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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO - UNIVASF CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA DISCIPLINA DE DOENÇAS INFECTO-CONTAGIOSAS PROFESSOR MATEUS MATIUZZI DA COSTA

DOENÇAS INFECTO-CONTAGIOSAS PROFESSOR MATEUS MATIUZZI DA COSTA PARTE I DOENÇAS BACTERIANAS PETROLINA, AGOSTO DE 2011. 1

PARTE I

DOENÇAS BACTERIANAS

PETROLINA, AGOSTO DE 2011.

SUMÁRIO

Colheita e remessa de materiais para exame bacteriológico

03

Diagnóstico molecular de enfermidades bacterianas

17

Garrotilho

31

Infecção por Rhodococcus equi em potros

35

Colibacilose e Doença do Edema

39

Erisipela

49

Doenças respiratórias dos suínos

56

Rinite Atrófica

59

Pneumonia Enzoótica

62

Pleuropneumonia suína

64

Carbúnculo Hemático

71

Clostridioses

77

Botulismo

79

Tétano

81

Carbúnculo sintomático, Edema maligno e Gangrena Gasosa

85

Hemoglobinúria bacilar

88

Enterotoxemia

91

Cerato conjuntivite infeccciosa dos bovinos

97

Oftalmia contagiosa dos ovinos

109

Foot Rot

110

Leptospirose

115

Tuberculose

125

Brucelose

141

Enfermidades do Trato Reprodutivo de Ovinos

146

Matsite

*

COLHEITA E REMESSA DE MATERIAL PARA EXAME BACTERIOLÓGICO

INTRODUÇÃO

Agueda Castagna de Vargas Mateus Matiuzzi da Costa

Para o diagnóstico de doenças bacterianas, os exames laboratoriais são muito importante, para identificação dos agentes etiológicos, confirmação do diagnótico e orientação do melhor agente antimicrobiano para terapia. O exame bacteriológico inicia bem antes da colheita de qualquer amostra para análise laboratorial. De centenas de microrganismos que têm sido identificados como causa ou coadjuvantes de doenças nos animais, provavelmente 90% podem ser excluídos com alto grau de confiança simplesmente com base na espécie do hospedeiro envolvido, sinais clínicos, ou lesões e sob quais circunstâncias é encontrada (localização geográfica, época do ano, idade do animal, sistema de criação). O conhecimento do laboratorista com referência a estes aspectos é essencial, não somente porque é freqüentemente questionado, a respeito disto bem antes dos testes laboratoriais estarem com o resultado definitivo disponível, mas também para a utilização racional do laboratório de diagnóstico. Logo a elaboração de um histórico preciso é muito importante para orientação dos laboatoristas. O exame bacteriológico é importante para confirmar um diagnóstico, estabelecer prognóstico e selecionar tratamento eficaz. O alcance desses objetivos não depende somente da exatidão e minúcia com que são efetuados os exames, mas principalmente de devida colheita de amostras, evitando contaminação secundária. Um aspecto muito importante que o clínico deve ter em mente é a melhor hora para coleta das amostras, a fim de maximizar o cultivo laboratorial.

Colheita das

Colheita das Remessa para o Cultivo e Testes Testes de Resultados Figura 1. Fluxo das amostras

Remessa para o

Colheita das Remessa para o Cultivo e Testes Testes de Resultados Figura 1. Fluxo das amostras
Colheita das Remessa para o Cultivo e Testes Testes de Resultados Figura 1. Fluxo das amostras

Cultivo e

Colheita das Remessa para o Cultivo e Testes Testes de Resultados Figura 1. Fluxo das amostras
Colheita das Remessa para o Cultivo e Testes Testes de Resultados Figura 1. Fluxo das amostras

Testes

Testes de

Colheita das Remessa para o Cultivo e Testes Testes de Resultados Figura 1. Fluxo das amostras

Resultados

Figura 1. Fluxo das amostras remetidas para exame bacteriológico

TÉCNICA

As considerações a seguir são importantes e aplicáveis a maioria das amostras a serem colhidas:

1- Materiais Necessários: Antes da coleta de amostras o organização de todo material utilizado é muito importante. No caso de visitas as propriedades rurais é muito importante verificar se estes estão em condições e quantidade necessária, antes da saída para colheita. Abaixo são listados os materiais necessário a uma coleta de amostras ao exame bacteriológico.

Tabela 1. Materiais necessários para coleta de amostras para exame bacteriológico a partir de necropsia.

Materiais

Avental

Luvas descartáveis

Tesoura ponta larga, tesoura ponta fina

Cabo de bisturi

Lâmina bisturi

Pinça dente de rato

Faca

Fio de algodão

Seringas descartáveis de 3ml e 5ml

Alcool de cozinha e solução de etanol 70%

Lamparina

Sacos plásticos

Swabs

Meio de transporte

Frascos estereis

Caneta, folha de papel para anotações

Fitas e etiquetas

Caixa de isopor

Gelo reciclável

Frasco contendo formol

2 - Condições da amostra - A amostra deve ser colhida sob condições estéreis, ou ao menos evitando contaminações o máximo possível. Para isto, a coleta do material deve ter

prioridade evitando a manipulação excessiva dos tecidos e fluidos a serem coletados. O uso de swab para colheita de materiais fistulaos não é indicado, pois existe uma grande probabilidade de contaminação com bactérias da pele. O uso de recipientes e aparelhagem estéreis para colheita é fundamental para prevenção da contaminação. A colheita acontecer na fase aguda da doença em animais vivos ou necropsiados logo após a morte. Esta deve ser realizada preferencialmente antes do inicio da terapia antimicrobiana, sendo adequado em alguns casos, manter animais sentinelas livres da alimentação com antimicrobianos, por

48hs.

3- Quantidade de amostra - A amostra deve ser de tamanho adequado. Os swabs freqüentemente não contém amostra suficiente e representativa do material. Sua utilização se restringe àquelas situações onde não é possível se obter volume ou massa coletável. Para o estudo microbiológico de amostras vale o ditado ("se pouco é bom, mais é melhor"). Deve sempre ter se e mente que vdevemos coletar o máximo de tecido afetado possível. Gerlamente, vinte a cinqüenta mililitros de fluídos e 30 a 100 gramas de tecido são medidas adequadas, que cobrirão as necessidades do laboratório.

4 - Embalagem - A amostra deve ser individualizada e contida em frasco resistente não quebrável ou adequadamente protegido contra quebradura, ou em sacos plásticos, previamente identificados.

5 - Conservação - A amostra deve estar protegida contra deterioração após a colheita.

Deve-se prevenir ou minimizar danos pela dessecação, oxidação, aquecimento e atividade enzimática da própria bactéria ou das células e fluídos com os quais está em contato. O procedimento mais importante para minimizar estes danos é o rápido processamento das amostras. Quando isto não for possível deve proceder-se a refrigeração em trânsito. A colocação de gelo reciclável supre esta necessidade. Devemos ressaltar que quando do uso de gelo não reciclável é importante fecha-lo hermeticamente, para que no derretimento não orcorra o comprometimento da amostra.

A remessa de swabs deve ser feita em meio de transporte (Stuart, Amies) - são tubos com meio semi-sólido, o qual não permite crescimento mas provem umidade, pH fisiológico estável e baixo potencial de oxido-redução, prolongando a viabilidade dos microrganismos em trânsito (ver anexo). Sistemas especiais de transporte são disponíveis para colheita de amostras para culturas anaeróbicas. Os swabs de dacron, alginato de cálcio e rayon são os mais apropriados para a colheita do material. Os swabs de fibra de algodão apresentam efeito nocivo a amostra por apresentarem substâncias inibidoras. A sua utilização tem sido recomendada se antes do processo de autoclavação forem embebidos por 5 minutos em solução de Sörensen 0,067M, pH = 7,5. O uso de hastes comerciais não é recomendado, devido possuirem substâncias antimicrobianas, geralmente deridaso do formol.

Amostras para cultivo de bactérias anaeróbicas ou microaerófilas, deve-se tomar cuidados na remessa da amostra. Para tal, devem ser utilizados meios de transporte especiais. O laboratorista também deve ser informado desta suspeita, por que os mesmos devem ser cultivados sob condições atmosféricas especiais.

6 - Acondicionamento - A amostra ser remetida em caixa isotérmica com tampa

devidamente vedada com fita adesiva. No caso em que as amostras forem enviadas pelo correio e transportadoras é importate avisar o laboratório do envio via telefone ou correio eletrônico. Além disto, é importante manter o número do protocolo da amostra.

7 - Identificação - Toda a amostra deve ser acompanhada por um documento escrito

contendo informações identificando o material, a criação de onde origina-se a amostra,

bem como histórico completo do caso, com a suspeita clínica e exames requisitados. Abreviações devem ser evitadas sempre que possível. Além disto deve possuir o nome completo, endereço do destinatário, telefone e e-mail para contatos futuros.

COLHEITA DE AMOSTRAS CLÍNICAS ESPECÍFICAS

A) OLHOS: As amostras nos casos de onjuntivite devem ser colhidas com swab, diretamente das lesões oculares, ou do saco conjuntival. A punção com seringa utilizando agulhas finas (25 ou 27g) podem ser indicadas nos casos de lesões profundas. As amostras devem ser remetidos rapidamente ao laboratótio. O uso de meios de transporte é muito importante. A conjuntiva possui uma flora prórpia que pode em alguns casos interfeir nos resultados.

B) FEZES - "Swab" ou conteúdo diretamente do reto, colocando em frasco estéril. Em

necropsia colher porção de intestino ligando-o com fio de algodão.

C) ABCESSOS - Remetê-los inteiros (fechados), puncioná-los em seringa (vedando a

extremidade e remetendo-a) ou em frascos estéreis. O transporte deve ser realizado rapidamente a fim de facilitar o isolamento de bactérias anaeróbicas.

D) LAVADO PREPUCIAL - Deve ser realizado com solução salina tamponada fosfatada

- PBS (+ ou - 100 ml) pH = 7,2 , introduzir no prepúcio, fazer massagem e colher com pipeta estéril. Um técnica muito utilizada e o aspirado prepucial, onde se conecta uma bainha de inseminação a uma seringa de 5ml e aspirar a mucosa do prepucio coletando amostras que podem ser metidas na própria bainha, fechada herméticamente ou em frascos estéreis.

E) OSSO LONGO - Metacarpiano ou metatarsiano (canela) - desarticulado, inteiro e livre

de pele, músculos e tendões. Deve ser colhido em enfermidades septicêmicas, associado a

outro material nunca isolado.

F) URINA - Colher em frasco esterilizado com tampa de borracha. Deve se colher nas

primeiras horas da manhã para facilitar a concentração do material, obteno resultaos significativos. Quando possível através de sonda, ou citocentese, sendo a última importante

para evitar a ontaminação por bactérias do tratao genitourinário. A cistocentese é muito

utilizada para pequenos animais, contudo não é recomendada em animais com alterações nervosas, distúrbios da coagulação e piometras.

G) LÍQUIDO SINOVIAL OU HIGROMAS - Colher em seringas esterilizadas enviando-

as ou passar para frasco esterilizado.

H) SANGUE - Fazer desinfecção do local e com agulha e seringa estéreis colher da veia,

transferindo para frasco estéril com anticoagulante (SPS). Em animal morto puncionar diretamente do coração. Para estudo bacteriológico deve ser colhido 3 amostras em torno de

10 ml num intervalo de 24 horas.

L) LEITE - O úbere e mão do ordenhador devem estar limpos. Fazer desinfecção da

extremidade do teto com algodão embebido em álcool. Desprezar os primeiros jatos de leite

e colher em frasco esterilizado. Identificar quartos colhidos e de preferência individualizados. Colher em torno de 10 ml.

M) SWAB UTERINO (CERVICAL) - Desinfetar a vulva e com auxílio de um espéculo, colher o material do colo uterino com "swab". Enviar em meio de transporte, sendo possível fazer coleta intrauterina (swab próprio) para colher material de sítios profundos (ACCU-MED.CORPORATION). Fora os swabs próprios a coleta de materiais não é indicada devido a grande probabilidade de contaminação. O mais inicado nestes casos é a coleta cirurgica ou com espéculos vaginais esterilizados.

N) FRAGMENTOS DE ÓRGÃOS - Retirar fragmentos com cápsula de mais ou menos 7

cm de com primento por 5 cm de largura (30 a 100 gramas).

O) TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR: A única maneira de se obter amostras não

contaminadas do trato respiratório inferior antes da morte do animal são o aspirado e lavado

traqueais. O aspirado utiliza sondas específicas enquanto que o lavado trasntraqueal, ocorre a introdução de um cateter fino através de um oríficio feito entre dois anéis traqueais.

Soluções de Ringer com lactato são intiladas (2-5ml) e após o inicio de um paroxismo de tosse o fluido deve ser aspirado e remetido ao laboratório resfriado.

P) ORELHAS: As secreções devem ser colhidas com auxilio de swab e transportado para

o laboratório resfriado e em meio de transporte.

Q) PELE: As bactérias comensais são grandes conatminantesdas lesões e podem dificultar em muito o isolamento e caracaterização bacteriana. Pústulas podem ter seu conteúdo aspirado através de agulhas finas. Um aspeto importante é sempre desinfetar dequadamente

a pele antes da coleta de amostras que pode ser realizada com álcool iodado 1% e lavagem

com etanol 70%. Amostras de ferimentos e queimaduras profundas devem ser colhidas o mais profuno possível através de agulha fina. A instilação de solução salina ou Ringer com lactato podem ser indicados, para aumentar o volume a ser colhido.

SOLUÇÕES IMPORTANTES

1. MEIO DE TRANSPORTE STUART MODIFICADO

Ágar

0,3 g

Glicerofosfato de sódio

1,0 g

Tioglicolato de sódio

0,1 g

Cloreto de cálcio

0,01 g

Água destilada

100,0 ml

pH = 7,2

 

Distribuir em tubos e autoclavar à 120°C por 15 minutos.

2. ALCOOL IODADO

3. ALCOOL 70%

BIBLIOGRAFIA

CARTER, G. R. & COLE, J. R. Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and

Mycology.

5º ed. California, Academic Press Inc.; 1990. 620p.

FERREIRA, F.M. Antibioticoterapia em pequenos animais. São Paulo: Ícone Editora, 1997. 214p.

GARCIA

TINAJERO,

CORDOBA-PONCE,

Manual

- Laboratório de Bacteriologia Y Mycology. IICA. 1988. 316p.

R.

&

R.

Ilustrado

para

ENFERMIDADES BACTERIANAS DOS ANIMAIS DOMÉSTICOS COM RESPECTIVOS MATERIAIS A SEREM ENVIADOS PARA DIAGNÓSTICO

1. ACTINOBACILOSE

Colher nódulos, conteúdo purulento ou linfonódos atingidos.

2. BOTULISMO

Alimento suspeito, vômito, fezes, fígado, conteúdo estomacal e intestinal, soro sangüíneo coletado no início dos sinais clínicos.

3. BRUCELOSE

Soro, feto, conteúdo estomacal do feto, placenta, sêmen.

4. CARBÚNCULO

Osso longo, esfregaço de sangue , baço, fígado, linfonódos adjacentes a área atingida.

HEMÁTICO

5.

CAR. SINTOMÁTICO

Osso longo, clap de fígado, porção de tecido alterado, fígado.

E GANGRENA GASOSA

11

6.

CAMPILOBACTE-

Sêmen, secreção vaginal (colhido durante o estro) ou abomaso, fígado e pulmão fetal , raspado e lavado prepucial que deve chegar ao laboratório no máximo 6 hs após a colheita (ver meios e instruções em anexo).

RIOSE

7.

CERATOCONJUNTI-

Swab embebido na lágrima (saco conjuntival) do olho atingido, na fase de lacrimejamento. Remeter em meio de transporte (no máximo 48 hs após a colheita).

VITE

8. DIARRÉIA

Fezes, swab retal, linfonódio mesentérico, fígado, intestino delgado e grosso. (verificar porção mais atingida).

9. ENCEFALITES E

Colher um hemisfério cerebral, líquor.

MENINGITES

10. ENDOMETRITE

Swab uterino

11. ENTEROTOXEMIA

Conteúdo do intestino delgado, líquido de ascite, fígado, rim.

12. EPIDERMITE

Swab das lesões, crostas e fragmentos de pele.

EXSUDATIVA

13. ERISIPELA

Tonsilas, baço, rins, fígado, lesões cutâneas, articulações e sangue.

14. FOOT ROT

Tecido recentemente invadido pela bactéria. Dar preferência a animais que não tenham sido tratados.

15. HEMOGLOBINÚRIA

Osso longo, fígado, sangue.

BACILAR

16. LEPTOSPIROSE

Cérebro, fígado, rim, placenta, urina, soro.

17. MASTITE

Leite (5 a 10 ml)

12

18.

Fezes, porção terminal do intestino delgado (próximo a válvula íleo- cecal).

PARATUBERCULOSE

19. RINITE ATRÓFICA

Swab nasal, fragmento dos cornetos.

20. TUBERCULOSE

Linfonódos caseosos, fragmento de órgãos afetados.

ANEXOS

QUADRO DE REFERÊNCIA DE MICRORGANISMOS ENCONTRADOS EM AMOSTRAS DE DIFERENTES SÍTIOS NOS ANIMAIS DOMÉSTICOS

TIPO DE AMOSTRA

MICRORGANISMO PROVÁVEL

MORFOLOGIA

(GRAM)

Swab Nasal

Staphylococcus sp. Streptococcus sp. Pasteurella sp. Haemophylus sp. Corynebacterium sp. Bordetella sp. E. coli Mycoplasma sp.

coco (+)

coco (+)

bacilo (-)

bacilo (+)

bacilo (+)

bacilo (-)

bacilo (-)

FP (Giemsa)

Swab de Ouvido

Staphylococcus sp. Streptococcus sp. proteus sp. Pseudomonas sp. Klebsiella sp. Corynebacterium sp.

coco (+)

coco (+)

bacilo (-)

bacilo (-)

bacilo (-)

bacilo (+)

13

Swab e Líquido Sinovial

Staphy. e Streptococcus sp.

 

E.

coli

Erisipelothrix sp. Actinobacillus sp. Haemophylus sp. Mycoplasma sp. Salmonella sp.

Pele e Músculos

Actinobacillus sp. Clostridium sp. Bacteroides sp. Actinomyces sp. Corynebacterium sp. Staphy. e Streptococcus sp. Pseudomonas sp. Dermatophilus congolensis Brucella sp.

bacilo (-)

bacilo (+)

BP (-)

BP(+)

bacilo (+)

coco (+)

bacilo (-)

bacilo (+)

coco-bacilo (-)

Rim

Leptospira sp

E (Giemsa)

E.

coli

bacilo (-)

Corynebacterium sp. Klebsiella sp.

bacilo (+)

bacilo (-)

Conteúdo Purulento, Líquidos Pleurais e Peritoniais

Staphy., Strep. sp. Corynebacterium sp. Pasteurella sp. Actinobacillus sp. Actinomyces sp. Haemophilus sp. Pseudomonas sp. Bacteroides sp. Clostridium sp.

coco (+)

bacilo (+)

bacilo (-)

 

bacilo (-)

BP (+)

bacilo (-)

bacilo (-)

BP (-)

bacilo (+)

Líquido Cerebro-espinhal

Listeria sp. Achromobacter sp.

bacilo (+)

coco-bacilo (-)

Haemophilus sp. Staphy., Strep. sp.

bacilo (-)

coco (+)

E.

coli

bacilo (-)

Mycoplasma sp.

FP (Giemsa)

Pulmão

Mycobacterium sp. Diplococcus sp. Bacteroides sp. Mycoplasma sp. Haemophilus sp. Pasteurella sp. Actinomyces pyogenes Salmonella sp. Bordetella bronchiseptica

bacilo (+)

diplococo (+)

BP (-)

FP (Giemsa)

bacilo (-)

bacilo (-)

bacilo (+)

bacilo (-)

bacilo (-)

Fígado

Bacteroides sp. Corynebacterium sp. Clostridium sp. Achromobacter sp. Salmonella sp.

BP (+)

bacilo (+)

bacilo (+)

coco-bacilo (-)

bacilo (-)

Urina

E.

coli

bacilo (-)

Leptospira sp. Staphy., Strep. sp. Corynebacterium sp. Actinobacillus sp.

E (Giemsa)

coco (+)

bacilo (+)

bacilo (-)

TIPO DE AMOSTRA

MICRORGANISMO PROVÁVEL

MORFOLOGIA

(GRAM)

Leite

Staphy., Strept. sp.

coco (+)

E.

coli

bacilo (-)

Klebsiella sp. Pseudomonas sp. Brucella sp. Mycobacterium sp. Mycoplasma sp.

bacilo (-)

bacilo (-)

coco-bacilo (-)

bacilo (+)

FP (Giemsa)

Exsudato Ocular

Haemophilus sp.

bacilo (-)

Moraxella sp.

coco-bacilo (-)

Neisseria sp.

diplococo (-)

Mycoplasma sp.

FP (Giemsa)

Sangue

B.

anthracis sp.

bacilo (+)

Pasteurella sp. Yersinia sp. Coxiella sp. Clostridium sp. Streptococcus sp. Salmonella sp.

bacilo (-)

bacilo (-)

BP (-)

bacilo (+)

coco (+)

bacilo (-)

Erysipelothrix sp.

bacilo (+)

E.

coli

bacilo (-)

Material Fecal

Salmonella sp. Enterococcus sp.

bacilo (-)

coco (+)

E.

coli

bacilo (-)

Klebsiella sp. Proteus sp. Mycobacterium sp. Vibrio sp. Alcaligenes sp.

bacilo (-)

bacilo (-)

bacilo (+)

BC (-)

bacilo (-)

Trato Genital e Fetos

Brucella sp. Leptospira sp. Salmonella sp. Campylobacter sp. E. coli Listeria sp. Corynebacterium sp. Staphy., Strept. Sp.

coco-bacilo (-)

E

(Giemsa)

bacilo (-)

E

(Campo escuro)

bacilo (-)

bacilo (+)

bacilo (+)

coco (+)

FONTE: GARCIA TINAJERO & CORDOBA (1988)

MORFOLOGIA (Abreviaturas):

(+)

= gram positivo

(-)

= gram negativo

BP

= bacilo pleomórfico

FP

= Formas pleomórficas

E

= Espirilo

BC

= bacilo curvo

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ENFERMIDADES INFECCIOSAS

Tendo em vista os avanços obtidos na biologia molecular, muitas técnicas vêm sendo aplicadas para precisa classificação e diagnóstico das enfermidades bacterianas dos seres humanos e animais. Estas técnicas apresentam diversas vantagens, entre elas a grande sensibilidade, precisão e especificidade, não necessitar da viabilidade do organismo para sua caracterização, bem como automação, praticidade e facilidade de execução. Entretanto estas técnicas podem apresentar um alto custo, principalmente quanto poucas amostras são analisadas, uma vez que necessitam de reagentes importados, de equipamentos específicos e mão-de-obra especializada. A maior utilização destas técnicas tem possibilitado uma

redução considerável no custo dos exames. A tabela 1 relaciona as técnicas clássicas (classificação morfológica, bioquímica e tintorial), quanto as suas vantagens e desvantagens.

Tabela

1.

Vantagens

e

desvantagens

utilizadas no laboratório de microbiologia.

das

técnicas

fenotipicas

e

moleculares

 

Vantagens

Desvantagens

Métodos fenotípicos

Simplicidade Baixo custo Fácil padronização Grande utilização

Subjetividade na interpretação dos resultados Necessidade da viabilidade do microrganismo As vezes baixa reprodutibilidade Demora

Métodos moleculares

Sensibilidade e precisão Facilidade de execução Automação Rapidez

Custo Necessidade de pessoal treinado Algumas vezes limitado

TÉCNICAS BASEADAS NO ESTUDO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

PCR E SUAS VARIAÇÕES

POLIMERASE CHAIN REACTION-PCR (REÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE)

INTRODUÇÃO

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método para amplificação “in vitro” de segmentos de DNA. Este método é considerado excelente para caracterização de ácidos nucléicos, especialmente no que diz respeito a sua sensibilidade e especificidade. Sendo que pelo PCR, podem ser amplificados fragmentos de ácido nucléicos, a partir de picogramas do DNA molde presente nas amostras. O número de aplicações para o PCR parece infinito, sendo que entre elas podemos citar clonagem e seqüênciamento de DNA e cDNA genômicos, mutagênese “ in vitro”, análise de fingerprinting, medicina forense, testes para detecção de agentes infecciosos, diagnóstico de doenças genética perinatais, análise de variações nas seqüências genéticas alélicas, análises na estrutura da transcritos de RNA.

TÉCNICA

Esta técnica é baseada num processo cíclico que mimetiza a replicação do DNA, uma vez que o número de moléculas de DNA duplica após cada ciclo. Logo após x ciclos teríamos 2 x moléculas de DNA. Ou seja, após 30 ciclos seriam obtidos milhões de moléculas de DNA amplificado, o que justifica a sensibilidade da técnica.

As fases do Ciclo da PCR

Desnaturação: A desnaturação ocorre a altas temperaturas (rupturas da pontes de H), sendo que as duas fitas devem ficar separadas até que a temperatura seja reduzida. Geralmente esta temperatura pode ser de 91-97C. um dos fatores limitantes da temperatura de desnaturação, do número de ciclos e o tempo de execução do PCR é a meia vida da DNA polimerase (enzima que realiza a duplicação do DNA). A meia vida da Taq

polimerase é de 30 minutos a 95C, o que explica a realização de 30 ciclos. Geralmente o tempo de desnaturação varia de 15s (temperaturas elevadas, ex.: 96C) a 1 minuto (94-95C)

Annealing / Associação dos primers: Nesta fase os primers (oligonucleotídeos sintéticos), sintetizados para serem complementares as regiões franqueadoras do fragmento a ser amplificado, sendo que os dois primers devem ter os sítios 3´voltados para si e não devem ser complementares um ao outro (formação de primer-dimer). Devido o excesso de primers colocados em presença do DNA, a formação de um complexo primer-template é favorecida em relação a reassociação das fitas de DNA desnaturadas. A união dos primers ao DNA molde ocorre quando a temperatura baixa. A temperatura adequada para o annelaing depende diretamente do tamanho e constituição dos primers (TM). Geralmente a temperatura de annealing varia de 55-65C, sendo que o tempo nunca deve exceder 90 seg., pois pode haver hibridizações inespecíficas.

Extensão: amplificação dos segmentos de DNA realizado por uma polimerase 5´-3´para

replicação do complexo primer-template, sendo que o primer é incorporado ao produto de

amplificação. A amplificação destes complexos dá origem a dois tipos de moléculas

temperatura de extensão e de melhor atividade da enzima é de 72C, sendo que o tempo pode variar de 30 seg à 3 minutos, entretanto fragmentos maiores podem requerer um tempo maior (3Kb).

A

OBS.:

* Como dito anteriormente o número de ciclos normalmente utilizado em PCR são de 30,

sendo que esta variável depende da quantidade inicial de DNA presente na amostra. Entretanto um número maior de ciclos pode não ser interessante, uma vez que existe um

efeito plateau onde a amplificação do DNA cessa (meia vida da enzima e esgotamento dos constituintes da reação-mix);

* As diferentes temperaturas e tempo necessários para cada ciclo são obtidos com uma máquina denominada termociclador.

Constituintes do mix da PCR

Template: É a molécula de ácido nucléico molde utilizado para amplificação com os primers. Existem muitos métodos para preparação do DNA para PCR, sendo que em alguns casos até DNA com um certo grau de degradação pode ser utilizado, principalmente para amplificação de fragmentos de tamanho menor. Um grande número de substâncias encontradas na amostra (DNA) podem reduzir a eficiência do PCR, como uréia, SDS, acetato de sódio, EDTA, fenol, etanol, hemoglobina entre outros. Geralmente 100ng de DNA genômico são suficientes para amplificação por PCR.

Primers: Oligonucleotídeos sintéticos que variam de 18-30nt, que são projetados para serem complementares as extremidades do fragmento de DNA a ser amplificado. Os primers podem ser específicos para determinada região do DNA ou serem universais. Primers universais contém seqüências que são extremamente comuns a um grande número

de espécies. Como exemplo tem-se os primers universais para bactéria. Em casos onde não

se sabe a seqüência total do sítio a ser amplificado, devem ser utilizados primers degenerados que são construídos a partir da seqüência de proteína (código genético).

Entretanto alguns nucleotídeos não são precisamente estimados, devido à degeneração prórpia do código genético. Ex.: HisPheProPhe=CAYTTYCCNTTY, onde Y=pirimidinas, N=qualquer base

A temperatura de anelamento e a concentração de Mg presente no tampão são muito

importantes para a correta associação dos primers com a seqüência de interesse e desta forma para especificidade do PCR

DNTPs: São os nucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) que servem de substrato para duplicação das seqüências de DNA, sendo utilizados numa mistura. Em alguns casos estes nucleotídeos podem ser marcados com compostos radioativos ou flourogênicos para o sequenciamento de regiões do DNA.

Enzima: Inicialmente o PCR utilizava o fragmento Klenow da DNA pol I de E.coli, entretanto este fragmento era instável a temperatura e devia ser reposta após cada etapa de desnaturação (em cada um dos 30 ciclos!), constituindo num processo laborioso. Porém, o isolamento e clonagem de DNA polimerases de organismos termofílicos, que crescem a elevadas temperaturas (algumas próximas a 100C), permitiu avanços significativos a técnica de PCR. A enzima mais utilizada para o PCR é a DNA polimerase (Taq DNA polimerase) de Thermus aquaticus, uma alga que cresce em poços vulcânicos. Entretanto esta enzima é conhecida por inserir erros (substituições) na sequência de DNA amplificada, uma vez que esta não apresenta atividade de proofreading 3´-5´ e exonuclease. Por esta razão enzimas com maior precisão se tornam adequadas para amplificação de fragmentos grandes (devido a problemas com a processividade) e onde seja necessária uma grande fidelidade com a seqüência alvo.

Tampão de enzima: tampão recomendado para a DNA polimerase, sendo que este geralmente contém. Deve sempre ser diluído em água Milli-Q visando à obtenção de uma concnetração dos sais adequadas, sendo:

10-50mM Tris-Cl, pH 8,3 50mM de KCl 1,5mM ou mais de MgCl 2

As concentrações de magnésio podem variar de acordo com o grau de especifidade requeridos pelo teste, quanto maiores as concentrações deste íon maior a especificidade do PCR.

Verificação dos produtos amplificados: Realizada em gel de agarose, corado com brometo de etídeo e visualizados sob luz UV.

Cuidados na realização do PCR:

CONTAMINAÇÃO!!!!!!!!!!!!!!!!

*Sempre preparar a mix num local onde não exista manipulação com ácidos nucléicos *Utilizar tips novos *Utilizar luvas *Evitar maipulação exagerada *Utilizar pipetas livres de contaminações *Acrescentar o template num local diferente daquele onde se prepara a mix

VARIAÇÕES DA PCR

PCR multiplex

Nesta técnica utilizam-se mais de um par de primers, sendo obtidas mais de um resultado ao mesmo tempo, poupando tempo e reagentes. Pode ser utilizado para identificar dois genes de um mesmo organismo, ou dois microrganismos diferentes presentes numa amostra. Um problema associado a esta técnica é a competição entre os primers para amplificação de suas seqüências alvo, a formação de primers-dimers e a temperatura de annealing que deve ser a mesma para os dois conjuntos.

PCR Nested

Nesta técnica o DNA é inicialmente amplificado com um para de primers e em seguida este produto de amplificação é utilizado como template (molde) para um novo PCR empregando primers construídos para região interna a amplificada inicialmente. Uma variação da técnica é o PCR semi nested, onde apenas um primer e desenhado para região interna do produto amplificado na primeira reação, sendo o utilizado um dos primers utilizados inicialmente para completar o para, ou seja, é amplificada uma extremidade. Esta

técnica é utilizada para melhorara tanto a sensibilidade como especificidade, porém o problema de contaminação é maior, bem como a interferência dos constituintes da primeira reação na segunda (excesso de primers, DNTP, produtos abortados, impurezas

RT-PCR

PCR empregado para verificar a expressão de genes e montar bancos de cDNA. Neste método ocorre inicialmente a síntese de uma fita de DNA molde a partir de uma fita de RNA, utilizando a enzima transcriptase reversa (retrovírus). Inicialmente gera-se uma molécula híbrida DNA-RNA, contudo a fita de RNA é removida pela adição de RNAses (RNAse H) e a molécula de DNA serve de molde para o ensaio de PCR convencional. OBS.: RNA não serve como molde para amplificação por PCR.

ELETROFORESE EM AGAROSE (DNA)

A eletroforese em gel de agarose (polímero que se forma quando hidratado fundido e colocado em temperatura ambiente) permite a separação de fragmentos de DNA através de uma rede de poros, que permitem a rápida passagem dos fragmentos pequenos de DNA enquanto retarda os fragmentos maiores. Está separação só é possível devido a carga elétrica negativa característica do DNA. Quando as moléculas de DNA são colocadas num campo elétrico estas tendem a migrar do pólo negativo para o positivo, permitindo desta forma a separação no gel de agarose. Num gel de agarose O DNA é detectável pela adição de brometo de etídeo o qual é um agent intercalante que se coloca entre as fitas de DNA. Quando o brometo de etídeo é colocado sobre luz ultravioleta este emite uma fluorescência laranja, visível a olho nú. As amostras devem ser aplicadas no gel com um tampão de amostra que contém compstos de alta densidade (glicerol, xilol e azul de bromotimol), que permitem a descida do DNA para os poços formados no gel.para assegurar a correta migração do DNA estes devem ser colocados numa câmara contendo um tampão (TBE ou TAE), sendo que a

velocidae de migração do DNA no gel está diretamente relacionado com a concentração de agarose e voltagem presente no campo elétrico.

Tabela 2. Resolução dos géis de DNA

Matriz

%

Espectro de separação

Obs.

poliacrilamida

20

5- 100pb

 
 

15

20-150pb

 
 

8

60-400pb

Sequenciamento de DNA

agarose

2

0,2-1,5Kb

PCR

 

1,5

0,3-3Kb

PCR

 

1,0

0,5-5Kb

 
 

0,8

1-71Kb

DNA GENÔMICO

 

0,4

5-30Kb

Mega plasmídeos

Pulse-field

 

>5000Kb

CHEF

SOUTHERN E NORTHERN BOT

Esta técnica tem como príncipio a complementaridade do DNA e do RNA, bem como a desnaturação e renaturação de suas fitas. Entre os inúmeros fragmentos presentes amostra de DNA genômico, digerido com enzimas de restrição fica impossível identificar genes específicos, contudo se fragmentos específicos do gene de estudo forem marcados, estes podem procurar seqüências complementares neste DNA total da bactéria e se ligar, indicando em que fragmento de restrição o gene se encontra. Além disto esta técnica pode ser usada para verificar identidade de produtos amplificados (por PCR) ou de misturas de RNAs, ou seja se dois produtos de PCR ou moléculas de RNA são iguais ou complementares estes devem hibridizar. Nesta técnica o DNA ou RNA extremamente puro e em alta quantidade deve ser aplicado num gel de agarose para que todos os fragmentos a serem estudados (DNA total bacteriano digerido com enzimas, fragmentos de PCR) possam ser separados. Em seguida

as moléculas de DNA são imobilizadas em membranas de hibridização, a fim de facilitar a manipulação. Estas membranas podem ser de nylon ou nitrocelulose e são carregadas positivamente, o que permite que o DNA ligue-se a elas na mesma posição que ocupavam no gel anteriormente. Para transferência pode ser utilizada corrente elétrica ou gradiente de sais e álcalis. Em seguida, o DNA deve ser desnaturado pelo aumento da temperatura e a sonda (gene conhecido ou produto de PCR conhecido) marcada, com material radioativo ou peroxidase são acrescentadas, sendo esta mistura incubada. Depois de um período de incubação (que pode ser de horas a dias), renaturação e lavagens para remover a sonda não ligada, a membrana é colocada sobre um filme de raio X para que ocorra a sensibilização do mesmo. Se esta ocorrer, ou seja, se verificarmos bandas presentes no filme isto indica que a sonda ficou presa ao DNA ou RNA estudados, estes são complementares. Estas técnicas são utilizadas para aumentar a sensibilidade dos métodos de diagnóstico para bactérias. Para que as moléculas de RNA hibridizam, qualquer impedimento espacial deve ser removido (pareamentos intra molécula), pela adição de um agente desnaturante, como exemplo a formamida.

2.Comparação da sensibilidade de técnicas de detecção de microrganismos

Método

Sensibilidade em número de células

Coloração com brometo de etídeo

10

8

Sondas radiomarcadas

10

6

Sondas maracadas com enzimas

10

4

PCR

10

ANÁLISE DO DNA POR RESTRIÇÃO COM ENDONUCLEASES

Endonucleases: são enzimas que tem a capacidade de clivar o DNA e sítios específicos de modo altamente preciso. Estas enzimas normalmente reconhecem seqüências ditas palindrômicas, ou seja que podem ser lidas da mesmas forma em ambas as fitas de

DNA, tanto no sentido 5´-3´, como no 3´-5´ ( Ex.: SOCORRAM ME SUBI NO ONIBUS EM MARROCOS). As endonucleases são produzidas geralmente para degradar DNA exógeno (bacteriófagos), logo são inefetivas contra o DNA da própria bactéria. As endonucleases podem tanto clivar o DNA em nucleotídeos na mesma posição gerando extremidades blunch ou cegas, ou clivarem as fitas de DNA nuleotídeos em posições diferentes no palíndromo (extremidades coesivas). As endonucleases recebem o nome das bactérias onde foram encontradas, senod que alguns exemplos podem ser vistos na tabela 3

Tabela 3. Principais endonucleases utilizadas em biologia molecular

Enzima

Organismo

Sitio no DNA 5´-3´

AluI

Arhobacter luteus

AG/CT

TC/GA

BamHI

Bacillus amyloliquefaciens

G/GATCC

CCTAG/G

BglII

Bacillus globigii

A/GATCT

TATAG/A

EcoRI

Escherichia coli

G/AATTC

CTTAA/G

HaeIII

Haemophillus aegyptius

GG/CC

CC/GG

Hind III

Haemophillus influenzae Rd

A/AGCTT

TTCGA/A

KpnI

Klebsiella pneumoniae

C/CATGG

GGTAC/C

PstI

Providencia stuartti

CTGC/C

G/ACGC

SmaI

Serratia marcensces

CCC/GGG

GGG/CCC

TÉCNICAS BASEADAS NO ESTUDO DAS PROTEÍNAS

Estas técnicas também exigem a viabilidade da bactéria, uma vez que uma proteína só será expressa em quantidades detectáveis se a bactéria estiver viva e fazendo a sua expressão (traduzindo a proteína de interesse). Além disto, muitas destas técnicas utilizam anticorpos para detectar determinadas proteínas logo exigindo que estas sejam capazes de induzir uma resposta imune específica (resposta contra uma proteína em especial sem respostas cruzadas). Estes anticorpos podem ser obtidos de diferentes maneiras

Hiperimunização: Por esta técnica cobaios são inoculados sucessivamente com a proteína de interesse fazendo com que este animal produza grande quantidades de anticorpos. Para obtermos estes anticorpos devemos sangrar o animal e purificar o soro que estará rico em anticorpos.

Ac Monoclonais: Para obtenção de anticorpos monoclonais, linfócitos B (células produtoras de ac) são fusionadas a células carcinogênicas (com alto potencial de multiplicação e sobrevivência). Com isto teremos uma célula capaz de produzir anticorpos e sobreviver in vitro e in vivo. Os anticorpos podem ser obtidos de duas formas: ou inoculando estas células em cobaios (líquido ascítico) e inoculando a proteína de interesse ou em placas de cultivo celular (sobrenadante).

ELETROFORESE

ELECTROPHORESIS)

PARA

PROTEÍNAS

SDS-PAGE

(POLIACRILAMIDE

GEL

OF

A eletroforese de proteínas é uma técnica muito utilizada para determinar a presença de determinadas proteínas bacterianas como enzimas, proteínas de superfície e toxinas. As proteínas podem ser obtidas pela lise simples da bactéria, por processos físicos e químicos, entretanto muitas vezes protocolos elaborados para purificação destas podem ser necessários. Entretanto, um aspecto comum para todas as proteínas é que estas devem estar desnaturadas, o que é obtido pela fervura com mercaptoetanol e que estas devem ter suas

cargas positivas neutralizadas (para que todas possam ter a mesma orientação de corrida no gel). Para isto é utilizado o SDS, o qual é um poderoso detergente aniônico (agrega radicais negativos e neutraliza positivos), entretanto este também induz a desnaturação protéica. As amostras de proteína então migram, sendo que os poros formados pela acrilamida separam as proteínas pelo seu peso molecular. A acrilamida é um polímero que se forma após a mistura de TEMED e persulfato de amônio. Para detecção das proteínas são usados corantes contendo ácido tricloroacético, Comassie Blue ou prata (somente para proteínas com resíduos de lisina, cisteína e metionina).

Eletroforese bidimensional: analisas as diferenças na massa e potencial isolelétrico das proteínas, produzindo maiores informações a respeito das mesmas.

Gel de atividade: para muitas enzimas se torna necessário a determinação de sua atividade “in vitro”, para isto pode-se usar o gel de acrilamida, entretanto sem SDS, uma vez que este induz a desnaturação protéica com conseqüente perda de atividade. Em seguida ensaios enzimáticos podem ser realizados sobre o gel, acrescentando-se o substrato para a enzima e medindo o produto final formado.

WESTERN BLOT OU IMUNOBLOT

Esta técnica se assemelha em muito com a técnica de southern blot é uma técnica muito sensível para detecção de uma determinada proteína. Nesta técnica os géis de poliacrilamida são utilizados para separar misturas de proteínas. Em seguida estas são transferidas por potencial elétrico para membranas de nylon (membranas de Nc ligam-se muito mal a proteínas). Em seguida, anticorpos primários (produzidos de modo descrito acima) são incubados com a membrana e se a proteína de interesse estiver presente estes se fixarão. Se estes anticorpos estiverem marcados radioativamente, ou com preroxidase estes produzirão uma impressão no filme de raio X, indicando a presença da proteína de estudo.

Porém se este anticorpo não estiver marcado, anticorpos secundários marcados devem ser utilizados.

ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)

Esta técnica apresenta uma grande aplicação nos mais diferentes campos da biologia. Entre as muitas vantagens desta metodologia podemos citar a simplicidade, praticidade, rapidez, sensibilidade e especificidade, segurança e custo. Porém equipamentos específicos são necessários para leitura dos resultados. O principio da técnica está na habilidade de anticorpos se ligarem a proteínas. Estes anticorpos conhecidos são ligados a enzimas que em presença de certos substratos levam ao desenvolvimento de cor que pode ser detectada de modo muito preciso em espectrofotômetros (leitores de ELISA). Podem detectar tanto as bactérias como os anticorpos específicos para as proteínas bacterianas.

Os passos básicos de em ELISA são descritos abaixo:

1. ligação passiva de proteínas ou anticorpos ao plástico

2. Lavagem para remover excessos

3. Adição da amostra (contendo ac ou proteínas)

4. Uso de proteínas inertes (molico) para reduzir respostas inespecíficas

5. Nova lavagem

6. adição de um anticorpo ou anti-anticorpo maracado com uma enzima

7. Uso de proteínas inertes (molico) para reduzir respostas inespecíficas

8. Nova lavagem

9. Adição de um substrato e incubação

10. parada na catálise

11. medida da cor por espectrofotometria

ESTUDOS DE HIBRIDIZAÇÃO “IN SITU”

Utiliza sondas (DNA ou RNA) ou anticorpos para detecção de ácidos nucléicos ou proteínas especificas de bactéria diretamente nos tecidos do hospedeiro. Estas técnicas só são realizáveis em amostras de cortes histológicos, ou seja, oriundo de necropsias ou biópsias.

Streptococcus equi equi (GARROTILHO, STRANGLES)

Etiologia

O garrotilho, também conhecido como Strangles (do inglês enforcar) é uma enfermidade respiratória aguda dos eqüinos, caracterizada pela inflamação mucopurulenta das bolsas guturais e linfadenite com formação de abscessos, especialmente nos linfonodos submandibulares e retrofaríngeos. Esta bactéria traz um grande prejuízos aos criatórios eqüinos do mundo, a ponto de em 2000 iniciar-se o projeto genoma de S. equi equi, concluído em 2001, que possibilitou o acesso gratuito a 99% das seqüências de DNA obtidas e ao estudo de possíveis candidatos para o desenvolvimento de vacinas contra a bactéria.

Patogenia

A infecção geralmente inicia pela inalação ou ocasionalmente por inalação. Após adentrar no trato respiratório superior esta alcança rapidamente os linfonodos da cabeça. Neste local a bactéria replica e atrai inúmeras células de defesa, como macrófagos e neutrófilos. A inflamação evolui para formação de pus, o qual é drenado através de sinus. Estes processo geralmente envolve duas a três semanas onde são observados sinais de depressão, perda de apetite, febre, descarga nasal mucopurulenta e dispnéia. A formação e ruptura dos abscessos em outros órgãos são denominados garrotilho bastardo e pode levar a morte do animal acometido (10% dos casos). Outra complicação observada é a púrpura hemorrágica

(petéquias e edema generalizado, com complicações articulares e olhos é associada a formação de imunocomplexos entre anticorpos e a proteina M-like do S. equi equi. Entre os fatores implicados na virulência do S. equi eui podemos citar:

- Adesinas: As adesinas de S. equi equi são muitos importantes para que a bactéria possa

colonizar e se nutrir nos mais diferentes tecidos animais. Os principais receptores encontrados nos tecidos são a fibronetina e o fibrinogênio.

- Cápsula: Cepas acapsuladas produzidas no laboratório foram capazes de aderir e persistir nas bolsas guturais, entretanto não conseguiram reproduzir a s alterações patologias.

- Proteína Associada ao Hialuronato (HAP): É uma proteína de 53kDa associada a síntese

da cápsula, sendo, que anticorpos contra esta proteína, tem reduzido consideravelmente a

formação de cápsula e a patogenicidade bacteriana. Em virtude disto diversos estudos vem sedo desenvolvidos para a utilização desta na confecção de vacinas de subunidades. -Proteina M: São proteínas que ligam o fibrinogênio e possuem a capacidade de inibir a fagocitose. Esta proteína foi grandemente associada a patogenicidade bacteriana, contudo recentemente sua propriedade subespécie especifica tem demonstrado um grande potencial na taxonomia bacteriana, bem como bactérias que possuem um deleção (proteína truncada) na região amino-ternimal tem indicado a perda da patogenicidade pelo isolado e a sua presneça como um portador. A atividade antifagocitária desta proteína parece estar

associada a dois fatores: inibição na deposição do C3b e ligação ao fibrinogênio, que inibe a fagoitose.

- SOD: Ainda esta sendo estudada, embora o S. equi equi possua uma Mn-SOD.

Epidemiologia

A enfermidade afeta eqüinos de todas as idades, contudo é comum em animais com menos de dois anos de idade. Os animais infectados adquirem imunidade, embora possam adoecer novamente. A égua transmite a imunidade passiva ao potro por até 3 meses.

A transmissão ocorre pelo contato direto entre animais doentes e sadios. Tratadores

também podem ser indicados como transmissores, assim como água, cama, estábulos, utensílios e insetos. O S. equi equi pode permanecer viável por várias semanas ou meses. Vinte por cento dos animais infectados albergam a bactéria durante a recuperação. O estresse, transporte excesso de trabalho e infecções virais aumentam a susceptibilidade dos animais e precipitam, surtos.

Sinais Clínicos

Os animais apresentam febre (41C), anorexia, depressão e corrimento nasal mucopurulento e bilateral. O animal pode apresentar também tosse, devido a compressão da laringe ou faringe. O animal apresenta a cabeça baixa e conjuntivite purulenta pode ser observada. O infarto dos linfonodos ocorre rapidamente com comprometimento dos linfonodos regionais, em especial o retofaríngeo e submandibular. Estes encontram-se na maioria das vezes edemaciados e doloridos, inicialmente firmes tornando-se com a evolução do abscesso amolecidos. Em 10 dias pode ocorrer a ruptura dos abscesso, com elimincação degrandes qauntidades de pus amarelado de consistência amarelada . a ruptura interna dos abscesso pode levar a formação de abscessos no fígado, rins, SNC e articulações.

Patologia

AS lesões observadas são inespecíficas e caracterizam-se por rinite, faringite e laringite aguda. Nos linfonodos se observa grande quantidade de pus.

Diagnóstico

O diagnóstico baseia-se, principalmente nos achados clínicos e na demonstração da

bactéria em esfregaços de exsudato nasal ou pus. O RX dos linfonodos pode confirmar o diagnóstico. Com tudo esta só e definitiva pelo isolamento bacteriano. O S. equi equi pode

ser isolado em AS a partir de swabs colhidos e enviados em leite molico estéril. È

característicos para identificação a formação de gama hemólise (total). A hemólise é associada a patogenicidade bacteriana.

O garrotilho pode ser confundido em sua fases iniciais com outras infecções

viricas, como a influenza eqüina e com outras infecções piogênicas, como a pneumonia por S. equi zooepidemicus. Neste caso a diferenciação torna-se complicada pela similaridade entre as duas subespécies. Vários métodos para o diagnóstico molecular da enfermidade vem sendo pesquisados. Um PCR baseado na proteína M-like detectou 90% dos carreadores, enquanto que a cultura sozinha detectou apenas 60%. Contudo a PCR só obteve resultados conclusivos, quando amostras repetidas foram colhidas, indicando a necessidade de outros métodos de diagnóstico. Recentemente técnica de PCR para detecção de amostras de S. equi equi em carreadores (com deleção da proteína M) e o sequenciamento de DNA para diferenciação das duas subespécies estão em desenvolvimento no país.

Tratamento

O tratamento da enfermidade é indicado no caso de complicações respiratórias e

febre, sendo indicado por no mínimo 7 dias. O uso dos antibióticos no início da enfermidade está associado a redução na formação dos abscessos. O S. equi equi é sensível a penicilinas e sulfas, sendo resistentes a estreptomiinas, tetraciclinas e gentamicina.

Contudo o uso de antibióticos pode ser ineficaz, principalmente devio a fraca irrigação dos abscessos impedindo a entrada das drogas.

O uso do calor também pode ser indicada para amolecimento e facilitar a

drenagem. Após a drenagem o tratamento com iodo é importante para evitar infecções

secundárias.

Controle e Profilaxia

Em surtos de garrotilho se torna importante o isolamento dos animais de no mínimo 4-5 semanas, bem como a quarentena dos animais que entram na propriedade. Animais convalescentes podem manter a bactéria por mais de seis semanas nas bolsas guturais. Cuidados devem ser tomados com material que entrar em contato com os animais doentes, como cordas, baldes e seringas. Os estábulos devem ser limpos e as camas queimadas.

Infecção por Rhodococcus equi em potros

Etiologia

R. equi é um cocobailo gram positivo, previamente classificado com Corynebacterium equi. Esta bactéria apresentam colônias mucóides, coalescentes e branco acinzentadas. Algumas colônias apresentam a coloração Salmon. Esta bactéria é um patógeno oportunista que ocasiona um broncopneumonia piogranulomatosa, enterite ulcerativa e linfadenite mesentéria em potros com menos de três meses de idade. Bovinos, caprinos, suínos e até o homem podem ser infectados. Nos seres humanos esta bactéria acomete hospedeiros imunossuprimidos, como aidéticos, transplantados e doentes crônicos. Um terço das infecções humanas acontecem sem o contato com eqüinos. Isto pode ser explicado pelo caráter telúrio da bactéria, sobrevivendo no solo de parques e praças nas grandes cidades. A principal fonte de contaminação dos potros pela bactéria são as fezes de animais doentes, ricos em amostras virulentas. A contaminação do solo acontece com disseminação da bactéria pelo vento, indicando alta na prevalência nos meses de verão. O potro se contamina, principalmente pela inalação ou ingestão.

Patogenia

Após a infecção esta bactéria intracelular é fagocitada pelos macrófagos levando ao desenvolvimento de uma lesão piogranulomatosa. A base da patogenicidade bacteriana está associada em sua habilidade em persistir a morte intracelular nos macrófagos. Esta encontra-se associada a inibição da junção fagolisossomal, que ocorre pela presença da proteína associada a virulência (VAP). Esta proteína, na verdade uma família de proteínas (VAP A-G) é codificada por genes num operon localizado num megaplasmídeo de 85- 90Kb. Este plasmídeo é encontrado numa única cópia por célula bacteriana e a sua perda natural (cura) está associada na perda da patogenicidade dos isolados para os eqüinos. Contudo ensaions em camundongos imunossuprimidos e em achados clínicos humanos indicam que para homem isolados sem o plasmídeo de virulência podem ainda ser patogênicos. Entre os demais fatores de virulência podemos citar o fator equi (colesterol oxidase), resposável pela penetração da bactéria nos tecidos, o ácido micólico da parede celular e antígenos capsulares. Contudo seu papel na patogenicidade é controverso, pois tantos isolados virulentos, como apatogênicos os possuem. A SOD foi recentemente descrita em R. equi, sendo relacionada a sobrevivência a morte intracelular em macrófagos e com o disparo da expressão dos genes vap.

Epidemiologia

O período de maior riso para os potros vai dos 2-6 meses de idade, período que coincide com a baixa na imunidade materna e ausência de um sistema imune (humoral e celular) eficientes.A enfermidade é endêmica e a maioria dos haras apresenta a bactéria, contudo a ocorrência dos surtos é grandemente associada a presença de bactérias virulentas no solo, ou seja diretamente proporcional ao número de casos clínicos, uma vez que estes eliminam a bactéria em suas fezes. As taxas de morbidade variam de 5-17%. Taxas de mortalidade acima de 80% podem ser observadas, especialmente onde o controle e tratamento não sejam corretamente aplicados. Estudos apontam que o R. equi é responsável

pela mortalidade de 3% dos potros ao redor do mundo. Trabalham apontam que o puro sangue árabe é uma raça bastante predisposta a infecção por R. equi.

Sinais Clínicos

A doença é associada a formação de abscessos pulmonares múltiplos, com febre (41C), tosse, descarga nasal bilateral, depressão, taquipinéia. A doença progride até septicemia e morte por asfixia. Nos potros com infecção crônica pode ser observada diarréia resultante da invasão bactéria do cólon. A evolução da enfermidade pode ser acompanhada pela elevação do fibrinogênio e do número de leucócitos. A enfermidade em eqüinos adultos é rara e geralmente associada a imunossupressão. R. equi pode estar associado a aborto, infertilidade e mastites em fêmeas eqüinas.

Patologia

As

lesões macroscópicas observadas são broncopneumonia supurativa, com extensa

abscedação e linfadenite associada. No intestino pode ser observada a linfadenite mesentérica, principalmente nas placas de Peyer. No microscópio, pode ser observado o severo infiltrado de células fagocíticas em especial células gigantes multinucleadas. A degeneração dos macrófagos é compatível com o grau de dano ao parênquima pulmonar, bem como a ação suicida dos neutrófilos. A necrose caseosa pode ser observada em infecções crônicas, contudo a supurativa é freqüentemente encontrada.

Diagnóstico

O diagnóstico precoce é fundamental para o controle e redução das perdas

associadas a enfermidade. Torna-se importante diferenciar a infecção por R. equi daquelas

ocasionadas por outros patógenos respiratórios como o S. equi zooepidemicus. A idade do surgimento dos sinais clínicos pode ser fundamental.

O diagnóstico definitivo somente será obtido após a confirmação da bactéria em

esfregaços traqueobronquiais. Contudo o isolamento do R. equi pode demorar até 48hs em AS. Para apressar este diagnóstico varias metodologias vem sendo empregadas como o ELISA, sem bons resultados e a PCR com resultados promissores em lavados traqueo bronquiais e sangue. Esta ténica apresneta a grande vantagem de produzir resultados rápidos e precisos.

O monitoramento clínico dos potros (auscultação e temperatura) é importante para

o estabelecimento de um diagnóstico e terapias precoces. A radiografia torácica pode ajudar na confirmação dos resultados.

O teste de IDGA baseado no fator equi tem sido muito útil no diagnóstico da

infecção, contudo estas provas estão sujeitas a falhas.

Tratamento e Controle

O tratamento da pneumonia por R. equi é realizada pela associação de eritromicina e rinfampicina, contudo estas drogas podem apresentar inúmeros problemas, como o desenvolvimento de resistência bacteriana e reações alérgicas nos potros. Outras drogas

como a josamicina vem sendo estudadas. Os efeitos colaterais observados ao usoa da droga são anorexia cólica e bruxismo. As doses dos mediamentos utilizaos na terapia da infeção por R. equi são descritos na tabela abaixo.

A terapia de apoio é muito importante, comofluidoterapia e nebulização. Potros com

dificuldade respiratória podem ser submetidos a oxigenioterapia. O uso do plasma hiperimune em potros com deficiência na ingestão de colostro (bancos) e co os primeiros sinais clínicos pode ser fundamental. Os anticorpos facilitam a eliminação do R. equi pela opsonização. O uso de vacinas, inclusive de DNA, para profilaxia da infecção por R. equi é

muito controversa. Outras medidas de controle incluindo redução na poeira, aguamento dos passeios, remoção da fezes, isolamento dos potros e parição no pasto são muito indicadas.

COLIBACILOSE E DOENÇA DO EDEMA (Escherichia coli)

Etiologia Escherichia coli é um cocobacilo gram negativo possuidor de flagelos peritriquios. Culturas bacterianas puras podem ser obtidas após um dia de incubação, devido seu reduzido intervalo entre gerações. O gênero Escherichia é constituído de um grande número de espécies, contudo somente a E. coli é um patógeno significativo para os animais. Esta bactéria faz parte da flora normal do trato gastrointestinal, sendo seu habitat natural o cólon. Os microrganismos se estabelecem no intestino logo após o nascimento, através da contaminação oral por bactérias originadas da mãe ou do meio ambiente. A maior parte das cepas de E.coli constituintes da microflora intestinal não são patogênicas. E. coli patogênicas são um pequeno grupo presente em animais adultos. Estas bactérias podem ser transmitidas por via oral para os animais jovens, podendo ocasionar diarréias e septicemia em várias espécies domésticas, como leitões, terneiros, potros, cordeiros e cãezinhos. A E. coli também pode estar envolvida como oportunista em inúmeras enfermidades do trato urinário e pneumonias.

Patogenia

A susceptibilidade de animais jovens às infecções por E. coli parece estar relacionada com a presença de receptores para certos tipos de fimbrias (K88-F4, K99-F5, F41, 987P-F6). O decréscimo nestes receptores está diretamente relacionado com a diminuição na ocorrência da enfermidade em terneiros, leitões e cordeiros. A Escherichia coli é um importante patógeno para bovinos e suínos confinados, sendo que este organismo pode causar colibacilose entérica e septicêmica nestes animais, além da doença doedema em suínos. A colibacilose entérica ocorre com maior freqüência em animais mantidos de forma intensiva, sendo raramente observada em animais criados extensivamente Tendo em vista o caráter oportunista da bactéria, a colibacilose neonatal ocorre pela ingestão de bactérias de origem ambiental, ausência das defesas naturais, como flora normal dos intestinos e barreira gástrica, presença de receptores para pili nos recém

nascidos e alta susceptibilidade as enterotoxinas produzidas por E.coli. Associados a estes fatores, a inadequada ingestão de colostro pelos leitões é considerada como um dos principais fatores predisponentes. Nestes casos, a bactéria tende a ocasionar doença nos animais recém nascidos. Por outro lado, o estresse e a redução nos níveis de anticorpos recebidos passivamente desempenham um importante papel na infecção por ETEC em suínos desmamados. O estresse provocado pelo desmame induz a uma elevação do pH gástrico, provocando redução na atividade bactericida do estômago. A diarréia pós desmame é associada à elevação no número de E.coli hemolíticas presentes no trato intestinal, em relação às não hemolíticas. Este aumento ocorre devido à má absorção, provocada pela troca na dieta alimentar, que cria o ambiente ideal para multiplicação de E. coli hemolítica.

Fatores de Virulência bacteriana

Antígenos capsulares (K) são muito importantes para estes microrganismos, uma vez que protegem a célula bacteriana do ataque de partículas do complemento, bem como da fagocitose por células de defesa do hospedeiro. Existem no mínimo 80 antígenos K distintos. Os dois componentes de superfície de Escherichia coli, que constituem a base da classificação sorológica são os antígenos O (sorogrupo) e os antígenos H (sorotipo). Os antígenos O são lipopolissacarídeos (LPS) da parede celular, sendo muito importantes como fatores de virulência. Além de possuir um efeito tóxico (lipídio A), o comprimento da cadeia de LPS é responsável pelo retardamento do ataque do complexo de membrana do complemento. Existem aproximadamente 165 antígenos O sorologicamente diferentes. Quase todas as amostras de E.coli são móveis, devido à presença de flagelos peritríquios (antígenos H, de “Hauch”, flagelo em alemão). Existem no mínimo cinqüenta antígenos flagelares distintos.

Enterotoxinas: são proteínas plasmídio-codificadas, que ocorrem como toxinas termolábeis (LT) e toxinas termoestáveis (ST). A toxina termolábil é a maior e mais

imunogênica das proteínas, apresentando uma relação de 75% de identidade, na seqüência

de aminoácidos, com a toxina da cólera esta pode ser divida em dois tipos A e B

molécula da LT é divida em 1 subunidade A e cinco subunidades B. A ação desta toxina baseia-se na estimulação da enzima adenilciclase em enterócitos. A subunidade B é um multímero, que se liga a receptores (gangliosídeo GM1), permitindo translocação da unidade A através da membrana celular. Esta, após ativação, induz a enzima adenilciclase a uma superprodução de AMP cíclico. O AMPc estimula a abertura de canais para cloro nas células crípticas e o bloqueio na absorção de cloreto de sódio nas células apicais. Por osmolaridade, ocorre a perda de água e eletrólitos para a luz intestinal. Estes eventos levam

A

à diarréia, hipovolemia, acidose metabólica e hiperkalemia. A enterotoxina termoestável (ST) apresenta um peso molecular menor que a LT, entretanto, provoca um efeito biológico semelhante. Existem dois subtipos de toxinas ST:

STa e STb. A STa afeta o sistema guanidilciclase, levando à produção de GMPc e bloqueio da absorção de cloreto de sódio. Segundo GYLES & THOEN (1993), existem evidências de que a guanidilciclase é o próprio receptor para STa . A STb é a enterotoxina mais comumente identificada em suínos, entretanto sabe-se que a presença somente da STb não é suficiente para o desenvolvimento de infecção em suínos neonatos. A toxina STb ainda não tem seu papel na patogenicidade bacteriana bem definido

Verotoxinas (VT) ou Shiga-Like Toxinas (SLT) receberam estes nomes, devido sua toxicidade para células Vero (rim de macaco verde) e por sua semelhança com a toxina produzida por Shigella dysenteriae. As verotoxinas são codificadas em uma ilha de patogenicidade denominada LEE (Locus Enterocite Effacement), contendo outros genes de interesse como o eae (intimina) associadas com a doença do edema em suínos, colite e diarréia hemorrágica em terneiros e Síndrome Hemolítica Urêmica (E.coli O157H:7) em humanos. Uma característica comum destas enfermidades é o dano vascular provocado pelas toxinas. No intestino, as verotoxinas são produzidas, absorvidas e vão se depositar no endotélio vascular de diferentes órgãos, levando ao desenvolvimento de edema, hemorragia e trombose.

Hemolisinas: também são consideradas como fatores de virulência de E.coli e podem ser classificadas como alfa ou beta de acordo com o padrão de hemólise observada no Ágar Sangue. A toxina beta é ligada as células e pouco se conhece a respeito de seu papel na virulência bacteriana. A toxina alfa é produzida pela maioria das cepas virulentas de E.coli e a perda dos genes para esta hemolisina promovem alterações significativas na patogenicidade dos isolados. Pesquisas têm demonstrado que as hemolisinas apresentam um importante papel em septicemias ocasionadas por E.coli, aumentando os níveis de ferro disponível no hospedeiro, além do efeito tóxico sobre os mais diferentes tipos celulares.

Proteínas ligadoras de ferro (sideróforos): São encontrados em cepas de E.coli associadas a bacteremia em terneiros, cordeiros e humanos. Para multiplicar dentro do hospedeiro, o microrganismo necessita adquirir o pouco ferro disponível, uma vez que este é necessário para sua multiplicação. Logo, os sideróforos são muito importantes para determinar a invasividade bacteriana.

Fatores citotóxicos necrotizantes (CNF): Ocasionam a destruição da membrana celular dos enterócitos. Existem dois tipos de CNF: CNF1 e CNF2. O CNF1 tem sido encontrado num grande número de isolados envolvidos com infecções do trato urinário. Estudos recentes comprovaram que E.coli produtoras de CNF2 fazem parte da flora intestinal normal de bovinos.

Patotipos ou Virotipos de E.coli

As características de ataque da bactéria à célula hospedeira, produção de toxinas e capacidade de invasão são utilizadas para classificação dos virotipos de E. coli. Existem cinco virotipos descritos: E.coli enterotoxigênica (ETEC), enteroagregativa (EaggEC), enteropatogênica (EPEC), enterohemorrágica (EHEC) e enteroinvasiva (EIEC). E.coli enterotoxigências (ETEC) têm a capacidade de aderir a mucosa intestinal do hospedeiro e produzir alterações pela elaboração de importantes toxinas, que ocasionam a diarréia. EaggEC são o virotipo mais recente e são associadas com diarréia persistente em crianças.

Essas bactérias ligam-se as células do intestino formando agregados e produzindo ST e hemolisinas. Ao contrário de ETEC e EaggEC, E.coli enteropatogênicas (EPEC) produzem alterações consideráveis sobre a ultra estrutura dos enterócitos. Em tecidos infectados por EPEC podem ser visualizados microvilos enlongados, onde não se observam bactérias e microvilos atrofiados, onde a E.coli está ligada. Este fenômeno é denominado “attaching- effacing” e resulta na formação de um “pedestal” onde o microrganismo encontra-se aderido. Estudos demonstram que um bacteriofago introduziu a toxina SLT em isolados de EPEC tornando-as E.coli enterohemorrágicas (EHEC) foram recentemente reconhecidas, sendo responsabilizadas por diversos surtos de uma doença fatal (Síndrome Hemolítica Urêmica) envolvendo crianças em vários países desenvolvidos como EUA e Canadá. Este grupo é constituído predominantemente por E.coli O157H:7. Além disto, bactérias pertencentes a este grupo ocasionam a doença do edema em suínos, sendo associada a presença da fimbria F18. Na colibacilose neonatal as ETEC são o principal virotipo envolvido, podendo ocasionar elevados índices de morbidade e mortalidade nos rebanhos acometidos. A E.coli enterotoxigênica utiliza dois fatores de virulência para o desenvolvimento da enfermidade. Primeiramente, a capacidade de aderir e colonizar as vilosidades intestinais conferidas pelas fimbrias . Os principais tipos de fimbrias encontradas em E.coli isoladas de terneiros são a K99 (F5) e F41, enquanto que nos suínos encontramos a K88 (F4), e 987P (F6). A presença de receptores para estas adesinas explicam a maior susceptibilidade de animais com menos de um mês de vida. Com o crescimento estes receptores são perdidos, diminuindo a prevalência da enfermidade. Recentemente, animais geneticamente modificados para não expressar receptores para E.coli foram descritos. O segundo fator de virulência utilizado pelas ETEC para infecção são as enterotoxinas. Estas exotoxinas alteram o funcionamento intestinal, levando à diarréia, acidose e desidratação.

Tabela 1. Principais patotipos de E.coli

Patotipo

Fimbria

Toxina

Lesão attaching

Enfermidade

 

Effacing

ETEC

K88, K99, 987P

ST, LT

não

Diarréia

EPEC

F41

?

sim

Diarréia,

 

absorção

EHEC

F41

SLT

sim

Doença

do

 

Edema, SHU

EIEC

Não

Não

não

Septicemias

determinada

EaggEC/d

Não deterinada

SLT - like

não

Humanos

Epidemiologia

A ocorrência de diarréia depende da interação entre o patógeno, seu hospedeiro e o meio ambiente. Somente a presença de E.coli virulenta pode levar ao desenvolvimento de enfermidade, desde que as condições de imunidade dos animais (ingestão de colostro IgA) e as condições higiênicos sanitárias (pobres) sejam favoráveis. A temperatura ambiental é um importante fator a ser considerado, uma vez que temperaturas menores que 25C tendem a diminuir significativamente os movimentos persitálticos facilitando a colonização bacteriana. A transmissão da E.coli ocorre pela rota oro-fecal. Na doença do edema as taxas de morbidade e mortalidade são baixa e alta, respectivamente. As epidemias surgem e desaparecem rapidamente (cerca de 15-18 dias).

Sinais Clínicos

Os sinais clínicos da diarréia neonatal tendem a variar de acordo com o status imune dos animais e a virulência dos isolados. Nos casos de maior severidade, são observadas a desidratação intensa, acidose metabólica e morte. Muitas vezes animais jovens podem

morrer sem manifestar diarréia. A diarréia neonatal ocorre entre 2-3 horas e pode ser desde inaparente até limpida e aquosa. A coloração das fezes pode estar alterada. Cerca de 30- 40% do peso corporal pode ser perdido. A musculatura abdominal está flácida e o animal apresenta severa depressão. Nestes casos o animal tende a morrer. Nos animais mais velhos (até o desmame e pós desame) os mesmos sinais clínicos são observados, porém com menor intensidade.

A doença do edema geralmente afeta leitões dos sete aos dez dias de vida. A doença

típica caracteriza-se por disfunções no sistema nervoso central, como perda da coordenação, que evolui em questão de horas para paralisia total. Ocorrem também tremores musculares e convulsões. Edema leve nos tecidos pode ser observado e a morte dos animais ocorre geralmente dentro de 1-3 dias.

Achados patológicos

Poucos achados são característicos da diarréia ocasionada por E.coli nos animais, como desidratação, dilatação do estômago e intestino delgado. A microscopia eletrônica de varredura pode ser udada para demonstrar a bactéria aderida as vilosidades intestinais. Na doença do edema, ao contrário apresenta alguns sinais característicos como edema subcutâneo, hidrpericárdio, edema pulmonar, efusão serosa e fibrinosa nas cavidades. AS lesões microscópicas refletem o edema tecidual e o forte dano vascular em diferentes órgãos como SNC, estômago, intestinos, rins e tonsilas.

Diagnóstico

O diagnóstico bacteriológico a partir de amostras de intestino delgado e fezes dos

animais é realizado pela cultura e isolamento bacterianos. Este é muito importante para realização do diagnóstico diferencial. Após a confirmação pelas características

morfológicas (Bacilo gram negativo) e bioquímicas (oxidase negativa, fermentação da glicose, lactose e sacarose em TSI e indol positivo) os isolados de E.coli podem ser

submetidos a biotipificação, através de PCR multiplex para detecção de genes codificando fimbrias e toxinas. Somente o isolamento de E.coli de amostras fecais pode ser inconclusivo, uma vez que cepas não patogênicas fazem parte da microflora intestinal. O PCR apresenta-se como uma técnica de maior sensibilidade, quando comparado com as técnicas convencionais de biotipificação para Escherichia coli, uma vez que antígenos fimbriais podem não ser expressos em cultura, induzindo a resultados falso negativos. A biotipificação de isolados de E. coli também pode ser realizada por soroaglutinação, ELISA e imunofluorescência.

Tratamento e controle

Para tratamento da diarréia dos terneiros utiliza-se a reposição de líquidos e eletrólitos perdidos pelos animais durante a diarréia, bem como o uso de antibioticoterapia. A maior importância dos antimicrobianos na terapia da colibacilose é evitar o desenvolvimento de septicemias. Um aspecto importante da infecção por E.coli é verificar que a resistência múltipla aos antimicrobianos pode ser facilmente adquirida.

TABELA 2 Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de E. coli isoladas de bovinos

ANTIMICROBIANO

SENSÍVEL

%

INTERMEDIÁRIO

RESISTENTE

Eritromicina

1,88

0

98,11

Penicilina

1,96

0

98,03

Sulfonamida

43,39

1,88

54,71

Tetraciclina

37,25

3,92

58,82

Tilmicos

11,32

0

88,67

Florfenicol

41,50

39,62

18,86

Ampicilina

64,15

1,88

33,96

Ceftiofur

84,90

3,77

11,32

Enrofloxacin

92,30

1,92

5,76

Neomicina

63,79

1,72

34,48

Espectinomicina

62,06

6,89

31,03

A resistência de E.coli isoladas no trato intestinal de bovinos e suínos criados de forma intensiva reflete a exposição destes animais às drogas antimicrobianas, o que leva a seleção de clones resistentes. Como exemplo, temos o caso da tetraciclina, que após sua descoberta em 1940 foi utilizada indiscriminadamente na produção animal. Este uso abusivo levou a índices de resistência que variam de 80-90% em animais confinados. A maior sensibilidade de E.coli pode ser observada para fluoroquinolonas, cefalosporinas de terceira geração, carbadox, gentamicina, sulfa-trimetropin e nitrofurantoínas. A escolha de um antimicrobiano para tratamento de infecções por E.coli deve sempre considerar os resultados obtidos no antibiograma, uma vez que existem grandes variações na sensibilidade de isolados provenientes de diferentes regiões. A resistência múltipla aos antimicrobianos é um processo importante em E.coli. Este ocorre pela troca de plasmídeos codificando gens para resistência aos antimicrobianos entre bactérias entéricas. A correção das medidas de manejo e das condições nutricionais e de higiene dos rebanhos são fundamentais para controle da enfermidade. Tais procedimentos visam a

redução da exposição aos agentes infecciosos e melhora das condições do animal, principalmente no que diz respeito à adequada ingestão de colostro pelos terneiros. Nos suínos, o tratamento da colibaciolose em suínos envolve reposição de fluídos, antimicrobianoterapia e controle da temperatura do animal (30-34C). O uso de antimicrobianos para o tratamento da colibacilose entérica é controverso, sendo que este deve levar em conta os resultados obtidos na cultura e antibiograma. Geralmente os agentes antimicrobianos utilizados no combate a infecção por E.coli em suínos são o sulfazotrim, colistina e kanamicina. A administração destas drogas na alimentação de suínos para controle e profilaxia de enfermidades bacterianas é conhecida. Porém, estas práticas estão associadas à presença de resíduos de antimicrobianos nos produtos de origem animal e seleção de bactérias resistentes, trazendo sérios riscos à saúde pública. Além disto condições estressantes tem sido relacionadas a seleção de bactérias resistentes. A vacinação das porcas antes do parto tem sido de grande utilidade no controle da colibacilose. Neste caso, o colostro de fêmeas vacinadas contém quantidade suficiente de imunoglobulinas para proteção dos filhotes. Além disto, o colostro contém fatores não específicos como lactoferrina e transferrina, que auxiliam na prevenção das enfermidades ocasionadas por E. coli em suínos. Estas substâncias apresentam efeito bacteriostático, devido sua grande capacidade de ligação ao ferro, desprovendo os microrganismos deste metal necessário ao crescimento e multiplicação de E.coli. O tratamento da doença do edema em suínos não é conside, sendo que diversos estudos vem sendo desenvolvidos para imunização os animais, utilizando toxóides, toxinas modificadas geneticamente e fímbrias. Recentemente trabalhos tem apontado que a imunização das porcas, seguida de duas doses de vacinas nos leitões podem ser eficientes

Tabela 3- Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos- estudo canadense.

Antimicrobiano

Sensibilidade

Amicacina

100

Enrofloxacin

100

Ampicilina

46

Gentamicina

63

Neomicina

56

Sulfazotrin

71

Tetracilina

7

 

ERISIPELA (RUIVA, Erysipelothrix rhusopathie)

Etiologia

A erisipela ou ruiva é uma enfermidade causada pela bactéria Erysipelothrix rhusiopathie, manifestada por uma septicemia aguda ou subaguda e lesões crônicas proliferativas. A doença possui distribuição mundial, e é de grande importância econômica principalmente na forma crônica. O agente também causa poliartrites em ovelhas, morte em perus. Em humanos, causa lesão local da pele, geralmente em pessoas que manejam com animais, materiais, ou produtos de animais contaminados. Nos humanos a erisipela é uma infecção causada por Streptococcus. Erysipelothrix rhusiopathiae são bacilos gram positivos, acapsulados, anaeróbicos facultativos, curtos, finos e às vezes levemente curvados (0,2-0,4 m de largura e 0,8-2,5

m de comprimento). O organismo é imóvel, não produz esporos, são catalase negativos, hemolíticos e cresce em temperaturas 4-37°C. Em culturas em ágar nutrientes, feitas diretamente de tecidos em caso de infecção aguda, as colônias aparecem de formas lisas, e o organismo como bastonetes delgados, curtos, retos ou levemente curvos e isolados ou em

cadeias. As formações paliçadas são comuns. Já em culturas mais velhas ou isoladas de lesões crônicas as colônias se apresentam de forma rugosa e onde predominam a forma filamentosa do bacilo. Em meio ágar TSI produzem ácido sulfídrico (WOOD, 1992).

O agente sobrevive 4 a 5 dias na água e vários dias no solo, em condições

favoráveis. Persiste em fezes de suínos entre 1 a 6 meses, em temperatura abaixo de 12°C.

Resiste ao fenol 0.2%, mas é destruído pela maioria dos desinfetantes comuns e ao calor (10 minutos a 56°C).

Epidemiologia

O reservatório mais importante do Erysipelothrix rhusiopathiae é o suíno, mas a

bactéria também tem sido isolada em mamíferos, ave e peixes. Bovinos, ovinos, eqüinos, galinhas, perus, cães e gatos podem se infectar. A fonte de infecção mais importante é o suíno portador. Estima-se que 30-50% dos suínos saudáveis possuem o E. rhusiopathiae nas amígdalas ou outros tecidos linfóides. Estes portadores podem eliminar o organismo em suas fezes ou secreções oronasais, tornando-se uma importante fonte de infecção. Suínos afetados com E. rhusiopathiae na forma aguda, eliminam abundantemente o agente nas fezes, urina, saliva e secreções nasais. O solo, cama, alimentos e a água são contaminados, e podem servir como um meio indireto de transmissão. Além disso, contaminação das águas pode transportar o organismo para outras criações. Uma grande variedade de mamíferos e aves silvestres são carreadores do E. rhusiopathiae (WALKER, 1988). Os animais selvagens, particularmente os roedores comumente encontrados em criações de suínos, são considerados como importantes fontes de transmissão. O agente da erisipela também tem sido isolado de diversos animais

domésticos (bovinos, eqüinos, ovinos, caninos e felinos), proporcionando reservatórios adicionais na produção de suínos.

A transmissão por várias espécies de mosquitos e carrapatos também tem sido

demonstrada, mas a importância destes não tem sido estabelecida. Suínos com menos de 3 meses ou mais de 3 anos de idade são geralmente menos predispostos à erisipela. Isto

provavelmente se deva à imunidade passiva nos animais jovens, e a imunidade ativa nos animais mais velhos conseqüente das várias infecções subclínicas.Doenças infecciosas pré- existentes, infecções parasitárias, aflatoxicose, estresse e fatores ambientais tem sido descritos como fatores prediponentes para a ocorrência da erisipela Patogenia

Suínos de todas as idades são susceptíveis, mas os leitões novos são mais resistentes por adquirirem imunidade através do colostro. São comuns as observações de lesões cutâneas generalizadas na ocasião do abate. Representam uma agudização da doença desencadeada pelo transporte ao frigorífico, ou resultam do agrupamento de animais de diversas origens no período que antecede o abate lactação. A infecção natural se processa mais freqüentemente pela ingestão de alimentos ou água contaminados. Parece provável que a penetração no organismo ocorra através das amígdalas ou tecido linfóide ao longo do aparelho digestivo. A infecção pode ocorrer também através de ferimentos de pele. Um resumo da patologia da E. rhusiopathiae é descrito por GYLES et al. (1993) na Figura 1.

Animais portadores Ambiente contaminado

Ingestão do organismo

Entrada no intestino delgado

Aderência no epitélio

Penetração no intestino

Dano Vascular Artrite Endocardite Lesões de pele

Dano Vascular

Trombose

Febre

Figura 1. Patogenia da bactéria E. rhusiopathiae

O E. rhusiopathiae não parece produzir toxinas. Vários autores sugerem que a neuraminidase seja um fator na patogenia deste organismo. A neuraminidase atua sobre o ácido siálico, que é um mucopolissacarídeo da superfície das células, e que tem a função de impedir que uma célula se ligue às outras por um mecanismo de repulsão. Com a destruição deste componente as hemaceas se aglutinam no endotélio, levando a trombose. Na forma aguda ou subaguda a erisipela começa com uma bacteremia que ocorre 24 horas após a exposição, e que rapidamente resulta em sinais clínicos de infecção generalizada (septicemia). Aproximadamente 36 horas após a exposição começam as alterações dos capilares e vênulas. Observa-se tumefação do endotélio, com aderência de monócitos à parede vascular e evidência de trombose hialina disseminada. Esse processo de coagulopatia generalizada progride em 4 dias para trombose fibrinosa nos tecidos perivasculares. Em casos altamente agudos, a hemólise é comumente observada. Necrose isquêmica de tecidos perivasculares ocorre em conseqüência do comprometimento da microcirculação. Somente a lesão cutânea também pode ser observada, quando da infecção por cepas menos virulentas. A erisipela na forma crônica afeta primariamente as articulações e começa com uma sinovite aguda que pode ocorrer em 4-10 dias após a exposição. Dentro de 3 meses ocorre exsudação fibrinosa e proliferação, desenvolvendo até uma fibrose severa e destruição da cartilagem articular em 5-8 meses. Estas alterações parecem ser devido à deposição de fibrina durante a fase vascular. Uma outra manifestação da erisipela crônica é a ocorrência de endocardite cujas lesões valvulares começam, provavelmente, com a inflamação vascular e infartos de miocárdio.

Sinais clínicos

Forma aguda Após período de incubação que oscila entre 1 a 7 dias, observa-se febre alta (até 42°C), prostação, anorexia, fezes firmes e secas, conjuntivite e andar cambaleante,

geralmente os animais permanecem deitados pois, sentem muita dor ao caminhar. Podem ocorrer mortes nos lotes afetados. Lesões cutâneas em forma de eritema, urticária, ou lembrando contornos em losango tornam-se visíveis a partir do segundo ou terceiro dia de infecção. São áreas salientes na pelo com coloração púrpura-escura, facilmente visíveis em animais de pelagem clara. Na fase aguda fatal, freqüentemente ocorre colorações escuras e desaparecem 4 a 7 dias, ou dar origem a áreas de necrose que persistem por várias semanas, devido à infecção secundária. Leitoas que contraem a infecção durante a gestação podem abortar.

Forma crônica

A forma crônica pode ser uma conseqüência da erisipela aguda ou subaguda e é

caracterizada pôr sinais de artrite e insuficiência cardíaca. Os animais apresentam engrossamento das articulações e dos membros locomotores, com escasso conteúdo líquido sanguinolento turvo no interior da cápsula articular, podendo evoluir para fibrose. A proliferação de tecido granular nas válvulas cardíacas causa endocardite vagetativa, com insuficiência cardíaca. Infecção no homem

A erisipela é uma zoonose ocupacional, médicos veterinários e tratadores podem se

contaminar. Nestes casos, os sinais mais característicos são de febre intensa e alterações na pele, denominadas ersipelóides. Manifestações sistêmicas e graves estão associadas a alterações cardíacas (endocardites). Um aspecto interessante é que a infecção em indivíduos sem contato direto com animais também ocorre. A adoção de medidas de higiene parece ser fundamental para prevenção da doença.

Achados patológicos

Nas infecções agudas são encontradas além das lesões de pele (hemostase cutânea), aumento e congestão dos nódulos linfáticos, petéquias no epicardio e endocardio, gastrite catarral a hemorrágica, fígado congesto, infartos renais e do baço. O exame histopatológico

revela danos (tumefação aos capilares e vênulas, com infiltração perivascular por células linfóides e fibroblastos. Lesões purulentas não são características de erisipela.

Na forma crônica, observa-se animais com uma ou mais articulações aumentadas, a

cápsula articular se encontra espessada com tecido conjuntivo fibroso. A cavidade articular contém uma quantidade excessiva de líquido sinovial serosanguinolento. A membrana sinovial apresenta graus variados de hiperemia e proliferação. A endocardite vegetativa consiste de crescimento granular proliferativo nas válvulas cardíacas. A lesão microscópica típica é uma pronunciada hiperplasia da íntima sinovial e tecido conjuntivo subintimal, com vascularização e acúmulo de células linfóides e macrófagos. Observa-se uma progressiva

deposição e organização de fibrina. O crescimento vegetativo nas válvulas cardíacas é composto de tecido de granulação e massas superimpostas de fibrina

Diagnóstico

A infecção por E. rhusiopathiae em suínos deve ser diferenciada de outras

infecções, entre as quais as causadas pelo vírus da peste suína clássica, Salmonella chllerae suis e Streptococcus sp. Os dois primeiros, pelos sintomas septicêmicos e o último, por

estar envolvido em artrites e endocardites. Lesões cutâneas com outras etiologias também devem ser consideradas. O diagnóstico precoce da enfermidade é difícil devido ao tamanho diminuto da s colônias e a presença de contaminações. O isolamento pode ser utilizado o coração, pulmões, fígado, baço, rins e articulações. Caso a doença tenha persistido por muitos dias, deve ser enviado somente as articulações e fluídos articulares, sendo importante coletar tecido e líquido de várias articulações, porque a bactéria pode estar presente em pequeno número e em áreas limitadas. A identificação por imunofluorescência direta tem sido relatada, embora pareça não ter boa sensibilidade e especificidade para o diagnóstico. Nenhum teste sorológico tem se mostrado útil para o diagnóstico de retina, mas pode ser utilizada na identificação de infecção crônica, os mais utilizados são soroaglutinação, aglutinação em crescimento e

ELISA. Uma técnica de PCR foi descrita com sucesso desde que utilize meio seletivo de enriquecimento TSB contendo brometo de etídeo ou azida sódica.

Tratamento

O tratamento de escolha é feito com penicilina (50.000 UI/Kg de peso vivo), o Erysipelothrix rhusiopathie é altamente sensível a essa droga, quando iniciado na fase aguda a resposta pode aparecer nas primeiras 24-36 horas. Outras drogas utilizadas são as tetraciclinas, lincomicina e tilosina. No caso de erisipela crônica não há tratamento. A injeção de penicilinas durante 3 a 5 dias nos animais doentes, tem sido eficiente no tratamento das formas agudas. Erysipelothrix rhusiopathiae é sensível a penicilina, cefalosporina, clindamicina. Recentemente esta bactéria adquiriu resistência a eritromicina, oxitetraciclina e dihidrostreptomicina. Um aspecto importante a lembrar é que a bactéria é naturalmente resistente a vancomicina e o tratamento empírico com esta droga pode levar a morte dos animais.

Prevenção e controle

É praticamente impossível erradicar a erisipela suína, em função da capacidade de sobrevivência da bactéria no ambiente, e da variedade de espécies animais que podem ser infectados, além de estar presente em suínos portadores sadios. A eliminação de portadores, manejo sanitário adequado, higiene, nutrição, boas instalações, eliminação de suínos cronicamente afetados e o uso de um programa de vacinação tem sido efetivos na prevenção da erisipela suína. Também deve-se dar grande importância ao adquirir animais de reposição, tendo o cuidado para que estes sejam livres do agente. Casos de artrite e endocardites não respondem bem ao tratamento, devem ser adotadas medidas higiênicas e desinfecção de instalações. desinfetantes fenólicos ou cresóis são recomendados, por apresentarem boa ação residual e atividade na presença de matéria orgânica.

A imunização a doença pode ser feita através de vacinas vivas, atenuadas ou lisadas,

administradas parentalmente ou por via oral. No Brasil as vacinas disponíveis consistem de crescimentos bacterianos inativados (bacterinas) com hidróxido de alumínio como adjuvante, os programas de vacinação existente hoje no mercado para erisipela, são eficientes apenas para forma aguda da doença, para combater a forma crônica torna-se necessário um grau de imunização mais elevado, o que pode ser conseguido através de um programa de vacinação (Tabela 1). Vacina recombinante utilizando lactobacilos como vetor para proteínas de virulência de E. rusiopathiae para imunização oral dos suínos vem sendo estudada.

Tabela 1. Programa de vacinação para erisipela suína.

ERISIPELA

Leitoas de reposição

1ª. dose aos 70 dias de gestação 2ª. dose aos 90 dias de gestação

Porcas

1ª. dose aos 80 dias de gestação 2ª. dose aos 100 dias de gestação

Machos

na época de seleção, aplicar duas doses, com intervalos de 21 dias. A partir daí, revacinar anualmente.

Leitões

1ª. dose aos 21 dias de idade 2ª. dose aos 42 dias de idade

Fonte: BARCELLOS et al., 1996.

DOENÇAS RESPIRATÓRIAS DE SUÍNOS

Já é antiga a preocupação de médicos veterinários envolvidos na produção de suínos

com o impacto econômico e a multiplicidade causal das enfermidades respiratórias dos

suínos. Estas perdas decorrem desde alterações no parênquima pulmonar e tecidos

adjacentes, levando a condenação da carcaça ou de parte dela, bem como pelo estresse respiratório e redução no ganho de peso pelos animais. Estudos revelaram que as perdas decorrentes da pneumonia e rinite atrófica associadas podem aumentar em cinco dias a terminação dos animais. Todas as granjas possuem leitões portadores de algum patógeno potencial, sendo estes classificados como primários, quando inoculados isoladamente levam a alterações (M. hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae e Bordetella bronchispetica) e secundários, quando necessitam de fatores ou infecções prédisponentes (P. multocida, H. parasuis, Streptococcus suis, M. hyorinis, Arcanobacterium pyogenes). A tabela abaixo reporta o índice de lesões relacionadas a rinite atrófica, pleuropneumonia e pneumonia enzoótica em diversos países.

Tabela 1. Percentual de lesões de RA, PL, e PE em diversos países na década de 90.

País

RA

PE

PL

USA

69

69

-

Suécia

-

10,05

7,68

Suiça

-

29,9

23,6

Itália

-

33,7

53,5

Brasil

78,10

75,70

7,05

Fonte adaptado de KICH e PONTES (2001)

Estima-se que as pneumonias sejam responsáveis pela perda de 2,4 suínos com peso médio de 95Kg para cada 100 animais abatidos no sul do país. A tabela 2 indica a freqüência da rinite atrófica e pneumonia enzoótica na região sul do país.

Tabela 2. Prevalência da RA e PE na região sul do Brasil.

Estado

Rebanhos analisados

RA

PE

RS

42

81,39%

76,87%

SC

56

80,76%

69%

PR

89

71,15%

81,14%

Brasil

245

78,14%

75,7%

Fonte: Adaptado KICH e PONTES (2001)

A enumeração dos espirros e da tosse como uma forma de classificar o rebanho quanto a

ocorrência de rinite atrófica e pneumonias pode ser um importante aliado no controle destas enfermidades. Em 1999, Morés e colaboradores conduziram um experimento e obtiveram através da análise estatística uma formula para classificação dos rebanhos segundo a presença da rinite atrófica. As contagens de espirros e tosse foram realizadas aos 30, 60 e 90 dias, sendo realizadas 3 contagens de 2 minutos cada, com intervalos de 1 a 2 minutos.

Tabela 3. Exemplo para contagem do número de tosse e espirro em um lote de suínos

Sinal Clínico

1

2

3

Média

Total de animais

%

Tosse

8

10

8

8,67

150

5,78

Espirro

12

7

9

9,33

150

6,22

Aplicando-se o percentual obtido a formula dada, obtem-se um escorre, que possui maior confiabilidade quanto maior sua proximidade do abate dos animais. O ideal é 30 dias após a instalação dos animais na terminação:

IP = 0,35 + (0,11 x %-5,78) = 0,98

IRA= 0,36 + (0,065 x %-6,22) = 0,76

Índice de Pneumonia (IP) 1= granjas de baixa ocorrência IP menor que 0,55 2= granjas de ocorrência moderada IP entre 0,55 e 0,90 3= granjas com alta ocorrência de pneumonias maior que 0,90

* Este índice é menos específico, sendo recomendado para IP maiores que 0,55 o diagnóstico etiológico.

Índice de Rinite Atrófica (IRA) 1= granjas de baixa ocorrência IRA menor que 0,50 2= granjas de ocorrência moderada IRA entre 0,50 e 0,84 3= granjas de ocorrência alta IRA maior que 0,84

PRINCIPAIS ENFERMIDADES RESPIRATÓRIAS BACTERIANAS DOS SUÍNOS

1. RINITE ATRÓFICA

Etiologia

A enfermidade é uma doença respiratória aguda dos suínos, caracterizada pela atrofia das conchas nasais. Esta enfermidade esta associada a graves perdas produtivas principalmente pela predisposição de outras pneumonias, em animais com lesões severas. Os agentes etiológicos da rinite atrófica são as bactérias gram negativas Pasteurella multocida e Bordetella bronchispetica.Estas bactérias habitam a membrana mucosa dos animais. Além disto a Pasterurella multocida pode ocasionar importante pneumonia, no estágio final da pneumonia enzoótica.

Patogenia

Estas bactérias produzem um potente toxina necrotizante (TDN) e estào associadas ao desenvolvimento da enfermidade. Estas aderem fortemente ao epitélio respiratório. Os danos ocasionados somente pela B. bronchispetica são reversíveis, contudo tornam-se graves quando associados a P. multocida TDN+. A destruição total das conchas nasais pode ocorrer em duas semanas. Cinco sorotipos diferentes de P. multocida são descritos (A, B, D, E, F), especialmente as do tipo D estão envolvidas em surtos de rinite atrófica. Entre os fatores de virulência descritos para B. bronchiseptica podemos citar neuraminidases e produção de uma adelinatociclase capaz de inibir a escada rolante mucociliar.

Epidemiologia

A rinite atrófica não é transmitida facilmente entre os rebanhos, exigindo a proximidade dos animais. Os leitões jovens contaminam-se a partir de suas mães. Surtos da enfermidade estão associados a introdução de animais infectados no rebanho, sendo este muitas vezes um portador. A proteção com anticorpos de origem materna esta associada a inibição na infecção por B. bronchispetica. Falhas no manejo a infecção por B. bronchispetica ocorre já na primeira semana de vida, enquanto que naqueles onde as técnicas de criação são bem executadas esta ocorre após 3 a 4 semanas. A infecção por P. multocida ocorre geralmente de 3 a cinco semanas de vida. Entre os principais fatores de risco associados ao desenvolvimento da enfermidade podemos citar: número excessivo de primiparas, alimentação, presença de outras infecções, alojamento dos animais (volume de ar menor que 3m cúbicos, oscilação de temperatura de 6C, lotação maior que 500animais), manejo do rebanho.

Sinais Clínicos

São observados nos animais doentes espirros e a formação de placas escuras nos cantos internos dos olhos, corrimento nasal mucopurulento e encurtamento e/ou desvio lateral do focinho. Animais com infecção severa apresentam atraso no desenvolvimento. O diagnóstico clínico é facilmente realizado em animais em torno de cinco semanas de vida.

Diagnóstico e achados patológicos

O diagnóstico patológico é muito importante, em leitões com 5 a 10 semanas, ou de animais remetidos ao frigorífico. É aconselhável o exame de 20 animais, provenientes de

várias leitegadas. As conchas nasais devem ser observadas após corte transversal do focinho, entre o primeiro e o segundo pré-molares. Baseado no grau das lesões 0 (normal),

1 (leve alteração), 2 (moderada) e 3 (grave ou completa) se classificam os rebanhos. Esta

classificação é realizada no frigorífico com intervalos mensais ou bimestrais, por um intervalo de 6 meses a um ano. Com a definição do quadro a análise pode ser reduzida. No cálculo do analisam 16 animais sendo que se obtivermos 4 animais com cada índice,

devemos aplicar a fórmula :

(4x0=0) + (4x1=4) + (4x2=8) + (4x3= 12) = 24

24/16 = 1,5, este quociente deve ser comparado aos índices da tabela:

Índice de RA

Classificação dos rebanhos

0

a 0,30

Livre

0,31 a 0,45

Levemente afetados

0,46 a 3,0

Moderada ou severa

O diagnóstico laboratorial da rinite atrófica pode ser realizado pela colheita de amostras de swab de cavidade nasal ou de biópsia de tonsilas, principalmente de animais jovens. A cultura em AS, MC e realização de teste de antibiograma são de grande utilidade.

Várias técnicas de PCR vêm sendo desenvolvidas para caracterizar e genotipificar amostras

de P. multocida.

Tratamento e controle

O controle da rinite atrófica envolve a vacinação ou tratamento de porcas gestantes e suas

leitegadas. Estes procedimentos devem ser acompanhadas de medidas que melhorem o conforto e ambiente dos animais. As vacinas utilizadas atualmente são preparadas com bacterianas mistas tentando a incorporação do toxóide de P.multocida às bacterinas. A

vacinação deve seguir os critérios descritos pelos fabricantes. O uso de vacinas recombinantes encontra-se em estudo.

O uso de antimcrobianos nos surtos podem ser aplicados nas fêmeas no final da

gestação e nos leitões lactantes, com fornecimento na ração após o desmame. Ë muito

importante o resultado dos testes de antibiograma.

PNEUMONIA MICOPLÁSMICA DOS SUÍNOS (PNEUMONIA ENZOÓTICA)

Etiologia

A pneumonia enzoótica tem como agente etiológico o M. hyopneumoniae. Esta

enfermidade é geralmente não fatal e crônica resultando em redução no ganho de peso, aumento da conversão alimentar e predisposição a infecções bacterianas. A indústria

suinicola americana perde cerca de 300 milhões de dólares ano devido a esta enfermidade.

O M. hyopneumoniae reside na traqueia, bronquio e bronquiolos dos animais.

Patogenia

Após a infecção o M. hyopneumoniae coloniza o trato respiratório através de suas proteínas externas, que contém uma adesina de 97kDa denominada P97, a qual possui

receptores na célula hospedeira. A cápsula é um importante fator de patogenicidade em micoplasma.

Epidemiologia

A doença apresenta alta morbidade, porém baixa mortalidade. , sendo que a transmissão ocorre a partir de animais portadores através do contato direto e de secreções contaminadas. A ocorrência de surtos de pneumonia micoplásmica em granjas SPF tem alertado para a disseminação do agente via o vento. Toma-se que uma distância de 4Km seria suficiente para barrar a transmissão. A qualidade na oferta do ar, espaço mínimo para os animais, status imunitário são muito importantes. Estima-se uma perda de 37,4g/dia para cada 10% de tecido pulmonar hepatizado. A doença é grandemente observada em animais com 2 semanas, contudo animais até as seis semanas podem ser afetados.

Sinais Clínicos

Os principais sinais clínicos observados são os mesmos de qualquer pneumonia. Tosse seca ou com catarro. A tosse pode ser observada em animais em repouso, bem como somente após o movimento. A febre pode ser observada.

Diagnóstico

Além dos sinais clínicos é importante a confirmação sorológica (ELISA) ou através do isolamento bacteriano em lavados transtraqueais. Contudo este pode ser bem complicado e as amostras devem ser remetidas imediatamente ao laboratório. As amostras ideais são obtidas pela necrópsia (fragmentos de tecido pulmonar). O isolamento bacteriano

é realizado em meio de Friis. A identificação se faz pela observação de colônias com

aspecto de ovo frito. Para facilitar o diagnóstico várias técnicas de PCR, baseados no rDNA 16S vem sendo desenvolvidas para o diagnóstico in vivo a partir de lavados brônquio alveolares.

Tratamento e controle

O tratamento com antimicrobianos pode ser utilizado, contudo resultados significativos podem ser obtidos com a vacinação dos animais. Várias vacinas vêm sendo estudadas, sendo diversas de subunidades (projeto genoma).

PLEUROPNEUMONIA SUÍNA

Etiologia

A pleuropneumonia suína (PPS) é uma das doenças bacterianas mais importantes do trato respiratório, ocorrendo na maioria dos países suinocultores, onde ocasiona prejuízos aos sistemas de produção. A importância da PPS decorre do fato de que a enfermidade pode tanto apresentar manifestações clínicas severas, como se tornar crônica e subclínica na maioria dos rebanhos, causando prejuízos, devido à morte dos animais enfermos, a redução

na produtividade e o aumento nos custos com medicação e vacinação. O primeiro surto desta doença foi descrito na Inglaterra (1961) e em seguida nos EUA (1963) e Argentina (1964). No Brasil, a PPS foi diagnosticada pela primeira vez em 1981. A partir daí vários surtos foram observados no Sul do país, onde a suinocultura é praticada de forma intensiva.

O Actinobacillus pleuropneumoniae (App) é o agente etiológico da pleuropneumonia suína.

Esta bactéria é gram negativa, capsulada e com morfologia de cocobacilo. Baseado na exigência de NAD (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo) para a sua multiplicação, esta espécie pode ser divida em dois grupos: o biótipo 1, NAD dependente e o biótipo 2, que

não necessita do NAD para sua multiplicação. Tanto em estudos de campo, como em infecções experimentais o biótipo 2 se mostrou menos virulento que o biótipo 1.

Patogenia

Vários fatores são associados à virulência de App entre eles a cápsula, os lipopolissacarídeos, as proteínas externas de membrana, as proteínas de ligação a transferrina, as proteases, as toxinas Apx, e as adesinas. As Apx produzidas por estas bactérias pertencem a uma família de toxinas geneticamente relacionadas, as quais são denominadas RTX (Repeat Toxins) sendo também produzidas por uma variedade de bactérias gram-negativas. Segundo FREY (1995) dados epidemiológicos indicam que as exotoxinas produzidas por A. pleuropneumoniae estão assciadas com a patogenicidade da bactéria. Existem muitas indicações relacionando a função das toxinas na evasão do sistema de defesa do hospedeiro, pela morte de macrófagos e neutrófilos. Além disto, a produção excessiva de radicais livres de oxigênio pode danificar os tecidos adjacentes e promover grande injúria e destruição tecidual. A. pleuropneumoniae produz diferentes RTX (Apx), que apresentam efeitos citotóxicos e hemolíticos distintos. Todos os sorotipos de A. pleuropneumoniae variam quanto à secreção de uma ou duas das toxinas ApxI, II e III. A tabela abaixo apresenta a distribuição das toxinas nos diferentes sorotipos de App.

Sorotipo

ApxI

ApxII

ApxIII

ApxIV

1,5,9,11

sim

sim

Não

Sim

2,3,4,6,8

não

sim

Sim

Sim

7,12

não

sim

Não

Sim

10

sim

não

Não

Sim

A toxina ApxI é uma proteína de 105 KDa que apresenta forte efeito hemolítico e citotóxico, sendo secretada pelos sorotipos 1, 5, 9, 10 e 11, que são considerados como de maior virulênica. A toxina ApxII também apresenta 105 KDa e possui uma atividade

hemolítica fraca e moderada citotoxicidade, sendo detectada em todos os sorotipos com exceção do sorotipo 10. A toxina ApXIII não apresenta efeito hemolítico, entretanto é altamente citotóxica, sendo encontrada nos sorotipos 2, 3, 4, 6 e . A sinergia no incremento de hemólise observada entre as toxinas apxI e II e as toxinas de Staphylococcus aureus é denominado de efeito CAMP (Christie-Aktins-Munch-Peterson), que é corriqueiramente utilizado no diagnóstico bacteriológico. Recentemente, um quarto tipo de toxina RTX foi descoberta, sendo denominada Apx IV. Esta toxina é expressa somente in vivo estando presente em todos os isolados de App, demonstrando seu grande potencial para o diagnóstico da PPS e a caracterização deste patógeno. As toxinas Apx induzem uma forte reação imunológica em suínos infectados e são usadas como antígenos em vacinas de subunidades, com o intuito de induzir imunidade protetora.

A sorotipagem é uma das ferramentas mais importantes em estudos epidemiológicos

e programas de controle. Esta é principalmente baseada nas diferenças sorológicas de lipopolissacarídeos e polissacarídeos capsulares, permitindo a discriminação destas bactérias em quatorze sorotipos distintos. Destes, doze sorotipos de A.pleuropneumoniae foram classificados no biótipo 1, enquanto que outros dois sorotipos no biótipo 2. Recentemente, o sorotipo 15 de App foi proposto para isolados australianos que se distinguem consideravelmente dos demais . Observações a campo indicaram que os sorotipos 1, 5, 9, 10 e 11 são os mais virulentos, sendo estes geralmente envolvidos em surtos severos com alto nível de lesões pulmonares e mortalidade. Os outros sorotipos, em especial o sorotipo 3 possuem menor virulência, mas também são encontrados ocasionando enfermidade em diversos países . No Brasil, os sorotipos 3, 5 e 7 são considerados de grande ocorrência e importância, principalmente, para os criatórios suínos do sul do Brasil.

Epidemiologia

A principal rota de disseminação da enfermidade é a aerógena. As bactérias são

transmitidas principalmente pelo contato direto entre os animais durante os surtos e pela introdução de portadores em populações sem histórico prévio da infecção, que portanto são

muito susceptíveis, pois apresentam imunidade reduzida. Trabalhos recentes comprovaram

o papel importante dos aerossóis e do movimento do ar na disseminação de A.

pleuropneumoniae em distâncias superiores a 2,5m. Na fase aguda da doença, tanto a morbidade, quanto à mortalidade variam, mas são geralmente altas. A mortalidade pode ser influenciada pelo grau de virulência de cada isolado, pela presença de infecções concomitantes com outros patógenos respiratórios e por características ambientais particulares. Entretanto, ao contrário de outros patógenos respiratórios de suínos, as infecções prévias por outras bactérias e vírus não são determinantes para o desenvolvimento da pleuropneumonia (patógeno primário).

Esta doença vem sendo associada com até 20% de redução no desenvolvimento corpóreo. Segundo STRAW et alii (1989) a pleuropneumonia ocasiona, em média, uma redução no ganho de peso diário de 34% e uma redução de 26% na eficiência alimentar. Além disso, ocasionalmente, de 10 a 20% das carcaças dos animais provenientes de rebanhos infectados são totalmente condenadas no frigorífico. A mortalidade pode ser de 10 a 20% durante os surtos, porém é usualmente menor que 1% em rebanhos com infecção crônica

Sinais Clínicos

A PPS é caracterizada por pneumonia necrótica hemorrágica e pleurite fibrinosa. Os sinais clínicos variam de acordo com a idade dos animais, o estado de imunidade, condições ambientais e o grau de exposição ao agente infeccioso. Na forma superaguda da doença ocorre febre, apatia, diarréia e vômito, bem como em alguns casos, podem ocorrer falências circulatória e cardíaca. Com o desenvolvimento da enfermidade, o animal pode tornar-se cianótico e na fase terminal é observada dispnéia intensa, podendo a morte ocorrer

de 24 a 36 horas após o aparecimento dos sinais clínicos. Na forma aguda, são observados

elevação discreta da temperatura e o avermelhamento da pele, bem como a recusa da ingestão de água e alimento e a relutância ao exercício. Sinais clínicos respiratórios

severos, como dispnéia e tosse, são evidentes. A forma subaguda e a crônica desenvolvem-

se logo após o desaparecimento dos sinais agudos, sendo observada pouca ou nenhuma

febre e a tosse pode ocorrer de forma intermitente com intensidade variável. O apetite pode estar reduzido, o que pode contribuir para a diminuição do ganho de peso, sendo que os animais enfermos são identificados pela sua relutância ao movimento.

Diagnóstico e sorotipificação de App

O diagnóstico presuntivo da pleuropneumonia pode ser realizado através dos achados de necropsia, como pleurisia, pneumonia exsudativa e necrose. Entretanto, o diagnóstico definitivo requer o isolamento do agente e sorotipificação, bem como a diferenciação de outros patógenos presentes no trato respiratório como Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophillus parasuis, Pasteurella multocida e Bordetella bronchiseptica. As técnicas tradicionais para o diagnóstico da infecção por A. pleuropneumoniae envolvem a cultura bacteriana e testes imunológicos, como ELISA e fixação do complemento (SCHALLER et alii, 2001). A. pleuropneumoniae é normalmente isolado dos tecidos e secreções em meio de ágar sangue suplementado com 5% de sangue ovino utilizando uma semeadura perpendicular de S. aureus, que supre o NAD necessário para o crescimento do biótipo 1 de App. Após incubação por 24 horas, pequenas colônias podem ser observadas com características de satelitismo a semeadura de S. aureus. O ágar chocolate também pode ser utilizado no isolamento bacteriano, entretanto este meio apresenta menor poder de diferenciação. Através da sorotipificação podem ser obtidos dados relativos a virulência dos sorotipos presentes no rebanho. A sorotipificação de App pode ser realizada diretamente pelas técnicas de aglutinação em látex, hemaglutinação indireta e testes de difusão em gel, ou indiretamente através da análise do perfil de toxinas Apx presente nos isolados. Entretanto, muitos problemas são observados, como reações cruzadas, presença de amostras auto-aglutinantes e principalmente ocorrência de amostras não sorotipifícáveis.

Diversos testes de ELISA foram desenvolvidos para o diagnóstico da pleuropneumonia suína. Estes são baseados em antígenos extraídos com EDTA, extrato

salino fervido, polissacarídeos capsulares e lipolissacarídeos de cadeia longa. KICH (1996), realizou um estudo a campo no estado de Santa Catarina, onde comparou a cultura bacteriana com os resultados obtidos por ELISA descrito por Machado (1996) em animais oriundos de rebanhos com ou sem histórico da infecção por App. Este trabalho comprovou que o teste de ELISA é eficiente para a diferenciação de rebanhos e indivíduos infectados por App, entretanto esta metodologia não pode ser associada aos resultados obtidos na cultura da bactéria.

A técnica de PCR para o genes da cápsula e toxinas Apx vem sendo padronizados tendo em vista a dificuldade no isolamento e caracterização bacteriana. Todos os sorotipos de A. pleuropneumoniae possuem o gene apxIVA. Este gene não foi encontrado em nenhuma das espécies correlatas pertencentes à família Pasteurellaceae, o que comprova a sua especificidade.

Tratamento e Controle

O controle da pleuropneumonia suína é realizada pela combinação do tratamento dos animais, vacinação e técnicas de manejo adequadas. O uso de desinfetantes também é importante. Todas estas medidas devem ser associadas ao diagnóstico no frigorífico e laboratorial a fim de definir os melhores esquemas de profilaxia.

Antmicrobianos utilizados para tratamento de pneumonias agudas

A. pleuropneumoniae

Antmicrobiano

Dosagem

Via

Freq.

Duração

danofloxacin

1,25mg/kg

IM

-

-

ceftiofur

1mg/kg

IM

24

3

flumequine

15-30mg/kg

VO

12

5

Oxitetraciclina

5-22mg/Kg

IM

24

4-7

Sulfa-

5-15mg/kg

IM

24

5

trimetropin

B.

bronchiseptica

Antmicrobiano

Dosagem

Via

Freq.

Duração

Oxitetraciclina

20mg/kg

IM

72

?

Sulfatiazol

125mg/kg

VO

-

Não mais 7

Tilosina

10mg/kg

IM

-

3-5

M.hyopneumoniae + P. multocida

 

Antmicrobiano

Dosagem

Via

Freq.

Duração

danofloxacin

1,25mg/kg

IM

-

-

Espiramicina

25-50mg/kg

IM

24

3-5

Lincomicina

10-30mg/kg

IM

12-24

10

Oxitetraciclina

5-22mg/Kg

IM

24

4-7

Tiamulin

15mg/kg

IM

-

3

Antimicrobianos para tratamentos de pneumonias subclínicas

 

pleuropneumoniae

 

Antmicrobiano

Água (g/l)

Ração

Duração

Remoção

Clortetraciclina

0,5

400-1000ppm

5-7

21

Oxitetraciclina

0,5-07

400-1000ppm

5-14

21

B.bronchispetica + P. multocida

Antmicrobiano

Água (g/l)

Ração

Duração

Remoção

Tilosina (fosf.)

NA

250-400ppm

5

0

Clortetraciclina

0,5

400-1000ppm

5-7

21

Oxitetraciclina

0,5-07

400-1000ppm

5-14

21

M.hyopneumoniae+P.multocida

 

Antmicrobiano

Água (g/l)

Ração

Duração

Remoção

Clortetraciclina

0,5

400-1000ppm

5-7

21

Lincomicina

0,22-0,33

400

21

1

Tiamulin

0,12-0,25

200-240

5-10

5

Espiramicina

NA

250-1000

5-10

0

Oxitetraciclina

0,5-07

400-1000ppm

5-14

21

CARBÚNCULO HEMÁTICO (ANTHRAX, Bacillus anthracis)

Etiologia

O agente etiológico da enfermidade é o B. anthracis, um bacilo gram positivo, aeróbico, capsulado, esporulado e não hemolítico. A forma vegetativa da bactéria é muito sensível sendo destruída rapidamente pela pasteurização, uso de desinfetantes comuns e putrefação das carcaças. Contudo, os esporos formados quando da abertura das carcaças e exposição da bactéria ao oxigênio são resistentes a maioria dos agentes externos, como

salga dos couros, tratamento térmico padrão e uso de desinfetantes. Podem persistir no meio ambiente por períodos superiores a 60 anos, desde que em condições favoráveis. Sobrevivem muito bem em solos alcalinos ricos em matéria orgânica, em especial com alto teor de umidade e temperaturas elevadas. Entre os fatores de patogenicidade da bactéria podemos citar a cápsula e a toxina

protéica. Ambas são codificadas em plasmídeos (px02 e px01, respectivamente). A toxina é produzida em três formas:

- Protetor de antígeno: Tem por função permitir a entrada das demais toxinas na célula-

alvo, para isto deve ser clivada por proteínas da superfície das células como a calmodulina.

Esta toxina interage com receptores celulares.

- Fator de edema: É uma adelinato ciclase, que quando ativa é capaz de produzir AMPc na células do hospedeiro. Leva a perda de água e eletrólitos pela célula. - Fator letal: Toxina mais importante. Possui natureza enzimática e atua sobre as mitocôndrias. Levam a alteração nas mitocôndrias induzindo a morte da célula por apoptose.

Toxinas

DL

50

 

Edema %

Letal + Edema

5.10

5

40

Letal

10

7

-

Edema

+ de 10 9

20

Epidemiologia

Esta enfermidade acomete naturalmente todos os animais de sangue quente, contudo os ruminantes são bem mais sensíveis, seguidos pelos equinos. Suínos e o homem ocupam posição intermediária, sendo que os carnívoros são extremamente resistentes. A morbidade é variável de acordo com a demografia, contaminação do terreno e sua constituição. O reservatório da bactéria é o solo, sendo classificada como uma enfermidade telúrica. A presença de solo rico em húmus, férteis e principalmente de clima quente e chuvoso levam

a propagação da enfermidade, gerando o que se chamam de campos malditos. Com a

decomposição da matéria orgânica o solo incorpora muito N, fundamental a vegetação da bactéria, a qual é seguida pela formação de novos esporos extremamente resistentes,

mantendo o solo contaminado por anos. Entretanto, solos pobres e arenosos dificultam o surgimento da enfermidade, sendo os surtos associados a introdução de animais contaminados.

A principal forma de infecção se dá pela via oral, uma vez que o solo e a água são

muito contaminados em especial quando da presença de pequenos ferimentos na mucosa oral dos animais. O consumo de rações contaminadas também é importante. A transmissão por via respiratória também deve ser sempre considerada. Não existem transmissores, contudo pode haver vetores mecânicos, como insetos hematófagos. As principais zonas enzoóticas estão localizadas nos trópicos ou subtrópicos. No Brasil, a enfermidade ocorre três áreas distintas: A zona da campanha ou fronteira do Rio Grande do Sul, onde as terras são predominantemente baixas e alagadas. O vale do Parnaíba, nos estados do RJ e MG e o nordeste brasileiro, principalmente nos arredores de Recife.

No oeste de SC, em 1984 foi descrito um surto em suínos, onde dos 450 animais, 95 morreram. A fonte do surto foi provavelmente devido ao consumo de ração contaminada.

Sinais Clínicos

O período de incubação da enfermidade geralmente é de uma a duas semanas. Em

bovinos, pode ocorrer a forma superaguda, onde o animal esta bem e cai, tendo convulsões

e a morte em questão de horas. A forma prevalente é a aguda que mata de 24 a 72 horas, podendo se prolongar por até 10 dias. Manifestam-se por febre, respiração e pulso

acelerado, anorexia, queda, convulsões e morte. Imediatamente antes ou após a morte podem ocorrer hemorragias por todos os orifícios naturais. O edema também é observado, contudo é maior em animais, onde a bactéria leva bastante tempo para matar, contudo, isto

é raro.

Em pequenos ruminantes, o carbúnculo é sempre superagudo, fulminante, ocorrendo a morte em questão de horas. Os principais sinais clínicos são andar inseguro, intranqüilidade, tremores, dispnéia e hemorragias. Nos eqüinos, os sinais são caracterizados por cólicas e grande áreas de edema localizadas no baixo ventre, membros e genitálias. A morte pode ocorrer pela reação local (edema) na garganta do animal. Os suínos, embora relativamente resistentes, podem adquirir a infecção, preferencialmente por via digestiva, estando a reação localizada a garganta e aos intestinos. Alguns animais possuem diarréia e desinteria, sendo estes sinais os mais frequentemente observados. A recuperação de 50% dos animais demonstrando sinais clínicos é normal bem como a infecção sem o desenvolvimento de enfermidade. Os carnívoros apresentam principalmente edemas na face cabeça e pescoço. A gastroenterite aguda também pode ser observada. No homem, duas formas clínicas são observadas, dependendo principalmente das vias de infecção. A pústula maligna é caracterizada por lesões inflamatórias, ulcerativas, localizadas, quentes e dolorosas, com forte edema subcutâneo. As lesões podem se complicar e com o tempo levar a septicemia. Um estado de choque precede a morte, que ocorre em torno de 10 a 20% dos casos. A infecção respiratória leva ao carbúnculo pulmonar, onde são observados edema pulmonar, pneumonia hemorrágica, septicemia e meningites. Os índices de mortalidade nestes casos podem atingir 100%.

Achados de necropsia

Um animal morto pelo anthrax não deve ser submetido a necropsia, por que os bacilos podem esporular e contaminar o meio ambiente, bem como o responsável pela necropsia. O rigor mortis rapidamente se estabelece e é prontamente resolvido, sendo comum a descrição de ¨ausência de rigor mortis¨. Pode ocorrer a eliminação de um fluído sanguinolento pela boca narinas e anus. O timpanismo é marcante e a deterioração da

carcaça também. O sangue se apresenta escuro e não coagulado. Hemorragias podem ser observadas no trato digestivo e úlceras podem ser visualizadas nas placas de Peyer. O baço apresenta-se edemaciados, bem como o fígado, rins e linfonodos. A análise microscópica, principalmente do baço indicará sinais de septicemia, como distenção dos tecidos, presença de leucócitos e cadeias de bacilos, que podem ser observadas também nos vasos sanguíneos.

Diagnóstico

A necropsia não deveria ser realizada, contudo o diagnóstico baseado somente nos achados clínicos e post mortem pode ser difícil, especialmente em regiões onde a ocorrência da enfermidade é inesperada. Da mesma forma em outras espécies animais, que não os ruminantes os sinais clínicos não claros, sendo geralmente realizada a necropsia. O material a ser colhido são amostras de sangue periférico e swabs, porém estas devem ser remetidas em frascos lacrados. No histórico deve estar bem clara a suspeita de B. anthracis. No laboratório, o exame microscópico do sangue revelará a presença de bacilos. A cápsula será demonstrada pela coloração de Loeffer. A cultura bacteriana em aerobiose e a inoculação em camundongos são confirmatórias. É sempre interessante a diferenciação da bactéria do B. cereus, um contaminante sem importância clínica. As características são apresentadas abaixo:

Característica

B. cereus

B. anthracis

hemólise

sim

Fraca ou ausente

Sensibilidade a penicilina

não

Sim

Liquefação da gelatina

rápida

Lenta

Cápsula

sim

Não

Patogenicidade

a

sim

Não

camundongos

O diagnóstico diferencial do carbúnculo hemático deve ser realizado de outras

enfermidades causadoras de morte súbita, como: clostridioses, timpanismo, picada de cobra descarga elétrica, anaplasmose, ingestão de samambaia. Nos eqüinos a anemia infeciosa eqüina, cólica e intoxicações. Em suínos a PSC, a PSA e o edema maligno devem ser considerados.

Controle e profilaxia

O controle da enfermidade é muito importante pela sua implicação na saúde pública e prejuízos a criação de animais. A quarentena de propriedades infectadas deve ser realizada proibindo-se o tansporte de animais, bem como de seus subprodutos, como carne e leite. As caraças infetadas não devem ser abertas e sim incineradas ou enterradas (a pelo menos 2m de profundidade, coberta de cal virgem). Cama e solo superficial também devem ter o mesmo tratamento. A desinfecção de instalações com formalina (5-105) são eficientes, bem como o uso de ácidos. O pessoal deve usar luvas, botas e outros equipamentos para proteção pessoal. Materiais como farinha de osso e carne não devem ser administradas aos animais. A imunização dos animais deve ser realizada em áreas de ocorrência da enfermidade. A vacina é viva, produzida a partir da cepa Stern. Esta contém esporos suspensos em saponina ou adsorvidos em hidróxido de alumino. Esta cepa é toxigênica e acapsulada sendo rapidamente eliminada pelo organismo. Por isto, o uso de adjuvantes. A cepa Stern pode ser aplicada a outras espécies animais, como os eqüinos, entretanto reações adversas, geralmente associadas a forte edema localizado são descritas. A vacina não e recomendada para eqüinos rotineiramente. Nos seres humanos, a vacina não é segura, podendo induzir fortes reações. A pesquisa de novas vacinas tem levado ao surgimento de novas opções como o uso de proteínas recombinantes no caso o protetor de antígeno.

O leite de animais infectados, mesmo em tratamento deve ser desprezado até a

recuperação dos animais. Para tal, estas devem ser fervidas de 15 a 20 minutos e então dissolvendo em soda caustica até a concentração de 5%. A soda deve agir no leite quente por 10 minutos.

As medidas para controle da enfermidade envolvem:

- Notificação de casos

- Estabelecimento de quarentena

- Incineração ou enterro de carcaças, fômites e dejetos

- Isolamento de animais doentes

- Uso de repelentes e inseticidas

- Controle de carniceiros

- Pessoas devem tomar cuidados sanitários

Tratamento

O B. anthracis é muito sensível a penicilina (1000UI/Kg/2x ao dia). O uso

preferencial recomendado é o da penicilina benzatina. Além da penicilina estreptomicina

também pode ser empregada (8-10g, diariamente em duas doses) ou oxitetraciclina (9mg/Kg/dia). Animais de grande valor podem ser tratados preventivamente com tetraciclina (20mg/Kg/dia) na água de bebida.

CLOSTRIDIOSES

As clostridioses são importantes enfermidades, na sua maioria letais, ocasionadas pelo gênero Clostridium sp. Estes são bacilos gram positivos, anaeróbicos e formadores de esporos. Existem mais de 80 espécies de Clostridium sp., contudo poucas apresentem importância em medicina veterinária. As clostridioses são muito importantes em países tropicais. A invasividade e toxigenicidade destas bactérias variam muito e permitem a classificação destas bactérias em dois grandes grupos:

C.

septicum

C.

chauvoei

C.

perfringens

C.

novyi

C.

tetani

C.

botulinum

Toxicidade

C. novyi C. tetani C. botulinum Toxicidade Invasividade O cultivo bacteriano é muitas vezes complicado

Invasividade

C. tetani C. botulinum Toxicidade Invasividade O cultivo bacteriano é muitas vezes complicado pela grande

O cultivo bacteriano é muitas vezes complicado pela grande exigência de anaerobiose. Estas enfermidade são de grande importância para países de clima tropical e subtropical. Abaixo é demonstrada comparando as principais clostridioses.

Entrada

Porta de Sítio de replicação bacteriana ou produção de toxina

Síndrome/Doença

Espécies

Etiologia

Principais

susceptíveis

toxinas

 

produzidas

Ingestão

Músculo

Carbúnculo

Bovinos,

C.

chauvoei

beta, gama e delta, sintomático e ovinos

 

caprinos

alfa

 

Fígado

Hemoglobinúria

Bovino,

C.

blecitinase

 

bacilar

ovino

haemolyticum

 

Hepatite

Bovino,

C.

novyi tipo

blecitinase

necrótica

ovino

B

 

Enterotoxemia

Bovino,

C.

beta e épsilon tipos B, C e D

 

ovino e

perfringens

caprino

 

Ossos e carcaças em decomposição, água parada e fonte de alimentação

Botulismo

Bovino, ovino e caprino, eqüino, aves e cães

C. botulinum

neurotoxinas tipos C e D,

botulínicas C1 e

D

Feridas

Feridas

Edema maligno

Bovino,

C.

septicum,

alfa, beta,gama

 

ou gangrena

ovino e

C.

chauvoei,

e delta

gasosa

caprino

C.

sordellii,

 

C.

 

perfringens,

 
 

C.

novyi

Tétano

Todas as

C.

tetani

tetanospasmina

espécies de

e tetanolisina

mamíferos

Lobato e Assis (2005)

BOTULISMO (Clostridium botulinum)

Etiologia

O botulismo é uma neurointoxicação, causada por sete tipos (A-G) diferentes de toxina. No Brasil as toxinas mais importantes são C e D. O C. botulinum se caracteriza por não ser invasivo, contudo produz potentes toxinas que atuam sobre sistema nervoso e levam

a morte do animal. No caso do botulismo a toxina é pré-formada durante a putrefação da carcaça. Os animais ao ingerirem água, alimentos (silagem) e ossos contaminados pela

toxina desenvolvem o botulismo. A toxina botulínica atua bloqueando de modo irreversível

a liberação de acetilcolina na fenda sináptica. Esta possui uma ação proteolítica sobre

proteínas (VAMP) que auxiliam na exocitose dos grânulos de acetilcolina na fenda sináptica. Estas proteínas se fixam na T-SNARE uma proteína da membrana citoplasmática dos neurônios, com isto ocorre a fusão de membranas e a liberação do conteúdo das vesículas (acetilcolina) na fenda sinátpica. Com isto ocorre a flacidez muscular característica da enfermidade. As espécies mais sensíveis são bovinos, aves domésticas (ciscam) e caninos, entretanto a gravidade dos sinais clínicos e diretamente proporcional a quantidade de toxina absorvida. Tanto a bactéria quanto as suas toxinas são sensíveis ao calor (120 o C por 5 minutos).

Epidemiologia

As espécies mais susceptíveis são bovinos, aves e carnívoros. O reservatório para o C. botulinum são o solo e o meio aquático. Quando um animal morre, os esporos bacterianos presentes, principalmente no intestino e produzem as potentes toxinas. A transmissão se dá pela ingestão da toxina. No Brasil, a região CO é grandemente afetada, pela carência nutricional do solo e pastagens de brachiária fraca em P, que estimula os animais a osteofagia. Neste sentido é importante considerara a correta suplementação mineral dos animais. Na região sul, foi descrito um surto em bovinos confinados alimentados com silagem contaminada. A mobidade da enfermidade é de 10%, enquanto que a mortalidade é de 100%.

Sinais Clínicos

Os sinais clínicos característicos da enfermidade são a paralisia dos músculos que inicia nos membros posteriores e em seguida dos membros anteriores até a parada respiratória por paralisia do diafragma. Outros sinais verificados são hipotonia ruminal, anorexia e decúbito. Pode haver diminuição do reflexo pupilar. A morte pode ocorrer de dois dias até semanas, dependendo da susceptibilidade do animal e da quantidade de toxina ingerida. A paralisia de língua é bem característica, especialmente nos bovinos. Nas aves, o sinal característico é a perda de tônus no pescoço. O botulismo deve ser diferenciadas de outras enfermidades neurológicas, como a raiva e infecção pelo HBV 5.

Diagnóstico

O diagnóstico do botulismo é baseado na anamnese, sinais clínicos, isolamento, que raramente é possível e deve ser realizado no alimento e nunca no animal. Entretanto o mais importante. As amostras de eleição são: soro, conteúdo intestinal, ossos e alimentos suspeitos. A técnica mais utilizada é a soroneutralização em camundongos. Uma vez que haja suspeita da presença da(s) toxina(s), o que é verificado pela morte dos camundongos,

que apresentam a cintura de vespa, característica da dificuldade respiratória dos animais ocorre uma primeira confirmação. Contudo o diagnóstico definitivo é realizado com anti- soros específicos. Atualmente, tem-se utilizado a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), que permite por meio de primers de oligonucleotídeos, detectar os genes responsáveis por codificar as neurotoxinas.

Controle e Profilaxia

Não existe tratamento eficaz e a prevenção deve ser feita com o uso de vacinas, destino adequado de carcaças e mineralização balanceada dos animais. As silagens e fenos devem ser preparados de maneira que não haja a contaminação com animais mortos (aves, ratos, etc.). Nos caninos e felinos, além da terapia suporte e uso de antibióticos (penicilina, melhor ampicilina, para evitar as infecções secundárias) pode ser administrado antisoro (10.000 a 15.000UI, IV ou IM, 4-4h). Evitar sempre o uso de aminoglicosídeos, tetraciclina e penicilina procaínica. A vacinação dos bovinos e suplementação com P é uma das importantes formas de prevenção do botulismo.Vacinas podem ser aplicadas com 4 meses e após reaplicadas em 14-21 dias. A revacinação anual ou semestral é indicada em propriedades com surtos freqüentes.

Etiologia

TÉTANO

O C. tetani é o agente do tétano. Esta bactéria apresenta um esporo característico subterminal, que confere a célula um forma de raquete. A infecção ocorre pela contaminação de feridas com solo e fezes. Após a cicatrização prévia e contaminação por bactérias anaeróbicas ocorre a redução da tensão de oxigênio e vegetação dos esporos. A bactéria fica presente no local da ferida, produzindo as toxinas que são a tetanolisina

responsável pela necrose tecidual e a tetanoespasmina, neurotóxica, que vai por via nervosa até a placa motora e bloqueiam a liberação do GABA na fenda sináptica. Este neurotrasmissor inibitório, atua impedindo a contração exagerada dos músculos. Sem este inibidor ocorre a forte contratura muscular, que pode levar o hospedeiro a morte por parada respiratória. A adoção de postura de cavalete e o opistótono são característicos. A localização da ferida contaminada pode ser difícil, devido à cicatrização. Em humanos recém nascidos e idosos são os mais atingidos devido à baixa na imunidade. Todos somos vacinados contra o tétano na infância.

Epidemiologia

Os animais mais susceptíveis são os eqüinos (solípedes), ovinos, suínos, bovinos e caninos. As aves são muito resistentes, pois não possuem gangliosídeos que servem como receptores para as toxinas. A bactéria é distribuída mundialmente e é encontrada facilmente no solos e fezes, bem como no intestino dos animais. A transmissão ocorre por cortes, seja eles acidentais cirúrgicos, em decorrência do parto ou umbilicais. A letalidade em bovinos jovens é superior a 80%, mas a taxa de recuperação é alta em bovinos adultos. Em eqüinos a letalidade varia muito entre áreas, sendo que em algumas, quase todos os animais morrem de forma aguda, enquanto que em outras, a taxa de letalidade está em torno de 50%.

Sinais Clínicos

Na maioria dos animais susceptíveis os sintomas ocorrem entre 2 semanas e um mês após a inoculação bacteriana. O período de incubação do tétano é variável e depende das dimensões do ferimento, grau de anaerobiose, número de bactérias inoculadas e título de antitoxina do hospedeiro. Os casos de ovinos e cordeiros ocorrem 3 a 10 dias após a tosa ou remoção da cauda. O quadro clínico é similar àquele de todas as espécies animais. Os primeiros sinais clínicos em alguns animais podem ser vaga rigidez e claudicação, postura de extensão da cabeça, postura de cavalo de pau, orelhas e lábios retraídos em direção a nuca, cauda levantada, saliva espumosa acumulando-se na comissura labial, estrabismo

ventrolateral, pupilas fixas e dilatadas e normalmente morrem durante convulsão terminal. Um aumento generalizado da rigidez muscular é observado e se acompanha por tremor muscular. Há trismo com restrição dos movimentos mandibulares e prolapso da terceira pálpebra, além da rigidez dos membros posteriores que causa um andar errante e instável. O prolapso da terceira pálpebra fica exagerado pelo levantar do focinho ou abaixar a face. Os sinais adicionais incluem uma expressão ansiosa e alerta, crispada pela ereção das orelhas, retração das pálpebras e dilatação das narinas, e por respostas exageradas aos estímulos normais. A constipação é usual e a urina fica retida, em parte pela incapacidade de assumir a posição normal para urinar. À medida que a doença progride, a tetania muscular aumenta. As contrações musculares desiguais podem ocasionar o desenvolvimento de uma curvatura da coluna e desvio lateral da cauda. A marcha é dificultada e o animal fica propenso a cair. A queda ocorre com os membros ainda no estado de tetania e o animal pode se autotraumatizar. O opistótono é acentuado, os membros posteriores estão paralisados em abdução, com as pernas traseiras estendidas para trás e as dianteiras para frente. As convulsões ocorrem e, inicialmente, são estimuladas pelo som ou toque, mas logo ocorrem espontaneamente. Em casos fatais, quase sempre há um período transitório de melhora por algumas horas, antes de um espasmo tetânico grave, final, durante o qual a respiração fica suprimida, podendo levar o animal a morte.

Diagnóstico

No tétano, o diagnóstico laboratorial é semelhante ao botulismo, sendo a demonstração da neurotoxina o mais empregado. Entretanto, na maioria dos casos, o diagnóstico está baseado apenas na anamnese e na sintomatologia clínica, sem referência a testes laboratoriais. A cultura, quando possível (em AS, sobre condições de anaerobiose) deve ser realizada e a morfologia do C. tetani é caracterizado pela produção de um esporo terminal dando ao bacilo um formato de raquete de tênis.

Tratamento e Controle

O tratamento do tétano é realizado pela terapia suporte, transporte do animal num local escuro. O uso de antitoxina (eqüinos: 1.500-3.000 UI, SC; bovinos: 3.000-9.000UI no local da ferida; caninos: 1.000 U, IM; ovinos: 200U, no corte da cauda em propriedades enzoóticas), uso de sedativos e antibióticos são recomendados. A vacinação (2, 3 e 6 meses com reforço um ano após) e uso de antisoro são recomendados antes de procedimentos que possam levar ao desenvolvimento da enfermidade. O relaxamento da tetania muscular pode ser propiciado pela sedação e manutenção do paciente em local tranqüilo e obscuro. A terapia medicamentosa que pode reduzir os espasmos musculares consiste de clorpromazina (0,4 mg/kg de peso vivo), promazina (0,5- 1mg/kg) ou acetilpromazina 0,05-0,1 mg/kg), duas vezes ao dia, durante 8-10 dias, até que os sinais graves desapareçam. Nas áreas enzoóticas, todos os animais suscetíveis devem ser imunizados ativamente com “toxóide”, uma toxina precipitada pelo alumínio e tratada pela formalina. Uma injeção confere proteção em 10 a 14 dias, persistindo por um ano, e a revacinação em 12 meses confere uma sólida imunidade por toda a vida. Um programa mais intensivo de 2 vacinações com seis a oito semanas de intervalo seguidas por vacinação anual de reforço é preferido.

Comparação entre as toxinas do C. tetani e C. botulinum

 

C. tetani

C. botulinum

 

Produção da toxina

ferida

ingestão

Ação

Bloqueio

da

inibição

da

Inibição

da

sinapse-

sinapse- central

 

periférica

paralisia

espástica

flácida

Tipos de toxina

tetanosespamina

 

8 tipos (especialmente C e D)

CLOSTRIDIOS HISTOTÓXICOS

CARBÚNCULO SINTOMÁTICO, EDEMA MALÍGNO E GANGRENA GASOSA (MANQUEIRA, BLACK LEG)

Etiologia

Este complexo de enfermidades é ocasionado por várias bactérias do gênero Clostrdium. Todas apresentam um mecanismo de patogenicidade parecidos, sendo diferenciados apenas do ponto de vista didático e por algumas características peculiares. As toxinas produzidas por estas bactérias não são muito potentes, mas servem para reduzir as condições de aerobiose dos tecidos e desta forma permitir a invasão dos tecidos. A origem das bactérias pode ser endógena e exógena ou endógena. A infecção endógena é característica do carbúnculo sintomático, onde os endósporos ingeridos nas pastagens vão ao intestino e são absorvidos indo se depositar nos músculos. Quando o animal sofre uma lesão esta leva a uma necrose muscular reduzindo a tensão de oxigênio e permitindo a disseminação bacteriana. Na infecção exógena, característica do edema maligno, a bactéria presente no solo fezes contamina feridas que por suas características necróticas permitem a multiplicação dos bacilos e produção de toxinas. Entre as toxinas bacterianas podemos citar hemolisinas (aspecto escuro) e lecitinases, sendo observados os produtos da fermentação como ácido butírico (manteiga rançosa) e gás.

Epidemiologia

Os ruminantes são grandemente afetados, embora surtos esporádicos em suínos também sejam reportados. No caso do edema maligno a infecção é muito comum em fêmeas que pariram em solo contaminado por fezes e nos ovinos após a descola. Situações de estresse levam a uma redução na oxigenação dos tecidos periféricos, o que pode precipitados surtos de carbúnculo sitomático. Geralmente acomete animais em excelente

estado nutricional, logo com uma grande taxa de deposição muscular o que reduz a oxigenação dos tecidos. Sinais Clínicos Começa com uma manqueira, em virtude da mionecrose acentuada e de feridas infetadas da pele e dos pés que podem estar presentes no edema maligno. Há perda de apetite, febre alta, cólicas, parada ruminal, respiração acelerada, apatia, dispnéia e os característicos tumores crepitantes (tumefações gasosas), quentes e dolorosas. Os tumores parecem mais freqüentemente no pescoço, paletas, peito e flancos. O interior da boca apresenta coloração escura. A morte pode ser superaguda (8-12h) ou aguda (36-72h). Clostridios causadores de gangrena

Espécie

Hospedeiro

Doença

Entrada

Sinais clínicos e pós mortem

 

C.

chauvoei

Terneiros

3-

C. sintomático

endógena

Morte

subida,

necrose

 

24 meses

Gangrena gasosa

muscular, especialmente

no

músculo cardíaco

 
 

ovinos

 

feridas

Odor

rançoso,

músculos