V - SEPARAO DE DUAS ENZIMAS POR CROMATOGRAFIA DE

PERMUTA INICA
INTRODUO
Cromatografia de permuta inica
A cromatografia um conjunto de tcnicas para a separao de compostos existentes
numa mistura. A cromatografia de permuta inica uma forma de cromatografia em que o
mecanismo de separao se baseia no estabelecimento de interaces electrostticas
reversveis entre solutos inicos e uma fase estacionria (um permutador inico) que contm
grupos com carga contrria.
Os permutadores inicos utilizados nesta aula so constitudos por duas partes: uma
matriz tridimensional insolvel e grupos carregados electricamente, ligados de forma
covalente matriz no seu interior e sua superfcie. Um permutador aninico apresenta
grupos funcionais carregados positivamente, ligados de forma covalente matriz, mas tero
de existir tambm contra ies com carga negativa, de forma que globalmente o permutador
fique neutro. Estes contra-ies podem ser trocados (ou permutados) com outros contra-ies
com a mesma carga, que existam no meio com o qual o permutador posto em contacto (ver,
por ex. a eq. 1).
Para a separao de protenas, cujas molculas apresentam carga elctrica global no
nula, excepto no seu ponto isoelctrico (PI), so adequados os permutadores celulsicos ou os
permutadores acrlicos, ou base de dextrano, que so polmeros com baixa percentagem de
ligaes cruzadas. De entre os permutadores celulsicos mais comuns destacam-se o
permutador aninico DEAE-celulose (grupo funcional DiEtilAminoEtilo) e o permutador
catinico CM-celulose (grupo funcional CarboxiMetilo).

DEAE-celulose

CM-celulose
Se a fase estacionria constituir o enchimento de uma coluna, no caso concreto desta aula
possvel analisar o processo cromatogrfico como envolvendo os seguintes processos:
1 - O enchimento da coluna (substncia permutadora inica insolvel), contendo grupos
funcionais inicos (neste trabalho com carga positiva: DEAE+), encontra-se rodeado pelos
contra-ies (ies de sinal contrrio: A) de uma soluo tampo. Nestas circunstncias o
enchimento pode ser representado por: DEAE+A;
1

2 Aps a introduo da amostra na coluna, as molculas de solutos com diferentes cargas

entram em contacto com o permutador inico. Nesta zona do topo da coluna estabelece-se o
equilbrio de permuta aninica descrito na eq. 1. Este equilbrio que a base dos processos
que iro permitir a separao cromatogrfica, pode neste caso ser escrito na forma:

n DEAE+A

Ezn

'

(DEAE+)nEz n + n A

(eq. 1)

3 Faz-se passar pela coluna um caudal de uma soluo tampo que contm ies A. Como
os grupos DEAE+ da fase estacionria esto fixos na coluna, todos os ies de carga negativa
que estejam ligados a esses grupos no se deslocam ao longo da coluna medida que se faz
passar a soluo tampo;
4 As molculas de soluto que tenham uma carga elctrica de sinal oposto ao do permutador
(neste caso, negativa: Ezn) podem ligar-se fase estacionria, tanto mais fortemente
quanto maior for a sua carga (e enquanto estiverem ligadas fase estacionria no se
deslocam). As molculas neutras e as de carga idntica do permutador movem-se com a
soluo de eluio (neste caso um tampo);
5 Como a soluo tampo que se faz passar ao longo da coluna contm ies A, o equilbrio
da eq. 1 vai-se deslocando progressivamente para a esquerda, o que significa que os ies
Ezn da amostra vo tambm sendo progressivamente deslocadas ao longo da coluna. As
molculas do soluto ligadas fase estacionria podem ser mais eficientemente libertadas da
sua ligao fase estacionria (ies DEAE+) por eluio com um tampo de fora inica
mais elevada (ou pH mais baixo, pois a carga negativa dos ies Ezn diminui medida que
o meio se torna mais cido, o que diminui a interaco entre o soluto e o permutador por
reduo da carga negativa do soluto);
medida que se faz passar o tampo ao longo da coluna, o equilbrio descrito pela eq. 1
repete-se um nmero enorme de vezes. Em todos os instantes em que os ies Ezn no esto
ligados aos grupos DEAE+ do enchimento, esto em movimento ao longo da coluna. Ao fim
de algum tempo (ou seja, volume de tampo que j passou), os ies Ezn saem na outra
extremidade da coluna, onde podero ser detectados por um mdodo adequado. Um aumento
da fora inica (isto , da concentrao do tampo) faz sair as molculas do soluto de uma
forma mais rpida, ou seja, para um volume de tampo mais pequeno.
Catalase
A catalase (EC 1.11.1.6) uma enzima que contm o grupo prosttico hemo e que
catalisa a decomposio do perxido de hidrognio (gua oxigenada) de acordo com a
equao:
H2O2

'

H2O

O2 .

O dioxignio produzido pela reaco pode ser detectado pela observao da libertao de
bolhas gasosas na mistura reaccional.
Glucose oxidase
A glucose oxidase (EC 1.1.3.4) uma enzima que utiliza a flavina adenina
dinucletido (FAD) como grupo prosttico e que catalisa a oxidao da glucose de acordo
com o esquema:

-D-glucose

'

O2

D-glucono--lactona

H2O2

que se pode considerar realizado em dois passos:

E-FAD

'

-D-glucose

E-FADH2

O2

E-FADH2

'

+ D-glucono--lactona

E-FAD

H2O2

A deteco da gua oxigenada produzida na reaco pode ser feita usando a sua
capacidade de oxidar o io iodeto (I) a iodo (I2) (aparecimento de cor amarela ou
acastanhada),
H2O2

2 I

2 H+

I2

2 H2O

um processo praticamente instantneo na presena de molibdato como agente catalisador.

Determinao de H2O2 por titulao volumtrica
O perxido de hidrognio existente numa soluo aquosa pode ser determinado por
titulao volumtrica em meio cido com uma soluo titulante de permanganato de potssio
(K+MnO4) de acordo com a reaco:
2 MnO4

5 H2O2

6 H+

'

5 O2

2 Mn 2+

8 H2O

Determinao de protena pelo mtodo de Bradford

A determinao da quantidade de protena existente numa soluo aquosa pelo mtodo de
Bradford baseia-se na ligao protena de um corante denominado Azul Brilhante de
Coomassie G-250. A ligao deste corante protena em meio cido conduz a uma variao
no comprimento de onda do mximo de absoro do corante de 465 nm para 595 nm. A
absorvncia (A) a 595 nm est directamente relacionada com a concentrao da protena (C)
na soluo (A = K C) e se se dispuser de uma recta de calibrao A vs. C, pode determinarse C por simples leitura de A.
Actividade especfica de uma enzima
A indicao da quantidade de uma determinada enzima existente num extracto celular
normalmente feita atravs da determinao da sua actividade cataltica (actividade
enzimtica) e normalmente traduz-se, no pela indicao de um determinado nmero de
miligramas ou moles da enzima existentes no extracto, mas recorrendo a unidades
estabelecidas em funo da actividade enzimtica. Usam-se correntemente as chamadas
unidades de enzima (1.0 unidades de actividade do enzima definida como a quantidade de
enzima que catalisa a transformao de 1 mol de substrato por minuto, a 25C) ou o Katal
(Kat), recomendado pela Comisso sobre Enzimas da Unio Internacional de Bioqumica e
Biologia Molecular (quantidade de actividade enzimtica que converte uma mole de
substrato por segundo, a 25 C, em condies definidas por diversos factores tal como o pH).
O termo actividade refere-se ao total de unidades de enzima existente numa soluo. No
caso de enzimas j purificadas utilizada frequentemente a indicao da actividade
especfica, que d conta da actividade enzimtica por unidade de massa da protena. A
determinao da actividade especfica exige assim o conhecimento da actividade enzimtica

na soluo onde se encontra a enzima num grau de pureza elevado e, simultaneamente, o

conhecimento da quantidade total de protena existente na soluo.
OBJECTIVO DO TRABALHO
O objectivo do trabalho consiste na separao das enzimas catalase e glucose oxidase
por cromatografia de permuta inica, tcnica em que explora o facto dos pontos isoelctricos
para as duas protenas serem diferentes. Ou seja, a carga Ezn das duas enzimas diferente, o
que faz com que a fora da ligao (DEAE+)nEz n seja diferente. Assim sendo, a constante
do equilbrio descrito pela eq. 1 diferente para as duas enzimas e o volume de tampo
necessrio para deslocar as enzimas ao longo de toda a coluna tambm ser diferente.
A presena das enzimas nas fraces recolhidas sada da coluna pode ser detectada
qualitativamente pela presena de bolhas gasosas (dioxignio que se liberta como produto da
reaco catalisada pela catalase aps adio de gua oxigenada fraco), ou pela presena
de uma cor amarela ou acastanhada aps adio de glucose fraco, seguida da adio de
uma soluo de iodeto (formao de I3 por reaco do io I com a gua oxigenada, que se
forma como produto da reaco de oxidao da glucose catalisada pela glucose oxidase).
tambm feita a determinao quantitativa da catalase nas fraces em que a deteco
revelar a existncia de maior quantidade desta enzima. Utilizar-se- um mtodo volumtrico
(titulao da gua oxigenada adicionada a um determinado volume da fraco e no destruda
aps um curto tempo de incubao), usando como titulante uma soluo de KMnO4.
Finalmente faz-se a determinao da quantidade de catalase existente numa das fraces
usando o mtodo de Bradford e calcula-se a actividade especfica da enzima nessa fraco.
REAGENTES
a) Separao cromatogrfica e determinao qualitativa (deteco) das enzimas nas
fraces
Soluo tampo 20 mM em acetato de sdio e 5 mM em cido actico soluo A;
Soluo tampo 40 mM em acetato de sdio e 40 mM em cido actico soluo B;
Soluo tampo 0,10 M em acetato de sdio e 0,10 M em cido actico soluo C;
Soluo contendo as enzimas catalase (Sigma C-10) e glucose oxidase (Sigma G-7141),
preparada por dissoluo das enzimas na soluo tampo A (concentraes aproximadas
de 1 a 3 mg/mL);
gua oxigenada a 30 volumes;
Glucose;
Soluo concentrada de iodeto de potssio contendo uma pequena quantidade de
molibdato de sdio;
b) Determinao quantitativa da catalase por titulao volumtrica;
Soluo tampo de fosfato 0,02 M (pH 7,0) soluo D;
Soluo 0,05 M em H2O2 preparada com a soluo D soluo E;
Soluo 3,0 M em H2SO4;
Soluo 0,005 M em KMnO4.
c) Determinao quantitativa da protena total pelo mtodo de Bradford

Reagente de Coomassie (Ver trabalho Testes para a identificao de aminocidos e

protenas).
4

MATERIAL
Coluna de vidro para cromatografia com enchimento de DEAE-celulose
Tubos de ensaios
Pipeta de 500 L e outras
Banho de gua e gelo
Copos de 100 mL de forma alta
Bureta de 25 mL
Espectrofotmetro UV-Vis
TCNICA
a) Separao cromatogrfica e deteco das enzimas nas fraces
1)
2)
3)
4)

Equilibrar a coluna de DEAE-celulose com a soluo A.

Marcar nove tubos de ensaio com os nmeros 0, 1, 2, 8.
Introduzir duas gotas da soluo das duas enzimas no tubo marcado com o nmero 0.
Adicionar 10 mL da soluo A ao tubo 0, agitar suavemente e dividir a soluo em duas
partes alquotas, colocando-as em dois tubos de ensaio marcados 0-C e 0-GO.
5) Adicionar 3 gotas de gua oxigenada ao tubo 0-C e observar o eventual desprendimento
de pequenas bolhas gasosas.
6) Adicionar glucose slida (~ 100 mg) ao tubo 0-GO e agitar suavemente para dissoluo
do slido.
7) Adicionar 3 gotas da soluo de iodeto de potssio ao tubo 0-GO e observar o eventual
aparecimento de uma cor amarela.
8) Prosseguir o trabalho no caso dos testes mencionados em 5) e 7) terem sido positivos,
carregando a coluna com 2 mL da soluo das duas enzimas. Para isso abrir a coluna para
fazer sair o lquido at o menisco do lquido atingir o topo do enchimento e introduzir
ento cuidadosamente os 2 mL da soluo das duas enzimas. Procurar perturbar o topo do
enchimento o mnimo possvel;
9) Abrir a coluna para fazer entrar a soluo das duas enzimas no enchimento, recolhendo o
lquido sada da coluna para o tubo com o nmero 1.
10) Fechar a coluna quando o menisco do lquido atingir o topo do enchimento.
11) Introduzir progressivamente na coluna um total de 8 mL da soluo A, continuando a
recolher o lquido sada da coluna para o tubo com o nmero 1. Procurar perturbar o
topo do enchimento o mnimo possvel sempre que adiciona lquido ao topo da coluna. O
topo do enchimento nunca dever secar; consulte o professor sobre como proceder.
12) Fechar a sada da coluna quando o menisco do lquido atingir o topo do enchimento.
13) Adicionar cuidadosamente soluo B at encher completamente a coluna.
14) Abrir a coluna continuando a recolher o lquido sada da coluna para o tubo com o
nmero 1 at que o volume total da fraco recolhida neste tubo seja igual a 10 mL.
15) Trocar de tubo passando a recolher o lquido sada da coluna para o tubo com o nmero
2. V repondo no topo da coluna soluo B.
16) Passar 3 mL da fraco contida no tubo 1 para um outro tubo marcado 1-C e testar a
presena de catalase tal como indicado em 5).
17) Passar 3 mL da fraco contida no tubo 1 para um outro tubo marcado 1-GO e testar a
presena de glucose oxidase tal como indicado em 6) e 7).
18) Colocar o tubo 1 contendo o que restou da fraco (4 mL) num banho de gua e gelo.
19) Continuar a recolher fraces de 10 mL cada para os tubos marcados 2, 3, usando
como eluente a soluo B at que os testes enzimticos para ambas as enzimas sejam
negativos. Os tubos 2, 3, contendo o que restou das fraces devem ser igualmente
colocados num banho de gua e gelo.
5

20) Passar a usar como eluente a soluo C e recolher mais trs fraces de 10 mL cada.
21) Testar a actividade enzimtica das trs ltimas fraces.
Terminada a parte essencial do trabalho, dever deixar a coluna pronta para uma prxima
separao cromatogrfica:
22) Levar o menisco do lquido at ao topo do enchimento. Introduzir cuidadosamente 3 mL
de soluo A e levar novamente o menisco do lquido at ao topo do enchimento. Juntar
cuidadosamente soluo A at ao topo da coluna e escoar o lquido da coluna at ao topo
do enchimento.
23) Repetir esta operao, isto , juntar cuidadosamente soluo A at ao topo da coluna e
escoar o lquido da coluna at ao topo do enchimento. Juntar cuidadosamente soluo A
at ao topo da coluna e deixar assim (no escoar).
b) Determinao quantitativa da catalase (actividade enzimtica) nas fraces por
volumetria
1) Seleccionar os tubos de ensaio contendo as duas fraces para as quais o teste qualitativo
para a presena de catalase tiver revelado uma maior actividade enzimtica.
2) Preparar um conjunto de dois tubos de ensaio 18150 mm, marcados, respectivamente,
com Cat-A e Cat-B e com o nmero da fraco a testar, contendo, cada um deles, 10 mL
da soluo D e 2 mL da soluo E.
3) Colocar o par de tubos num banho de gelo e gua.
4) Adicionar 2 mL de H2SO4 3,0 M ao tubo Cat-A, que servir para controlo (tempo zero).
Neste tubo a enzima estar inactivada (desnaturao em meio fortemente cido) antes da
incubao com o substrato;
5) Adicionar 500 L de uma das fraces escolhidas ao tubo marcado com Cat-B e accionar
o cronmetro a meia adio;
6) Agitar imediatamente e com cuidado a mistura reaccional e voltar a coloc-la no banho
de gua e gelo;
7) Terminar a incubao do tubo Cat-B ao fim de cinco minutos pela adio de 2 mL de
H2SO4 3,0 M seguida, imediatamente, de agitao;
8) Adicionar 500 L da fraco escolhida ao tubo marcado com Cat-A;
9) Transferir a soluo do tubo Cat-B para um copo de 100 mL de forma alta;
10) Lavar o tubo com alguns mililitros de gua destilada e adicion-los ao copo;
11) Titular o contedo do copo com uma soluo 0,005 M em KMnO4 at ao aparecimento da
primeira cor rsea persistente agitao durante cerca de 30 segundos;
12) Transferir a soluo do tubo marcado com Cat-A para um copo de 100 mL de forma alta;
13) Repetir os passos 10) e 11);
14) Calcular o nmero de moles de MnO4 usado em cada titulao a partir do volume de
titulante gasto;
15) Calcular o nmero de moles de H2O2 que permaneceram sem decomposio em cada
um dos tubos Cat-A e Cat-B;
16) Para obter o nmero de moles de H2O2 decomposto por aco da enzima, subtrair o
nmero de moles de H2O2 que permaneceram sem decomposio no tubo Cat-B ao
valor calculado para o tubo Cat-A;

17) Definindo uma unidade de actividade enzimtica (U) como a actividade enzimtica que
conduz decomposio de 1 mole de H2O2 por minuto nas condies experimentais
usadas, calcular a actividade enzimtica na fraco (testada) recolhida sada da coluna
expressa em U/mL da fraco;
18) Repetir os passos 2) a 18) para a outra fraco seleccionada.
c) Determinao quantitativa da protena total numa das fraces pelo mtodo de Bradford
1) Misturar, em tubos de ensaio de vidro, 2,5 mL de reagente de Coomassie com 50 L da
fraco que tiver revelado maior actividade enzimtica de catalase. Fazer o ensaio em
triplicado;
2) Cerca de 20 minutos aps a mistura dos reagentes, ler a absorvncia das solues ao
comprimento de onda de 595 nm num espectrofotmetro.
3) Utilizando uma recta de calibrao, obtida com solues aquosas de albumina srica
bovina (Bovine Serum Albumin, Fraction V, Sigma) de concentraes conhecidas,
compreendidas entre 50 e 600 g/mL, calcular a concentrao de protena total na
fraco.
4) Calcular a actividade especfica da catalase na fraco a partir dos resultados obtidos em
b) 17) e em c) 3).
Nota: S determinada a actividade especfica para a catalase.

SEPARAO DE DUAS ENZIMAS POR CROMATOGRAFIA DE

PERMUTA INICA
FOLHA DE RESULTADOS
GRUPO:

DATA: ...............

TURMA: .................

Nome ....................................................................................

N ...............................

Nome ....................................................................................

N ...............................

Nome ....................................................................................

N ...............................

RESULTADOS EXPERIMENTAIS
Actividade enzimtica (deteco)

Fraco n

Presena de catalase

Presena de glucose oxidase

1
2
3
4
5
6
7
8
Obs.: Indicar a actividade enzimtica da seguinte maneira: intensa + + +; mdia
+ + ; pouco intensa +; no detectvel o.
Concluso

A enzima catalase tem um ponto isoelctrico superior/inferior ao da enzima glucose

oxidase?

Actividade enzimtica (determinao quantitativa)

Tubo
n

Diluio

Volume de

titulante. mol MnO4

utilizado
(mL)

mol H2O2
remanescente

mol H2O2
decomposto

Actividade
enzimtica
(U/mL)

Determinao da protena total

Absorvncia

Concentrao

Clculo da actividade especfica