ARTIGO:

RESUMO 1:
Medidas de transporte molecular atravs de complexos de poro nuclear
(NPCs) fornecerm informaes valiosas que podem ser usados para revelar
os mecanismos de comunicao entre o ncleo e o citoplasma. Mas,
molculas individuais sofrem um transporte muito rpido, sendo difcil de
seguir o seu movimento em um estado fisiolgico em clulas vivas.
A espectroscopia de correlao de fluorescncia (FCS) fornece sensibilidade
a uma nica molcula, na presena de muitas outras. Neste estudo, foram
medidos os tempos de transporte nucleocitoplasmtico de molculas GFP,
em todo o envelope nuclear (NE), mas sem resoluo de um nico poro.
Medindo as mudanas na intensidade de fluorescncia ao longo da orbita,
pode-se determinar as correlaes no espao e no tempo de molculas de
ligao individuais e deixando o NPC.
Para realizar o mtodo, foi utilizado o receptor nuclear Kapb1 marcados para
GFP e transitoriamente introduzidos em clulas CHO-K1. Kapb1-GFP serve
como um marcador dinmica do poro, uma vez que transporta atravs do
NE e localmente acumula em NPCs individuais, onde se realiza o transporte
bidireccional. De acordo com o modelo molecular Kapb1 reconhece a
molcula de carga no lado citoplasmtico do NPC e transloca-se para a
cesta nucleoplsmica, onde liberta a sua carga e se liga a RanGTP. O
complexo Kapb1-RanGTP facilmente exportado de volta para o citoplasma.
Este processo bidirecional sustentada pelo gradiente qumico de RanGTP
atravs do NE.
Ao longo da rbita, 64 pontos so amostrados. A orientao da NE
selecionado de tal maneira que o ponto de incio de digitalizao situa-se
sobre a NE. Assim, a primeira metade da rbita pontos corresponde a um
compartimento (por exemplo, o ncleo) e a segunda metade corresponde ao
outro compartimento. A intensidade de fluorescncia registado ao longo
da rbita e, em seguida, calculado num tapete bidimensional, em que o eixo
x representa o nmero total de pontos ao longo da rbita pontos e o eixo y
representa o tempo de aquisio. Normalmente, 6,4x10 5 rbitas so
digitalizados, correspondendo a ~ 32 s de aquisio total (tempo rbita
0,5 ms).
Anlise FCS realizado para extrair informaes sobre a dinmica Kapb1 a
nvel nica molcula. Calcula-se a funo de autocorrelao (ACF) em cada
ponto ao longo da rbita para quantificar a difusividade correspondente do
Kapb1-GFP. A protuberncia identifica um tempo caracterstico de
correlao de fluorescncia as flutuaes detectadas no poro, o que pode

ser explicado em termos de movimento bidirecional da Kapb1-GFP atravs

do poro Por conseguinte, as corcundas podem estar em diferentes locais (e
tempos) porque as molculas podem razoavelmente iniciar e parar em
pontos diferentes na estrutura de poros.
Os dois componentes da Kapb1 de vaivm podem ser separados por par de
correlao espacial entre os pontos 16 e 48 (e o inverso) da rbita. Se a
interpretao do perfil ACF correcta, o efeito de protuberncia deve provar
ser 1), dependente da presena de Kapb1 (isto , reflectindo uma actividade
Kapb1); 2), caracterstica da proximidade do poro (ou seja, a actividade de
poro reflectindo); e 3), dependente da energia metablica.

Assim, a combinao de FCS com acompanhamento orbital nos permite

extrair as correlaes caractersticos de eventos de transporte no sistema
de referncia da poro, e na presena de muitas molculas, sob condies
fisiolgicas