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Ensaios imunes Profª Heide Baida
Ensaios imunes
Profª Heide Baida
Introdução • A produção de anticorpos, parte fundamental da resposta imune adaptativa e que compõem
Introdução
• A produção de anticorpos, parte fundamental da resposta imune
adaptativa e que compõem o que chamamos de resposta imune
humoral, é o tipo de resposta específica e direcionada. O antígeno
que estimulou sua produção pode ser de origem viral, bacteriana,
fúngica, tumoral, etc
• Os anticorpos, assim como alguns antígenos, circulam pelos
líquidos corpóreos e podem ser dosados e analisados de forma
qualitativa e quantitativa;
• Os teste imunes simulam “ in vitro” os processos imunes “ in vivo”,
fornecendo assim dados sobre o estado clínico do paciente e sobre
a infecção que está sendo pesquisada.
Ensaios imunes não marcados
Ensaios imunes não marcados
Introdução • São ensaios onde a ligação Antígeno/Anticorpo (Ag/Ac) é visualizada sem o auxílio de
Introdução
• São ensaios onde a ligação Antígeno/Anticorpo (Ag/Ac) é
visualizada sem o auxílio de marcadores;
• A ligação Ag/Ac é detectada macroscopicamente podendo, em
alguns casos, ser auxiliada pelo microscópio óptico;
• As principais técnicas imunes não marcadas são:
1. Imunoprecipitação
2. Aglutinação
3. Ensaios líticos (fixação de complemento)
Imunoprecipitação • Preferencialmente, o antígeno deve conter vários epítopos e consequentemente ocorre a dosagem
Imunoprecipitação
• Preferencialmente, o antígeno deve conter vários epítopos e
consequentemente ocorre a dosagem policlonal dos
anticorpos;
• A concentração de antígenos e anticorpos deve ser bem
definida, para que não ocorra o fenômeno conhecido com
“Pró ‐zona”;
• Define ‐se a concentração ideal através da análise de várias
diluições, até que seja encontrada a “Zona de Equivalência”
Zona de equivalência e Efeito “Pró‐zona” Pró‐ zona
Zona de equivalência e
Efeito “Pró‐zona”
Pró‐ zona
Imunoprecipitação • Para melhor visualização dos imunocomplexos (ligações Ag/Ac), os testes são realizados em
Imunoprecipitação
• Para melhor visualização dos imunocomplexos (ligações
Ag/Ac), os testes são realizados em meio gelificado, que
proporcionam e formação de uma linha de precipitado, visível
a olho nú.
• Técnica de IMUNODIFUSÃO: utiliza ‐se gel de agarose onde as
moléculas (tanto antígenos como anticorpos) difundem ‐se e
encontram‐se, formando então os complexo Ag/Ac, que
possuem alto peso molecular e ficam imobilizados no gel.
Formou ‐se então o imunoprecipitado, que é visível. A técnica
pode ser executada como:
Conceito de Difusão • DIFUSÃO: o soluto é transportado devido ao movimento aleatório das moléculas
Conceito de Difusão
• DIFUSÃO: o soluto é transportado devido ao movimento aleatório das
moléculas que o compõem, onde o choque aleatório e a agitação
térmica entre elas promove o movimento e a passagem do meio mais
concentrado para o meio menos concentrado.
• DIFUSÃO PASSIVA: é um processo físico a favor de um gradiente de
concentração.

Difusão

MOLÉCULAS SOLVENTE
MOLÉCULAS
SOLVENTE
Imunoprecipitação 1. IMUNODIFUSÃO SIMPLES: Ocorre a imobilização de um dos componentes (anticorpo ou antígeno) no
Imunoprecipitação
1. IMUNODIFUSÃO SIMPLES: Ocorre a imobilização de um dos
componentes (anticorpo ou antígeno) no meio gel. Após a
gelificação, adiciona ‐se ou outro componente e aguarda‐se (por
cerca de 1 semana) a formação da linha de precipitação na zona
de equivalência.
Imunoprecipitação 2. IMUNODIFUSÃO SIMPLES RADIAL: Ocorre a imobilização de um dos componentes (anticorpo ou
Imunoprecipitação
2. IMUNODIFUSÃO SIMPLES RADIAL: Ocorre a imobilização de
um dos componentes (anticorpo ou antígeno) no meio gel. A
mistura é então adicionada a uma lâmina. Após a gelificação,
orifícios são abertos no gel e adiciona ‐se o segundo
componente aos orifícios. Ocorrerá e difusão simultânea através
do gel e consequentemente a formação da linha de precipitação
na zona de equivalência.
Imunodifusão Simples Radial
Imunodifusão Simples Radial
Imunoprecipitação 3. IMUNODIFUSÃO DUPLA RADIAL: Neste método não há incorporação dos componentes ao gel. Ambos
Imunoprecipitação
3. IMUNODIFUSÃO DUPLA RADIAL: Neste método não há
incorporação dos componentes ao gel. Ambos difundem ‐se pelo
gel através de orifícios, formando as linhas de precipitação nas
zonas de equivalência.

Imunodifusão Dupla Radial

Imunodifusão Dupla Radial
Imunoprecipitação 4. IMUNOELETROFORESE: 4.1. ELETROFORESE: Consiste na migração de moléculas com diferentes
Imunoprecipitação
4. IMUNOELETROFORESE:
4.1. ELETROFORESE: Consiste na migração de moléculas com
diferentes potenciais elétricos e pesos moleculares em um meio
condutor, submetidas a um campo elétrico. Utiliza ‐se, via de
regra, gel de ágar e poliacrilamida.
Imunoprecipitação 4. IMUNOELETROFORESE: 4.2. IMUNODIFUSÃO RADIAL: Após a migração das moléculas por
Imunoprecipitação
4. IMUNOELETROFORESE:
4.2. IMUNODIFUSÃO RADIAL: Após a migração das moléculas
por eletroforese, anticorpos específicos para as moléculas
estudadas são adicionadas a uma canaleta, de onde irão se
difundir e se ligar aos antígenos (no caso, as moléculas a serem
estudadas), evidenciando cada uma das moléculas,
separadamente.
Imunoeletroforese
Imunoeletroforese
Imunoprecipitação Variações da Imunoeletroforese: • Imunofixação: utiliza ‐se esta técnica para a pesquisa de
Imunoprecipitação
Variações da Imunoeletroforese:
• Imunofixação: utiliza ‐se esta técnica para a pesquisa de classes
e subclasses de anticorpos dirigidos a um determinado
antígeno, separado previamente por eletroforese.
• Eletroimunodifusão: ambos (antígeno e anticorpo) migram
mediante a aplicação de um campo elétrico.
Imunoprecipitação Automação nos ensaios de Imunoprecipitação: • Nefelometria: A medição é feita através da
Imunoprecipitação
Automação nos ensaios de Imunoprecipitação:
• Nefelometria: A medição é feita através da dispersão de luz,
provocada pela presença dos complexos Ag/Ac;
• Turbidimetria: a detecção é feita através de absorbância.
Aglutinação • Nesta técnica, antígeno ou anticorpo são adsorvidas a partículas ou células (tais como
Aglutinação
Nesta técnica, antígeno ou anticorpo são adsorvidas a
partículas ou células (tais como as hemácias), estes
componentes fazendo parte da FASE SÓLIDA da reação;
A
aglutinação ocorre por ligações simultâneas dos anticorpos
antígenos, tornando ‐se visível a olho nú podendo, em alguns
casos, ter o auxílio do microscópio óptico;
e
O teste pode ser realizado em tubo, placas contendo orifícios,
lâminas de vidro (como as Placas de Kline);
A
técnica pode ser executada de várias formas:
Aglutinação 1. AGLUTINAÇÃO DIRETA: nesta técnica, o antígeno é parte integrante da célula que teoricamente
Aglutinação
1. AGLUTINAÇÃO DIRETA: nesta técnica, o antígeno é parte
integrante da célula que teoricamente está servindo de fase
sólida da reação. Um clássico exemplo da aglutinação direta é a
TIPAGEM SANGUÍNEA, também conhecida como
HEMAGLUTINAÇÃO.
Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea TIPO A TIPO B TIPO AB TIPO O Sangue do paciente
Aglutinação Direta
Tipagem Sanguínea
TIPO A
TIPO B
TIPO AB
TIPO O
Sangue
do
paciente
ANTICORPOS
ANTICORPOS
ANTICORPOS
AUSÊNCIA
Anti‐A e
Anti‐B
Anti‐A
DE
ANTICORPOS
ANTICORPOS
Anti‐B
‐ AGLUTINAÇÃO
com soro Anti‐A
‐ AGLUTINAÇÃO
com soro Anti‐B
AGLUTINAÇÃO
Ausência de
com soro Anti‐A
aglutinação
Resultados do
Teste de
Hemaglutinação
com soro Anti‐A
‐ Ausência de
aglutinação
com soro Anti‐B
‐ Ausência de
aglutinação
com soro Anti‐A
Ausência de
AGLUTINAÇÃO
com soro Anti‐B
aglutinação
com soro Anti‐B

Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea

Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea
Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea
Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea
Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea
Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea
Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea

Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea

Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea RESULTADO NEGATIVO RESULTADO POSITIVO

RESULTADO NEGATIVO

Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea RESULTADO NEGATIVO RESULTADO POSITIVO

RESULTADO POSITIVO

Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea RESULTADO NEGATIVO RESULTADO POSITIVO
Aglutinação 2. AGLUTINAÇÃO INDIRETA: nesta técnica, o antígeno ou anticorpo é adsorvido a uma partícula
Aglutinação
2. AGLUTINAÇÃO INDIRETA: nesta técnica, o antígeno ou
anticorpo é adsorvido a uma partícula ou célula que não
interfere na reação Ag/Ac. As partículas mais utilizadas são as de
látex e as células mais utilizadas são as hemácias formolizadas
de aves e carneiro.
Aglutinação Indireta A. PESQUISA DE ANTICORPOS B. PESQUISA DE ANTÍGENOS
Aglutinação Indireta
A. PESQUISA DE ANTICORPOS
B. PESQUISA DE ANTÍGENOS
Aglutinação Indireta RESULTADO QUANTITATIVO
Aglutinação Indireta
RESULTADO
QUANTITATIVO
Aglutinação 3. INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO DIRETA: alguns antígenos virais possuem a capacidade de se ligar
Aglutinação
3. INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO DIRETA: alguns antígenos virais
possuem a capacidade de se ligar às hemácias de seus
hospedeiros. São chamados de HEMAGLUTININAS. Quando o
indivíduo possui anticorpos específicos para o vírus pesquisado,
este se ligará ao mesmo (na primeira etapa do teste) impedindo
que esta hemaglutinina se ligue às hemácias (na segunda etapa
do teste).
Inibição da Aglutinação Direta
Inibição da Aglutinação Direta
Aglutinação 4. INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO INDIRETA: Utilizada na pesquisa de antígenos, onde o anticorpo específico
Aglutinação
4. INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO INDIRETA: Utilizada na pesquisa
de antígenos, onde o anticorpo específico se liga ao antígeno
presente na amostra pesquisada, evitando e aglutinação.

Inibição da Aglutinação Indireta

Inibição da Aglutinação Indireta
Aglutinação 5. FLOCULAÇÃO: Ocorre a formação de imunocomplexos em meio líquido, observado à olho nú
Aglutinação
5. FLOCULAÇÃO: Ocorre a formação de imunocomplexos em
meio líquido, observado à olho nú ou com auxílio de mcroscópio
óptico. O exemplo clássico é a reação de VDRL (Veneral Disease
Research Laboratories), utilizado no diagnóstico e também no
acompanhamento evolutivo do tratamento da Sífilis.
Floculação
Floculação
Ensaios Líticos • O princípio consiste em detectar antígenos ou anticorpos, tendo como resultado final
Ensaios Líticos
• O princípio consiste em detectar antígenos ou anticorpos,
tendo como resultado final a HEMÓLISE (destruição das
hemácias);
• Utiliza ‐se as proteínas do Sistema Complemento para
promover a hemólise, pois são proteínas que se ativam na
presença de anticorpos (IgG ou IgM), culminando no final do
processo na formação do "Complexo de Ataque à Membrana",
que fura a membrana celular (no caso, as hemácias) e provoca
sua lise;
• Este tipo de ensaio imune recebe o nome de "Reação de
Fixação do Complemento" ‐ RFC
Reação de Fixação do Complemento • Pesquisa de ANTICORPOS: amostra é colocada junto com o
Reação de Fixação do Complemento
• Pesquisa de ANTICORPOS: amostra é colocada junto com o
antígeno e as proteínas do sistema complemento. Finalmente
é adicionado o sistema indicador (hemácias revestidas com
anticorpos anti‐hemácias).
NA
AMOSTRA
QUE
CONTÉM
ANTICORPOS
NÃO
OCORRE
HEMÓLISE
AMOSTRA
AMOSTRA
AMOSTRA
ANTÍGENO
COM
COM
+
ANTICORPOS
ANTICORPOS
PROTEÍNAS
DO COMPLEMENTO
+
SISTEMA INDICADOR
Reação de Fixação do Complemento AMOSTRA AMOSTRA AMOSTRA ANTÍGENO SEM SEM AMOSTRA NEGATIVA COM +
Reação de Fixação do Complemento
AMOSTRA
AMOSTRA
AMOSTRA
ANTÍGENO
SEM
SEM
AMOSTRA
NEGATIVA COM
+
ANTICORPOS
ANTICORPOS
HEMÓLISE
PROTEÍNAS
DO COMPLEMENTO
+
SISTEMA INDICADOR
Figuras extraídas: • Biologia Molecular da Célula ‐ Alberts • Imunobiologia – Janeway • Imunologia
Figuras extraídas:
• Biologia Molecular da Célula ‐ Alberts
• Imunobiologia – Janeway
• Imunologia – Kuby
• Imunoensaios ‐ Vaz
• Google
Obrigada!