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AVALIAO DA PRODUO DE

ETANOL EM TEMPERATURAS
ELEVADAS POR UMA LINHAGEM
DE S. CEREVISIAE

CRISLA SERRA SOUZA

Tese (Doutorado) apresentada ao


Programa de Ps-Graduao
Interunidades em Biotecnologia
USP/Instituto Butantan/IPT, para
obteno do Ttulo de Doutora
em Biotecnologia.

So Paulo
2009

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza

AVALIAO DA PRODUO DE ETANOL


EM TEMPERATURAS ELEVADAS POR
UMA LINHAGEM DE S. CEREVISIAE

CRISLA SERRA SOUZA

Tese (Doutorado) apresentada ao


Programa
de
Ps-Graduao
Interunidades
em
Biotecnologia
USP/Instituto
Butantan/IPT,
para
obteno do Ttulo de Doutor em
Biotecnologia.
rea de concentrao: Biotecnologia
Orientadora: Prof. Dr. Ceclia Laluce

So Paulo
2009

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Resumo

RESUMO
SOUZA, C. S. Avaliao da produo de etanol em temperaturas elevadas por
uma linhagem de S. cerevisiae. 2009. 155 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia)
Programa de Ps-Graduao Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto
Butantan/IPT, So Paulo, 2009.

A metodologia de superfcie de resposta foi utilizada como uma ferramenta para


otimizar as condies de produo mxima de etanol com maior reteno de
viabilidade da linhagem de S. cerevisiae 63M em processo descontnuo. As
condies de concentrao de sacarose, inculo e temperatura foram avaliadas em
Erlenmeyers utilizando um planejamento fatorial completo 23 seguido de um
planejamento de superfcie de resposta 23 e as melhores condies obtidas foram:
200 g.L-1 de sacarose, 40 g.L-1 de inculo a 30 C resultando em uma produo de
etanol de 82,7 g.L-1 com viabilidade de 90% aps 4 horas de fermentao.
Processos

descontnuo,

descontnuo alimentado

com

vazo constante

alimentado por pulsos foram avaliados para a linhagem 63M em mini-reatores


contendo meio sinttico e o processo que apresentou maior viabilidade (99%), alta
produtividade (18,6 g.L-1.h-1) e alto rendimento (99,2%) foi o descontnuo
alimentado por cinco pulsos de volumes decrescentes de sacarose a 30 C. A
reduo da concentrao de sacarose na alimentao foi uma estratgia que
permitiu aumentar a temperatura da fermentao at 37 C sem perdas em
viabilidades. Uma linhagem utilizada nas destilarias brasileiras foi comparada com
a linhagem 63M em temperaturas elevadas e observou-se que a 63M produziu uma
maior concentrao final de etanol em menor tempo e conseqentemente maior
produtividade e rendimento. A reduo do inculo para 20 g.L-1 permitiu alongar o
tempo de fermentao a 37 C, de 3 horas para 6 horas, mas sem ganhos em
viabilidade. Oito ciclos sucessivos de fermentao com reutilizao de clulas da
linhagem 63M foram realizados em meio sinttico em processo descontnuo
alimentado por pulsos de sacarose (150 g.L-1) e inculo de 20 g.L-1 a 37 C e uma
perda gradual de viabilidade foi observada (at 30% no 8 ciclo), mas o etanol final
permaneceu constante (ao redor de 70 g.L-1) em todos os ciclos.
Palavras-chave: S. cerevisiae. Produo de etanol. Metodologia de superfcie de
resposta.

Temperaturas

elevadas.

Ciclos

sucessivos

de

fermentao.

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Crisla S. Souza
Abstract

ABSTRACT
SOUZA, C. S. Evaluation of ethanol production at high temperatures by a strain of
S. cerevisiae. 2009. 155 f. Doctor thesis (Biotechnology) - Programa de PsGraduao Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, So Paulo,
2009.

Surface response methodology was used as a tool to optimize the conditions of


maximum ethanol production with high viability retention of strain 63M of S.
cerevisiae in batch culture. Sucrose concentration, inoculum and temperature
conditions were evaluated in Erlenmeyers flasks using a 23 complete factorial
planning

followed by a 23 response surface planning and the best obtained

conditions were: 200 g.L-1 sucrose, 40 g.L-1 inoculum at 30 C, resulting in 82.7 g.L-1
ethanol production with 90% viability after 4 hours of fermentation. Simple batch,
fed-batch of constant flow and pulse fed-batch cultures were compared using strain
63M in mini-reactors containing synthetic medium and the process showed the
highest viability (99%), productivity (18,6 g.L-1.h-1) and high yield (99.2%) was pulse
fed-batch using five decreasing pulses of sucrose at 30 C. The reduction of the
sucrose concentration in the feeding was a strategy that allowed increasing the
temperature of the fermentation up to 37 C without losses in viabilities. An
industrial strain BG1 used in Brazilian distilleries was compared with strain 63M in
fermentations at high temperatures and it was observed that strain 63M produced a
higher final ethanol concentration in shorter time with higher productivity and yield.
Decreasing the inoculum to 20 g.L-1 (dry mass) allowed increasing the fermentation
time at 37 C, from 3 hours to 6 hours, but without increase in viability. Eight
successive cycles of fermentation with reuse of cells of strain 63M were carried out
in synthetic medium in fed-batch process using sucrose pulses (150 g.L-1) and an
inoculum of 20 g.L-1 at 37 C. A gradual and decreasing viability was observed (up
to 30% in the 8 cycle), but the final ethanol was kept constant (70 g.L-1) though the
eight fermentation cycles.

Key words: S. cerevisiae. Ethanol production. High temperatures. Response


surface methodology. Successive cycles of fermentation.

Introduo e Reviso
de Literatura
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Introduo e Reviso de Literatura

1 INTRODUO E REVISO DE LITERATURA


1.1 ASPECTOS GERAIS
A produo de etanol muito importante para a economia nacional. Assim,
faz-se necessrio conhecer as leveduras, as diversas formas de estresse (alcolico,
trmico, osmtico) que as clulas so submetidas, as formas de respostas das
leveduras aos estresses (protenas de choques trmicos), os tipos de processos de
fermentao que podem ser utilizados, incluindo vantagens e desvantagens, e por
fim a importncia do uso do planejamento estatstico na otimizao do processo
escolhido.
1.1.1 Etanol: Importncia e papel na economia brasileira
O etanol utilizado como combustvel nos motores de ciclo Otto,
especificamente no setor de transporte rodovirio. Conhecido desde a antigidade,
tanto como parte da cerveja dos egpcios como no vinho dos povos da Mesopotnia
e da Grcia, o lcool ocupou lugar de destaque nas mais variadas culturas. Tanto
como produto resultante da fermentao do arroz, na China, quanto do milho, no
Imprio Inca no Peru, o conhecimento envolvido na fabricao do etanol era
guardado a sete chaves, dada a importncia das bebidas, e seu uso no preparo de
remdios, especialmente na conservao de plantas medicinais. O etanol
produzido a partir de cana-de-acar, cereais, tubrculos como beterraba e
mandioca, entre outros derivados agrcolas (UNICA, 2007).
O Brasil foi o primeiro pas a produzir a bioenergia em larga escala, com a
implementao do Programa Nacional do lcool (PROLCOOL) pelo decreto n
76.596/73 do Governo Federal datado de 1973. Este programa trouxe diversos
benefcios, como o desenvolvimento rural e a criao de um combustvel que
colabora com a reduo da poluio ambiental (PARRO, 1996). O Brasil lanou em
2003, o automvel flex-fuel que movido tanto pelo etanol quanto pela gasolina. Em
2004, esse tipo de automvel representou 21,6% do total de carros vendidos,
enquanto que em 2005 a cifra de 61,7% de carros vendidos e atingiu em 2007 o
correspondente a 90% das vendas de automveis (JORNAL DA CANA, 2007)

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A produo de lcool etlico no Brasil chegou a 17,5 bilhes de litros na safra


2006/2007, das quais trs bilhes de litros foram exportados, sendo o restante
consumido pelo mercado interno (JORNAL DA CANA, 2007). Devido ao alto custo
da gasolina, o etanol est ganhando abertura para tornar-se uma importante matriz
energtica mundial e renovvel.
1.1.2 Leveduras utilizadas nas destilarias brasileiras
A maioria das unidades produtoras de etanol, tradicionalmente iniciava a safra
usando toneladas de levedura oriunda da indstria de panificao at meados dos
anos 90. Essa estratgia permite uma partida rpida e mais segura minimizando
possveis problemas relativos a acidentes fermentativos. A partir dos anos 90,
constatou-se que as leveduras utilizadas como inculo so completamente
substitudas por leveduras nativas ainda no incio da safra (ANDRIETTA et al.,
2006). Constatou-se ainda que a nica levedura que tem a capacidade de
permanecer no processo aquela isolada da mesma unidade em safras anteriores
(BASSO et al., 1993).
A partir dessa constatao, as usinas comearam a propagar a sua prpria
levedura para o incio da safra. As unidades se equiparam de modo a serem aptas a
realizarem a propagao de sua prpria levedura nativa para o incio da
fermentao. Parte dessas unidades realiza uma anlise de cariotipagem para
constatar a permanncia dessa linhagem nas dornas de fermentao durante a
safra. Os resultados confirmam o esperado, isto , quando as leveduras utilizadas
como inculo so as isoladas da prpria unidade, essas dominam o processo at o
final do perodo da safra (ANDRIETTA et al., 2006). Nos meados dos anos 50, o
professor Jayme Rocha de Almeida (1905-1964), do Instituto Zimotcnico da
Universidade de So Paulo (ESALQ) isolou uma levedura eficiente IZ-1940
(AMORIM, 2005), que foi distribuda para as usinas no incio das safras. A
dificuldade na obteno de grandes volumes desse fermento desestimulou as usinas
fazerem uso desse fermento, passando a utilizar fermento de panificao para a
partida da planta.
Atualmente existe o fornecimento por unidades produtoras de biomassa, de
grandes volumes de leveduras previamente isoladas de unidades brasileiras durante
o perodo da safra. Essas leveduras foram isoladas do prprio processo, sendo
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assim consideradas nativas. Essas so utilizadas como inculo tanto para as


unidades das quais foram isoladas como para outras unidades. Algumas linhagens
de S. cerevisiae isoladas de processos de fermentao alcolica so largamente
utilizadas como inculo para incio das safras brasileiras. Essas foram nomeadas
com as iniciais das unidades de origem, dessa forma tm-se disponveis as
seguintes linhagens: BG-1 (Usina Barra Grande), CR-1 (Usina Cresciumal), AS-1
(Usina Santa Adlia), CAT-1 (Usina Catanduva), PE-2 (Usina da Pedra), CL (Usina
Clealco), entre outras. Embora a utilizao de uma levedura qualquer selecionada
seja uma alternativa vivel para o incio da safra, o uso de leveduras provenientes
do prprio processo a expectativa para o futuro das usinas brasileiras. A
estabilidade microbiolgica em relao s leveduras do processo de produo de
lcool est relacionada utilizao de inculo de uma levedura isolada do prprio
processo (STROPPA, 2002).

1.1.3 Leveduras termotolerantes


S. cerevisiae uma levedura mesoflica (20-40 C) utilizada em muitos
processos industriais, tais como produo de bebidas alcolicas, biomassa
(panificao, alimento) e vrios produtos do metabolismo (DEMAIN et al., 1998). A
produo de etanol combustvel a partir do melao de cana-de-acar por linhagens
termotolerantes (de ambientes terrestres) de leveduras, merece ateno especial
por estas cepas de leveduras serem capazes de crescerem e fermentarem durante
os meses de vero em pases no-tropicais, bem como em pases tropicais,
reduzindo, assim, os custos com a refrigerao dos fermentadores. Por outro lado,
uma concentrao mais alta de etanol produzido a temperaturas elevadas poderia
minimizar os gastos com a destilao (UENO et al., 2003). O nmero de tentativas
para obter leveduras capazes de crescerem e fermentarem a 40 C ou acima desta
temperatura pequeno (UENO et al., 2001). Um programa de screening e
isolamento de leveduras foi financiado pela Fundao do Banco do Brasil no perodo
de 1985 a 1993. Leveduras amilolticas e termotolerantes foram isoladas e
transferidas para Fleishman & Royal para a produo de leveduras de panificao
em 1985. Dentro deste mesmo programa foram realizados estudos de estabilidade
gentica e obteno de hbridos melhorados de leveduras (PERES et al., 2001).
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Alguns pesquisadores descreveram a obteno de leveduras termotolerantes por


fuso de protoplastos (SEKI et al., 1983; KIDA et al.,1992) e cruzamentos entre
leveduras haplides (KAWAMURA, 1999). Com relao origem das amostras para
seleo de leveduras termotolerantes, duas situaes parecem ser comuns.
Primeiro, a seleo tem sido realizada dos tanques de fermentao de cervejarias
ou leveduras de destilarias (HACKING et al., 1984; DAMORE et al., 1989). Em
segundo lugar, os isolados tm sido obtidos de ambientes naturais, especialmente
das regies quentes. Linhagens termotolerantes de Kluyveromyces marxianus
capazes de crescerem a 52 C e de fermentarem a 50 C foram isoladas de
amostras de solo ao redor de destilarias da ndia (BANAT et al., 1992) e suas
caractersticas foram estudadas (FLEMING et al., 1993; BARRON et al., 1994;
BRADY et al., 1994; HACK e MARCHANT 1998). Uma destas leveduras foi tambm
testada em fermentadores para produo de etanol usando melao de cana-deacar (SINGH et al., 1998) com bons resultados.

1.2 PROCESSOS DE PRODUO DE ETANOL


O etanol pode ser produzido por quatro principais tipos de operaes
industriais: processo descontnuo, descontnuo alimentado, semicontnuo e contnuo
(KEIM, 1983).
1.2.1 Processo descontnuo
Na fermentao em processo descontnuo (ou batelada), o substrato e as
clulas da levedura so adicionados juntos ao bioreator (KEIM, 1983), sendo
efetuado um inculo por tanque (SCHMIDELL e FACCIOTTI, 2001). O nico material
adicionado e removido durante a fermentao em batelada a troca de gases e as
solues para controle de pH e anti-espumantes. Terminada a fermentao,
descarrega-se a dorna e o meio fermentado segue para os tratamentos finais. Ento,
deve-se lavar a dorna, esteriliz-la e recarreg-la com mosto e inculo. Uma das
vantagens da operao em batelada (processo descontnuo) a maior flexibilidade
que pode ser alcanada usando um bioreator para vrias especificaes de produtos
(AYLAK e SUKAN, 1996). Este processo mais utilizado na indstria de alimentos.
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Alguns dos alimentos e bebidas produzidos por esse processo fermentativo so:
iogurte, chucrute, picles, cerveja, vinho, entre outros. Por outro lado, a principal
desvantagem da fermentao descontnua o tempo gasto entre as bateladas,
compreendendo a carga e descarga do fermentador, a limpeza, esterilizao e a
reincio do processo (REVIEW, 2007). Outra desvantagem que a fermentao em
processo descontnuo pode levar a baixos rendimentos e/ou produtividades, quando
o substrato adicionado de uma vez s no incio da fermentao exerce efeitos de
inibio, represso ou desvia o metabolismo celular para formao de produtos que
no interessam (CARVALHO e SATO, 2001b). Segundo uma referncia que trata de
um cultivo descontnuo (GRUBB e MAWSON, 1993), os cultivos em bateladas
apresentaram algumas limitaes mesmo para diversas leveduras termotolerantes.
Um rendimento de etanol alto requer alta concentrao inicial de acar e isto gera
uma alta presso osmtica do meio sobre as clulas. A adio gradual de acar no
meio conforme sugerido por Melle-Boinot (SCHIMIDELL e FACCIOTTI, 2001),
minimiza os efeitos da presso osmtica e dos nveis altos de etanol produzido. Por
outro lado, a combinao da alta concentrao de acar com a elevao da
temperatura pode inibir o crescimento (GRUBB e MAWSON, 1993). O efeito da
presso osmtica alta pode ser observado em destilarias brasileiras quando a
concentrao de acar do mosto maior ou igual a 250 g.L-1. Dependendo do nvel
de etanol nas dornas de fermentao, pode ocorrer diminuio da tolerncia
temperatura (DAMORE et al., 1990; LYND et al., 1991). Por outro lado, leveduras
termotolerantes pertencendo principalmente aos gneros de Saccharomyces e
Kluyveromyces tm sido crescidas em condies de bateladas simples produzindo
concentraes de etanol variando entre 4-8% (m/v) (HUGHES et al., 1984;
HACKING et al., 1984; ANDERSON et al.; 1986; SZCZODRAK e TARGONSKI,
1988; DAMORE et al., 1989; BALLESTEROS et al., 1991; BANAT et al., 1992;
FLEMING et al., 1993; BARRON et al., 1994; BRADY et al., 1994; BANAT e
MARCHANT, 1995; BANAT et al., 1996).
Em escala industrial, o processo descontnuo foi adaptado tendo em vista
otimizar a produo, de modo a atender o objetivo de diferentes indstrias
(BORZANI, 1975). No caso das destilarias de lcool, o processo com recirculao de
microrganismo foi utilizado e como o prprio nome indica, usa como inculo o
microrganismo da batelada anterior. Para isto, o meio fermentado centrifugado,
separando assim as clulas e reutilizando-as. No entanto, como h a tendncia de
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aumentar o nmero de contaminantes a cada nova batelada, as usinas normalmente


empregam uma metodologia para elimin-los. Consiste num tratamento do leite de
levedura (suspenso de leveduras altamente concentrada, obtida a partir da
centrifugao do meio fermentado) com gua e cido sulfrico. Deixado nessas
condies, sob agitao por 2 a 3 horas, proporciona a eliminao de
contaminantes, bem como de clulas que j se apresentam em fase de degenerao
(CARVALHO e SATO, 2001b).
1.2.2 Processo semicontnuo
Em processos semicontnuos, uma poro da cultura coletada em intervalos
de tempos e o meio fresco adicionado ao sistema. Nos processos semicontnuos
h variao no volume da cultura. Este mtodo tem algumas vantagens sobre as
operaes contnuas e de bateladas. No h necessidade de ter um frasco separado
para o inculo, exceto no incio. O tempo tambm no desperdiado para limpeza
e re-esterilizao. Outra vantagem desta operao que no requerido muito
controle. No entanto, h um alto risco de contaminao e mutao devido aos
longos perodos de cultivos e as operaes manuais. Alm disso, so necessrios
reatores de volumes maiores e os custos de investimento so levemente mais
elevados (AYLAK e SUKAN, 1996).
1.2.3 Processo descontnuo alimentado
O processo descontnuo alimentado (ou batelada alimentada) definido como
uma tcnica onde um ou mais nutrientes so adicionados ao fermentador durante o
cultivo e os produtos permanecem no fermentador at o final da fermentao. Em
alguns casos, todos os nutrientes so gradualmente adicionados dorna
(CARVALHO e SATO, 2001a). Outros autores (BROWN, 1990; WHITAKER, 1980)
estendem esse conceito para o acrscimo de aditivos. A vazo de alimentao pode
ser constante ou variar com o tempo (KELLER e DUNN, 1978) e a adio de mosto
pode ser de forma contnua ou intermitente. Mudana de volume pode ou no
ocorrer, dependendo da concentrao de substrato e da taxa de evaporao do
sistema (CARVALHO e SATO, 2001a). Devido flexibilidade de utilizao de
diferentes vazes de enchimento de dornas com o meio nutriente, possvel
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controlar a concentrao de substrato no fermentador, de modo que, por exemplo, o


metabolismo seja deslocado para uma determinada via metablica, levando ao
acmulo de um produto especfico (CARVALHO e SATO, 2001a).
A principal vantagem do sistema descontnuo alimentado que a inibio e
represso de catablitos so impedidas por alimentao intermitente do substrato.
Se o substrato tem um efeito inibitrio, a adio intermitente melhora a produtividade
da fermentao pela manuteno de uma concentrao baixa de substrato.
essencial manter o volume da cultura constante na operao contnua, enquanto
que no processo descontnuo alimentado h variao no volume do meio. Para
solucionar estes problemas surgidos com o uso de leveduras termotolerantes em
processo descontnuo, a tcnica de cultura em processo descontnuo alimentado
geralmente tem sido utilizada. Neste sistema, parte do problema de alta
concentrao inicial de acar pode ser solucionada atravs da adio gradual do
substrato por certo perodo a partir do incio da cultura. Esta forma de alimentao,
entretanto, no parece reduzir os efeitos inibitrios do acmulo de etanol na cultura
(BANAT et al., 1998).
Com outra viso, pode-se definir o processo descontnuo alimentado como
um processo no qual as clulas separadas por centrifugao so retornadas ao
volume de reao, a fim de se iniciar um novo perodo de alimentao, o que evita o
preparo de um novo inculo. No processo descontnuo alimentado repetido, certa
frao do lquido fermentado retirada, iniciando-se ento um novo perodo de
alimentao.
Em grande escala, h a possibilidade de combinaes de processos, a fim de
se conseguir o mximo de desempenho de um dado sistema, como por exemplo, o
caso da fermentao alcolica executada segundo o processo de Melle-Boinot.
Neste processo, ao trmino de uma fermentao, o vinho separado por
centrifugao, retornando-se as clulas ao reator aps tratamento adequado para
diminuir os contaminantes das leveduras. A seguir, inicia-se a alimentao com o
mosto a ser fermentado (na verdade, a introduo do inculo e a alimentao de
mosto ocorrem simultaneamente desde o incio do processo), e assim, o processo
operado na forma de um reator descontnuo alimentado na maior parte do tempo.
Quando as dornas encontram-se preenchidas, aguarda-se tempo suficiente para o
consumo total dos acares fermentescveis (SCHMIDELL e FACCIOTTI, 2001).
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1.2.4 Processo contnuo


No processo contnuo, o material nutriente (o qual contm a fonte de carbono
e outros nutrientes) bombeado continuamente dentro de um frasco agitado, onde
os microrganismos esto ativos e ao mesmo tempo, o produto retirado do sistema.
Neste tipo de processo, essencial manter um volume de cultura constante. O
produto, o qual retirado do topo de um bioreator, contm etanol, clulas e acar
residual (AYLAK e SUKAN, 1996). A manuteno de volume constante de lquido
no reator de primordial importncia, a fim de que o sistema atinja a condio de
estado estacionrio, condio na qual as variveis de estado (concentrao de
clulas, de substrato limitante e de produto) permanecem constantes ao longo do
tempo de operao do sistema (FACCIOTTI, 2001).
As principais vantagens do processo contnuo de fermentao (FACCIOTTI,
2001), em relao ao descontnuo tradicional, so decorrentes da operao em
estado estacionrio, dentre eles esto: a) aumento de produtividade do processo,
em virtude de uma reduo do tempo morto ou no-produtivo; b) obteno de
caldo fermentado uniforme, o que facilita o projeto das operaes de recuperao do
produto de interesse; c) manuteno das clulas em um mesmo estado fisiolgico, o
que torna o processo contnuo uma excelente ferramenta para estudos de
mecanismo de regulao metablica (MARTINI et al., 1989; SCHMIDELL e
FACCIOTTI, 1994) ou, ainda, para estudos de otimizao da composio de meio
de cultura (GOLDBERG e ER-EL, 1981; KUHN et al., 1979; MATELES e BATAT,
1974; YEE e BLANCH, 1993); d) possibilidade de associao com outras operaes
contnuas de linha de produo; e) maior facilidade no emprego de sistemas de
controle mais sofisticado; f) menor necessidade de mo-de-obra.
O processo contnuo possui algumas desvantagens ou problemas prticos
(FACCIOTTI, 2001), que podem limitar o emprego deste tipo de sistema em escala
industrial, para alguns processos fermentativos. Assim, podem-se destacar: a) maior
investimento inicial da planta; b) possibilidade de ocorrncia de mutaes genticas
espontneas, resultando na seleo de mutantes menos produtivos; c) maior
possibilidade de ocorrncia de contaminaes por se tratar de um sistema aberto, no
entanto, necessita de manuteno de condies de assepsia nos sistemas de
alimentao e retirada de meio; d) dificuldades de manuteno de homogeneidade
no reator, quando se trabalha com baixas vazes, ou quando o caldo adquire
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comportamento pseudoplstico, como o caso do cultivo de fungos filamentosos; e)


dificuldades de operao em estado estacionrio em determinadas situaes
(formao de espuma, crescimento de microrganismo nas paredes do reator, ou
ainda, nos sistemas de entrada e sada de lquidos).
Apesar dos problemas acima mencionados, a utilizao do processo contnuo
de fermentao encontra grande aplicao prtica, como por exemplo, a
fermentao alcolica, onde se utiliza normalmente, em escala industrial, o processo
contnuo com reciclo de clulas ou, ainda, o processo contnuo em mltiplos
estgios (FINGUERUT, 1993), permitindo, desta forma, a obteno de elevados
rendimentos e produtividades do processo.
1.3 FERMENTAO ALCOLICA
A levedura realiza a fermentao do acar com o objetivo de conseguir
energia qumica necessria sua sobrevivncia, sendo o etanol somente um
subproduto desse processo. Portanto, desejvel produzir tanto lcool, quanto
conhecer as condies ideais para as leveduras produzirem etanol com maior
eficincia. O etanol s formado pelas leveduras a partir de monossacardeos,
sendo necessrio decompor a sacarose, C12H22O11, em D-glicose e D-frutose. Na
fermentao alcolica, estes microrganismos fornecem a enzima invertase, que
hidrolisa a sacarose. A reao da inverso demonstrada abaixo:
C12H22011 + H2O

invertase

C6H1206 + C6H1206
D-glicose

D-frutose

Dois ciclos distintos que definem o processo de transformao de acares


solveis em molculas menores pela ao da levedura. O primeiro a gliclise
(ocorre na mitocndria) que possui a funo de quebrar a molcula de glicose at
cido pirvico, atravs de uma srie de reaes catalisadas por enzimas
especficas, que se situam na parede celular e no interior da clula. Na ausncia de
oxignio h uma tendncia atuao das enzimas piruvato descarbosilase e lcooldesidrogenase, produzindo etanol e gua a partir de cido pirvico (ocorre no
citoplasma). A equao de Gay-Lussac faz um balano desta etapa. Porm, na
presena de oxignio h um deslocamento de parte do cido pirvico para o Ciclo
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de Krebs, onde este ser oxidado enzimaticamente a dixido de carbono e gua. Os


balanos globais dos dois ciclos esto nas seguintes equaes:
Equao de Gay-Lussac
C6H12O6 + 2Pi + 2ADP

2C2H50H + 2 CO2 + 2ATP + 2H2O + 57kcal

Ciclo de Krebs
C6H12O6 + 6O2

6CO2 + 6H2O + 38ATP + 688kcal

O rendimento terico (YP/S) para a produo de etanol de 0,511 g/g. Na


prtica, este valor no observado devido a utilizao de parte da glicose para a
produo de glicerol e alcois superiores, substncias necessrias para sntese de
material celular e manuteno da levedura.
Assim, frente a um nmero elevado de reaes catalisadas enzimaticamente
no metabolismo celular, fatores como pH, temperatura, presso, concentrao de
reagentes, micronutrientes, etc. afetam os parmetros cinticos que definem as
taxas de reproduo celular, consumo de substrato e produo de etanol.
1.4 FATORES QUE AFETAM A FERMENTAO ALCOLICA
As clulas de leveduras so submetidas a vrios tipos de estresses medida
que as condies do meio mudam, tanto em ambientes naturais como durante os
processos industriais. Tanto os danos provocados pelo estresse quanto a resposta
da levedura, dependem do tipo e grau do estresse, e da posio da levedura em seu
ciclo de diviso celular no momento em que ocorre o estmulo (FOLCH-MALLOL et
al., 2004). Em geral, as condies adversas, que estes microrganismos enfrentam,
afetam principalmente as estruturas celulares (ex. as membranas) e as diferentes
macromolculas, especialmente os lipdios, protenas e cidos nuclicos, as quais
sofrem modificaes estruturais que danificam suas funes (FOLCH-MALLOL et al.,
2004). Para se defender destas situaes desfavorveis, a levedura responde
rapidamente sintetizando molculas que permitem aumentar o grau de reparo dos
danos causados pelo estresse. Entre as molculas bem caracterizadas esto as
27

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protenas de estresses. Estas respostas a nvel transcricional so importantes para


a sobrevivncia celular e possui vrias vias de transduo de sinais (RUIS e
SCHLLER, 1995).
Durante os ciclos sucessivos de fermentao em processos descontnuos
alimentados, as clulas da levedura Saccharomyces cerevisiae so expostas aos
estresses oxidativos, hiperosmticos, inicos, elevaes de temperaturas e
limitaes por nutrio (QUEROL et al., 2003). O estresse nutricional ocorre nas
clulas em fase estacionria o qual resulta em interrupo do crescimento. Os
fatores que mais afetam a produo de etanol e que esto descritos abaixo so:
temperatura, concentrao de etanol e substrato, pH, oxignio, viabilidade e
contaminao bacteriana que dependendo da concentrao podem causar estresse
cido s clulas e consumir nutrientes podendo levar a srios prejuzos.
1.4.1 Temperatura
A temperatura afeta diretamente a ecologia microbiana e as reaes
bioqumicas da levedura (TORIJA et al., 2003). A temperatura exerce um efeito em
todos os aspectos do crescimento, metabolismo, viabilidade e fermentao das
leveduras. A escolha da temperatura de operao na fermentao alcolica
influenciada tanto por fatores fisiolgicos quanto fsicos, tais como a perda do etanol
por evaporao e a grande formao de espumas a temperaturas elevadas.
Diminuies em produo de etanol em fermentaes de bateladas repetidas
foram observadas quando a temperatura foi gradualmente aumentada de 30 C a 35
C (MORIMURA et al., 1997). No entanto, em um sistema contnuo de produo de
etanol a partir de xarope de cana-de-acar (sistema de cinco reatores em srie,
operando com temperaturas decrescentes), a biomassa e a viabilidade foram mais
altas no ltimo reator em srie quando a temperatura deste foi de 35 C (LALUCE et
al., 2002).
A produo industrial de etanol em destilarias ocorre na faixa de 25-35 C. A
temperatura tima varia entre as leveduras, sendo que as leveduras termoflicas
apresentam temperaturas timas de crescimento acima de 40 C (WALKER, 1998).
Segundo Oliveira (1988), S. cerevisiae em temperaturas elevadas, afeta o
metabolismo da levedura levando a uma diminuio da tolerncia ao etanol e
formao de metablitos secundrios como o glicerol. O efeito inibitrio do etanol
28

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est intimamente relacionado temperatura da fermentao. Segundo S-Correia e


Van Uden (1983), a faixa de melhor resistncia ao etanol para cepas usuais de
Saccharomyces cerevisiae de 13 a 27 C a 11% (v/v) de etanol no mosto. A
tolerncia ao etanol diminui para temperaturas mais baixas que 13 C ou maiores
que 27 C, de forma que a inibio do crescimento do microrganismo ocorre tanto
em processos baixa temperatura (cervejas, champanhes), como em processos
alta temperatura (lcool combustvel, vinhos tintos).
Alm disto, bactrias lticas podem tolerar temperaturas mais elevadas (ex.:
temperaturas timas na faixa de 55 C a 58 C (EPSTEIN e GROSSOWICZ, 1969)
que aquelas toleradas pelas clulas de leveduras (BALAKUMAR et al., 2001).
Assim, a competio das clulas de bactrias e de leveduras pela fonte de carbono
aumenta quando a temperatura se eleva.
A produo de etanol atravs de fermentao no uma alternativa muito
vivel economicamente em climas quentes devido alta energia exigida para manter
a temperatura da fermentao entre 25 e 35 C (BANAT et al., 1992). O controle da
temperatura essencial para maximizar a produo de etanol e prever inativao
irreversvel das clulas de leveduras. Este problema poderia ser amenizado pelo uso
de leveduras termotolerantes (MORIMURA et al., 1997). Fermentaes a 34-40 C
ou acima possuem a vantagem de facilitar a recuperao do etanol com significante
economia relativa dos custos do controle de refrigerao em destilarias de produo
de etanol combustvel, especialmente em pases tropicais (LALUCE et al., 1991).
A termotolerncia pode ser definida como a capacidade transitria das clulas
sobreviverem quando expostas a temperaturas elevadas (LASZLO, 1988). As
leveduras que apresentam termotolerncia intrnseca suportam choques trmicos a
50 C, enquanto que as leveduras que apresentam termotolerncia induzida
resistem a choques trmicos somente quando adaptadas a elevaes suaves de
temperaturas (p. ex., 30 minutos de exposio a 37 C). Outros fatores so capazes
de afetarem a termotolerncia das leveduras e estes so: agentes qumicos, presso
osmtica, valores baixos de pH externo, fase de crescimento, aquisio de
resistncia na fase estacionria e estado nutricional (PIPER, 1993).
As respostas ao estresse trmico em leveduras esto bem estudadas. Um
aumento de 10 a 15 C acima da temperatura tima de crescimento induz a sntese
de um grupo de protenas chamado HSP (Heat Shock Proteins). A maioria das
protenas deste grupo so as proteases e chaperoninas que esto envolvidas em
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impedir a desnaturao ou induzir a renaturao de protenas, a degradao de


protenas com defeito no seu empacotamento e desintegrao de agregados
proticos formados por desnaturao. Algumas destas protenas se encontram
tambm presentes em temperaturas timas e estudos genticos indicam que so
protenas indispensveis para manuteno da estrutura correta da folha pregueada
de outras protenas, unir e separar unidades proticas em estruturas oligomricas e
degradar protenas desnaturadas ou com defeitos na estrutura secundria
(LINDQUIST, 1992).
Em S. cerevisiae, ateno grande tem sido dada famlia das protenas de
choque trmico ou Hsp (SANCHEZ e LINDQUIST, 1990), entre as quais est a
protena Hsp 104 que desempenha um papel chave sobre a tolerncia ao calor e a
outros agentes estressantes (SANCHEZ et al., 1992). As protenas Hsp 104, Hsp 70
e Hsp 40 formam o complexo chaperonina, o qual reverte a conformao de
protenas alteradas pelo calor (GLOVER e LINDQUIST, 1998), restaurando as
atividades essenciais de protenas na clula viva. Um aumento na sntese das
protenas de choque trmico pode tambm ser induzido por condies hipertnicas e
etanol elevado entre muitos outros agentes de estresse (SANCHEZ et al., 1992). A
ubiquitina (protena de baixo peso molecular envolvida com a degradao de
protenas celulares), a gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase da via glicoltica, a
catalase so outras protenas envolvidas com a resposta ao estresse trmico
(WALKER, 1998).
O contedo celular de trealose eleva-se durante o crescimento exponencial
em resposta a mudanas de temperaturas atingindo um valor mximo em fase
estacionria, o qual leva a aquisio da tolerncia ou resistncia ao calor, ao
estresse osmtico e etanlico (ELEUTHERIO et al., 1995). Por outro lado, a
gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase da via glicoltica passa a ser acumulada na
superfcie das clulas sob estresse trmico (DELGADO et al., 2003).
1.4.2 Etanol
Do ponto de vista fisiolgico, o etanol inibe o crescimento e a viabilidade das
leveduras por atuar negativamente sobre os diferentes sistemas de transportes
(incluindo permeases de aminocidos), sobre a sinalizao celular da glicose e a
30

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atividade de enzimas chaves da via glicoltica (ALEXANDRE e CHARPENTIER,


1998; BISSON, 1999).
O etanol parece alterar o grau de polaridade da membrana celular
citoplasmtica, causando interrupo do crescimento em concentraes elevadas
(LYND et al., 1991) e, ainda, aumentando a fluidez da membrana (LLOYD et al.,
1993). Estas alteraes em fluidez resultam em mudanas na permeabilidade das
espcies inicas, principalmente, na permeabilidade de prtons (CARTWRIGHT et
al., 1986). Concentraes elevadas de cidos graxos insaturados na membrana,
vitaminas e protenas parecem aumentar a tolerncia ao etanol. Outros fatores
fisiolgicos, tais como, composio do meio, acmulo intracelular de etanol,
temperatura e presso osmtica podem contribuir para a elevao da tolerncia ao
etanol (DAMORE e STEWART, 1987). A ao da trealose consiste em estabilizar a
membrana e proteger as clulas das leveduras frente aos efeitos do etanol. Assim, a
concentrao intracelular deste dissacardeo tem desempenhado um importante
papel sobre capacidade da clula em tolerar elevadas concentraes de etanol
(MAJARA et al., 1996).
Holzberg et al. (1967) demonstraram que o crescimento celular no inibido
em concentraes de etanol inferiores a 26 g.L-1, mas inibido totalmente quando a
concentrao de etanol atinge 68,5 g.L-1 no meio da fermentao. Luong (1984)
observou que o etanol apresentava efeito significativo sobre a velocidade de
crescimento celular a concentraes acima de 15 g.L-1 e que a concentrao de
etanol mxima a partir da qual as clulas no mais cresciam era aproximadamente
100 g.L-1. Esse mesmo autor tambm verificou que a capacidade de produo de
etanol de Saccharomyces cerevisiae era completamente inibida a uma concentrao
de etanol de 105 g.L-1. Daugulis e Swaine (1987) encontraram valores mximos de
etanol onde as clulas no cresciam mais de 87,5 a 140 g.L-1, para sistemas
utilizando diversas linhagens de leveduras. A anlise desses valores deve ser
cuidadosa, entretanto, uma vez que eles dependem do tipo de microrganismo, do
seu estado fisiolgico, do meio de cultura e da temperatura.
Leveduras isoladas de destilarias mostraram inibio de suas atividades
fermentativas em batelada simples a 30 C quando a concentrao de etanol no
meio foi superior a 8%. Acima de 8% de etanol a fermentao ocorre de forma
gradativamente reduzida. Por outro lado, grandes perdas em biomassa foram
31

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observadas em concentrao de etanol no meio da ordem de 4% (PERES e


LALUCE, 1998).
1.4.3 Substrato (acar)
As linhagens de leveduras normalmente utilizadas nos processos industriais
apresentam uma osmotolerncia limitada. Por esta razo, fermentaes alcolicas
so conduzidas em concentraes de acar usualmente 20% (m/v).
Concentraes elevadas de acar resultam em perdas da atividade de transporte
de acar, produzindo menos etanol (SALMON e MURICO, 1994). O estresse
induzido pelo aumento da osmolaridade externa leva a reduo em crescimento e
perda da viabilidade das clulas das leveduras, devido s perturbaes no gradiente
osmtico atravs da membrana plasmtica. Isto leva, por sua vez, a perdas em
volume das clulas que se contraem (MAGER e VARELA, 1993) por causa de
diferenas em presso osmtica entre o exterior e o interior das clulas.
Quando as clulas de Saccharomyces cerevisiae se encontram em uma
condio de alta osmolaridade externa, sofre uma mudana imediata em seu volume
celular devido perda de gua do citosol. Esta desidratao um processo rpido
(aproximadamente 1 minuto) sendo parcialmente compensada por um influxo de
gua no vacolo para o citoplasma quando ons txicos se acumulam em organelas
(SERRANO, 1996). Para sobreviverem e continuarem a crescer, as clulas
desidratadas podem recuperar a turgncia sempre e quando a intensidade do
estresse for fisiologicamente tolervel. A proliferao celular se renova aps um
perodo de adaptao no qual varia dependendo de um nmero de fatores, como por
exemplo, o tipo e a intensidade do estresse, a gentica da linhagem e sua fase de
crescimento (BLOMBERG, 2000). Nesta fase de adaptao, as clulas de levedura
experimentam uma srie de mudanas como a reestruturao do citoesqueleto de
actina, interrupo transitria do ciclo celular e reprogramao do metabolismo (TAO
et al., 1999). Ao mesmo tempo, mecanismos envolvidos com a resistncia dos
estresses so induzidos, como o aumento na concentrao intracelular de glicerol e
a excluso de ons txicos. Alm disto, se induz a expresso de uma srie de genes
cujos produtos participam de diferentes processos como o potencial redox, a
produo de protenas protetoras e o reajuste dos nveis de carboidratos, lipdios e
aminocidos (REP et al., 2000).
32

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As clulas adaptam-se a concentraes elevadas de NaCl e outros solutos


atravs do acmulo de glicerol interno, por aumento da osmolaridade (BLOMBERG
e ADLER, 1989). O acmulo de glicerol resulta em aumentos da atividade de
glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD1) codificada pelo gene GPD1 (LARSSON et
al., 1993). Alm disso, o acmulo de glicerol estimulado pelo estresse osmtico
requer a expresso de outros dois genes, tais como os genes HOH1 (codifica para
protena mitognica e pertencente famlia das MAP quinases) e PBS2 (codifica
para uma protena componente da famlia das MAP quinases) (BREWSTER et al.,
1993).
A tolerncia das linhagens de leveduras ao estresse osmtico e temperaturas
elevadas pode aumentar atravs do aumento da concentrao de peptona e extrato
de levedura no meio (STEWART et al., 1988). Thomas e colaboradores (THOMAS et
al., 1994) estudaram os efeitos de substncias osmoprotetoras sobre a fermentao
de uma linhagem de cervejaria, S. cerevisiae, numa concentrao muito elevada de
glicose (35%, m/v) e mostraram que quando o meio suplementado por glicina
betana, glicina e prolina, ocorre um aumento na quantidade de acar fermentado.
1.4.4 pH
O pH um fator significativo para as fermentaes industriais devido sua
importncia tanto no controle da contaminao bacteriana quanto ao seu efeito
sobre o crescimento da levedura, taxa de fermentao e formao de subprodutos
(AMORIM et al., 1996).
Os valores de pH dos mostos industriais geralmente encontram-se na faixa de
4,5 a 5,5 com uma boa capacidade tampo (THOMAS et al., 2002), mas as
leveduras mantm uma homeostase de forma quase independente dos valores de
pH do meio, por isso toleram o tratamento cido. O tratamento cido tambm
provoca lixiviao de nutrientes tais como N, P e K da levedura que acaba por elevar
o pH. Embora o tratamento cido se mostre estressante levedura, ainda assim,
apresenta efeito benfico de controlar a contaminao bacteriana, pois ocorre a
reduo significativa no nmero de bactrias (AMORIM et al., 1996).
O pH timo para a produo de etanol por leveduras de S. cerevisiae situa-se,
geralmente, na faixa de 4 a 5. Aumentando-se o pH at 7, observa-se uma
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diminuio do rendimento em etanol, com aumento da produo de cido da


produo de cido actico (MAIA, 1989).
O pH interno da clula se mantm na faixa de 5,8 a 6,9, seja qual for o valor
do pH extracelular na faixa de 2 a 7. Entretanto, baixos valores de pH tornam o meio
mais agressivo, uma vez que exigem das leveduras um maior dispndio de energia
na manuteno do pH interno, alm de afetar as protenas de transporte da
membrana citoplasmtica que ficam expostas ao meio externo. O pH do meio
externo tambm afeta a velocidade de crescimento das leveduras, a qual atinge um
mximo quando o pH est compreendido entre 5 e 6. Na fermentao alcolica, o
estabelecimento e controle do pH do meio em valores inferiores a 5 tambm
considerado importante como meio para prevenir a contaminao por bactrias
lticas e acticas (MAIA, 1989).
1.4.5 Oxignio
A fermentao alcolica inibida na presena de grandes concentraes de
oxignio, fenmeno este denominado Efeito Pasteur. Este efeito est intimamente
associado ao estado fisiolgico da clula, sendo que se manifesta principalmente
nas leveduras que no esto na fase de crescimento (fase estacionria) nas quais
ocorre ntida diminuio do consumo especfico de glicose. Por outro lado, em
clulas na fase de crescimento (fase exponencial), no se observa diferena
significativa quanto velocidade de consumo da glicose entre uma clula aerbia e
outra anaerbia.
O uso de condies microaerbicas (0,5% de saturao) permite aumentar a
utilizao do substrato, aumentando a tolerncia da levedura ao etanol, sem haver
um decrscimo significativo no rendimento em etanol por unidade de substrato
consumido. Tal fato est relacionado sntese de cidos insaturados constituintes
da membrana celular, que depende da disponibilidade de oxignio. Alm de
indispensveis viabilidade celular, os cidos graxos insaturados e esteris
aumentam a permeabilidade da membrana ao etanol (MAIA, 1989).
Apesar do oxignio molecular ter tornado essencial vida durante a evoluo
continua a oferecer perigo para manuteno da viabilidade celular. O nion
superxido (O2-), o perxido de hidrognio (H2O2) e o radical hidroxila (OH) so as
mais importantes espcies de oxignio reativo (ROS) produzidos pelas clulas.
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Estes compostos altamente oxidativos so continuamente formados durante o


metabolismo celular normal atravs das reaes catalisadas por metais em
processos tais como respirao, -oxidao de cidos graxos, bem como, durante
as elevaes em temperatura, etanol e concentraes de agentes qumicos
estressantes (FRIDOVICH, 1981). Os radicais ROS causam danos oxidativos aos
cidos nuclicos, lipdios, protenas, carboidratos e outros componentes celulares
(VALENTINE et al., 1998). Alm disso, alguns dos produtos resultantes de danos
oxidativos sobre lipdios e acares reagem rapidamente com protenas e cidos
nuclicos. Isto resulta em perdas na viabilidade celular e mutagnese. Clulas
requerem sistemas antioxidantes, que elimina o oxignio ativo, para manter um
estado intracelular reduzido. O principal antioxidante a glutationa cujo papel
consiste em proteger as clulas de leveduras contra agentes oxidantes, radicais
livres e agentes alquilantes. Os nveis de atividade de GPX2 (glutationa peroxidase)
aumentam com o estresse oxidativo celular (INOUE et al., 1999). Tais antioxidantes
representam o maior sistema de defesa oxidante no enzimtico das leveduras.
Leveduras tambm possuem mecanismos enzimticos para neutralizar os efeitos
dos radicais de oxignio ativo. A defesa biolgica primria contra os danos
oxidativos envolve os sistemas de proteo das protenas, os quais removem os
radicais ROS ou seqestram os ons metlicos. As defesas secundrias consistem
em enzimas que removem e/ou reparam os componentes dos produtos gerados pela
oxidao (MORADAS-FERREIRA et al., 1996). A enzima antioxidante denominada
superxido dismutase encontra-se envolvida com converso do nion superxido
em O2 e H2O2. A gua oxigenada degradada pela catalase ou peroxidase
(JAMIESON,

1998).

levedura

S.

cerevisiae

possui

duas

isoformas

correspondentes a superxido dismutase (codificada pelo gene SOD), uma


citoplasmtica e dependente de Cu/Zn e outra mitocondrial dependente de Mn
(codificada pelos genes SOD1 e SOD2), as quais tm desempenhado um importante
papel na proteo de leveduras contra a toxidade do oxignio (GRALLA e
VALENTINE, 1991). Alm da elevao da sensibilidade a perxidos e incapacidade
de crescimento das leveduras em certas fontes de carbono, outros diversos defeitos
metablicos (p. ex. auxotrofias relativa lisina e metionina) tm sido tambm,
associados com a deficincia na expresso do gene SOD (CHANG e KOSMAN,
1990).
35

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Embora parea contraditrio, sabe-se hoje que a completa falta de oxignio


no benfica ao processo de produo de etanol (ALFENORE et al., 2004). Nveis
mais altos de rendimentos alcolicos e menos glicerol formado foram obtidos em
culturas nas quais havia certa quantidade de oxignio disponvel.
1.4.6 Viabilidade
A viabilidade celular sem dvida um aspecto importante no controle da
fermentao alcolica. Quanto maior esse nmero melhor ser o desempenho do
processo. Como o ambiente das dornas de fermentao no propriamente ideal
para manuteno da viabilidade celular, um controle minucioso deve ser feito pelas
unidades produtoras de etanol. Milanese-Rubilar e Maugeri (1990) verificaram que a
viabilidade celular dependia da concentrao celular e do tempo de residncia.
Aumentos da temperatura de fermentao produzem uma forte diminuio da
viabilidade celular, devido ao aumento das taxas de produo e acmulo de etanol
no meio e nas clulas. A linhagem 19G, isolada de reatores durante a operao de
uma indstria brasileira, mostrou rendimentos mximos de etanol dentro de uma
faixa de 40 C a 43 C quando fermentou xarope de cana-de-acar 15% (acar
redutor total). No entanto, decrscimos em viabilidades foram observados para esta
linhagem acima de 37 C (LALUCE et al., 1991).
Cysewski e Wilke (1977) observaram que a viabilidade celular diminui
continuamente em anaerobiose, mas permaneceu acima de 95% em aerobiose num
sistema de fermentao a vcuo. As leveduras utilizam o oxignio para produzir
cidos graxos polisaturados e seus precursores, compostos necessrios para a
biosntese de lipdeos constituintes da membrana plasmtica e mitocondrial. A
adio ao meio de cultura de cidos graxos insaturados ou esteris melhora a
tolerncia das leveduras ao etanol, assim, aumenta a viabilidade celular.
A fonte de nitrognio, cido olico e ergosterol desempenham um importante
papel na produo de altas concentraes de etanol em altas velocidades com
manuteno de viabilidade. Diversos autores tm observado que o extrato de
levedura (CASEY et al., 1983; THOMAS e INGLEDEW, 1992; THOMAS et al., 1993;
JONES e INGLEDEW, 1994; BAFRNCOV et al., 1999), amnia (LEAO e VAN
UDEN, 1983; JONES e INGLEDEW, 1994; NIESSEN et al., 2000), magnsio
(DOMBEK e INGRAM, 1986; CIESAROVA et al., 1996; BIRCH e WALKER, 2000) ou
36

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clcio (NABAIS et al., 1988) exercem um efeito protetor sobre o crescimento,


fermentao, ou viabilidade, com estmulo sobre a velocidade de produo de
etanol. Uma suplementao com extrato de levedura melhorou a viabilidade e a
formao de biomassa em fermentaes com alta densidade de clulas (CASEY et
al., 1983).
1.4.7 Contaminao bacteriana
As leveduras da fermentao alcolica competem pelo substrato com
bactrias que normalmente habitam as dornas. Um processo de fermentao
considerado sadio trabalha com nveis de bactrias nunca menores que 105
clulas/mL (ANDRIETTA et al., 2006).
A procedncia dessas a mesma das leveduras nativas, isto , a matria
prima. As fontes de contaminao incluem: a cana-de-acar, as prticas agrcolas,
industrializao, extrao, equipamentos (STUPIELLO, 1993). Entretanto a presena
de bactrias no processo, diferindo das leveduras nativas, nunca benfica para a
fermentao.
Embora o caldo ou o melao diludo sejam um excelente meio de cultivo para
a grande maioria dos microrganismos, quando esse substrato passa a fazer parte do
processo de fermentao suas caractersticas so completamente modificadas. Os
microrganismos habitantes do mesmo, que se beneficiavam de todas as
propriedades no restritivas desse substrato, encontram na dorna de fermentao
um ambiente hostil. Nesse novo ambiente, os microrganismos contaminantes alm
de competir com a levedura de processo tm que apresentar caractersticas que
lhes permitam crescer em condies de altos teores alcolicos e alta acidez. So
alguns representantes dos gneros Lactobacillus e Bacillus que renem as
caractersticas que os colocam como os principais contaminantes do ambiente
fermentativo. Gallo (1989) trabalhou em um extenso levantamento da microbiota
predominante de amostras de todo o ambiente fermentativo. Os resultados obtidos
revelaram que 98,52% das bactrias isoladas eram pertencentes ao grupo das
Gram+. O gnero Lactobacillus foi o mais freqente (59,75%) e o gnero Bacillus
representaram 26,58% do total dos microrganismos isolados. Outros trabalhos
(RODINI, 1985; ROSALES, 1989; SEKI et al., 1989; OLIVA-NETO, 1990) de
37

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levantamento da microbiota de processos fermentativos confirmam os resultados


obtidos por Gallo (1989).
Talvez o maior problema relativo aos altos nveis de contaminao nas dornas
sejam os problemas operacionais que o produto do metabolismo de certas bactrias
cause ao processo. A floculao do fermento o mais srio deles. A falta de
homogeneidade do vinho fermentado faz com que a centrfuga no opere de forma
eficiente provocando srios danos ao processo (ANDRIETTA et al., 2006).
1.5 FERMENTAES COM ALTA DENSIDADE DE CLULAS
O uso de altas densidades de clulas reduz o perodo de fermentao. As
destilarias brasileiras operam com altas concentraes de acar (10-20% de acar
redutor total, m/v) e altas densidades de clulas (10-12% de massa de clulas
midas, v/v). Altas densidades de clulas minimizam os efeitos do substrato e a
inibio pelo produto (RIESENBERG e GUTHKE, 1999), tornando possvel realizar
fermentaes em curtos perodos de tempo. Se a formao de biomassa for
significativa, ocorrer a diminuio na produo de etanol. Em destilarias brasileiras,
o excesso de biomassa obtido no final de cada ciclo de fermentao descartado
antes de iniciar um novo ciclo e usado na preparao de rao para animais
(LALUCE, 1991).
1.6 OTIMIZAO DE PROCESSOS
O planejamento estatstico de experimentos uma ferramenta til para
otimizar os processos onde muitas variveis so envolvidas, possibilitando uma
melhor manipulao dos parmetros, e uma anlise mais representativa dos
resultados (CAZETTA et al., 2005). Os experimentos convencionais, nos quais
apenas uma varivel passa por alteraes com o tempo, no permitem avaliao
dos efeitos combinados de todos os fatores envolvidos no processo. Alm disso, o
estudo de cada varivel, de forma independente, consome muito tempo
experimental. Estas restries podem ser superadas pelo uso de um planejamento
experimental estatstico combinado com a metodologia de superfcie de resposta
(DE FAVERI et al., 2004). A metodologia de superfcie de resposta (MSR) uma
coleo de tcnicas para delinear experimentos, construes de modelos, avaliando
38

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Introduo e Reviso de Literatura

os efeitos dos fatores ou parmetros e encontrando condies timas de fatores


para as respostas desejveis (WANG e LU, 2005). A MSR tem sido extensivamente
aplicada em muitas reas da biotecnologia para otimizao da produo de sorbitol
(CAZETTA et al., 2005), xilitol (DE FAVERI et al., 2004), cido ltico
(KOTZAMANIDIS et al., 2002), cido ctrico (LI et al., 2002) e etanol (SREEKUMAR
et al., 1999).
1.6.1 Planejamento fatorial
O planejamento fatorial muito empregado para avaliar a significncia de
variveis, bem como indicar condies timas para obteno dos melhores
resultados.
Em um planejamento fatorial, inicialmente preciso decidir os nveis
especficos dos valores dos fatores que sero usados nos experimentos. Neste tipo
de planejamento necessrio elaborar vrios experimentos para todas as
combinaes de nveis possveis (FERREIRA et al., 2005). De acordo com SILVA
(1998), o principal objetivo do planejamento fatorial relacionar empiricamente as
variveis dependentes com as variveis independentes, alm disto, descobrir
estatisticamente o efeito de cada varivel sobre a resposta desejvel.
Uma das vantagens do planejamento fatorial consiste no agrupamento das
variveis, o qual reduz o nmero de variveis a ser estudado, ou reduz o nmero de
seus nveis e conseqentemente ajuda a analisar as correlaes entre eles. Assim,
torna-se possvel reduzir consideravelmente o nmero de ensaios experimentais a
ser realizado (FERREIRA et al., 2005).
1.6.2 Metodologia de superfcie de resposta (MSR)
Uma MSR pode ser definida como um mtodo estatstico que utiliza dados
quantitativos de um delineamento experimental adequado para determinar e
simultaneamente solucionar equaes multivariadas. Essas equaes podem ser
representadas graficamente como superfcies de resposta, que podem ser usadas
de trs formas: a) descrever como as variveis em teste afetam as respostas; b)
para determinar as interrelaes entre as variveis em teste; e c) para descrever
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Avaliao da produo de etanol...

efeitos

combinados

de

todas

Crisla S. Souza
Introduo e Reviso de Literatura

as

variveis

em

teste

sobre

resposta

(MONTGOMERY, 2001).
Seguem, abaixo, algumas definies de alguns termos considerados
relevantes:
a) Fatores ou variveis independentes so caractersticas que podem ser
variadas no sistema; por exemplo, concentrao de reagentes, fora inica,
pH, temperatura, etc;
b) Nveis se referem ao grau ou a faixa de variao que um fator no
processo sofrer; exemplo, pH 2-10, tampo acetato 0,0 a 2 mol.L-1;
c) Respostas ou varivel dependente consiste na varivel que nos
interessa e seus efeitos sobre diferentes fatores; por exemplo, produo de
etanol, viabilidade.
Basicamente a MSR um procedimento de quatro etapas:
a) identificar os fatores: o primeiro passo identificar at 5 fatores que
sejam crticos ao estudo, ou seja os fatores responsveis pela maior
variao no processo. Esta etapa presume que o pesquisador conhea
quais so os fatores que influenciam o processo. Se os fatores no forem
conhecidos, experimentos preliminares devem ser realizados para
identificar os principais fatores;
b) definir os nveis: o segundo passo consiste em definir a faixa em que os
fatores esto sendo estudados. Se a faixa for muito ampla corre-se o risco
de no encontrarmos o ponto timo. Neste caso, um segundo
planejamento com uma faixa mais restrita deve ser realizado;
c) escolher o delineamento experimental apropriado: os delineamentos
estabelecem uma ordem de como os experimentos devem ser realizados.
Ao cobrir toda faixa escolhida para o experimento, enfatizam-se os pontos
mais prximos ao ponto mdio (ponto central), ao mesmo tempo em que
um nmero reduzido de experimentos realizado para validao;
d) anlise dos dados: a quarta etapa consiste em analisar os dados usando
um

programa

computacional

adequado.

As

concluses

desses

experimentos devem ser confirmadas por experimentos posteriores nas


condies consideradas timas. Como em qualquer outro estudo
cientfico, os resultados no podem ser extrapolados para alm dos
limites estabelecidos.
40

Avaliao da produo de etanol...

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Introduo e Reviso de Literatura

Fatores que devem ser considerados quando usamos a MSR


O uso efetivo da MSR deve levar em considerao cinco tipos de
presuposies:
a) os fatores que so crticos ao processo so conhecidos;
b) a regio em que os fatores influem o processo conhecida;
c) os fatores variam continuamente ao longo da faixa experimental
escolhida;
d) existe uma funo matemtica que relaciona os fatores resposta
medida;
e) a resposta que definida por essa funo uma superfcie lisa.
A MSR apresenta as seguintes limitaes:
a) grandes variaes dos fatores podem resultar em concluses falsas;
b) os fatores crticos no foram especificados corretamente;
c) a regio de timo pode no ser determinada devido ao uso de uma faixa
muito estreita ou muito ampla de nveis de variao;
d) como em qualquer experimento, resultados distorcidos podem ser
obtidos caso bons procedimentos estatsticos no forem usados, tais
como aleatorizao;
e) superestimar a computao: o pesquisador deve usar de bom senso e
seu conhecimento sobre o processo para chegar a concluses
apropriadas dos seus dados.

41

Concluses
42

Avaliao da produo de etanol...

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Concluses

5 CONCLUSES
Otimizao de condies em processo descontnuo
A otimizao das condies visando obter maior produo de etanol e maior
viabilidade em processo descontnuo foi obtida, com sucesso, atravs da
metodologia de superfcie de resposta (MSR), sendo que os resultados previstos
pelo modelo foram confirmados experimentalmente. As melhores condies obtidas
atravs da MSR foram: 200 g.L-1 de sacarose, 40 g.L-1 de inculo a 30 C,
resultando em 82,7 g.L-1 de etanol e 90% de viabilidade aps 4 horas de
fermentao em meio sinttico em processo descontnuo.
Comparao entre os tipos de alimentao
Utilizando-se concentraes de inculo, sacarose e temperatura resultante do
tratamento estatstico, comparou-se o processo descontnuo com o descontnuo
alimentado com vazo constante e por pulsos. A alimentao por 5 pulsos de
volumes decrescentes de sacarose, permitiu obter maior viabilidade, produtividade e
rendimento.
Efeito da temperatura, concentrao de sacarose no processo alimentado por
pulsos
Quando se elevou a temperatura, observou-se que s foi possvel produzir
etanol com valores elevados de viabilidade em temperaturas elevadas quando a
sacarose adicionada foi reduzida para 150 g.L-1 a 37 C e 100 g.L-1 a 40 C.
Comparao das linhagens 63M e BG1
A linhagem 63M foi comparada em temperaturas elevadas com a BG1,
linhagem utilizada nas destilarias brasileiras, e observou-se que a linhagem 63M foi
melhor por produzir maiores quantidades de etanol, maiores produtividades e
rendimentos, independente da quantidade de sacarose.

43

Avaliao da produo de etanol...

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Concluses

Efeito do tamanho do inculo a 37 C


Um estudo de variao de inculo a 37 C foi realizado e obtive-se que a
reduo do inculo para 20 g.L-1 permitiu alongar o tempo de fermentao de 3
horas para 6 horas, sem ganhos em viabilidade.
Reativao da levedura entre os ciclos de fermentao
O melhor tratamento de reativao foi quando se utilizou gua destilada
enriquecida com 50 g.L-1 de sacarose e 10 g.L-1 de extrato de levedura.
Ciclos sucessivos de fermentao a 37 C
Oito ciclos sucessivos de fermentao com reutilizao de clulas da
linhagem 63M foram realizados em meio sinttico em processo descontnuo
alimentado por pulsos de sacarose (150 g.L-1) e inculo de 20 g.L-1 a 37 C e uma
perda gradual de viabilidade foi observada (at 30% no 8 ciclo), mas uma
regenerao da protena total foi observada a partir do 5 ciclo e o etanol final
permaneceu constante em todos os ciclos ao redor de 70 g.L-1.

44

Referncias
45

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

REFERNCIAS

ALEXANDRE, H.; CHARPENTIER, C. Biochemical aspects of stuck and sluggish


fermentation in grape must. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., v. 20, n. 1, p. 20-27,
1998.
ALFENORE, S.; CAMELEYRE, X.; BEUBADIS, L.; BIDEAUX, C.; URIBELARREA, J.
L.; GOMA, G.; MOLINA-JOUVE, C.; GUILLOUET, S. E. Aeration strategy: a need for
very high ethanol performance in Saccharomyces cerevisiae fed-batch process.
Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 63, n. 5, p. 537-542, 2004.
AMORIM, H. V. Fermentao Alcolica Cincia & Tecnologia. Piracicaba:
Fermentec, 2005. 448 p.
AMORIM, H. V.; BASSO, L. C.; ALVES, D. M. G. Processo de produo de lcool
controle e monitoramento. Piracicaba: FERMENTEC/FEALQ/ESALQ-USP, 1996.
ANDERSON, P. J.; MCNEIL, K.; WATSON, K. High-efficiency carbohydrate
fermentation to ethanol at temperatures above 40 C by Kluyveromyces marxianus
var marxianus isolated from sugar mills. Appl. Environ. Microbiol., v. 51, n. 6, p.
1314-1320, 1986.
ANDRIETTA, M. G. S.; STECKELBERG, C.; ANDRIETTA, S. R. Biotanol Brasil, 30
anos na vanguarda. Multi-Cincia: Revista Interdisciplinar dos Centros e Ncleos da
Unicamp,
v.
7,
p.
1-16,
2006.
Disponvel
em:
<http://www.multiciencia.unicamp.br/intro_07.htm>. Acesso em: 26 set. 2008.
AQUARONE, E.; SATO, S.; BORZANI, W. Non-constant fed-batch ethanol
fermentation of molasses (preliminary tests). Arq. Biol. Tecnol., v. 29, p. 327-335,
1986.
BAFRNCOV, P.; SMOGROVICOV, D.; SLVIKOV, I.; PTKOV, J.; DMNY, Z.
Improvement of very high gravity ethanol fermentation by media supplementation
using Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Lett., v. 21, p. 337-341, 1999.

De acordo com:

ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS TCNICAS. NBR 6023: Informao e documentao: referncias:


elaborao. Rio de Janeiro, 2002.

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

BALAKUMAR, S.; ARASARATNAM, V.; BALASUBRAMANIAM, K. Isolation and


improvement of a thermotolerant Saccharamyces cerevisiae strain. World J.
Microbiol. Biotechnol., v. 17, p. 739-746, 2001.
BALLESTEROS, I.; BALLESTEROS, M.; CABANAS, A.; CARRASCO, J.; MARTIN,
C.; NEGRO, M. J.; SAEZ, F.; SAEZ, R. Selection of thermotolerant yeasts for
simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of cellulose to ethanol. Appl.
Biochem. Biotechnol., v. 28-9, p. 307-315, 1991.
BANAT, I. M.; MARCHANT, R. Characterization and potential industrial applications
of five novel, thermotolerant, fermentative, yeast strains. World J. Microbiol.
Biotechnol., v. 11, n. 3, p. 304-306, 1995.
BANAT, I. M.; NIGAM, P.; SINGH, D.; MARCHANT, R.; MCHALE, A. P. Review:
Ethanol production at elevated temperatures and alcohol concentrations: Part I
Yeast in general. World J. Microbiol. Biotechnol., v. 14, n. 6, p. 809-821, 1998.
BANAT, I. M.; SINGH, D.; MARCHANT, R. The use of a thermotolerant fermentative
Kluyveromyces marxianus IMB3 yeast strain for ethanol production. Acta
Biotechnol., v. 16, n. 2-3, p. 215-223, 1996.
BANAT, I. M.; NIGAM, P.; MARCHANT, R. Isolation of thermotolerant fermentative
yeasts capable of growth at 52 C and ethanol production at 45 C & 50 C. World J.
Microbiol. Biotechnol., v. 8, n. 3, p. 259-263, 1992.
BARRON, N.; MARCHANT, R.; MCHALE, L.; MCHALE, A. P. Growth of a
thermotolerant ethanol-producing strain of Kluyveromyces marxianus on cellobiose
media. Biotechnol. Lett., v. 16, n. 6, p. 625-630, 1994.
BASSO, L. C.; OLIVEIRA, A. J.; ORELLI, V. F. D. M.; CAMPOS, A. A.; GALLO, C.
R.; AMORIM, A. H. Dominncia das leveduras contaminantes sobre as linhagens
industriais avaliadas pela tcnica da cariotipagem. In: CONGRESSO NACIONAL DA
STAB, 5., 1993, guas de So Pedro. Anais... guas de So Pedro: Sociedade dos
Tcnicos Aucareiros e Alcooleiros do Brasil, 1993. p. 45-49.
BIRCH, R. M.; WALKER, G. M. Influence of magnesium ions on heat shock and
ethanol stress responses of Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb. Technol.,
v. 26, n. 9-10, p. 678-687, 2000.
BISSON, L. Stuck and sluggish fermentations. Am. J. Enol. Viticult., v. 50, n. 1, p.
107-119, 1999.
122

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

BLOMBERG, A. Metabolic surprises in Saccharomyces cerevisiae during adaptation


to saline conditions: questions, some answers and a model. FEMS Microbiol. Lett.,
v. 182, n. 1, p. 1-8, 2000.
BLOMBERG, A.; ADLER, L. Roles of glycerol and glycerol-3-phosphate
dehydrogenase (NAD+) in acquired osmotolerance of Saccharomyces cerevisiae. J.
Bacteriol., v. 141, n. 2, p. 1087-1092, 1989.
BORZANI, W. Fermentao descontnua. In: BORZANI, W.; LIMA, U. A.;
AQUARONE, E. (Ed.). Engenharia Bioqumica. So Paulo: Edgard Blcher, 1975.
v. 3, p. 105-111.
BRADY, D.; MARCHANT, R.; MCHALE, L.; MCHALE, A. P. Production of ethanol by
the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus IMB3 during growth on lactosecontaining media. Biotechnol. Lett., v. 16, n. 7, p. 737-740, 1994.
BREWSTER, J. L.; DE VALOIR, T.; DWYER, N. D.; WINTER, E.; GUSTIN, M. C. An
osmosensing signal transduction pathway in yeast. Science, v. 259, n. 5102, p.
1760-1763, 1993.
BROWN, A. Fed-batch and continuous culture. In: MCNEIL, B.; HARVEY, L. M.
(Ed.). Fermentation: a practical approach. Oxford: Oxford University Press, 1990. p.
113-130.
CAMILIOS NETO, D.; BUZATO, J. B.; CELLIGOI, M. A. P. C.; OLIVEIRA, M. R.
Otimizao da produo de etanol por Zymomonas mobilis na fermentao do
melao de cana-de-acar. Semina: Cincias Exatas e Tecnolgica, Londrina, v.
26,
p.
17-22.
Jan./jun.
2005.
Disponvel
em:
<http://www.uel.br/proppg/semina/pdf/semina-26_1_22_19.pdf>. Acesso em: 15 jan.
2007.
CARTWRIGHT, C. P.; JUROSZEK, J. R.; ROSE, A. H. Ethanol dissipates the protonmotive force across the plasma-membrane of Saccharomyces cerevisiae. J. Gen.
Microbiol., v. 132, p. 369-377, 1986. Part 2.
CARVALHO, J. C. M.; AQUARONE, E.; SATO, S.; BRAZZACH, M. L.; ALMEIDA, K.
A.; BORZANI, W. Influence of exponentially decreasing feeding rates on fed-batch
ethanol fermentation of sugar cane blackstrap molasses. Biotechnol. Lett., v. 12, n.
10, p. 777-782, 1990.

123

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

CARVALHO, J. C. M.; SATO, S. Fermentao descontnua alimentada. In:


SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. (Ed.). Biotecnologia
Industrial: Engenharia Bioqumica. 6. ed. So Paulo: Editora Edgard Blcher,
2001a. p. 205-218.
CARVALHO, J. C. M.; SATO, S. Fermentao descontnua. In: SCHMIDELL, W.;
LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. (Ed.). Biotecnologia Industrial:
Engenharia Bioqumica. 6. ed. So Paulo: Editora Edgard Blcher, 2001b. p. 193204.
CASEY, G. P.; MAGNUS, C. A.; INGLESEW, W. M. High gravity brewing: Nutrient
enhanced production of high concentrations of ethanol by brewing yeast.
Biotechnol. Lett., v. 5, n. 6, p. 429-434, 1983.
AYLAK, B.; SUKAN F. V. Comparison of different production process for bioethanol.
Turk. J. Chem., v. 22, p. 351-359, 1998.
AYLAK, B.; SUKAN, V. Comparison of different production processes for
bioethanol. Turk. J. Chem., v. 22, n. 4, p. 351-359, 1996.
CAZETTA, M. L.; CELLIGOI, M. A. P. C.; BUZATO, J. B.; SCARMINO, I. S.; SILVA,
R. S. F. Optimization study for sorbitol production by Zymomonas mobilis in sugar
cane molasses. Process Biochem., v. 40, n. 2, p. 747-751, 2005.
CHANG, E. C.; KOSMAN, D. J. O2-dependent methionine auxotrophy in Cu, Zn
superoxide dismutase-deficient mutants of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol.,
v. 172, n. 4, p. 1840-1845, 1990.
CIESAROVA, Z.; SMOGROVICOVA, D.; DOMENY, Z. Enhancement of yeast
ethanol tolerance by calcium and magnesium. Folia Microbiol., v. 41, n. 6, p. 485488, 1996.
CYSEWSKI, G. R.; WILKE, C. R. Rapid ethanol fermentations using vacuum and cell
recycle. Biotechnol. Bioeng., v. 19, n. 8, p. 1125-1143, 1977.
DAMIANO, D.; WANG, S. S. Improvements in ethanol concentration and fermentor
ethanol productivity in yeast fermentations using whole soy flour in batch, and
continuous recycle systems. Biotechnol. Lett., v. 7, p. 135-140, 1985.

124

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

D'AMORE, T.; CELOTTO, G.; RUSSELL, I.; STEWART, G. G. Selection and


optimization of yeast suitable for ethanol production at 40 C. Enzyme Microbial.
Technol., v. 11, n. 7, p. 411-416, 1989.
D'AMORE, T.; PANCHAL, D. J.; RUSSELL, I.; STEWART, G. G. A study of ethanol
tolerance in yeast. Crit. Rev. Biotechnol., v. 9, n. 4, p. 287-304, 1990.
D'AMORE, T.; STEWART, G. G. Ethanol tolerance of yeast. Enzyme Microbial.
Technol., v. 9, p. 322-330, 1987.
DAUGULIS, A. J.; SWAINE, D. E. Examination of substrate and product inhibition
kinetics on the production of ethanol by suspended and immobilized cell reactor.
Bioetechnol. Bioeng., v. 29, p. 639-645, 1987.
DE FAVERI, D.; TORRE, P.; PEREGO, P.; CONVERT, A. Statistical investigation on
the effects of starting xylose concentration and oxygen mass flowrate on xylitol
production from rice straw hydrolyzate by response surface methodology. J. Food
Eng., v. 65, n. 3, p. 383-389, 2004.
DELGADO, M. L.; GIL, M. L.; GOZALBO, D. Starvation and temperature upshift
cause an increase in the enzymatically active cell wall-associated glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase protein in yeast. FEMS Yeast Res., v. 4, n. 3, p. 297-303,
2003.
DEMAIN, A. L.; PHAFF, H. J.; KURTZMAN, C. P. The industrial and agricultural
significance of yeasts. In: KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W. (Ed.). The yeasts: a
taxonomic study. Amsterdam: Elsevier Science Publishers BV, 1998. cap. 3, p. 1319.
DOMBEK, K. M.; INGRAM, L. O. Magnesium limitation and its role in apparent
toxicity of ethanol during yeast fermentation. Appl. Environ. Microbiol., v. 52, n. 5,
p. 975-981, 1986.
ELEUTHERIO, E. C. A.; RIBEIRO, M. J. S.; PEREIRA, M. D.; MAIA, F. M.; PANEK,
A. D. Effect of trehalose during stress in a heat-shock resistant mutant of
Saccharomyces cerevisiae. Biochem. Mol. Biol. Int., v. 36, n. 6, p. 1217-1223,
1995.
EPSTEIN, I.; GROSSOWICZ, N. Prototrophic thermophilic Bacillus - Isolation,
properties, and kinetics of growth. J. Bacteriol., v. 99, n. 2, p. 414, 1969.

125

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

FACCIOTTI, M. C. R. Fermentao contnua. In: SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A.;


AQUARONE, E.; BORZANI, W. (Ed.). Biotecnologia Industrial: Engenharia
Bioqumica. 6. ed. So Paulo: Editora Edgard Blcher, 2001. p. 223-246.
FERREIRA, J. M.; SWARNAKAR, R.; SILVA, F. L. H. Effect on nutrient sources on
bench scale vinegar production using response surface methodology. Rev. Bras.
Eng. Agrc. Ambient., v. 9, n. 1, p. 73-77, 2005. Disponvel em:
<http://www.scielo.br/pdf/rbeaa/v9n1/v9n1a11.pdf> Acesso em: 8 Jul. 2007.
FINGUERUT, J. Estado da arte da fermentao alcolica nas usinas cooperadas.
Rev. Politcnica, n. 209, p. 42-45, 1993.
FLEMING, M.; BARRON, N.; MCHALE, L.; MARCHANT, R.; MCHALE, A. P. Studies
on the growth of a thermotolerant yeast-strain, Kluyveromyces marxianus IMB3, on
sucrose containing media. Biotechnol. Lett., v. 15, n. 12, p. 1195-1198, 1993.
FOLCH-MALLOL, J. L.; GARAY-ARROYO, A.; LLEDAS, F.; ROBLES, A. A. C. La
respuesta a estrs en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Rev. Latinoam.
Microbiol., v. 46, p. 24-46, 2004.
FRIDOVICH, I. Oxygen and Living Process. New York: Spring Verlag, 1981.
GALLO, C. R. Determinao da microbiota bacteriana de mosto e dornas de
fermentao alcolica. Tese (Doutorado). Universidade Estadual de Campinas,
Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, 1989.
GLOVER, J. R.; LINDQUIST, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A novel chaperone
system that rescues previously aggregated proteins. Cell, v. 94, n. 1, p. 73-82, 1998.
GOLDBERG, I.; ER-EL, Z. The chemostat an efficient technique for medium
optimization. Proc. Biochem., v. 16, p. 2-8, 1981.
GONZALEZ, B.; FRANCOIS, J.; RENAUD, M. A rapid and reliable method for
metabolite extraction in yeast using boiling buffered ethanol. Yeast, v. 13, n. 14, p.
1347-1355, 1997.
GRALLA, E. B.; VALENTINE, J. S. Null mutants of Saccharomyces cerevisiae Cu, Zn
superoxide-dismutase - characterization and spontaneous mutation-rates. J.
Bacteriol., v. 173, n. 18, p. 5918-5920, 1991.
126

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

GRAVES, T.; NERENDRANATH, N.V.; DAWSON, K.; POWER, R. Interaction effects


of lactic and acetic acid at different temperatures on ethanol production by
Sacchromyces cerevisiae in corn mash. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 73, n. 5, p.
1190-1196, 2007.
GROOT, W. J.; WALDRAM, R. H.; VAN DER LANS, R. G. J. M.; LUYBEN, K. C. A.
M. The effect of repeated temperature shock on bakers yeast. Appl. Microbiol.
Biotechnol., v. 37, p. 396-398, 1992.
GRUBB, C. F.; MAWSON, A. J. Effects of elevated solute concentrations on the
fermentation of lactose by Kluyveromyces marxianus Y-113. Biotechnol. Lett., v.15,
n. 6, p. 621-626, 1993.
HAALAND, P. D. Statistical problem solving. In: HALLAND, P. D. (Ed.).
Experimental Desing in Biotechnology. New York: Marcel Dekker Incorporation,
1989. p. 1-18.
HACK, C. J.; MARCHANT, R. Characterisation of a novel thermotolerant yeast,
Kluyveromyces marxianus var marxianus: development of an ethanol fermentation
process. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., v. 20, n. 6, p. 323-327, 1998.
HACKING, A. J.; TAYLOR, I. W. F.; HANAS, C. M. Selection of yeast able to produce
ethanol from glucose at 40 C. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 19, n. 5, p. 361-363,
1984.
HOLZBERG, I.; FINN, R. K.; STEINKRAUS, K. H. A kinetic study of the alcoholic
fermentation of grape juice. Biotechnol. Bioeng., v. 9, p. 413-427, 1967.
HUGHES, D. B.; TUDROSZEN, N. J.; MOYE, C. J. The effect of temperature on the
kinetics of ethanol production by a thermotolerant strain of Kluyveromyces
marxianus. Biotechnol. Lett., v. 6, n. 1, p. 1-6, 1984.
INOUE, Y.; MATSUDA, T.; SUGIYAMA, K.-I.; Izawa, S.; Kimura, A. Genetic analysis
of glutationa peroxidase in oxidative stress response of Saccharomyces cerevisiae.
J. Biol. Chem., v. 274, n. 38, p. 27002-27009, 1999.
JAMIESON, D. J. Oxidative stress responses of the yeast Saccharomyces
cerevisiae. Yeast, v. 14, n. 16, p. 1511-1527, 1998.

127

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

JONES, A. M.; INGLEDEW, W. M. Fuel alcohol production: Optimization of


temperature for efficient very-high-gravity fermentation. Appl. Environ. Microbiol., v.
60, n. 3, p. 1048-1051, 1994.
JORNAL DA CANA (Procana). Os impressionantes nmeros do setor (Safra
2006/07).
Disponvel
em:
<http://www.procana.com.br/Conteudo/Conheca%20o%20Setor.asp>. Acesso em:
10 dez. 2007.
KALIL, S. J.; MAUGERI, F.; RODRIGUES, M. I. Response surface analysis and
stimulation as a tool for bioprocess design and optimization. Proc. Biochem., v. 35,
n. 6, p. 539-50, 2000.
KAWAMURA, D. Breeding of yeast strains able to grow at 42 C. Biosci.
Biotechnol. Biochem., v. 63, n. 3, p. 560-562, 1999.
KEIM, C. R. Technology and economics of fermentation alcohol - an update.
Enzyme Microbial. Technol., v. 5, n. 2, p. 103-114, 1983.
KELLER, R. DUNN, I. J. Fed-batch microbial culture. Models, error and applications.
J. Appl. Chem. Biotechnol. Abst., v. 28, p. 508-514, 1978.
KIDA, K.; KUME, K.; MORIMURA, S.; SONODA, Y. Repeated-batch fermentation
process using a thermotolerant flocculating yeast constructed by protoplast fusion. J.
Ferment. Bioeng., v. 74, n. 3, p. 169-173, 1992.
KIRAN SREE, N.; SRIDHAR, M.; SURESH, K.; BANAT, I. M.; RAO, L. V. Isolation of
thermotolerant, osmotolerant, flocculating Saccharomyces cerevisiae for ethanol
production. Bioresour. Technol., v. 72, p. 43-46, 2000.
KOTZAMANIDIS, C.; ROUKAS, T.; SKARACIS, G. Optimization of lactic acid
production from beet molasses by Lactobacillus delbrueckii NCIMB 8130
World J. Microbiol. Biotechnol., v. 18, n. 5, p. 441-448, 2002.
KRAUTER, M.; AQUARONE, E.; SATO, S.; PEREGO JR., L.; BORZANI, W.
Influence of linearly decreasing feeding rates on fed-batch ethanol fermentation of
sugar-cane blackstrap molasses. Biotechnol. Lett., v. 9, n. 9, p. 647-650, 1987.

128

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

KUHN, H.; FRIEDRICH, U.; FIECHTER, A. Defined minimal medium for a


thermophilic Bacillus sp. developed by a chemostat pulse and shift technique. Eur. J.
Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 6, p. 341-349, 1979.
LALUCE, C. Current aspects of fuel ethanol-production in Brazil. Crit. Rev.
Biotechnol., v. 11, n. 2, p. 149-161, 1991.
LALUCE, C.; ABUD, C. L.; GREENHALF, W.; SANCHES-PERES, M. F.
Thermotolerant behavior in sugar cane syrup fermentations of wild type yeast strains
selected under pressures of temperature, high sugar and added ethanol.
Biotechnol. Lett., v.15, p. 609-614, 1993.
LALUCE, C.; PALMIERI, M. C.; CRUZ, R. C. L. Growth and fermentation
characteristics of new selected strains of Saccharomyces at high temperatures and
high cell densities. Biotechnol. Bioeng., v. 37, p. 528-536, 1991.
LALUCE, C.; SOUZA, C. S.; ABUD, C. L; GATTAS, E. A. L.; WALKER, G. M.
Continuous ethanol production in a nonconventional five-stage system operating with
yeast cell recycling at elevated temperatures. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., v. 29,
p. 140-144, 2002.
LARSSON, K.; ANSELL, R.; ERIKSON, P.; ADLER, L. A gene encoding SN-glycerol
3-phosphate dehydrogenase (NAD+) complements an osmosensitive mutant of
Saccharomyces cerevisiae. Mol. Microbiol., v. 10, n. 5, p. 1101-1111, 1993.
LASZLO, A. Evidence for two states of thermotolerance in mammalian cells. Int. J.
Hyperther., v. 4, n. 5, p. 513-526, 1988.
LEAO, C.; VANUDEN, N. Effects of ethanol and other alkanols on the ammonium
transport-system of Saccharomyces-cerevisiae. Biotechnol. Bioeng., v. 25, n. 8, p.
2085-2090, 1983.
LEE, S. S.; ROBINSON, F. M.; WANG. H. Y. Rapid-determination of yeast viability.
Biotechnol. Bioeng. Symp., v. 11, p. 641-649, 1981. Suppl. 11.
LI, C.; BAI, J. H.; CAI, Z. L. Optimization of a cultural medium for bacteriocin
production by Lactococcus lactis using response surface methodology. J.
Biotechnol., v. 93, n. 1, p. 27-34, 2002.
LINDQUIST, S. Heat shock proteins and stress tolerance in microorganisms. Curr.
Opin. Genet. Dev., v. 2, n. 5, p. 748-755, 1992.
129

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

LLOYD, D.; MORELL, S.; CARLSEN, H. N.; DEGN, H.; JAMES, P. E.; TOWLANDS,
C. C. Effects of growth with ethanol on fermentation and membrane fluidity of
Saccharomyces cerevisiae. Yeast, v. 9, n. 8, p. 825-833, 1993.
LUONG, J. H. T. Kinetics of ethanol inhibition in alcohol fermentation. Biotechnol.
Bioeng., v. 27, p. 280-285, 1984.
LYND, L. R.; AHN, H. J.; ANDERSON, G.; HILL, P.; KERSEY, D. S.; KLAPATCH, T.
Thermophilic ethanol production - investigation of ethanol yield and tolerance in
continuous culture. Appl. Biochem. Biotechnol., v. 28-9, p. 549-569, 1991.
MAGER, W. H.; VARELA, J. C. S. Osmostress response of the yeast
Saccharomyces. Mol Microbiol., v. 10, n. 2, p. 253-258, 1993.
MAIA, A. B. R. A. Fundamentos de fermentao alcolica. Belo Horizonte: UFMG,
1989. (Apostila do curso de Engenharia Qumica).
MAJARA, M.; O`CONNOR-COX, E. S. C.; AXCELL, B. C. Trehalose - A Stress
Protectant and Stress Indicator Compound for Yeast Exposed to Adverse Conditions.
J. Am. Soc. Brew. Chem., v. 54, n. 4, p. 221-227, 1996.
MARTINI, G.; MIGNONE, C.; ERTOLA, R. Studies in beta-galactosidase production
in transient operation cultures. Biotechnol. Lett., v. 11, n. 8, p. 545-550, 1989.
MATELES, R. I.; BATAT, E. Continuous culture used for media optimization. Appl.
Microbiol., v. 28, p. 901-905, 1974.
MILANESE-RUBILAR, A. A.; MAUGERI, F. F. Modeling alcohol production and cell
viability in cascate reactor with immobilized cells. Rev. Microbiol., v. 21, n. 1, p. 7984, 1990.
MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing
sugar. Anal. Chem., v. 31, n. 3, p. 426-428, 1959.
MONTGOMERY, D. G. Design and analysis of experiments. 5th ed. New York:
John Wiley and Sons, 2001.

130

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

MORADAS-FERREIRA, P.; COSTA, V.; PIPER, P.; MAGER, W. The molecular


defenses against reactive oxygen species in yeast. Mol. Microbiol., v. 19, n. 4, p.
651-658, 1996.
MORIMURA, S.; LING, Z. Y.; KIDA, K. Ethanol production by repeated-batch
fermentation at high temperature in a molasses medium containing a high
concentration of total sugar by a thermotolerant flocculating yeast with improved salttolerant. J. Ferment. Bioeng., v. 83, n. 3, p. 271-274, 1997.
NABAIS, R. C.; SACORREIA, I.; VIEGAS, C. A.; NOVAIS, J. M. Influence of
calcium-ion on ethanol tolerance of Saccharomyces-bayanus and alcoholic
fermentation by yeasts. Appl. Environ. Microbiol., v. 54, n. 10, p. 2439-2446, 1988.
NIESSEN, T. L.; KIELLAND-BRANDT, M. C.; NIELSEN, J.; VILLADSEN, J.
Optimization of ethanol production in Saccharomyces cerevisiae by metabolic
engineering of the ammonium assimilation. Metab. Eng., v. 2, p. 69-77, 2000.
OLIVA-NETO, P. Influncia da contaminao por bactrias lticas na
fermentao alcolica pelo processo batelada alimentada. 1990. Dissertao
(Mestrado). Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de
Campinas, 1990.
OLIVEIRA, E. S. Efeito da adio de suplementos nutricionais na fermentao
alcolica de melao de cana de acar em diferentes temperaturas. 1988. 63 f.
Dissertao (Mestrado) - Universidade Federal de Viosa, Viosa, 1988.
PARRO, J. E. A viso do setor petrleo. In: PERSPECTIVAS do lcool
combustvel no Brasil. So Paulo: IEE/USP, 1996. 166 p.
PEREGO JR, L.; DIAS, J. M. C. S.; KOSHIMIZU, L. H.; CRUZ, M. R. M.; BORZANI,
W. Influence of temperature, dilution rate and sugar concentration on the
establishment of steady-state in continuous ethanol fermentation of molasses.
Biomass, v. 6, p. 247-256, 1985.
PERES, M. F. S.; LALUCE, C. Ethanol tolerance of thermotolerant yeasts cultivated
on mixtures of sucrose and ethanol. J. Ferment. Bioeng., v. 85, n. 4, p. 388-397,
1998.

131

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

PERES, M. F. S.; SOUSA, S. R.; LALUCE, C. Obtaining strains of Saccharomyces


tolerant to high temperatures and ethanol. In: SPENCER, J. F. T.; SPENCER, A. L.
R. (Ed.). Methods in Biotechnology: Food Microbiology Protocols. Totowa:
Humana Press, 2001. v. 14, cap. 40, p. 355-367.
PIPER, P. W. Molecular events associated with acquisition of heat tolerance by the
yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Rev., v. 11, n. 4, p. 339-356,
1993.
QUEROL, A.; FERNNDEZ-ESPINAR, M. T.; DEL OLMO, M.; BARRIO, E.
Adaptative evolution of wine yeast. Int. J. Food Microbiol., v. 86, n. 1-2, p. 3-10,
2003.
REP, M.; KRANTZ, M.; THEVELEIN, J. M.; HOHMANN, S. The transcriptional
response of Saccharomyces cerevisiae to osmotic shock - Hot1p and Msn2p/Msn4p
are required for the induction of subsets of high osmolarity glycerol pathwaydependent genes. J. Biol. Chem., v. 275, n. 12, p. 8290-8300, 2000.
REVIEW on fed-batch fermentations: Mathematical Modelling, Parameters and
Control. Disponvel em <http://userpages.umbc.edu/~gferre1/outline.html>. Acesso
em: 12 Nov. 2007.
RIESENBERG, D.; GUTHKE, R. High-cell-density cultivation of microorganisms.
Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 51, n. 4, p. 422-430, 1999.
ROBYT, J. F.; WHITE, B. J. Qualitative and quantitative methods for determining
biological molecules. In: ROBYT, J. F.; WHITE, B. J. (Ed.). Biochemical
Techniques: theory and practice. Illinois: Waveland Press, 1990. cap. 7, p. 235.
RODINI, M. A. T. Isolamento, caracterizao e identificao de bactrias
contaminantes de dornas de fermentao nas destilarias de etanol. 1985.
Dissertao (Mestrado) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,
Universidade de So Paulo, Piracicaba, 1985.
ROSALES, S. Y. R. Contaminantes bacteriano da fermentao etanlica:
isolamento em meios diferenciais, identificao e avaliao de desinfetantes. 1989.
Tese (Doutorado). Universidade Jlio de Mesquita Filho/UNESP, Rio Claro, 1989.
RUIS, H.; SCHULLER, C. Stress signaling in yeast. Bioessays, v. 17, n. 11, p. 959965, 1995.
132

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

S-CORREIA, I.; VAN UDEN, N. Temperature profiles of ethanol tolerance: Effects


on ethanol on the minimum and maximum temperatures for growth of the yeasts
Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces fragilis. Biotechnol. Bioeng., v. 25,
p. 1665, 1983.
SALMON, J. M.; MURICO, J. C. Relationship between sugar uptake kinetics and total
sugar consumption in different industrial Saccharomyces cerevisiae strains during
alcoholic fermentation. Biotechnol. Lett., v. 16, n. 1, p. 89-94, 1994.
SANCHEZ, Y.; LINDQUIST, S. L. Hsp104 required for induced thermotolerance.
Science, v. 248, n. 4959, p. 1112-1115, 1990.
SANCHEZ, Y.; TAULIEN, J.; BORKOVICH, K. A.; LINDQUIST, S. Hsp104 is required
for tolerance to many forms of stress. EMBO J., v. 11, n. 6, p. 2357-2364, 1992.
SCHIMIDELL, W.; FACCIOTTI, M. C. R. Biorreatores e processos fermentativos. In:
SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. (Ed.). Biotecnologia
Industrial: Engenharia Bioqumica. 6. ed. So Paulo: Editora Edgard Blcher, 2001.
p. 179-192.
SCHMIDELL, W.; FACCIOTTI, M. C. R. Studies on glucoamylase production in a
bioreactor operating with polysaccharide pulses in the reactor. Biotecnologia, v. 4,
n. 2, p. 43-47, 1994.
SEKI, M.; KANEUCHI, C.; KUMNNATA, J.; MANTIRUNGIJ, M.; OHOMONO, T.;
KOMAGATA, K. Identification of lactic acid bacteria isolated from fermented cane
molasses at alcohol plants in Thailand. Bull. J. Fed. Cult. Collect., v.5, n. 2, p. 80-8,
1989.
SEKI, T.; MYOGA, S.; LIMTONG, S.; UEDONO, S.; KUMNUANTA, J.; TAGUCHI, H.
Genetic construction of yeast strains for high ethanol-production. Biotechnol. Lett.,
v. 5, n. 5, p. 351-356, 1983.
SERRA, G. E.; CEREDA, M. P.; FERES, R. J.; BERTOZO, M. T.; VICENTE, A. T.
Contaminao da fermentao alcolica floculao do fermento. Brasil
Aucareiro, v. 93, n. 6, p. 26-31, 1979.
SERRANO, R. Salt tolerance in plants and microorganisms: Toxicity targets and
defense responses. Int. Rev. Cytol., v. 165, p. 1-52, 1996.

133

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

SILVA, F. L. H. Modelagem, simulao e controle de fermentao alcolica


contnua extrativa. 1998. 162 f. Tese (Doutorado) Universidade de Campinas,
Campinas. 1998.
SINGH, D.; BANAT, I. M.; NIGAM, P.; MARCHANT, R.; Industrial scale ethanol
production using the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus IMB3 in an
Indian distillery. Biotechnol. Lett., v. 20, p. 753-755, 1998.
SINGH, D.; BANAT, I. M.; NIGAM, P.; MARCHANT, R. Industrial scale ethanol
production using the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus IMB3 in an
Indian distillery. Biotechnol. Lett., v. 20, n. 8, p. 753-755, 1998.
SREEKUMAR, O.; CHAND, N.; BASAPPA, S. C. Optimization and interaction of
media components in ethanol production using Zymomonas mobilis by response
surface methodology. J. Biosci. Bioeng., v. 88, n. 3, p. 334-338, 1999.
STEWART, G. G.; DAMORE, T.; PANCHAL, C. J.; RUSSEL, I. Factors that
influence the ethanol tolerance of brewers yeast strains during high gravity wort
fermentations. Master Brew. Assoc. Am., v. 25, p. 47-53, 1988.
STROPPA, C. T. Dinmica populacional de leveduras caracterizadas por
eletrocaritipos e desempenho fermentativo em processos de fermentao
alcolica. 2002. Tese (Doutorado) - Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2002.
STUPIELLO, M. G. Avaliao de metodologia para estudo da ao de alguns
antimicrobianos frente a bactrias Gram (+) isoladas da fermentao alcolica.
Dissertao (Mestrado). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
Universidade de So Paulo, Piracicaba, 1993.
SZCZODRAK. J.; TARGONSKI, Z. Selection of thermotolerant yeast strains for
simultaneous saccharification and fermentation of cellulose. Biotechnol. Bioeng., v.
31, n. 4, p. 300-303, 1988.
TAO, W.; DESCHENES, R. J.; FASSLER, J. S. Intracellular glycerol levels modulate
the activity of Sln1p, a Saccharomyces cerevisiae two-component regulator. J. Biol.
Chem., v. 274, n. 1, p. 360-367, 1999.

134

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

THOMAS, K. C.; HYNES, S. H.; HONES, A. M.; INGLEDEW, W. M. Production of


fuel alcohol from wheat by VHG technology - Effect of sugar concentration and
fermentation temperature. Appl. Biochem. Biotechnol., v. 43, n. 3, p. 211-226,
1993.
THOMAS, K. C.; HYNES, S. H.; INGLEDEW, W. M. Effects of particulate materials
and osmoprotectants on Very-High-Gravity ethanolic fermentation by Saccharomyces
cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., v. 60, n. 5, p. 1519-24, 1994.
THOMAS, K. C.; HYNES, S. H.; INGLEDEW, W. M. Influence of medium buffering
capacity on inhibition of Saccharomyces cerevisiae growth by acetic and lactic acids.
Appl. Environ. Microbiol., v. 68, n. 4, p. 1616-1623, 2002.
THOMAS, K. C.; HYNES, S. H.; INGLEDEW, W. M. Initiation of anaerobic growth of
Saccharomyces cerevisiae by amino acids or nucleic acid bases: ergosterol and
unsaturated fatty acids cannot replace oxygen in minimal media. J. Ind. Microbiol.
Biotechnol., v. 21, n. 4-5, p. 247-253, 1998.
THOMAS, K. C.; INGLEDEW, W. M. Production of 21% (v/v) ethanol by fermentation
of very high gravity (VHG) wheat mashes. J. Ind. Microbiol., v. 10, n. 1, p. 61-68,
1992.
TILBURY, R. H.; HOLLINGSWORTH, B. S.; GRAHAM, S. D.; POTTAGE, P. Mill
sanitation A fresh approach to biocide evaluation. In: CONGRESS OF THE
INTERNATIONAL SOCIETY OF SUGAR CANE TECHNOLOGISTS, 16., 1977, So
Paulo. Proceedings So Paulo: ISSCT, 1977. p. 693-701.
TORIJA, M. J.; ROZES, N.; POBLET, M.; GUILLON, J. M.; MAS, A. Effects of
fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. Int.
J. Food Microbiol., v. 80, p. 47-53, 2003.
UENO, R.; HAMADA-SATO, N.; URANO, N. Fermentation of molasses by several
yeasts from hot spring drain and phylogeny of the unique isolate producing ethanol at
55 C. J. Tokyo Univ. Fish., v. 90, p. 23-30, 2003.
UENO, R.; URANO, N.; KIMURA, S. Characterization of thermotolerant, fermentative
yeasts from hot spring drainage. Fish. Sci., v. 67, n. 1, p. 138-145, 2001.
UENO, R.; URANO, N.; KIMURA, S. Effect of temperature and cell density on
ethanol fermentation by a thermotolerant aquatic yeast strain isolated from a hot
spring environment. Fish. Sci., v. 68, n. 3, p. 571-578, 2002.
135

Avaliao da produo de etanol...

Crisla S. Souza
Referncias

UNICA em ao. lcool combustvel: caractersticas. Disponvel em:


<http://www.portalunica.com.br/portalunica/index.php?Secao=UNICA%20em%20a
o&SubSecao=lcool%20combustvel&SubSubSecao=caractersticas&id=%20and%2
0id=1>. Acesso em: 10 dez. 2007.
VALENTINE, J. S.; WERTZ, D. L.; LYONS, T. J.; LIOU, L.; GOTO, J.J.; GRALLA,
E.B. The dark side of dioxygen biochemistry. Curr. Opin. Chem. Biol., v. 2, n. 2, p.
253-262, 1998.
WALKER M. W. Yeast Growth. In: WALKER M. W. (Ed.). Yeast physiology and
biotechnology. Chichester: John Wiley & Sons, 1998. p. 101-202.
WANG, Y. X.; LU, Z. X. Optimization of processing parameters for the mycelial
growth and extracellular polysaccharide production by Boletus spp. ACCC 50328.
Process Biochem., v. 40, n. 3-4, p. 1043-1051, 2005.
WHITAKER, A. Fed-batch culture. Process Biochem., v. 15, p. 10-15, 1980.
YEE, L.; BLANCH, H. W. Defined media optimization for growth of recombinant
Escherichia coli X90. Biotechnol. Bioeng., v. 41, p. 221-230, 1993.
ZOLMAN, N. Biostatistics: Experimental design and statistical inference. New York:
Oxford University Press, 1993.

136