UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA

PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA

COORDENAO GERAL DE PESQUISA
PROGRAMA DE INICIAO CIENTFICA E TECNOLGICA
PIBIC/PIBITI/PIVIC/PIVITI

Relatrio Final
Vigncia 2015-2016

Ttulo do Projeto:
Estudo fitoqumico de plantas de interesse medicinal: uma abordagem por CLAE-DAD

Ttulo dos Planos:

Identificao dos constituintes fenlicos de Hypenia salzmannii por CLAE-DAD

ANDR CHAVES DE ALBUQUERQUE

Joo Pessoa
2016

RESUMO

Hypenia salzmannii Benth. uma espcie arbustiva pertencente famlia Lamiaceae,

conhecida popularmente como canela-de-urubu. A populao utiliza esta planta para o tratamento de
afeces do trato respiratrio como gripes, resfriados e outras doenas respiratrias em geral (AGRA
et al., 2007). Tendo em vista que para esta espcie j foram relatadas atividades farmacolgicas do seu
extrato metanlico (FALCO & MENEZES, 2003), alm de moderada atividade contra radicais
livres e antioxidante (DAVID et al., 2007), o isolamento de diterpenos, lignanas, flavonas, chalconas e
do cido p-metoxicinmico (publicado com a sua sinonmica botnica: Hyptis salzmannii)
(MESSANA et al., 1990) e que estudos anteriores de nosso grupo de pesquisa levaram ao isolamento e
caracterizao de uma nova lignana desta espcie (LUCENA et al.,2013), este trabalho deu
continuidade ao estudo qumico da espcie, agora com uma abordagem mais precisa, utilizando
CLAE-DAD. O material botnico foi coletado no municpio de Maturia Paraba e identificado pela
Profa. Dr. Maria de Ftima Agra e uma exsicata encontra-se depositada no Herbrio Prof. Lauro Pires
Xavier, na Universidade Federal da Paraba. As partes areas de Hypenia salzmannii foram dessecadas
em estufa com ar circulante a temperatura de 40 C durante 72 horas, em seguida, trituradas e modas
em moinho mecnico. O p obtido foi submetido a macerao com etanol (EtOH) a 95 % por trs dias
consecutivos. A soluo etanlica obtida foi filtrada e o solvente, evaporado com o auxlio de um
rotaevaporador sob presso reduzida a uma temperatura mdia de 40C, sendo o extrato etanlico
bruto (EEB) obtido ao final deste processo. Amostras do extrato etanlico bruto de Hypenia
salzmannii e de padres de marcadores qumicos foram diludas em metanol:H2O (1:1) at as
concentraes de 1 mg/mL e 100 g/mL, respectivamente. Utilizando um sistema de CLAE-DAD, a
coinjeo com padres levou deteco dos cidos cafeico e rosmarnico.
Palavras chave: Lamiaceae, Hypenia salzmannii, CLAE-DAD.

PARTE I
1. INTRODUO
Baseado na experincia popular e reconhecendo a importncia das plantas para combater os
males cotidianos, o homem passou a se interessar na aplicao de preparos vegetais para tratar
enfermidades das quais pudesse ser acometido (YUNES ; CECHINEL-FILHO, 2007).
O Brasil apresenta uma cultura popular particularmente rica no que se refere ao uso de plantas
medicinais. Apesar deste fato, nota-se que apenas uma pequena porcentagem de sua biodiversidade e
do conhecimento popular aplicada a pesquisa e desenvolvimento de agentes fitoterpicos
(CALIXTO, 2005).
Dadas estas condies, nota-se um crescente interesse no uso e na pesquisa de plantas
medicinais para fins teraputicos, tendo em vista, ainda, a boa aceitabilidade e as altas cifras
relacionadas a fitomedicamentos no mercado farmacutico. O Brasil o pas com maior potencial para
pesquisa com espcies vegetais, uma vez que detm a maior e mais rica biodiversidade do planeta
(NOLDIN et al., 2006).
Apesar dos notveis avanos da medicina moderna, nas ltimas dcadas, como o crescimento
vertiginoso da rea da qumica de sntese, cerca de 25% dos medicamentos comercializados
mundialmente ainda so de origem vegetal, seja por isolamento ou pela produo via semi-sntese
(FOGLIO et al., 2006).

1.1 Consideraes sobre a famlia Lamiaceae, o gnero Hypenia e a espcie Hypenia

salzmannii Benth.
A famlia Lamiaceae abrange 7.193 espcies, distribudas em aproximadamente 260 gneros.
Plantas dessa famlia so predominantes no mediterrneo, mas alguns de seus gneros, como Salvia e
Scutellaria , so distribudos de forma ampla e cosmopolita (Fig.1). No Brasil, ocorrem cerca de 350
espcies, pertencendo a 26 gneros, sendo a subtribo Hyptidinae a principal representante da famlia
Lamiaceae em regies do Cerrado do Leste da Amrica do Sul (SILVA et al., 2011).
Figura 1 - Mapa de distribuio da famlia Lamiaceae, em verde, no mundo.

A famlia Lamiaceae apresenta considervel quantidade de estudos fitoqumicos. Apresenta

grande importncia econmica por ser fonte de uma grande diversidade de leos essenciais (Mentha,
Lavandula, Ocimum, Rosmarinus, Salvia, Satureja, Thymus) e de plantas ornamentais. Muitas
espcies da famlia so utilizadas como condimentos na culinria devido ao sabor que acrescentam aos
alimentos (JUDD et al., 2002; MENEZES, 1994), tambm havendo entre essas espcies algumas
especiarias bem conhecidas como fonte de antioxidantes, especialmente os polifenis (HOSSAIN et
al., 2010).
O gnero Hypenia possui distribuio restrita Amrica do Sul, principalmente no Brasil (Fig.
2). Separado recentemente do gnero Hyptis Jacq. baseado em morfologia e em um grande nmero de
cromossomos, o gnero possui 27 espcies reconhecidas, baseando-se nas inflorescncias densas e
frouxas, incluindo as sees Desinfloraceae Benth. e Laxifloraceae Benth. (SILVA et al., 2011).

Figura 2 Mapa de distribuio do gnero Hypenia em verde.

Espcies de Hypenia so geralmente encontradas em solos arenosos e pobres em nutrientes,

com nveis elevados de alumnio. So distribudas em regies da Venezuela, da Bolvia, do Paraguai e
do Brasil, sendo frequentemente encontradas nas regies do cerrado (SILVA et al., 2011). Nessa
regio, tais espcies so frequentemente relatadas pelo seu uso etnobotnico, seja na forma de infuso
ou decoco de folhas, para o tratamento da gripe, de resfriados e outras doenas respiratrias comuns
(AGRA et al., 2007).
Popularmente conhecida como canela-de-urubu, a espcie Hypenia salzmannii (Fig. 3)
utilizada pela populao para tratar afeces do trato respiratrio (AGRA et al., 2007). Para esta
espcie, j foram relatadas atividades farmacolgicas de seu extrato metanlico, como: ao constra S.
aureus, S subtilis, C. albicans e M smegmatis (FALCO & MENEZES, 2003), alm de moderada
atividade contra radicais livres e antioxidante (DAVID et al., 2007).
Figura 3 - Espcie Hypenia salzmannii (Benth.) Harley (Lamiaceae). (Foto: Tavares, 2016).

Um trabalho com Hypenia salzmannii (publicado com sua sinonmica botnica: Hyptis
salzmannii) levou ao isolamento do diterpeno indito (-)-salzol; trs lignanas: (+)-sesamina, (-)cubenina, (-)-hinoquinina; trs flavonas: sakuranetina, isosakuranetina e narigenina-7,4-dimetileter;
uma chalcona: 4,2,6-triidrxi-4-metoxichalcona; alm do cido p-metoxicinmico (MESSANA et
al. 1990).

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Identificar constituintes fenlicos de Hypenia salzmannii utilizando tcnicas de CLAE-DAD.

2.2 Especficos

Desenvolver metodologia analtica para identificao de fenlicos de Hypenia salzmanii

utilizando CLAE-DAD .

3. MATERIAL E MTODOS

3.1 Coleta e identificao do material vegetal

O material vegetal (partes areas) de Hypenia salzmannii (Benth.) foi coletado no municpio
de Maturia, no estado da Paraba, e a exsicata desta espcie encontra-se catalogada no Herbrio Prof.
Lauro Pires Xavier (JPB), sob registro AGRA et al. 7048.

3.2 Processamento do material vegetal de Hypenia salzmannii Benth.

As partes areas de Hypenia salzmannii foram sexas em estufa com ar circulante temperatura
mdia de 45 C durante 72 horas.
Aps a secagem, o material vegetal foi submetido a um
processo de pulverizao em moinho mecnico tipo Harley, obtendo-se 3,488 Kg de p seco.

3.3 Obteno do extrato etanlico bruto (EEB)

O material vegetal seco e pulverizado foi submetido a sucessivas maceraes com etanol
(EtOH) a 95%. Foram feitos quatro processos de extrao com intervalos de 72h entre eles, para
garantir a maior extrao possvel dos constituintes qumicos. A soluo etanlica obtida foi filtrada,
fazendo-se, em seguida, a evaporao do solvente com o auxlio de um rotaevaporador sob presso
reduzida a uma temperatura mdia de 40 C. Aps o processo de retirada do solvente, foi obtido o
extrato etanlico bruto (EEB), que apresentou 168,25g (4,82% em relao ao peso seco da planta).

3.4 Desenvolvimento do mtodo analtico

3.4.1 Instrumentao

As anlises cromatogrficas foram realizadas utilizando um sistema de cromatografia lquida

de alta eficincia (CLAE) da Shimadzu (Prominence) equipado com mdulo de bombeamento de
solvente binrio LC-20AT, autoinjetor SIL-20A, um sistema de degaseificao DGU-20A5, detector
SPD-M20A diode array. A coluna utilizada foi Phenomenex Gemini C18 (250 mm x 4.6 mm d.i.
preenchido com partculas 5 m), com pr-coluna SecurityGuard Gemini C18 (4 mm x 3.0 mm d.i.
preenchido com partculas 5 m) adqurido da Maxcrom Instrumentos Cientficos Ltda (So Paulo, SP,
BR). A fase mvel consistiu de uma mistura de gua/metanol, com eluio gradiente de 5 a 95% por
tempo de 30 min. O volume de injeo foi de 20 L, com fluxo de fase mvel constante de 1,0 mL
min-1 e a deteco realizada por arranjo de fotodiodos (DAD), sendo os cromatogramas observados em
um comprimento de onda de 330 nm. O software LC Solution (Shimadzu, Japo) foi utilizado para o
controle do equipamento, aquisio e anlise dos dados.

3.4.2 Padres

Foram utilizados para comparao os seguintes padres de marcadores qumicos: cido

rosmarnico, cido cafeico, rutina, quercetina, catequin, epicatequin, narignenin, cido ferrlico, cido
p-coumrico, cido sinptico, cido clorognico, cido trans-cinmico, cido trans-p-metoxicinmico,
cido 3,4,5-trimetoxicinmico e cido 3,4-metilenodioxicinmico, todos adquiridos da Sigma
Aldrich. Dentre os marcadores, foram detectados no extrato vegetal o cido cafeico e o cido
rosmarnico (Fig. 4).
Figura 4- Estruturas moleculares dos cidos cafeico e rosmarnico.

3.4.3 Preparo das amostras

As amostras de extrato de Hypenia salzmannii e de padres utilizados para comparao foram
solubilizadas em metanol:gua (1/1) e submetidas a agitao por ultrassom por 15 minutos at a
concentrao final de 1 mg/mL para extrato e 100 g/mL para amostras de padro.

4. RESULTADOS

4.1 Identificao dos compostos fenlicos no extrato obtido de Hypenia salzmannii

A partir da anlise em CLAE-DAD, foi possvel obter os perfis cromatogrficos do EEB de
Hypenia salzmannii (Fig. 5), bem como dos padres de cidos Rosmarnico (Fig. 6) e Cafeico (Fig.7).
No cromatograma do EEB de Hypenia salzmannii (Fig 5), o pico com tempo de reteno em
16,124 min foi denominado Pico A, e o com tempo de reteno em 23,358, Pico B. Os picos A e B
deste mesmo cromatograma apresentaram ndices de pureza de 0,945351 e 0,947564, respectivamente.
O perfil cromatogrfico do padro de cido Cafeico (Fig 6) apresentou um pico com tempo de
reteno em 16,120 min, com ndice de pureza de 0,958784. O perfil cromatogrfico do padro de
cido Rosmarnico (Fig. 7), por sua vez, apresentou um pico com tempo de reteno em 23,919 min,
com ndice de pureza de 0,970472.
Figura 5- Perfil cromatogrfico do extrato etanlico bruto (EEB) de Hypenia salzmannii.

Figura 6- Perfil cromatogrfico do padro de cido Cafeico.

Figura

7-

Perfil

cromatogrfico

do

padro

de

cido

Rosmarnico.

4.2 Enriquecimento do extrato com padres

Foram adicionados 50g de padro de cido cafeico e a mesma quantidade de padro de cido
rosmarnico soluo de extrato de Hypenia salzmannii, e a soluo final foi submetida a anlise por
CLAE-DAD, obtendo-se um cromatograma com o perfil do extrato enriquecido (Fig. 8).
Figura 8- Perfil cromatogrfico do EEB enriquecido com padres de cido cafeico e rosmarnico.

O cromatograma do extrato de Hypenia salzmannii enriquecido (fig. 8) com padres

apresentou dois picos notveis: o Pico C, com tempo de reteno em 16,123 min e o Pico D, com
tempo de reteno em 23,186 min. Os picos C e D apresentaram indices de pureza de 0,963852 e
0,954888, respectivamente.

4.3 Ajuste do mtodo

Alterando-se o sistema de eluio para um sistema isocrtico de metanol:gua a 45% no

intervalo de 10 a 20 min permitiu a obteno de um novo perfil para o estrato etanlico de Hypenia
salzmannii (Fig. 9), em que o pico predominante (denominado E), diferentemente do sistema
inicialmente proposto para o mtodo, se apresenta livre de coeluies. O Pico E apresentou ndice de
pureza de 0,959313.
Figura 9- Perfil cromatogrfico do EEB sob sistema de eluio metanol:gua a 45% isocrtico de 10 a
20min de eluio.

5. DISCUSSO

Observou-se no cromatograma obtido para o EEB a similaridade entre os tempos de reteno

do Pico A (TR= 16,124 min) e do Pico B (TR= 23,358 min) (Fig. 5) com os padres de cido cafeico
(TR= 16,120 min) e de cido rosmarnico (TR= 23,919 min), respectivamente.
A adio de padres dos cidos cafeico e rosmarnico ao EEB, produzindo os picos C e D
(Fig.8), similares aos respectivos picos A e B (Fig. 5), indicam a presena, de fato, das duas
substncias no extrato obtido da planta.
A sobreposio dos cromatogramas obtidos para os extratos sem adio de padres e o
enriquecido com eles (Fig. 10), permite a comparao e, desta forma, a constatao dos cidos cafeico
e rosmarnico no extrato etanlico bruto de Hypenia salzmannii.

Figura 10- Sobreposio dos cromatogramas obtidos para o EEB inalterado (em rosa) e enriquecido
(em preto).

A otimizao do mtodo de eluio desenvolvido possibilita uma futura quantificao dos

metablitos secundrios cido cafeico e cido rosmarnico no EEB de H. salzmannii por CLAE-DAD,
uma vez que possibilitou uma melhor separao do pico de cido rosmarnico das demais substncias
que apresentaram tempos de reteno prximos ao seu, como observado no cromatograma da Fig.5,
obtido atravs da metodologia inicial.

6. CONCLUSES

O estudo do extrato etanlico bruto de Hypenia salzmannii atravs da comparao e coinjeo

com padres num sistema de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia equipado com um Detector de
Arranjo de Diodo (CLAE-DAD) revelou a presena de dois metablitos secundrios: os cidos cafeico
e rosmarnico, corroborando, desta forma, com a quimiotaxonomia da famlia Lamiaceae, e
contribuindo com a fitoqumica do gnero Hypenia.

7. REFERNCIAS
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PARTE II OUTRAS ATIVIDADES RELACIONADAS COM PROJETO/PLANO

PARTICIPAO EM REUNIES DO GRUPO DE PESQUISA

O estudante Andr Chaves de Albuquerque apresentou o artigo citado abaixo nas reunies
semanais do grupo de pesquisa no perodo desta vigncia (2015-2016).
KALINE R. CARVALHO; ALISON B. SILVA; MARIA CONCEIO M. TORRES;
FRANCISCO CHAGAS L. PINTO; LARISSA A. GUIMARES; DANILO D. ROCHA;
EDILBERTO R. SILVEIRA; LETCIA V. COSTA-LOTUFO; RAIMUNDO BRAZ-FILHO;
OTLIA DEUSDNIA. L. PESSOA. Cytotoxic Alkaloids from Hippeastrum solandriflorum Lindl.
Journal of the Brazilian Chemical Society, vol. 26, n. 10, 1976-1980, 2015.