de modelos
multivariados. Estas diferenas podem ser causadas por erros de medio,
amostras provenientes de outras populaes, etc. A deteco de amostras
anmalas pode ser realizada de vrias maneiras, e este trabalho adota uma
metodologia robusta para a deteco de amostras com alta influncia
(leverage), altos resduos no bloco X, isto , nos dados espectrais, ou altos
resduos no bloco Y, ou seja, os valores de propriedade ou de teor do analito
[19, 20].
Se uma amostra tem um leverage, uma medida da influncia de cada
amostra sobre o modelo PLS, maior que um valor limite, ela deve ser
considerada uma amostra anmala. Amostras anmalas com altos resduos em
X so detectados atravs da comparao do desvio-padro total, s(e), dos
dados espectrais no-modelados com os respectivos desvios padro de cada
amostra, s(ei). Se uma amostra apresentar s(ei)>2,5s(e), ela deve ser removida
com nvel de confiana de 99%. Amostras anmalas com altos resduos em Y
podem ser detectados atravs da comparao do erro quadrtico mdio da
calibrao (RMSEC) com os erros de predio. Se uma amostra possuir um
10
erro de predio maior do que trs vezes o RMSEC, ela deve ser removida
[19, 21].
Os dois primeiros testes acima descritos foram aplicados a ambos os
conjuntos de calibrao e de validao, enquanto que o terceiro teste s foi
aplicado ao conjunto de calibrao. Amostras anmalas no conjunto de
validao tambm foram detectados pelo teste de resduos padronizados
Jacknife. Este teste estima a varincia dos resduos da regresso
independente do ponto avaliado, o que dispensa a necessidade de se calcular
vrias regresses a cada novo ponto excludo [22].
2.5.2 Sinal Analtico Lquido (NAS) e curva pseudounivariada
O NAS (do ingles Net Analyte Signal) um conceito multivariado
proposto por Lorber em 1986 [23], que pode ser definido como a parte do sinal
analtico que exclusivamente relacionada com o analito/propriedade de
interesse, e ortogonal ao espao gerado pelos interferentes (Figura 2).
Figura 2 Representao vetorial do NAS

Inicialmente, este conceito foi proposto para mtodos de calibrao
multivariados diretos, como o CLS (mnimos quadrados clssicos), mas a sua
aplicao prtica surgiu apenas alguns anos mais tarde, quando esse conceito
foi ampliado para os mtodos de calibrao inversa, tais como PLS e PCR [24]
234
/01
e melhorado [25]. O vetor de .
pode ser calculado para cada amostra i a
partir do vetor de regresso de um modelo PLS com A variveis latentes (VL),

b, de acordo com a equao 5.
234
/01
.
= 5 5 5
57 .8 8
11
A norma (ou mdulo) de cada vetor fornece um :;<

= 1 escalar para cada
amostra, que anlogo a um sinal de analito seletivo univariado [21, 26].
O NAS um conceito til na validao analtica multivariada porque

usado para calcular algumas Figuras de Mrito (FOM) tais como a
sensibilidade, seletividade e os limites de deteco e quantificao [27]. Este
conceito tambm til para traar as curvas pseudounivariadas de calibrao,
as quais so uma maneira mais simples de apresentar os resultados obtidos a
partir de modelos multivariados, harmonizando-os com o pensamento
univariado [28].
Para isso, em primeiro lugar, valores escalares de NAS so calculados
para as amostras de calibrao e, em seguida, um coeficiente de regresso
> 234 estimado atravs de uma regresso linear entre o vetor ns, o qual
5
234
/01
contm a norma do vetor .
de cada amostra, e o vetor das concentraes
do analito ou propriedades (Y).
> 234 = ?@7 ?@

5
6A
?@5 B 9
Em seguida, o modelo de regresso expresso como na equao 7,

onde e um vetor contendo os resduos.
> 234 ?@ + F 10
DE = 5
2.5.3 Figuras de mrito (FOM)

A validao analtica foi realizada a fim de harmonizar conceitos
univariados e multivariados. Neste sentido, este trabalho procurou adaptar os
requisitos das diretrizes brasileiras [29] e internacionais [30-34] para o estado
do arte de como estimar FOM em calibrao multivariada [26, 27]. Assim, as
seguintes FOM foram estimadas: veracidade, preciso, linearidade, faixa de
trabalho, seletividade, sensibilidade, sensibilidade analtica, robustez, vis
(bias) e desvio relativo da predio. Os limites de deteco e quantificao
podem ser calculados com base no NAS, mas estes no foram estimados no
presente trabalho, nem os conceitos alternativos de limite de deciso (CC) e
capacidade de deteco (CC), pois eles no so exigidos para mtodos de
determinao de analitos que esto presentes em concentraes elevadas.
12
2.5.3.1 Exatido
De acordo com o Vocabulrio Internacional de Metrologia (VIM), o
conceito de exatido utilizando normalmente foi atualizado. Ele foi substituido
pelos termos veracidade ou acurcia, que definida como o grau de
concordncia entre a mdia de um nmero infinito de valores medidos
repetidos e um valor de referncia. E a juno da veracidade com a preciso
agora chamada de exatido, a qual definida como o grau de concordncia
entre um valor medido e um valor verdadeiro de um mensurando [35].
A veracidade e a preciso podem ser estimadas de forma semelhante
para mtodos univariados e multivariados. A veracidade foi avaliada atravs
dos erros relativos de predio para cada amostra. No entanto, a veracidade de
mtodos multivariados usualmente estabelecida atravs de parmetros mais
especficos no mencionados nas orientaes tradicionais de anlise de
alimentos, tais como RMSEC (raiz do erro quadratico mdio de calibrao) e
RMSEP (raiz do erro quadratico mdio de predio). O RMSEP mais robusto
que o RMSEC, uma vez que estimado a partir de amostras de validao
externas ao conjunto de calibrao.
A preciso foi avaliada em dois nveis, repetitividade e preciso
intermediria. A repetitividade foi estimada pela anlise de trs amostras
diferentes, pelo mesmo analista, seis repeties para cada amostra. A preciso
intermediria foi estimada por trs diferentes analistas que determinaram as
mesmas trs amostras em seis replicatas, no mesmo dia.
2.5.3.2 Linearidade
Uma vez que no h curvas de calibrao para modelos multivariados, a
linearidade costuma ser estimada atravs do coeficiente de correlao (r) entre
os valores de referncia e os valores preditos. Mas um valor de r perto de 1
no considerado suficiente para assegurar a linearidade do mtodo [33].
essencial ainda que se verifique previamente se os resduos do ajuste
apresentam comportamento aleatrio.
Esta verificao frequentemente realizada por inspeo visual de um
grfico dos resduos, o que pode ser considerado bastante subjetivo. A fim de
adotar critrios mais objetivos para avaliar a linearidade, o presente trabalho
13
adaptou a metodologia utilizada por Souza & Junqueira [22] para o mtodo
univariado dos mnimos quadrados ordinrios. Assim, o comportamento
aleatrio foi verificada atravs da aplicao dos testes de Ryan-Joiner (RJ), de
Brown-Forsythe (BF) e de Durbin-Watson (DW) para os resduos do modelo, a
fim de avaliar a sua normalidade, homocedasticidade, e independncia,
respectivamente . O principal teste o de DW [36], usado para verificar a
ausncia de autocorrelao, em que o desvio padro dos dados ordenados
residuais (SD) comparado com o desvio padro das diferenas sucessivas
(SDsd) do mesmo conjunto de dados. Se os dados so aleatoriamente e
normalmente distribudos e homoscedsticos, no deve haver diferena
estatstica entre o SD e o SDsd . Um valor DW estimado, variando de 0 a 4,
com mdia 2. Se o valor calculado converge para 2, isto significa que no h
autocorrelao. Se estes valores afasta-se para 0 ou 4, a autocorrelao
aumenta de maneira positiva ou negativa, respectivamente. Os valores de 1,5 e
2,5 podem ser utilizados como os limites de aceitao superiores e inferiores.
Como
alternativa,
os
parmetros
da
curva
de
calibrao
pseudounivariada, introduzida na seo 2.5.2 podem tambm ser usados para

expressar a linearidade.
A faixa de trabalho do mtodo pode ser estabelecida atravs da
confirmao que o mtodo proporciona graus aceitveis de veracidade,
linearidade e preciso dentro dos limites estudados.
2.5.3.3 Sensibilidade e seletividade
Para os mtodos de calibrao multivariada, a seletividade (SEL)
calculada como a razo entre a norma de cada vector NAS, ||nasi||, e a norma
do espectro respectivo, ||xi||.
HIJ =
||LMNO ||
11
||.1 ||
medida que cada amostra tem uma SEL diferente, um valor mdio utilizado
para caracterizar o mtodo. J que mtodos multivariados no necessitam de
resoluo de sinal, tambm importante ressaltar que a SEL no til para
14
fins de controle de qualidade. Ela apenas quantifica quanto do sinal analitico

utilizada no modelo.
A sensibilidade (SEN) de mtodos inversos, tais como PLS e PCR,
pode ser calculada como o valor do NAS em concentrao unitria, e obtida a
partir da norma do vetor dos coeficientes de regresso:
1
12
||5||
HIP =
Uma vez que a SEN dependente da tcnica analtica empregada,

uma FOM mais til para fins de comparao com outros mtodos a
sensibilidade analtica (), que calculada como a razo entre a SEN e o rudo
instrumental (). No caso das medies de reflectncia difusa, pode ser
estimado atravs do desvio padro combinado de um certo nmero de
replicatas de espectros da cela vazia.
Q =
HIP
13
R
O inverso de (-1) fornece uma estimativa da diferena de concentrao

mnima que distinguvel pelo mtodo, considerando o rudo aleatrio
experimental como a nica fonte significativa de erro, independentemente da
tcnica utilizada.
2.5.3.4 Robustez
A robustez avalia a susceptibilidade de um mtodo analtico para
pequenas alteraes deliberadas em condies experimentais. Para as
anlises utilizando o NIR foram avaliadas os tipos de placas utilizadas na
aquisio dos espectros e a forma de processamento da amostra.
2.3.3.5 Vis (Bias)
O vis, ou bias, uma FOM que avalia a presena de erros sistemticos
no modelo, e calculado apenas para o conjunto de validao, como segue:
(S;< =
2W
1X
D1
T U
DE1
:V
14
15
onde D1
T U
e DE1 so os valores de referncia e preditos para a propriedade de
interesse, respectivamente, e :V o nmero de amostras no conjunto de
validao. O desvio padro dos erros de validao (SDV) tambm estimado e

utilizado em um teste t de Student para determinar se as estimativas de
validao apresentam um vis estatisticamente significativo. O valor t calculado
ento comparado com o valor t crtico com o nmero apropriado de graus de

liberdade, que igual a :V .
HY =
[\D1T
DE1 ] (S;<]
15
:V 1
2.5.3.6 Relao de desempenho do desvio (RPD)

Outra FOM adequada para avaliar a capacidade de predio dos
modelos de calibrao a relao de desempenho do desvio (RDP, do ingls
residual predition deviation ou relative predictive determinant) [37]. A RPD a
relao da variao natural nas amostras de calibrao ou de validao em
relao ao tamanho dos provveis erros que ocorrem durante a predio, e
mais til para a comparao de modelos em conjuntos de dados diferentes (em
diferentes faixas de valores previstos), ou em termos absolutos. Ela calculada
para a calibrao e validao, de acordo com as equaes 13 e 14, na qual
SDcal e SDval so os desvios-padro dos valores de referncia para a calibrao
e validao, respectivamente.
_`Ya3b =
HYa3b
16
_cHId
_`YV3b =
HYV3b
17
_cHI`
2.5.3.7 Erro amostral especfico de predio (EAEP)

A estimativa da incerteza em calibrao multivariada um assunto muito
recente, comeando a ser estudada apenas no final da dcada de 1980. Desde
ento, tem havido um interesse crescente em determinar a melhor maneira de
16
estimar a incerteza multivariada. Alguns autores utilizam estratgias de

reamostragem, que consistem em simular novos dados matematicamente, a
partir dos dados j obtidos, atravs da adio de resduos aleatrios (bootstrap)
ou pela adio de rudo aleatrio. Dessa forma, possvel aumentar o nmero
de amostras (normalmente n > 1000), e a partir da, o erro de predio para
cada amostra calculado. Outra abordagem para a estimao do erro de
predio a utilizao de equaes, como as desenvolvidas por Martens e De
Vries (1995) [38] e Faber e Kowalski [39].
Neste trabalho, o EAEP
efg
foi calculado com base na equao
descrita por Faber e Bro [40]. Esta estratgia permite a estimativa da incerteza
de medida para cada amostra, com base em seu leverage (h). Esta equao
no utiliza a incerteza do mtodo de referncia para o clculo da incerteza
multivariada, e justamente por isso, escolhemos esta abordagem. A incerteza
para cada amostra calculada de acordo com a equao abaixo, onde MSEC
o erro mdio de calibrao, e
a incerteza associada aos valores de
referncia do conjunto de validao. Quando este valor no est disponvel,

como o caso deste trabalho, utiliza-se o RMSECV como estimativa de
efg k[ 1 + cHId
i ]
18
i .
2.5.4 Monitoramento ps-modelo

A grande maioria dos mtodos de calibrao multivariada publicados na
literatura no se preocupa em avaliar o seu desempennho depois de pronto,
acompanhando-o por um prazo mais longo. Como muitos trabalhos so
puramente acadmicos, a vida til desses modelos no costuma a ser
avaliada. No entanto, em aplicaes reais uma das primeiras preocupaes
prticas dos responsveis pelo laboratrio de controle de qualidade a
questo: At quando o modelo vai continuar funcionando? Nesse sentido,
esse trabalo se props a fazer um monitoramento ps-modelo.
As amostras utilizadas para construir os modelos foram obtidas a partir
de 2009. Aps os mtodos baseados em NIRS terem sido estabelecidos e
validados, eles foram ento implementados em substituio aos mtodos
17
tradicionais no IMA, a partir de 2011. O desempenho dos modelos foi

monitorado por amostragem aleatria de, no mnimo, uma amostra por
semana, as quais tambm foram determinados pelos mtodos de referncia. A
veracidade destas determinaes foi avaliada de acordo com as normas
brasileiras [29].
3. Determinao de umidade e gordura em queijos muarela

utilizando NIR e PLS
3.1 Introduo
Muarela um queijo feito de leite de vaca pasteurizado e parcialmente
desnatado, amplamente encontrada em todo o mundo, e originrio da regio de
Campania, no sul da Itlia. Tambm chamado Pizza Cheese, ela o queijo
mais consumido nos EUA, Brasil e outros pases, principalmente devido ao seu
uso em pizzas, sanduches e lanches [41].
No Brasil, o Estado de Minas Gerais o maior produtor de queijo, com
cerca de metade da produo (215 mil toneladas por ano, em 2001). Desse
total, 24% corresponde a muarela. A produo de muarela no Brasil
regulada
pelas
diretrizes
do
Ministrio
da
Agricultura,
Pecuria
Abastecimento (MAPA), que estabelece limites para a gordura (mnimo de 35%

p/p, em base seca) e umidade (mximo de 60% p/p) [42].
De acordo com esta legislao, a determinao de gordura deve ser
realizada por hidrlise cida (mtodo de Gerber). Este mtodo baseia-se na
utilizao de um butirmetro (Figura 3), e possui vrias desvantagens. A
determinao no pode ser automatizada e envolve um certo risco na
manipulao de cido sulfrico concentrado. Alm disso, a manipulao da
butirmetro requer prtica, o que tem efeito negativo sobre a robustez e a
preciso do mtodo [43].
18
Figura 3 Butirmetro de Gerber

A determinao de umidade realizada pelo mtodo gravimtrico de
dessecao em estufa.. Embora este mtodo seja simples, a sua principal
desvantagem a lentido, uma vez que cada anlise demora entre 3 e 6 horas
[44].
Em
geral,
os
mtodos
analticos
para
determinao
de
macroconstituintes,, tais como gordura e de umidade, so lentos, relativamente

caros, e exigem pessoal altamente qualificado. Estes mtodos
mtodos clssicos no
so eficazes o suficiente para cobrir a crescente demanda e os baixos custos
necessrios no controle de qualidade de alimentos em indstrias ou na
inspeo de qualidade pelos rgos pblicos [45].
O primeiro trabalho a sugerir um mtodo NIRS para a quantificao em
produtos lcteos foi publicado por Ben Gera & Norris, em 1968 [46], os quais
estimaram
aram o contedo de gordura no leite por meio de regresso linear mltipla
(RLM). Mas, em geral, a utilizao mais ampla de mtodos de NIRS s surgiu
no final dos anos oitenta, quando modelos de calibrao multivariada mais
estveiss e robustos, como o PLS e o PCR, substituram a RLM na maioria das
aplicaes prticas. Em 1994, Pierce & Wehling [47] publicaram o primeiro
trabalho desenvolvendo um mtodo usando NIRS e PLS para determinar a
umidade e gordura em queijo cheddar. Desde ento, vrios artigos foram
publicados usando NIRS e calibrao multivariada
multivariada para predio de
parmetros de qualidade, tais como gordura, protena, umidade e outros, em
diferentes tipos de queijos (fresco, Danbo, Emmental e Cheddar) e derivados
19
[48-54]. Especificamente, nenhum artigo foi publicado desenvolvendo mtodos

baseados em NIRS para a determinao de parmetros em queijos muarela.
Muitos modelos de calibrao multivariada baseados na NIRS no so
confiveis, robustos e estveis suficientemente para serem usados na prtica
em anlises de rotina. Da, a necessidade de desenvolver modelos mais
robustos, para os quais a estratgia de incorporar amostras com uma grande
diversidade de origem fundamental [55]. A maioria dos artigos citados acima
no incorporou varincia suficiente em seus modelos, necessria para um uso
mais amplo e robusto na rotina do controle de qualidade fiscal. Nesses
trabalhos, os modelos foram desenvolvidos a partir de amostras de queijo
obtidas de um pequeno nmero de produtores (s vezes, de um nico
produtor). Absolutamente nenhum dos modelos desenvolvidos nesses
trabalhos foram aplicados em situaes reais de anlises de rotina ou tiveram
sua robustez avaliada nesse contexto. Alm disso, a validao analtica
multivariada no foi realizada em nenhum dos artigos previamente citados.Esta
deficincia encontrada no somente em trabalhos relacionados a rea de
bromatologia, mas a grande maioria dos artigos envolvendo calibrao
multivariada. Talvez a falta dessas avaliaes mais rigorosas seja um dos
fatores que contribui para a no utilizao destas tcnicas em situaes de
rotina, e tambm para falta de reconhecimento dos orgos oficiais, que, salvo
raras excees, negligenciam por completo a calibrao multivariada.
3.2 Objetivos
Desenvolver modelos PLS robustos para a determinao de gordura e
umidade em queijos muarela utilizando NIR e PLS, e valid-los de acordo com
a legislao vigente, tentando harmonizar o guia do MAPA com a realidade
multivariada.
3.3 Material e mtodos
3.3.1 Equipamentos e softwares
Os espectros foram obtidos em um espectrofotmetro Perkin Elmer FTIR
400 (Waltham, EUA), equipado com um acessrio de reflectncia difusa. Os
20
dados foram tratados usando o software MATLAB, verso 7.13 (MathWorks,

Natick, EUA) juntamente com o pacote PLS Toolbox verso 6.5 (Eigenvector
Technologies, Manson, USA). Para a deteco de amostras anmalas
utilizou-se uma rotina desenvolvida por Jez W. B. Braga (IQ-UnB).
3.3.2 Materiais, reagentes e amostras
Todos os reagentes e materiais (cido sulfrico, lcool isoamlico e areia
purificada) foram de grau analtico, adquiridos de fornecedores certificados e
utilizados sem purificao adicional. 123 amostras de queijo muarela,
fabricados por diferentes processos e originrios de mais de 100 diferentes
produtores de todo o Estado de Minas Gerais foram coletadas e analisadas
entre 2009 e 2010. As amostras de queijo foram transportados sob refrigerao
a 4 C e analisadas imediatamente aps a sua abertu ra no laboratrio. Antes
da abertura, as amostras eram deixadas em repouso para atingir o equilbrio
trmico por um perodo de 30 minutos. As fatias da amostra foram retiradas da
parte interna do queijo, evitando a parte externa, que est sujeita a
ressecamento e degradao.
3.3.3 Procedimentos
As amostras de queijo foram cortadas, trituradas com um misturador
industrial, e transferidas para uma placa Perkin Elmer, em quantidade
suficiente para cobrir seu fundo. Os espectros foram coletados como uma
mdia de 32 varreduras, de 1000 a 2500 nm, passo 2 nm, com resoluo de
8 cm-1. Dez espectros idnticos da placa vazia foram tambm registadas nas
mesmas condies, a fim de estimar o rudo instrumental. Durante todas estas
medies, a temperatura da sala foi controlada a 22 1 C.
As anlises por mtodos de referncia foram realizados de acordo com a
literatura [56], sem repeties. A determinao de gordura foi realizada com o
mtodo de Gerber. Um grama de uma amostra de queijo foi pesada com
preciso no butirmetro, no qual 10 ml de uma soluo de cido sulfrico
(d=1,605 g.cm-1) e 1 mL de lcool isoamlico foram adicionados, ento, a
vidraria foi fechada, agitada e aquecida durante 15 minutos num banho de
gua a 65 C; a agitao e o aquecimento foram repe tidos at dissoluo total
da amostra e, finalmente, a coluna de gordura foi ajustada para o ponto zero e
21
o contedo absoluto de gordura foi lido a partir da extremidade inferior do

menisco .
A determinao da umidade foi realizada por mtodo gravimtrico
(dessecao em estufa). Trs gramas de uma amostra de queijo foram
pesados numa placa e misturados com a mesma quantidade de areia fina
pr-seca. A adio de areia auxilia na secagem mais rpida e eficiente da
amostra, evitando a formao de crostas que dificultam a evaporao da gua.
Esta mistura foi homogeneizada e seca em estufa a 105 C, at peso
constante (variao menor que 0,001g), o que costuma durar de trs a seis
horas.
3.4 Resultados e discusso
3.4.1 Desenvolvimento do modelo PLS
Os espectros de infravermelho prximo das 123 amostras de queijos
muarela analisadas so mostrados na Figura 4. Ao observar estes espectros,
possvel atribuir as bandas mais intensas e largas centradas em 1454 e 1936
nm a vibraes das molculas de gua, que correspondem ao primeiro
sobretom de estiramento da ligao OH, combinao das bandas
vibracionais dos modos de estiramento e deformao angular de ligaes O-H
respectivamente.
Figura 4 Espectros das 123 amostras de queijo muarela

Outros picos observados podem ser relacionados com o teor de gordura
dos queijos e a vibraes das molculas lipdicas, tais como: a banda centrada
em 1210 nm, que atribuda ao segundo sobretom do estiramento de ligaes
22
C-H; os picos em 1730 e 1763 nm, relacionados com o primeiro sobretom de

estiramento
C-H,
os
picos
em
2308
2348
nm,
atribudos
bandas de combinao resultantes de estiramento C-H e deformao de um

grupo CH2 [52, 53].
As amostras foram divididas em 82 para o conjunto de calibrao e 41
para o conjunto de validao usando o algoritmo de Kennard-Stone [57], que
garante a presena das amostras mais representativas no conjunto de
calibrao, por meio de uma varredura uniforme dos dados espectrais.
Na Figura 4 tambm pode ser observada a presena de desvios nolineares de linha de base, tpicos em medidas de reflectncia difusa, causados
pelo espalhamento multiplicativo da luz. Assim, os dados foram prprocessados usando correco de espalhamento multiplicativo (MSC), a fim de
superar este problema [58], antes de os dados serem centrados na mdia. O
espectros pr-processados por MSC so mostrados na Figura 5.
O nmero de VLs em cada modelo foi escolhido por validao cruzada
usando diviso em blocos contnuos (9 divises), com base nos valores mais
baixos de RMSECV (Erro quadrtico mdio de validao cruzada). Os
melhores modelos foram inicialmente selecionados, com 4 e 7 VLs para
umidade e gordura, respectivamente.
Modelos PLS por intervalos (iPLS com 10 intervalos) tambm foram
testados, mas todos os resultados foram piores (em geral, maiores valores de
RMSECV e maior nmero de VLs) do que os modelos PLS utilizando toda a
faixa espectral. Os coeficientes de regresso dos modelos PLS para
determinao de gordura e umidade so mostrados nas Figuras 5 e 6. Ao
observar a Figura 5, foi possvel identificar as regies espectrais que mais
contribuiram para a predio de gordura. Como era de se esperar, os maiores
coeficientes foram relacionados aos segundo e primeiro sobretons de
estiramento de ligaes C-H lipdicas (cerca de 1210, 1730 e 1763 nm); no
entanto, interessante notar que a contribuio mais intensa veio da regio
entre 1870 e 1890 nm, que pode ser atribuda banda de combinao de
vibraes de C-O e O-H de cidos carboxlicos [59], os quais esto presentes
na muarela em baixos teores.
23

gordura em queijo muarela
Na Figura 6, podem ser vistas as regies que mais contribuem para a
predio da umidade. Os
O coeficientes so mais positivas
ivas entre 1850 e 1910
nm,correspondente
correspondente banda de combinao de O-H
O H de gua; por outro lado, os
o
coeficientes mais negativos foram relacionados s vibraes C-H
H lipdicas,
lipd
uma
vez que existe uma relao inversa entre de gua e gordura em queijos. Eles
E
foram observados em torno de 1440 nm, e entre 1690 e nm 1780, atribuda
combinao
mbinao de primeiro sobretom de C-H,
C , e para o primeiro sobretom de
estiramento C-H,
H, respectivamente.
respectiv
Figura 6 - Coeficientes de regresso para o modelo de determinao de

umidade em queijo muarela
24
3.4.2 Otimizao dos modelos pela deteco de amostras anmalas

Aps a construo dos modelos PLS, foi realizada a otimizao
utilizando o procedimento para a deteco de amotras anmalas descrito
previamente. Os valores extremos foram detectados a um nvel de confiana
de 99%, e os resultados foram resumidos na Tabela 1. As amostras anmalas
podem ser removidas dentro de um limite de 22% de seu nmero total,
conforme estabelecido pelas diretrizes brasileiras [29].
Tabela 1 - Otimizao dos modelos PLS pela deteco de amostras anmala

(modelos finais esto destacados em negrito)
1
2
3
4
Modelos
Amostras de calibrao
Amostras de validao
Variveis latentes
RMSEC (%)
RMSEP (%)
Amostras de validao
Variveis latentes
RMSEC (%)
RMSEP (%)
Gordura
82
41
7
3,1
3,2
Umidade
82
41
4
1,8
2,2
77
41
8
2,1
3,0
74
37
8
1,8
2,1
-----------
77
41
8
1,0
1,8
74
41
8
0,8
1,7
73
35
6
0,6
0,9
A otimizao do conjunto de validao foi realizada somente aps

a otimizao do conjunto de calibrao. Alm disso, no mais de trs rodadas
de deteco de amostras anmalas (quatro modelos) devem ser realizadas, a
fim de evitar o "efeito bola de neve" (snowballing), que ocorre quando so
sempre identificados novos outliers a cada novo modelo [19].
Como pode ser visto na Tabela 1, para o modelo de gordura, oito outliers
foram detectados no conjunto de calibrao (correspondente a 9,8% das
amostras) e quatro no conjunto de validao (tambm 9,8%); destes 12
outliers, trs foram detectados com base no alto leverage e nove com base nos
resduos em Y. Para o modelo de umidade, nove outliers foram identificados
25
no conjunto de calibrao (11,0%) e seis no conjunto de validao (14,6%).

Destes quinze outliers, trs foram detectados com base no leverage, um com
base nos residuos espectrais (X) e onze com base nos residuos em Y.
Portanto, o modelo PLS otimizado para a determinao de gordura foi
construdo com 74 amostras de calibrao e 37 amostras de validao, usando
8
VLs,
explicando
99,1%
da
varincia
em
89,8%
em
Y.
O modelo otimizado para determinao de umidade foi construdo com 73

amostras de calibrao e 35 amostras de validao, utilizando 6 VLs,
explicando 98,2% da varincia em X e 94,1% em Y.
3.4.3 Validao analtica
A Tabela 2 resume os parmetros estimados para a avaliao das FOMs
para o proposto mtodos. Nas subsees seguintes, cada FOM estimada
discutida especificamente.
3.4.3.1 Linearidade
Tal como discutido na subseco 2.5.1, a linearidade foi estimada
atravs do ajuste dos valores de referncia contra os valores previstos. Os
resduos para os modelos de gordura e de umidade esto apresentados nas
Figuras 7 e 8. Na maioria da literatura referente quimiometria, os resduos
so plotados em funo dos valores de referncia, o que no estritamente
correto. Os resduos devem ser representados graficamente em funo dos
valores previstos, uma vez que no existe correlao entre eles (r=0). Se os
resduos so plotados contra os valores de referncia, sempre haver
correlao, com o coeficiente de correlao (r) sendo igual a um menos o valor
de r da curva de calibrao [60].
26
Figura 7 Grfico de resduos vs. valores preditos para o modelo de

determinao de gordura amostras de calibrao () e de validao ()

determinao de umidade amostras de calibrao () e de validao ()
Como pode ser observado nas figuras acima, nenhuma tendncia
sistemtica
evidente
nas
distribuies
residuais.
No
entanto,
comportamento aleatrio destes resduos foi confirmada por testes estatsticos

apropriados [22]. A nvel de confiana de 95%, os resduos dos dois modelos
foram considerados normais e homoscedsticos, de acordo com os testes RJ e
BF, respectivamente. Alm disso, a independncia dos resduos foi verificada
pelos valores do teste DW (Tabela 2), os quis estavam dentro dos limites da
faixa de aceitao, entre 1,50 e 2,50.
27
Tabela 2 - Figuras de mrito, estimadas para os modelos PLS de determinao

de gordura e umidade
Figuras de Mrito
Paramtros
Veracidade
Erros relativos
(mx/mn.)
Gordura
Umidade
Valores
-8,7 / 8,1 %
-3,5 / 2,9 %
0,7%
0,2%
0,3%
0,5%
0,4%
0,4%
3,2%
1,4%
Durbin-Watson
8,4%
4,0%
1,8
2,6%
1,2%
1,9
Inclinao
1,00 0,02
1,00 0,03
Intercepto
0,01 2,70
0,00 1,40
Coeficiente de
correlao (r) b
0,9442
0,9702
Faixa de trabalho
38,7 a 58,0 %
41,5 a 55,1 %
Seletividade
Sensibilidade
Sensibilidade analtica
(g)
1
0,07
0,009 c
0,11
0,012 c
1,8 %-1
2,4 %-1
0,60%
0,40%
DPR repetitividade
Preciso
DPR preciso
intermediria a
Linearidade
Vis
RPD
-0,7751,942 % 0,0010,933 %
RPD calibrao
RPD validao
2,1
2,0
2,9
2,4
Resultados para trs amostras em trs diferentes concentraes

Parmetros do ajuste para a curva de valores de referencia vs. valores preditos para as
amostras de calibrao
c
Valores expressos como a razo entre log (1/R) e %
b
28
Uma vez que os modelos lineares foram considerados vlidos, os

parmetros do ajuste da curva de valores de referncia contra os valores
previstos podem ser calculados (Tabela 2). Outra forma de expressar a
linearidade de modelos multivariados NIRS atravs da curvas de calibrao
pseudo-univariada, que so mostrados para os modelos de gordura e de
umidade nas Figuras 9 e 10. Os ajustes das curvas so mostrados nas
equaes 19 e 20, respectivamente.
Figura 9 Curva de valores de referncia vs. norma do NAS para o modelo de

determinao de gordura - amostras de calibrao () e de validao ()

determinao de umidade - amostras de calibrao () e de validao ()
29
Este tipo de representao permite uma melhor compreenso dos

modelos PLS, de uma forma univariada, o que til em anlises de rotina. Os
valores de norma do NAS so equivalentes aos sinais seletivos obtidos a partir
de cada espectro das amostras.
[mn op ;] = 110,91r|?@|r + 8,94 (19)
[s So;ot^ = 47,69r|?@|r + 4,45 (20)
3.4.3.2 Veracidade, preciso e faixa de trabalho

A veracidade dos mtodos pode ser avaliada atravs do valores de
RMSEP (absolutos) 2,1 e 0,9%, para gordura e umidade, respectivamente
(Tabela 2). Ela tambm pode ser avaliada com base nos erros relativos
observados, os quais ficaram entre -8,7 e 8,1% para a determinao de
gordura, e entre -2,9 e 3,5% para a determinao de umidade (Figuras 11 e
12). Todos estes valores esto de acordo com as diretrizes brasileiras, que
estabelecem limites de aceitao de erros relativos na faixa entre -20 e +10%
[29].
Figura 11 Erros relativos das amostras de validao para o modelo de

determinao de gordura
30

determinao de umidade
A preciso foi avaliada atravs do desvio padro relativo (DPR). Para
ambos os mtodos, estes valores variaram entre 0,2 e 0,7% no nvel de
repetitividade, e entre 1,2 e 8,4% no nvel de preciso intermedirio (Tabela 2).
Todos estes resultados tambm esto em conformidade com as diretrizes
brasileiras [29], que prescrevem um DPR mximo de 4% para repetitividade e
10% para preciso intermediria, considerando o nvel da concentrao dos
analitos (acima de 100 g kg-1). Os resultados do veracidade e preciso
permitem assegurar que ambos os mtodos foram considerados exatos [34].
Considerando-se os estudos de linearidade e preciso, os intervalos de
trabalho dos mtodos foram estabelecido como 38,7 - 58,0% p/p para a
gordura e 41,5 - 55,1% p/p para a umidade. importante ressaltar que estes
intervalos no so necessariamente idnticas s faixas teis de calibrao.
Enquanto a calibrao pode cobrir uma vasta gama de concentraes, o
restante do validao ir abranger um leque mais restrito [33].
3.4.3.3. Seletividade e sensibilidade analtica
Como discutido anteriormente, os valores de SEL no tm interesse
prtico para o controle de qualidade. As estimativas de SEL apenas indicam
que 7 e 11% do sinal analtico foram utilizados para predizer a gordura e a
umidade, respectivamente.
31
Uma vez que os valores de SEN no so apropriados para comparao

com outros mtodos, o dos mtodos (Tabela 2) foi tambm calculado com
base no estimado de 0,005. O inverso da indicou que os mtodos foram
capazes de discriminar diferenas de concentrao mnima de 0,6% para
gordura e 0,4% para umidade, considerando o rudo aleatrio instrumental
como a nica fonte de erros.
3.4.3.4. Robustez
Dois fatores de interesse prtico foram escolhidos para a avaliao de
robustez. O objetivo foi verificar se seria possvel substituir as placas fornecidas
pelo fabricante do equipamento por placas de petri convencional, menos
dispendiosas para as medidas de reflectncia. E tambm se um pr-tratamento
mais simples da amostra, sem triturao, proporcionaria os mesmos
resultados. Um planejamento fatorial completo 2 (2 fatores em 2 nveis)
indicou que os dois fatores estudados no apresentaram efeito significativo
sobre os resultados no nvel de confiana de 95%. Como pode ser visto na
Figura 13, todos os efeitos estimados esto abaixo do valor crtico de 2,31.
Placa*Processamento
Processamento
Gordura
Umidade
Placa
0.5
1.5
2.5
Efeitos padronizados
Figura 13 Efeitos do teste de robustez, de acordo com um planejamento 22
32
3.4.3.5. Vis e RPD

O vis foi calculado apenas com base nas amostras de validao e as
suas estimativas para ambos os modelos so mostradas na Tabela 2. Com os
valores de vis e SDV, um valor de t = 0,005 foi estimado para o modelo de
umidade, o que est abaixo do t crtico de 2,026 com 37 graus de liberdade
e no nvel de confiana de 95%. Para o modelo de gordura, t = 2,426 foi
estimado, o que pode indicar a ausncia de um vis estatisticamente
significativo apenas a 98% de confiana (tcritico=2,431).
De acordo com a literatura [37], valores RPD maiores que 2,4 so
considerados desejveis para boas equaes de calibrao, enquanto modelos
com RPD inferior a 1,5 so considerados inadequados. Assim, os valores RPD
para o modelo de umidade foram considerados bons, enquanto os valores de
RPD para o modelo de gordura foram considerados satisfatrios (Tabela 2).
3.4.3.6 Erro amostral especifico de previso (EAEP)
Os EAEP variaram entre 1,1% e 1,3% para umidade e entre 2,5%
e 2,8%. Comparando os valores preditos, juntamente com os intervalos de
erro estimados, com os valores de referncia, h uma concordncia de 75%
para o modelo de predio de gordura, enquanto a concordncia para o
modelo da umidade de quase 90% (Figuras 14 e 15). Isso se deve
principalmente exatido dos mtodos de referncia. Como j foi discutido
anteriormente, o mtodo gravimetrico de dessecao em estufa mais exato
que o mtodo de Gerber.
33

para o modelo de determinao de gordura - valores de referncia () e valores
preditos (*)

para o modelo de determinao de umidade - valores de referncia () e
valores preditos (*)
3.4.3.7 Monitoramento ps modelo

Uma vez que os mtodos foram validados e aprovados para o controle
de qualidade de queijos muarela, surgiu a necessidade de que fossem
monitorados, a fim de avaliar as suas estabilidades. Durante um perodo de
cerca de um ano, em 2011, 53 amostras foram coletadas e analisadas pelo
34
mtodo de referncia e pelos modelos PLS desenvolvidos . Os resultados so

mostrados como cartas de controle. O eixo y representa o erro relativo para
cada amostra e o eixo x representa cada amostra em funo da data de anlise
(Figuras 16 e 17). Os limites indicados nestas cartas de controle so baseados
nas diretrizes brasileiras [29], que estabelecem os limites de aceitao de erros
para o monitoramento da estabilidade de mtodos quantitativos.
40.00
30.00
Erro relativo (%)
20.00
10.00
0.00
-10.00
-20.00
-30.00
-40.00
Amostras
Figura 16 Carta de controle para estabilidade do modelo de determinao de

gordura
35
40.00
30.00
Erro relativo (%)
20.00
10.00
0.00
-10.00
-20.00
-30.00
-40.00
Amostras
Figura 17 - Carta de controle para estabilidade do modelo de determinao de

umidade
De acordo com essa normatizao, dois teros das amostras podem
apresentar erros relativos dentro da faixa de 15% (limites de alerta), enquanto
um tero pode ter erros mximos admissveis abaixo de 33% (limites de
ao). Uma vez que apenas trs amostras (5,6% do total) para o modelo de
gordura e uma amostra (1,9%) para o modelo de umidade apresentaram erros
relativos entre 15% e 33%, ambos os modelos foram considerados
satisfatoriamente estveis.
3.4.4 Concluses
Modelos NIRS utilizando reflectncia difusa para a determinao de
gordura e umidade em queijo muarela foram desenvolvidos e validados. Estes
modelos foram desenvolvidos sob as condies reais da anlise de rotina em
um laboratrio estatal de controle de qualildade de alimentos.
Estes modelos apresentaram vrias vantagens sobre os mtodos atuais,
tais como baixo custo, processo simplificado, sem necessidade de reagentes e
no gerando resduos qumicos. A principal vantagem dos mtodos
desenvolvidos foi a rapidez das anlises, uma vez que apenas cerca de trs
36
minutos foram gastos para a determinao de ambos os paramtros. Assim, os

mtodos NIRS foram cerca de 30 vezes mais rpidos do que o mtodo de
Gerber para a determinao de gordura, e 80 vezes mais rpidos do que o
mtodo gravimtrico para a determinao de umidade.
Ambos os mtodos foram validados em conformidade com as diretrizes
brasileiras e internacionais, sendo considerados lineares, precisos, sensveis e
robustos. Alm disso, aps os mtodos serem adotados, seus desempenhos
foram monitorados durante cerca de um ano atravs de grficos de controle,
demonstrando que eles continuaram a fornecer previses aceitveis.
Finalmente, mais do que estes mtodos especficos, esta aplicao teve
como objetivo apresentar uma completa e robusta metodologia multivariada.
Esta metodologia empregou o conceito de sinal do analito lquido e harmonizou
a validao tradicional univariada com os requisitos dos mtodos multivariados
de calibrao, o que essencial para a implementao de novos mtodos
NIRS na rotina anlise de controle de qualidade dos alimentos.
37
4. Determinao de umidade em queijos minas artesanal

utilizando NIR e PLS
4.1 Introduo
A produo de queijos artesanais no Brasil iniciou-se no perodo colonial
por portugueses que traziam consigo rebanhos bovinos. Os animais tinham
parte de sua escassa produo leitera destinada fabricao de um queijo
frescal, semelhante ao da Serra de Estrela, de Portugal. A diferena entre o
queijo portugus e o produzido no Brasil referia-se ao tipo de material usado
para coagulao do leite. Em Portugal, eram utilizados extratos de flores e
brotos de cardo silvestre (Cynara cardunculus L.), que no Brasil foram
substitudos por estmago seco e salgado de moc, bezerro ou cabrito [61].
No Brasil, so considerados como artesanais os queijos Minas,
produzidos nas regies de Arax, Serra da Canastra, Cerrado, Serro e Campo
das Vertentes, no estado de Minas Gerais; o queijo de Coalho e o queijo de
Manteiga, produzidos na Regio Nordeste; o queijo Serrano e o queijo Colonial,
produzidos na Regio Sul; e o queijo Caipira, produzido no estado do Mato
Grosso do Sul. As estatsticas sobre a produo e consumo de queijos
artesanais brasileiros so escassas [61].
Queijo Minas um queijo tradicional do brasileiro, sendo o queijo mais
consumido em todo o pas. Ele pode ser classificado em dois tipos diferentes: o
Queijo Minas Artesanal, produzido apenas no estado de Minas Gerais, e o
Queijo Minas Padro, produzido em todo o pas. As leis federais apenas
reconhecem o queijo minas padro, de modo que o queijo artesanal s pode
ser comercializado dentro do estado de Minas Gerais [62].
De acordo com as leis do Estado de Minas Gerais, para ser considerado
queijo artesanal, alguns pr-requisitos devem ser cumpridos. O leite utilizado
na produo de queijo deve ser da mesma fazenda onde o queijo ser
produzido, e este leite no pode ser pasteurizado. Em relao s propriedades
fsico-qumicas, o teor de umidade no deve ser superior a 45,9%. O mtodo
oficial para determinao de umidade a dessecao em estufa [63, 64].
38
4.2 Objetivos
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um mtodo simples, robusto e
rpido para determinao do teor de umidade em queijos minas artesanal
usando NIRS e PLS. Esse mtodo deve ser usado para o controle de qualidade
destes queijos no IMA (Instituto Mineiro de Agropecuria). Este trabalho
tambm tem como objetivos a realizao das anlises sob o ambiente realista
do controle de qualidade, incluindo uma validao analtica completa e a
avaliao permanente do desempenho do mtodo atravs do monitoramento
da estabilidade ps-modelo.
4.3.1 Equipamentos e Softwares
Para a obteno dos espectros e tratamento dos dados, foram utilizados,
os mesmos equipamentos e softwares citados na sesso 3.3.1.
Noventa e cinco amostras de queijo minas foram coletadas entre 2009 e
2010. As amostras foram mantidas em uma temperatura inferior a 4 C e
analisadas aps um perodo de 30 minutos, para que a amostra atingisse a
temperatura ambiente. As condies para preparo da amostra e aquisio dos
espectros foram similares as utilizadas para as amostras de muarela,
descritas na sesso 3.3.2.
O mtodo de anlise de referncia foi realizado de acordo com a
literatura. O teor de umidade total nos queijos foi determinado utilizando o
mtodo gravimtrico, sem repeties [56]. Trs gramas de amostra foram
pesadas e misturou-se homogeneamente com a mesma quantidade de areia
fina pr-seca, a fim de se evitar a formao de crosta e para acelerar o
processo de secagem. As amostras foram, em seguida, secas a 105 C, at
atingirem um peso constante.
39
4.4 Resultados e discusso

4.4.1 Desenvolvimento do modelo PLS
A Figura 18 mostra todos os espectros para as 95 amostras de queijo
minas artesanal. possvel ver que as bandas mais intensas e largas esto por
volta de 1450 e 1900 nm, o que corresponde ao primeiro sobretom de
estiramento de ligaes O-H e banda de combinao de estiramento e
deformao angular de O-H, respectivamente [52, 53]. As amostras foram
divididas em um conjunto de calibrao (63 amostras) e um conjunto de
validao (32 amostras), utilizando o algoritmo de Kennard Stone [57].
Figura 18 Espectros das amostras de queijo minas artesanal

Aps a separao dos grupos, os espectros foram pr-tratados para
remover artefatos fsicos. Como pode ser visto na figura 15, desvios de linha
base no lineares esto presentes nos espectros. Assim, para corrigi-los, a
correo do espalhamento multiplicativo (MSC), foi usada, antes de centrar os
dados na mdia. Os espectros pr-processados podem ser vistos na figura 19.
O melhor nmero de variveis latente foi escolhido usando o RMSECV,
calculado com base na validao cruzada por blocos contnuos (7 divises).
40
Figura 19 Espectros de queijo minas artesanal pr-tratados

Ao observar os coeficientes de regresso para o modelo (Figura 20),
possvel observar, como esperado, que as regies mais importantes esto
relacionadas com a absoro de O-H, com os maiores valores positivos
prximos de 1450 e 1900 nm. Tambm interessante destacar os dois picos
negativos, em 1200 e 1730 nm. Estes picos correspondem ao segundo e
primeiro sobretons, respectivamente, de ligaes C-H, as quais podem ser
relacionadas aos teores de carboidratos, gorduras e protenas no queijo, que
esto inversamente relacionados com o teor de umidade.

umidade em queijo minas artesanal
41
4.4.2 Deteco de amostras anmalas e otimizao do modelo

Aps o desenvolvimento do modelo, o mesmo foi otimizado tal como
descrito anteriormente, utilizando um nvel de confiana de 99%. Os resultados
esto resumidos na Tabela 3
Tabela 3 - Otimizao dos modelos PLS para determinao de umidade em

queijo minas artesanal pela deteco de amostras anmalas
(modelo final est destacado em negrito)
Modelos
Amostras de validao
Variveis latentes
RMSEC (%)
RMSEP (%)
2
63
32
3
3.1
5.2
3
58
32
6
2.0
5.0
4
55
27
7
1.5
2.0
-----------
Oito outliers foram detectados no grupo de calibrao, o que

corresponde a 12% do total das amostras. Deste grupo, dois foram removidos
por apresentarem alto Ieverage, um por alto resduo espectral e cinco por altos
resduos em Y. No conjunto de validao, cinco outliers foram detectados (16%
do
total
de
amostras),
todos
eles
por
altos
resduos
em
Y.
O modelo final otimizado foi construdo com 55 amostras do grupo de

calibrao e 27 no grupo de validao, usando 7 LVs, explicando 99,5% da
varincia em X e 95,5% da varincia em Y.
4.4.3 Validao analtica
A Tabela 4 resume os parmetros estimados para cada FOM, os quais
sero discutidos especificamente nas seguintes subsees.
4.4.3.1 Linearidade
A linearidade foi estimada a partir dos resduos do ajuste dos valores de
referncia contra os valores preditos Como pode ser observado, no h uma
tendncia sistemtica visvel na distribuio residual (Figura 21).
42

Figuras de Mrito
Paramtros
Valores
Veracidade
Erros relativos (mx/mn.)
-6,5 / 9,8%
DPR repetitividade
Preciso
DPR preciso
intermediria a
Linearidade
1,0%
0,7%
1,0%
1,6%
Durbin-Watson
1,7%
1,5%
2,0
Inclinao
0,95 0,06
Intercepto
1,86 2,40
Coeficiente de correlao
(r) b
0,9773
Faixa de trabalho
28,5 a 55,5 %
Seletividade
Sensibilidade
0,120
0,058 c
Sensibilidade analtica ()
10,34 %-1
0,1%
Bias
0,8201,902 %
RPD
RPD calibrao
RPD validao
3,4
2,1

c
b
43

determinao de umidade amostras de calibrao () e de validao ()
Para confirmar esta aleatoriedade, alguns testes estatsticos foram

utilizados. Os resduos foram avaliados para distribuio normal (RJ),
homocedasticidade (BF) e ausncia de autocorrelao (DW), todos eles com
um nvel de confiana de 95%. O resultado de DW, apresentado na tabela 4,
est dentro dos limites de aceitao (1,5-2,5), o que assegura que no h
dependncia entre os resduos. Uma vez que o ajuste linear foi considerado um
pressuposto vlido, os parmetros da curva de valores referncia contra
valores preditos foram calculados.
A linearidade tambm pode ser expressa atravs da curva de calibrao
pseudounivariada (Figura 22).
44

determinao de umidade - amostras de calibrao () e de validao ()
4.4.3.2 Exatido e faixa de trabalho

Para este modelo, o RMSEP foi de 2,0% (Tabela 4), e os erros relativos
variaram entre -9,8 e 6,5% (Figura 23). De acordo com as diretrizes brasileiras
[29], os limites de aceitao de erros relativos so -20% / 10%, de modo que
pode ser considerado que o mtodo est a fornecer resultados verdadeiros. O
modelo foi tambm considerado preciso, com desvio padro relativo (DPR)
variando de 1,5% a 1,7% quando avaliado no nvel de preciso intermediria e
DPR variando de 0,7% a 1,0% no nvel de repetitividade. Estes resultados
esto de acordo com as diretrizes brasileiras. O DPR de repetitividade deve ser
menor do que 4% e o DPR de preciso intermediria deve ser menor do que
10%, considerando o nvel de analito (acima de 100 g.kg-1). Os resultados de
veracidade e preciso permitem assegurar que o mtodo exato.
Considerando-se os estudos de linearidade e preciso, a faixa de trabalho do
mtodo foi estabelecido como 28,5 - 55,5% p/p.
45

determinao de umidade
4.4.3.3 Seletividade e sensibilidade analtica

Como discutido antes, a SEL no tem interesse prtico em modelos
quimiomtricos. A sua estimativa apenas nos d uma ideia de quanta
informao espectral foi utilizada para a construo do modelo. Para este
modelo, 12% do sinal analtico foi utilizado na predio da umidade.
A sensibilidade analtica (), calculada usando a SEN e o rudo
instrumental (), uma FOM til, que permite a comparao entre a
sensibilidade de diferentes tcnicas, e o inverso da (-1) indica a concentrao
mnima que o modelo pode discriminar, considerando o rudo instrumental
como a nica fonte de erros. O -1 calculado para este modelo foi de 0,1%
(Tabela 4).
4.4.3.4 Vis e RPD
O vis foi calculado com base apenas em amostras de validao,
utilizando 27 graus de liberdade, e apresentada na tabela 4. O resultado de
0,820 1,920 indica ausncia de erros sistemticos, a um nvel de confiana
de 95%. Considerando os limites estabelecidos para RPD na literatura [37, 65],
o presente modelo pode ser considerado adequado para quantificao
(Tabela 4).
46
4.4.3.5. Erro amostral especfico de predio (EAEP)

O EAEP estimado variou entre 2,5 e 2,7%. A figura 24 mostra os valores
preditos com o intervalo de EAPP e os valores de referncia para cada amostra
de validao. De um total de 27 amostras, sete estavam fora dos limites do
intervalo. Este elevado nmero de amostras fora dos limites pode ser devido
capacidade de o mtodo de referncia em determinar apenas gua livre na
amostra, e o NIRS detecta toda a gua, at mesmo a quimicamente ligada.
Talvez, devido a este fato, seis das sete amostras citadas acima tm valores de
referncia menores do que os valores preditos.
Figura 24 Erro amostral especfico de predio para as amostras de

validao valores de referncia () e valores preditos (*)
4.4.3.6 Monitoramento ps-modelo

Depois que o mtodo foi validado e adotado como anlise de rotina para
determinao de umidade em queijo minas artesanal, o mesmo foi monitorado
a fim de avaliar a sua estabilidade. Durante um ano, pelo menos uma amostra
por semana foi analisada em ambos os mtodos, de referncia e NIRS, e a
diferena foi avaliada como erro relativo. Os resultados so mostrados na
figura 21, como uma carta de controle. O limite de alerta ( 15%) e o limite de
ao ( 33%) foram estabelecidas de acordo com as diretrizes brasileiras [29].
Para ser considerado estvel, o modelo pode apresentar dois teros das
47
amostras analisadas com erros relativos dentro do limite de ateno ( 15%),

enquanto apenas um tero pode estar entre o limite de ateno e o limite de
ao (33%).
40.0
30.0
Erros relativos (%)
20.0
10.0
0.0
-10.0
-20.0
-30.0
-40.0
Amostras
Figura 25 Carta de controle da estabilidade do modelo para determinao de
Apenas trs amostras ficaram acima do limite de ateno (10% do total

de amostras analisadas), o que indica que o modelo permaneceu estvel
durante um ano aps a sua validao.
4.4 Concluso
Um modelo multivariado utilizando NIRS com reflectncia difusa para
determinao de umidade em queijo minas artesanal foi desenvolvido e
validado, de acordo com as diretrizes brasileiras, sendo considerado, linear,
preciso e acurado. O mtodo foi desenvolvido em condies reais de
laboratrio e tem sido utilizado na anlise de rotina por quase um ano. O
mtodo NIRS apresenta muitas vantagens sobre o mtodo tradicional. Ele
48
quase 80 vezes mais rpido, mais simples, mais barato e no tem necessidade
de reagentes. Alm disso, a estabilidade do modelo foi monitorada durante um
ano, o que demonstra que as respostas do modelo permaneam aceitveis ao
longo do perodo de estudo.
5. Modelos em desenvolvimento
Alm dos modelos para determinao de umidade em queijos Minas
Artesanal e umidade e gordura em muarela, tambm foi desenvolvido um
modelo para a determinao de umidade em doces de leite. Este modelo ainda
no foi finalizado, pois depende de um maior nmero de amostras, o que, por
sua vez, depende do fluxo de amostras no IMA.
De acordo com a norma da ASTM [20], o nmero mnimo de amostras
para um modelo PLS utilizado NIRS calculado com base no nmero de
variveis latentes utilizadas no modelo. Sendo k = nmero de variveis
latentes, um modelo necessita de, no mnimo, 6*(k+1) amostras para o
conjunto de calibrao e 4k amostras para o conjunto de validao. Para
finalizar o modelo de doce de leite, seriam necessrias 56 amostras (36 no
conjunto de calibrao e 20 no conjunto de validao) Portanto, somente
resultados preliminares sero reportados.
Para o doce de leite so avaliados o teor de protenas, umidade,
gordura, cinzas e extrato seco. Somente para a umidade foi obtido um modelo
com resultados satisfatrios, os quais sero apresentados neste captulo.
Outras matrizes, tais como leite fluido e iogurte j possuem um nmero
de amostras suficientes para a construo de modelos preliminares, porm,
estas matrizes no forneceram bons resultados para os parmetros estudados,
portanto, esses resultados no sero apresentados.
Para o leite fluido foram propostos modelos para a determinao de
gordura, protena, acidez e extrato seco desengordurado, e para iogurte foram
desenvolvidos modelos para determinao de protenas, gordura, acidez e
amido. Ambas as matrizes apresentam um problema similar, que o grande
particionamento da varincia explicada em Y, ou seja, cada VL explica
pequena quantidade de varincia em Y, necessitando-se de um grande nmero
delas para explicar toda a varincia necessria para produzir um bom modelo.
49
Tal particionamento pode ser explicado pela grande diversidade entre as

amostras, como no caso do iogurte, cujos modelos foram construdos com
amostras de diferentes sabores (diferentes corantes e outros aditivos), e no
caso do leite, devido principalmente s diferentes origens das amostras e as
variaes sazonais, que influenciam fortemente a sua composio, o que no
acontece com os queijos, por exemplo. Para tentar superar esse empecilho,
algumas tcnicas quimiomtricas sero avaliadas, como a seleo de
variveis, atravs do algoritmo das projees sucessivas (SPA) e outros tipos
de regresso, como a mquina de vetores de suporte por mnimos quadrados
(LS-SMV) [66, 67]. A SVM um modelo de aprendizagem supervisionada, que
pode ser usada em regresses multivariadas e particularmente indicada para
modelagem no linear. A dificuldade em obter bons modelos PLS (lineares)
para essas matrizes, associada grande diversidade de composio das
amostras, justifica a tentativa de emprego de um mtodo de calibrao
multivariada mais complexo.
5.1 Introduo
Doce de Leite (DL) um produto base de leite, popular nos pases sulamericanos. Principalmente consumido como um doce ou como uma geleia,
ele vagamente semelhante em gosto ao caramelo. Alm disso, o DL a base
para a elaborao de muitos doces e sobremesas que fazem parte dos
clssicos da cozinha sul-americana, sendo tambm conhecido como dulce de
leche na Argentina e Uruguai, arequipe na Colmbia e manjar blanco no Peru.
Em ingls chamado de milk caramel ou caramel jam [68].
O DL preparado com leite integral fervido com sacarose adicionada at
que a concentrao de 70% (p/p) de slidos totais seja atingida. Geralmente, a
sacarose parcialmente substituda por xarope de glicose para evitar a
cristalizao. Outro ingrediente adicionado o bicarbonato de sdio (cerca de
1%), que tem como funo favorecer as reaes de escurecimento no
enzimtico (reaes de Maillard) e impedir a coagulao das protenas do leite
atravs do aumento do pH da mistura acima do ponto isoeltrico. s vezes,
baunilha adicionada como aromatizante [68].
50
Durante a evaporao, o escurecimento no enzimtico ocorre

intensamente, levando a um produto de cor castanha, que tem um sabor
caracterstico e agradvel. O produto utilizado na confeitaria tem geralmente
uma viscosidade mais elevada do que o usado como geleia. Esse processo
dura em torno de duas a trs horas, e termina quando o teor de slidos
solveis totais atinge um valor de Brix entre 65 e 70 [68].
5.2.1 Equipamentos e Softwares
Para a obteno dos espectros e tratamento dos dados, foram utlizados
os mesmos equipamentos e softwares citados na sesso 3.3.1.
Cinquenta amostras de doce de leite foram coletadas entre 2009 e 2012,
sendo quinze amostras de doce de leite em barra (DLB) e trinta e cinco
amostras de doce de leite pastoso (DLP). O mtodo de anlise de referncia foi
realizado de acordo com a literatura [56], pelo mtodo gravimtrico de
dessecao em estufa a 105 C.
5.3 Desenvolvimento do modelo PLS
A Figura 26 mostra todos os espectros para as cinquenta amostras de
doce de leite. possvel notar uma clara distino entre as amostras de doce
em leite em barra (espectros com maior intensidade de sinal) das amostras de
doce de leite pastoso (espectros com menor intensidade de sinal). Para os
DLB, a umidade no ultrapassa 15%, j para o DLP, ela variou entre 25 e 35%,
aproximadamente.
Para uma melhor diviso das amostras, o algoritmo de Kennard-Stone
[57] foi utilizado em cada um destes dois subgrupos de espectros
separadamente, de forma a deixar a seleo das amostras mais homogneas.
O conjunto de calibrao foi composto de dez amostras de DLB e 24 amostras
de DLP, totalizando 34 amostras, e o conjunto de validao foi construdo com
cinco amostras de DLB e 11 de DLP, totalizando 16 amostras.
51
Figura 26 Espectros das amostras de doce de leite pastoso e em barra
Aps a separao dos grupos, os espectros foram pr-tratados com

correo do espalhamento multiplicativo (MSC), antes de centrar os dados na
mdia. Os espectros pr-tratados podem ser visto na figura 27. O melhor
nmero de variveis latente foi escolhido usando o RMSECV, calculado com
base na validao cruzada por blocos contnuos (5 divises).
Figura 27 Espectros de doce de leite pr-tratados usando MSC
52
5.3.1 Deteco de amostras anmalas e otimizao do modelo

Aps o desenvolvimento do modelo, o mesmo foi otimizado tal como
descrito anteriormente, utilizando um nvel de confiana de 99%. Os resultados
esto resumidos na Tabela 5
Tabela 5 Otimizao do modelo PLS para determinao de umidade em doce

de leite pela deteco de outliers (modelo final est destacado em negrito)
Modelos
Amostras de validao
Variveis latentes
RMSEC (%)
RMSEP (%)
2
34
16
5
1,7
1,8
3
32
16
5
1,4
1,9
4
30
16
5
1,2
1,9
29
13
5
1,1
1,4
No total, foram detectadas cinco amostras anmalas no conjunto de

calibrao, todas retiradas devido a altos resduos em Y, e, no conjunto de
calibrao, foram diagnosticadas 3 amostras anmalas. O modelo final
otimizado foi construdo com 29 amostras no grupo de calibrao e 13 no grupo
de validao, usando 5 VLs, explicando 99,9% da varincia em X e 98,6% da
varincia em Y. Algumas figuras de mrito tambm foram estimadas para o
modelo de determinao de umidade (Tabela 6). Apesar de ser um modelo
parcial, possvel verificar que ele apresenta boas previses.
53

umidade em doce de leite
Figuras de Mrito
Paramtros
Valores
Veracidade
Erros relativos (mx/mn.)
6,5 / -9,8%
DPR repetitividade
Preciso
DPR preciso
intermediria a
Linearidade
---------
Durbin-Watson
----2,4
Inclinao
0,98 0,05
Intercepto
0,40 1,30
Coeficiente de correlao
(r) b
0,992
Faixa de trabalho
11,1 a 39,5 %
Seletividade
Sensibilidade
0,35
0,006 c
Sensibilidade analtica ()
147,35 %-1
0,1%
Bias
0,0541,402 %
RPD
RPD calibrao
RPD validao
6,7
6,6

c
b
54
5.4 Concluses parciais

A partir do modelo obtido at o momento, possvel verificar que a
determinao de umidade em doce de leite por NIRS e PLS vivel, e a
finalizao da sua validao completa depende apenas do fluxo de amostras a
serem analisadas no IMA. Mesmo com o nmero de amostras inferior ao
mnimo recomendvel, o modelo mostrou-se linear, com veracidade dentro dos
limites exigidos pela legislao [29], ausncia de erros sistemticos e valores
de RPD acima de 2,4, que confirmam a capacidade do modelo para ser
utilizado, analisando amostras de DL pastoso e em barra simultaneamente.
55
6. Concluses gerais
A aplicao conjunta do NIRS e do PLS em mtodos de composio
centesimal de produtos lcteos apresentou excelentes resultados, com
predies estatisticamente similares s fornecidas pelas tcnicas clssicas de
referncia, com a vantagem de serem mais rpidas, mais simples, no
utilizarem solventes e reagentes e gerarem pouco ou nenhum resduo. A
tentativa de harmonizao entre a validao univariada e multivariada foi bem
sucedida, sendo a maioria das figuras de mrito exigidas pelas diretrizes
nacionais e internacionais estimadas de maneira coerente.
Os modelos tambm se apresentaram satisfatrios quando aplicados a
realidade de rotina de um laboratrio de controle fiscal. Os modelos aqui
apresentados para determinao de umidade e gordura em muarela e
umidade em queijo minas artesanal j esto implementados como mtodos
oficiais no IMA.
7. Atividades futuras
Como todas os modelos desenvolvidos neste projeto so consturdos na
situao de calibrao natural (amostras no planejadas, cuja matriz no pode
ser simplesmente reproduzida em laboratrio), o desenvolvimento de novos
modelos depende do fluxo de amostras do IMA. Devido a essa incerteza,
outras matrizes, alm dos alimentos de origem animal sero estudadas,
utilizando tambm outras tcnicas.
Estudos preliminares j foram realizados sobre a viabilidade da
determinao
de
corantes
em
sucos
industrializados
utilizando
espectrofluorimetria e anlise de imagens. Pretende-se desenvolver modelos

para a quantificao simultnea de corantes azo, atravs da utilizao conjunta
de espectrofluorimetria e do PARAFAC (Anlise de Fatores Paralelos) [69, 70]
um mtodo quimiomtrico de ordem superior. A principal vantagem na
utilizao deste mtodo a possibilidade de realizar a quantificao sem a
necessidade de processos de extrao, uma vez que as matrizes analisadas
so complexas e muitas vezes possuem mais de um corante.
56
Outro estudo tambm est sendo realizado no sentido de utilizar

imagens obtidas por um scanner de mesa para a determinao de corantes em
refrigerantes. As imagens adquiridas so decompostas em canais RGB (red,
blue e green), e convertidas em histogramas de cores. Estes histogramas
podem ser tratados como espectros, e a partir da modelos PLS serem
gerados. Outra alternativa a possibilidade de tratar as imagens como dados
tridimensionais, usando mtodos de ordem superior, tais como PARAFAC e
N-PLS [71, 72].
57
8 Referncias Bibliogrficas
1.
Burns, D.A. and E.W. Ciurczak, Handbook of near infrared analysis. 3rd
ed. 2008, Boca Raton: CRC Press. 836p
2.
Wu, D.S., Infrared Spectroscopy for food quality analysis and control. 1st
ed. 2009, Nova York: Academic Press. 415p.
3.
Hart, J.R., K.H. Norris, and C. Golumbic, Determination of the moisture

content of seeds by near-infrared spectrophotometry of their methanol
extracts. Cereal Chemistry, 1962. 39: p. 5.
4.
Pasquini, C., Near Infrared Spectroscopy: fundamentals, practical

aspects and analytical applications. Journal of the Brazilian Chemical
Society, 2003. 14: p. 198-219.
5.
Ferreira, M.M.C., et al., Quimiometria I: calibrao multivariada, um

tutorial. Qumica Nova, 1999. 22: p. 724-731.
6.
Sena, M.M.d., et al., Avaliao do uso de mtodos quimiomtricos em

anlise de solos. Qumica Nova, 2000. 23: p. 547-556.
7.
Shao, X., et al., Multivariate calibration methods in near infrared

spectroscopic analysis. Analytical Methods, 2010. 2: p. 1662-1666.
8.
Sun, T., et al., Research advances in nondestructive determination of

internal quality in watermelon/melon: A review. Journal of Food
Engineering, 2010. 100: p. 569-577.
9.
Nicola, B.M., et al., Nondestructive measurement of fruit and vegetable

quality by means of NIR spectroscopy: A review. Postharvest Biology
and Technology, 2007. 46: p. 99-118.
10.
Bucci, R., et al., Chemical Authentication of Extra Virgin Olive Oil

Varieties by Supervised Chemometric Procedures. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 2002. 50: p. 413-418.
11.
Garca-Alvarez, M., et al., Determination of Polarimetric Parameters of

Honey by Near-Infrared Transflectance Spectroscopy. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 2002. 50: p. 419-425.
12.
Llario, R., et al., Determination of quality parameters of beers by the use

of attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy.
Talanta, 2006. 69: p. 469-480.
13.
Cocchi, M., et al., Durum wheat adulteration detection by NIR

spectroscopy multivariate calibration. Talanta, 2006. 68: p. 1505-1511.
14.
Haughey, S.A., et al., The application of Near-Infrared Reflectance

Spectroscopy (NIRS) to detect melamine adulteration of soya bean meal.
Food Chemistry, IN PRESS
15.
Gurdeniz, G. and B. Ozen, Detection of adulteration of extra-virgin olive

oil by chemometric analysis of mid-infrared spectral data. Food
Chemistry, 2009. 116: p. 519-525.
16.
Guerreiro, J.S., et al., Principal component analysis of proteolytic profiles

as markers of authenticity of PDO cheeses. Food Chemistry, IN PRESS.
58
17.
Casale, M., et al., Characterisation of PDO olive oil Chianti Classico by

non-selective (UVvisible, NIR and MIR spectroscopy) and selective
(fatty acid composition) analytical techniques. Analytica Chimica Acta,
2012. 712: p. 56-63.
18.
Alves, M.R., et al., Classification of PDO olive oils on the basis of their
sterol composition by multivariate analysis. Analytica Chimica Acta,
2005. 549: p. 166-178.
19.
Valderrama, P., J.W.B. Braga, and R.J. Poppi, Variable Selection, Outlier
Detection, and Figures of Merit Estimation in a Partial Least-Squares
Regression Multivariate Calibration Model. A Case Study for the
Determination of Quality Parameters in the Alcohol Industry by NearInfrared Spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007.
55: p. 8331-8338.
20.
Annual Book of ASTM Standards, Standard Practices for Infrared

Multivariate Quantitative Analysis - E1655-05, ASTM International, West
Conshohocken, Pennsylvania, EUA, 2005.
21.
Silva, M.A.M., et al., Development and analytical validation of a

multivariate calibration method for determination of amoxicillin in
suspension formulations by near infrared spectroscopy. Talanta, 2012.
89: p. 342-351.
22.
Souza, S.V.C. and R.G. Junqueira, A procedure to assess linearity by

ordinary least squares method. Analytica Chimica Acta, 2005. 552: p. 2535.
23.
Lorber, A., Error propagation and figures of merit for quantification by

solving matrix equations. Analytical Chemistry, 1986. 58: p. 1167-1172.
24.
Lorber, A., K. Faber, and B.R. Kowalski, Net Analyte Signal Calculation
in Multivariate Calibration. Analytical Chemistry, 1997. 69: p. 1620-1626.
25.
Bro, R. and C.M. Andersen, Theory of net analyte signal vectors in

inverse regression. Journal of Chemometrics, 2003. 17: p. 646-652.
26.
Valderrama, P., J.W.B. Braga, and R.J. Poppi, Estado da arte de figuras
de mrito em calibrao multivariada. Qumica Nova, 2009. 32: p. 12781287.
27.
Olivieri, A.C., et al., Uncertainty estimation and figures of merit for

multivariate calibration. Pure and Applied Chemistry, 2006. 78: p. 633661.
28.
Faber, N.M., Response to Comments on construction of confidence

intervals in connection with partial least squares. Journal of
Chemometrics, 2000. 14: p. 363-369.
29.
Secretaria de Defesa Agropecuria. Ministrio da Agricultura, Pecuria e

Abastecimento. Instruo Normativa n 24, Brasil.
30.
ICH, International Conference on Harmonization, Tripartite Guideline

Q2A Text on Validation of Analytical Procedures, Fed. Regist., 60 FR
11260, USA. 1995.
59
31.
International Conference on Harmonization, Tripartite Guideline Q2B

Validation of Analytical Procedures: Methodology, Fed. Regist., 62 FR
27464. 1997, ICH: USA.
32.
Food and Agriculture Organization. Validation of analytical methods for

food control. Report of a Joint FAO/IAEA Experte Consultation, FAO
Food and Nutrition Paper n 68, Roma, Itlia.
33.
Thompson, M., S.L.R. Ellison, and R. Wood, Harmonized guidelines for

single-laboratory validation of methods of analysis (IUPAC Technical
Report), in Pure and Applied Chemistry. 2002. 74: p. 835-855.
34.
European Community Directive 657. Comission Decision of 12 August

2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the
performance of analytical methods and the interpretation of results,
Official Journal, L221, 8-36, Bruxelas, Blgica.
35.
Instituto Nacional De Metrologia, Qualidade E Tecnologia; Oliveira,

J.C.V. (coord.). Vocabulrio Internacional de Metrologia: conceitos
fundamentais e gerais e termos associados. Rio de Janeiro: Inmetro,
2009
36.
Durbin, J. and G.S. Watson, Testing For Serial Correlation In Least

Squares Regression. Ii. Biometrika, 1951. 38: p. 159-178.
37.
Williams, P., Implementation of near-infrared technology, in Near-infrared

technology in the agricultural and food industries, P. Williams and K.
Norris, Editors. 2001, American Association of Cereal Chemists Inc.: St.
Paul.
38.
De Vries, S. and C.J.F. Ter Braak, Prediction error in partial least

squares regression: A critique on the deviation used in The Unscrambler.
Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 1995. 30: p. 239-245.
39.
Faber, K. and B.R. Kowalski, Prediction error in least squares regression:

Further critique on the deviation used in The Unscrambler.
Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 1996. 34: p. 283-292.
40.
Faber, N.M. and R. Bro, Standard error of prediction for multiway PLS: 1.
Background and a simulation study. Chemometrics and Intelligent
Laboratory Systems, 2002. 61: p. 133-149.
41.
Harbutt, J., The World Cheese. 1st ed. 2009, Nova Iorque: DK Publishing.
42.
Secretaria de Defesa Agropecuria. Ministrio da Agricultura, Pecuria e

Abastecimento. Portaria n 364, Brasil.
43.
Badertscher, R., T. Berger, and R. Kuhn, Densitometric determination of

the fat content of milk and milk products. International Dairy Journal,
2007. 17: p. 20-23.
44.
Bradley, R.L. and M.A. Vanderwarn, Determination of Moisture in

Cheese and Cheese Products. Journal of AOAC International, 2001. 84:
p. 570-592.
45.
Rodriguez-Otero, J.L., M. Hermida, and J. Centeno, Analysis of Dairy

Products by Near-Infrared Spectroscopy: A Review. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 1997. 45: p. 2815-2819.
60
46.
Gera, L.B. and K.H. Norris, Influence of fat concentration on the

absorption spectrum of milk in the near infrared region. The Israel
Journal of Agricultural Research, 1968. 18: p. 7.
47.
Pierce, M.M. and R.L. Wehling, Comparison of sample handling and data
treatment methods for determining moisture and fat in Cheddar cheese
by near-infrared spectroscopy. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 1994. 42: p. 2830-2835.
48.
Rodriguez-Otero, J.L., M. Hermida, and A. Cepeda, Determination of fat,

protein, and total solids in cheese by near-infrared reflectance
spectroscopy. J AOAC Int, 1995. 78: p. 802-6.
49.
Wittrup, C. and L. Nrgaard, Rapid Near Infrared Spectroscopic

Screening of Chemical Parameters in Semi-hard Cheese Using
Chemometrics. Journal Of Dairy Science, 1998. 81: p. 1803-1809.
50.
Blazquez, C., et al., Prediction of moisture, fat and inorganic salts in

processed cheese by near infrared reflectance spectroscopy and
multivariate data analysis. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 2004.
12: p. 9.
51.
Karoui, R., et al., A comparison and joint use of NIR and MIR
spectroscopic methods for the determination of some parameters in
European Emmental cheese. European Food Research and Technology,
2006. 223: p. 44-50.
52.
Lucas, A., et al., Prediction of Dry Matter, Fat, pH, Vitamins, Minerals,
Carotenoids, Total Antioxidant Capacity, and Color in Fresh and FreezeDried Cheeses by Visible-Near-Infrared Reflectance Spectroscopy.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008. 56: p. 6801-6808.
53.
Pi, F., et al., Non-destructive determination of components in processed

cheese slice wrapped with a polyethylene film using near-infrared
spectroscopy and chemometrics. International Dairy Journal, 2009. 19: p.
624-629.
54.
Ntsame Affane, A.L., et al., Simultaneous prediction of acidity

parameters (pH and titratable acidity) in Kefir using near infrared
reflectance spectroscopy. International Dairy Journal, 2011. 21: p. 896900.
55.
Huang, H., et al., Near infrared spectroscopy for on/in-line monitoring of

quality in foods and beverages: A review. Journal of Food Engineering,
2008. 87: p. 303-313.
56.
Pomeranz, Y. and C.E. Meloan, Food Analysis : Theory and Practice. 3rd
ed. 1994, New York: Chapman & Hall.
57.
Kennard, R.W. and L.A. Stone, Computer Aided Design of Experiments.

Technometrics, 1969. 11: p. 137-148.
58.
Isaksson, T. and T. Ns, The Effect of Multiplicative Scatter Correction

(MSC) and Linearity Improvement in NIR Spectroscopy. Appl.
Spectrosc., 1988. 42: p. 1273-1284.
59.
Workman, J.J. and L. Weyer, Practical guide to interpretative near

infrared spectroscopy. 2008, Boca Raton: CRC - Press.
61
60.
Draper, N.R. and H. Smith, Applied Regression Analysis. 1998, Nova

Jersey: John Wiley & Sons.
61.
Resende, M.F.S., Queijo Minas Artesanal da Serra da Canastra:

Influncia da altitude e do nvel de cadastramento das queijarias nas
caracteristcas fsico-qumicas e microbiolgicas, in Tecnologia e
inspeo animal. 2010, Minas Gerais: Belo Horizonte. p. 72.
62.
Nogueira, M., G. Lubachevsky, and S. Rankin, Study of the volatile

composition of Minas cheese. LWT-Food Science And Technology,
2005. 38: p. 555-563.
63.
MINAS GERAIS. Assemblia Legislativa do Estado de Minas Gerais.

Decreto n 44.864 de 01 de agosto de 2008. Altera o regulamento da lei
n 14.185 de 31 de janeiro de 2002, que dispe sobre o processo de
produo do queijo Minas artesanal. Belo Horizonte: Assemblia
Legislativa.
64.
MINAS GERAIS. Assemblia Legislativa do Estado de Minas Gerais.

Decreto n 42.645, de 05 de junho de 2002. Aprova o regulamento da
Lei n 14.185, de 31/01/2002, que dispe sobre o processo de produo
de queijo Minas artesanal.
65.
Patil, A.G., et al., Nondestructive estimation of fatty acid composition in

soybean [Glycine max (L.) Merrill] seeds using Near-Infrared
Transmittance Spectroscopy. Food Chemistry, 2010. 120: p. 1210-1217.
66.
Ferro, M.F., et al., LS-SVM: uma nova ferramenta quimiomtrica para

regresso multivariada. Comparao de modelos de regresso LS-SVM
e PLS na quantificao de adulterantes em leite em p empregando
NIR. Qumica Nova, 2007. 30: p. 852-859.
67.
Arajo, M.C.U., et al., The successive projections algorithm for variable

selection in spectroscopic multicomponent analysis. Chemometrics and
Intelligent Laboratory Systems, 2001. 57: p. 65-73.
68.
Ranalli, N., S.C. Andrs, and A.N. Califano, Physicochemical and

rheological characterization of dulce de leche. Journal of Texture
Studies, 2012. 43: p. 115-123.
69.
Sena, M.M., M.G. Trevisan, and R.J. Poppi, PARAFAC: uma ferramenta
quimiomtrica para tratamento de dados multidimensionais. Aplicaes
na determinao direta de frmacos em plasma humano por
espectrofluorimetria. Qumica Nova, 2005. 28: p. 910-920.
70.
Andersen, C.M. and R. Bro, Practical aspects of PARAFAC modeling of

fluorescence excitation-emission data. Journal of Chemometrics, 2003.
17: p. 200-215.
71.
Huang, J., et al., Multi-way methods in image analysisrelationships and

applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 2003.
66: p. 141-158.
72.
Godinho, M.S., A.E. Oliveira, and M.M. Sena, Determination of interfacial

tension of insulating oils by using image analysis and multi-way
calibration. Microchemical Journal, 2010. 96: p. 42-45.
62
9 Anexos
Anexo 1 Projeto de Doutorado
Anexo 2 Resumos apresentados em Congressos
Anexo 3 Artigos submetidos e em fase de finalizao
63

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS UFMG

INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS ICEX

Aplicao de estatstica multivariada no

Admisso no programa: 2/2010

Aluno: Bruno Gonalves Botelho

1.2 OBJETIVOS GERAIS E ESPECFICOS

2. REVISO BIBLIOGRFICA .......................................................................... 3

2.2 ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL

2.2.1 OSCILAO HARMNICA E ANARMNICA ......................................................... 4

2.4.1 CALIBRAO MULTIVARIADA .......................................................................... 7

2.5.1 DETECO DE AMOSTRAS ANMALAS (OUTLIERS) ......................................... 10

3.3 MATERIAL E MTODOS

3.3.1 EQUIPAMENTOS E SOFTWARES .................................................................... 20

3.4.1 DESENVOLVIMENTO DO MODELO PLS .......................................................... 22

3.4.2 OTIMIZAO DOS MODELOS PELA DETECO DE AMOSTRAS ANMALAS .......... 25

4.3 MATERIAL E MTODOS

4.3.1 EQUIPAMENTOS E SOFTWARES ................................................................... 39

4.4.1 DESENVOLVIMENTO DO MODELO PLS .......................................................... 40

5. MODELOS EM DESENVOLVIMENTO ........................................................ 49

5.2 MATERIAL E MTODOS

5.2.1 EQUIPAMENTOS E SOFTWARES ................................................................... 51

5.3.1 DETECO DE AMOSTRAS ANMALAS E OTIMIZAO DO MODELO ................... 53

6. CONCLUSES GERAIS ............................................................................. 56

Figura 17 - Carta de controle para estabilidade do modelo de determinao de

Lista de siglas e abreviaes

1.2 Objetivos gerais e especficos

determinao de parmetros fiscais em produtos de origem

Validar estes modelos multivariados de acordo com a legislao

Implementar os modelos desenvolvidos nas anlises de rotina do

espectroscpicas foram realizados por W. W. Coblentz, em 1905. Coblentz

de absoro a grupos qumicos especficos. De forma geral, o movimento

onde k a fora da ligao, r a distncia internuclear durante a vibrao, re

onde a massa reduzida m dada por

A partir das equaes 2 e 3 possvel verificar que a frequncia

Entretanto, o modelo do oscilador harmnico no adequado a maiores

Figura 1 Representao esquemtica do comportamento harmnico e

fundamentais. Ao contrrio do MIR, a regio do NIR contm quase que

2.3 Espectroscopia no Infravermelho prximo (NIR)

eletromagnticas no infravermelho prximo com seus componentes [4].

microprocessadores, na dcada de 1980, que resultou em equipamentos

2.4.2 Mnimos quadrados parciais (PLS)

massa/carga ou valores de diferentes propriedades) Y pode ser um vetor (y) n

Onde T e U so as matrizes de escores das matrizes X e Y,

Os valores de (* so agrupados na matriz diagonal B, que contm os

coeficientes de regresso entre as matrizes de escores T de X e U de Y. A

Uma etapa crucial nesse processo a definio de h (nmero de

2.4.3 Quimiometria aplicada anlise de alimentos

torna invivel a utilizao do NIR para a determinao de microcontaminantes,

2.5 Validao analtica multivariada

Figura 2 Representao vetorial do NAS

partir do vetor de regresso de um modelo PLS com A variveis latentes (VL),

A norma (ou mdulo) de cada vetor fornece um :;<

amostra, que anlogo a um sinal de analito seletivo univariado [21, 26].

O NAS um conceito til na validao analtica multivariada porque

do analito ou propriedades (Y).

> 234 = ?@7 ?@

Em seguida, o modelo de regresso expresso como na equao 7,

2.5.3 Figuras de mrito (FOM)

pseudounivariada, introduzida na seo 2.5.2 podem tambm ser usados para

fins de controle de qualidade. Ela apenas quantifica quanto do sinal analitico

Uma vez que a SEN dependente da tcnica analtica empregada,

O inverso de (-1) fornece uma estimativa da diferena de concentrao

e DE1 so os valores de referncia e preditos para a propriedade de

interesse, respectivamente, e :V o nmero de amostras no conjunto de