Ensaios

imunes
Prof Heide Baida

Introduo
Aproduodeanticorpos,partefundamentaldarespostaimune
adaptativaequecompemoquechamamosderespostaimune
humoral,otipoderespostaespecficaedirecionada.Oantgeno
queestimulousuaproduopodeserdeorigemviral,bacteriana,
fngica,tumoral,etc...
Osanticorpos,assimcomoalgunsantgenos,circulampelos
lquidoscorpreosepodemserdosadoseanalisadosdeforma
qualitativaequantitativa;
Ostesteimunessimulaminvitroosprocessosimunesin vivo,
fornecendoassimdadossobreoestadoclnicodopacienteesobre
ainfecoqueestsendopesquisada.

Ensaios imunes no marcados

Introduo
SoensaiosondealigaoAntgeno/Anticorpo(Ag/Ac)
visualizadasemoauxliodemarcadores;
AligaoAg/Acdetectadamacroscopicamentepodendo,em
algunscasos,serauxiliadapelomicroscpioptico;
Asprincipaistcnicasimunesnomarcadasso:
1. Imunoprecipitao
2. Aglutinao
3. Ensaioslticos(fixaodecomplemento)

Imunoprecipitao
Preferencialmente,oantgenodevecontervrioseptopos e
consequentementeocorreadosagempoliclonal dos
anticorpos;
Aconcentraodeantgenoseanticorposdeveserbem
definida,paraquenoocorraofenmenoconhecidocom
Przona;
Defineseaconcentraoidealatravsdaanlisedevrias
diluies,atquesejaencontradaaZonadeEquivalncia

Zona de equivalncia e
Efeito Przona
Przona

Imunoprecipitao
Paramelhorvisualizaodosimunocomplexos (ligaes
Ag/Ac),ostestessorealizadosemmeiogelificado,que
proporcionameformaodeumalinhadeprecipitado,visvel
aolhon.
TcnicadeIMUNODIFUSO:utilizasegeldeagarose ondeas
molculas(tantoantgenoscomoanticorpos)difundemsee
encontramse,formandoentooscomplexoAg/Ac,que
possuemaltopesomoleculareficamimobilizadosnogel.
Formouseentooimunoprecipitado,quevisvel.Atcnica
podeserexecutadacomo:

Conceito de Difuso
DIFUSO: osolutotransportadodevidoaomovimentoaleatriodas
molculasqueocompem,ondeochoquealeatrioeaagitao
trmicaentreelaspromoveomovimentoeapassagemdomeiomais
concentradoparaomeiomenosconcentrado.
DIFUSOPASSIVA: umprocessofsicoafavordeumgradientede
concentrao.

Difuso
MOLCULAS

SOLVENTE

Imunoprecipitao
1.IMUNODIFUSOSIMPLES:Ocorreaimobilizaodeumdos
componentes(anticorpoouantgeno)nomeiogel.Apsa
gelificao,adicionaseououtrocomponenteeaguardase(por
cercade1semana)aformaodalinhadeprecipitaonazona
deequivalncia.

Imunoprecipitao
2.IMUNODIFUSOSIMPLESRADIAL:Ocorreaimobilizaode
umdoscomponentes(anticorpoouantgeno)nomeiogel.A
misturaentoadicionadaaumalmina.Apsagelificao,
orifciossoabertosnogeleadicionaseosegundo
componenteaosorifcios.Ocorreredifusosimultneaatravs
dogeleconsequentementeaformaodalinhadeprecipitao
nazonadeequivalncia.

Imunodifuso Simples Radial

Imunoprecipitao

3.IMUNODIFUSODUPLARADIAL:Nestemtodonoh
incorporaodoscomponentesaogel.Ambosdifundemsepelo
gelatravsdeorifcios,formandoaslinhasdeprecipitaonas
zonasdeequivalncia.

Imunodifuso Dupla Radial

Imunoprecipitao
4.IMUNOELETROFORESE:
4.1.ELETROFORESE:Consistenamigraodemolculascom
diferentespotenciaiseltricosepesosmolecularesemummeio
condutor,submetidasaumcampoeltrico.Utilizase,viade
regra,geldegarepoliacrilamida.

Imunoprecipitao
4.IMUNOELETROFORESE:
4.2.IMUNODIFUSORADIAL: Apsamigraodasmolculas
poreletroforese,anticorposespecficosparaasmolculas
estudadassoadicionadasaumacanaleta,deondeirose
difundireseligaraosantgenos(nocaso,asmolculasaserem
estudadas),evidenciandocadaumadasmolculas,
separadamente.

Imunoeletroforese

Imunoprecipitao
VariaesdaImunoeletroforese:
Imunofixao:utilizaseestatcnicaparaapesquisadeclasses
esubclassesdeanticorposdirigidosaumdeterminado
antgeno,separadopreviamenteporeletroforese.
Eletroimunodifuso:ambos(antgenoeanticorpo)migram
medianteaaplicaodeumcampoeltrico.

Imunoprecipitao
AutomaonosensaiosdeImunoprecipitao:
Nefelometria:Amediofeitaatravsdadispersodeluz,
provocadapelapresenadoscomplexosAg/Ac;
Turbidimetria:adetecofeitaatravsdeabsorbncia.

Aglutinao
Nestatcnica,antgenoouanticorposoadsorvidasa
partculasouclulas(taiscomoashemcias),estes
componentesfazendopartedaFASESLIDAdareao;
Aaglutinaoocorreporligaessimultneasdosanticorpos
eantgenos,tornandosevisvelaolhon podendo,emalguns
casos,teroauxliodomicroscpioptico;
Otestepodeserrealizadoemtubo,placascontendoorifcios,
lminasdevidro(comoasPlacasdeKline);
Atcnicapodeserexecutadadevriasformas:

Aglutinao
1.AGLUTINAODIRETA:nestatcnica,oantgenoparte
integrantedaclulaqueteoricamenteestservindodefase
slidadareao.Umclssicoexemplodaaglutinaodiretaa
TIPAGEMSANGUNEA,tambmconhecidacomo
HEMAGLUTINAO.

Aglutinao Direta
Tipagem Sangunea
TIPOA

TIPOB

TIPOAB

TIPOO

ANTICORPOS
AntiA e
ANTICORPOS
AntiB

Sangue
do
paciente

Resultadosdo
Testede
Hemaglutinao

ANTICORPOS
AntiB

ANTICORPOS
AntiA

AUSNCIA
DE
ANTICORPOS

AGLUTINAO
comsoroAntiA

AGLUTINAO
comsoroAntiB

AGLUTINAO
comsoroAntiA

Ausnciade
aglutinao
comsoroAntiB

Ausnciade
aglutinao
comsoroAntiA

AGLUTINAO
comsoroAntiB

Ausnciade
aglutinao
comsoroAntiA
Ausnciade
aglutinao
comsoroAntiB

Aglutinao Direta
Tipagem Sangunea

Aglutinao Direta
Tipagem Sangunea

RESULTADONEGATIVO

RESULTADOPOSITIVO

Aglutinao
2.AGLUTINAOINDIRETA:nestatcnica,oantgenoou
anticorpoadsorvidoaumapartculaouclulaqueno
interferenareaoAg/Ac.Aspartculasmaisutilizadassoasde
ltexeasclulasmaisutilizadassoashemciasformolizadas
deavesecarneiro.

Aglutinao Indireta

A. PESQUISADEANTICORPOS
B. PESQUISADEANTGENOS

Aglutinao Indireta
RESULTADO
QUANTITATIVO

Aglutinao
3.INIBIODAAGLUTINAODIRETA:algunsantgenosvirais
possuemacapacidadedeseligarshemciasdeseus
hospedeiros.SochamadosdeHEMAGLUTININAS.Quandoo
indivduopossuianticorposespecficosparaovruspesquisado,
esteseligaraomesmo(naprimeiraetapadoteste)impedindo
queestahemaglutininaseligueshemcias(nasegundaetapa
doteste).

Inibio da Aglutinao Direta

Aglutinao

4.INIBIODAAGLUTINAOINDIRETA:Utilizadanapesquisa
deantgenos,ondeoanticorpoespecficoseligaaoantgeno
presentenaamostrapesquisada,evitandoeaglutinao.

Inibio da Aglutinao Indireta

Aglutinao
5.FLOCULAO:Ocorreaformaodeimunocomplexos em
meiolquido,observadoolhon oucomauxliodemcroscpio
ptico.OexemploclssicoareaodeVDRL (Veneral Disease
Research Laboratories),utilizadonodiagnsticoetambmno
acompanhamentoevolutivodotratamentodaSfilis.

Floculao

Ensaios Lticos
Oprincpioconsisteemdetectarantgenosouanticorpos,
tendocomoresultadofinalaHEMLISE (destruiodas
hemcias);
UtilizaseasprotenasdoSistemaComplementopara
promoverahemlise,poissoprotenasqueseativamna
presenadeanticorpos(IgG ouIgM),culminandonofinaldo
processonaformaodo"ComplexodeAtaqueMembrana",
quefuraamembranacelular(nocaso,ashemcias)eprovoca
sualise;
Estetipodeensaioimunerecebeonomede"Reaode
FixaodoComplemento" RFC

Reao de Fixao do Complemento

PesquisadeANTICORPOS:amostracolocadajuntocomo
antgenoeasprotenasdosistemacomplemento.Finalmente
adicionadoosistemaindicador(hemciasrevestidascom
anticorposantihemcias).

NA
AMOSTRA
QUE
CONTM
ANTICORPOS
NO
OCORRE
HEMLISE

AMOSTRA

ANTGENO
+
PROTENAS
DOCOMPLEMENTO

AMOSTRA
COM
ANTICORPOS

AMOSTRA
COM
ANTICORPOS
+
SISTEMAINDICADOR

Reao de Fixao do Complemento

AMOSTRA

ANTGENO
+
PROTENAS
DOCOMPLEMENTO

AMOSTRA
SEM
ANTICORPOS

AMOSTRA
SEM
ANTICORPOS
+
SISTEMAINDICADOR

AMOSTRA
NEGATIVACOM
HEMLISE

Figuras extradas:
BiologiaMoleculardaClula Alberts
Imunobiologia Janeway
Imunologia Kuby
Imunoensaios Vaz
Google
Obrigada!