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1)
- LacIq pTac -> amplificado do pMAL2-c2X -> clonado para vector pHeL2
- LacZ -> clonado entre SpeI e BamHI dos stios de clonagem de pHeL2
-pHeL2- TL-> introduzido na estirpe N6 de H.pylori.
- Mediu-se a atividade da B-galactosidase na presena de IPTG
. Problemas:
-produo de B- galactosidase foi baixa
- observou-se atividade B- galactosidase residual sem a adio de IPTG.
* Problema devido => falta de reconhecimento de promotores E.coli pela
RNA polimerase da Hpylon ( diferenas entre os fatores sgima codificados
por genes rpoD da E.coli e H.pylori)
Resolveu-se a fuga de plasmdeo pHeL2-TL => pela adio uma 2 copia de
LacIq sob o controlo do promotor amiE => gerando plasmdeo PILL2150 : h
boa leitura de B-galactosidase. Logo, pode ser usado para controlar a
expresso genes essenciais de H.pylori para estudar o papel fisiologico das
proteinas codificantes sob condies com falta de IPTG.
2)
Melhorar o nvel de produo de B-galactosidase para se poder usar os
plasmdeos para controlar a produo de protena recombinante, interaes
proteina-proteina ou expresso de RNAs antisense(?)
Em pILL2150, apenas o 2 lacIq ficou sob o conrolo de um promotor de fora
(pamiE) ento, para substituir a regio LacI q- pTac por outro promotor de
fora, usou-se ureI.
Criou-se os primers pureI-LacI(op)- BgLII e pureI-LacI(op)-SpeI onde foi
introduzido um sitio de ligao LacI que no afetou as caixas -35 e -10
Amplificou-se o promotor ureI usando os primers (pureI-LacI(op)- BgLII
e pureI-LacI(op)-SpeI) e colonaram-se ambos em pHeL2-TL e pILL2150
por substituio da regio LacI9-pTac => criando pILL2151 e pILL2153
*a introduo do sitio de ligao da lacI no afetou a funcionalidade de pureI
(Pill2151) ver na FIGURA1
No entanto, a represso no foi eficiente o suficiente para permitir o estudo
de por exemplo o efeito da expresso exagerada do crescimento de
interaes protena-proteina.
Na ausncia de IPTG, pILL2153 expressou razoveis actividades de bgalactosidase
Criao de mutantes:
Tabela 2
A seleco de clones resistentes canamicina dependia da presena de
IPTG. Os poucos clones que cresceram em placas sem IPTG podem ser
explicados por mutantes promotores que perderam a forte regulao por
LacI9 ou Lac9-sem mutaes.
FOLHA 3
N6 ftsI