UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ODONTOLOGIA

DISCIPLINA METODOLOGIA CIENTFICA APLICADA 2015/1

Ensaios in vitro
Biologia Molecular, Cultivo Celular, Scaffolds e Engenharia Tecidual

Marcus Conde DDS, PhD

Bolsista de Ps-Doutorado (DOCFIX PPGO UFPel)
Email: marcusconde82@gmail.com
Princpio de Cultivo Celular
 Princpio de Cultivo Celular
Essa tcnica foi desenvolvida como um mtodo para estudar o comportamento de clulas
animais fora do organismo, em um meio ambiente controlado (Manual Fiocruz).

Ross Granville Harrison

O isolamento e cultivo de clulas de animais tornou-se uma tcnica laboratorial

rotineira na dcada de 1950 mas o conceito de manter linhagens de clulas vivas
separadas do seu tecido-fonte original foi descoberto no sculo XIX.
 Princpio de Cultivo Celular

Frascos de plstico tem a superfcie tratada qumica

(Agentes oxidantes) ou fisicamente (UV) para que

apresentem cargas negativas favorveis ao processo de

ancoragem das clulas

Formao da Monocamada Celular

Princpio de Cultivo Celular
Clulas Aderentes x Clulas No-Aderentes
 Princpio de Cultivo Celular

Reagentes para manuteno do cultivo celular

 Princpio de Cultivo Celular

Reagentes para manuteno do cultivo celular

 Princpio de Cultivo Celular

37C
95% Umidade
5% CO2
 Princpio de Cultivo Celular

37C
95% Umidade
5% CO2
Reagentes para manuteno do cultivo celular

Meio de Cultivo
Soro Fetal Bovino
Tipos de cultivo
 Princpio de Cultivo Celular

Isolar o Tecido
Desagregar
Semear Explants
Uma cultura primria estabelecida a partir do crescimento de clulas
oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregao mecnica
ou enzimtica;
As clulas que conseguirem sobreviver ao processo de desagregao e
aderirem garrafa formaro a primeira monocamada de clulas daquele
tecido. (Manual Fiocruz)
 Cultivo Primrio - Vantagens
Clulas Primrias possuem as caractersticas do tecido de origem

Manuteno das caractersticas Fenotpicas e Genotpicas

Utilizadas na produo de vacinas

 Cultivo Primrio - Desvantagens

Clulas Primrias possuem um tempo de vida curta

Apoptose Morte celular programada Botes apoptticos

Contaminao, Adeso, Agentes Exgenos - So menos

resistentes
 Cultivo Primrio - Desvantagens
Clulas Primrias possuem um tempo de vida curto

Apoptose Morte celular programada Botes apoptticos

Contaminao, Adeso, Agentes Exgenos - So menos

resistentes

Clulas-Tronco Necessidade de Caracterizao

 Passagens Celulares
Confluncia Celular e Inibio por Contato

Ferrua e Nedel, 2013 Conde, Chisini e Schultze, 2015

 Passagens Celulares

Tripsina Ao proteoltica nas junes clula-

clula e clula substrato

EDTA Agente Quelante (Ca2 e Mg-)

 Passagens Celulares

Sub-cultivo ou Repique Celular

No decorrer de sub-cultivos das culturas primrias, pode haver a seleo de
clones, capazes de sobreviver e se multiplicar por 50 ou mais passagens.

Esses clones linhagens celulares, tambm

do origem s chamadas
denominadas de linhagens estabelecidas ou contnuas. (Manual
Fiocruz)

Devem ser congelados com poucas passagens para posterior

utilizao
Culturas Finitas
Culturas Contnuas Imortalizao Celular
Clulas de tecidos humanos raramente se tornam imortais

Modificaes genticas que permitem mutaes nos genes

responsveis pelo controle do ciclo celular

Podem ser obtidas diretamente de tecidos submetidos

mutao Clulas Tumorais
Culturas Contnuas Imortalizao Celular
Contagem das clulas

As clulas foram contadas utilizando 0.4%

de azul de tripano (1:1) em cmara de

Neubauer (Gibco, Invitrogen, Grand Island,

NY, USA).
 Ensaios de Citoxicidade
um ensaio in vitro;

um teste inicial e no pode ser extrapolado de imediato para seres

humanos;

Determina preliminarmente o comportamento do material;

o teste inicial mais comumente selecionado;

 Ensaios de Citoxicidade - Vantagens
Controle das condies experimentais; temperatura, umidade,
nutrientes

Baixo custo; quando comparado a estudos in vivo

Resultados rpidos; 7, 15, 30 dias

 Ensaios de Citoxicidade - Desvantagens
O teste no consegue simular as condies in vivo;

Dificuldade em extrapolar os dados obtidos;

A falta de cautela pode confundir o pesquisador;

 DNA Watson e Crick
A estrutura da molcula de DNA foi
descoberta conjuntamente pelo norte-
americano James Watson e pelo
britnico Francis Crick em 7 de
Maro de 1953,

Prmio Nobel de Fisiologia ou

Medicina em 1962, juntamente com
Maurice Wilkins.
Dentro da gentica moderna, o gene uma sequncia de nucleotdeos do DNA que pode
ser transcrita em uma verso de RNA.
Segmento de DNA que leva produo de uma
cadeia polipeptdica e inclui sequncias que no
so traduzidas (ntrons) que se intercalam aos

segmentos codificadores individuais (xons),

que so traduzidos.
Alberts B. Molecular Biology of the Cell 5th Edition
 RNA polimerase a principal enzima do complexo
enzimtico responsvel pela transcrio do DNA
em RNA.

Alberts B. Molecular Biology of the Cell 5th Edition

Alberts B. Molecular Biology of the Cell 5th Edition
Reao em cadeia da polimerase (em ingls
Polymerase Chain Reaction - PCR) um
mtodo de amplificao (de criao de
mltiplas cpias) de DNA (cido
desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo
vivo
Consiste em reproduzir o processo de transcrio do RNA in vitro

Se baseia na aplicao de repetidos ciclos (marcados pela troca de temperatura)

Isolamento do material gentico (RNA ou DNA)
Isolamento do material gentico (RNA ou DNA)

O Isotiocianato de Guanidina utilizado como um desnaturante na purificao e extrao de

mRNA, cidos nuclicos e protenas, agindo como potente inibidor de RNAse, protegendo
os transcritos da degradao durante a extrao dos tecidos.
Isolamento do material gentico (RNA ou DNA)
Quantificao do material gentico isolado

1l das amostra

Quantificao RNA total

obtido
 uma enzima que polimeriza molculas de DNA a partir de molculas de RNA,
exatamente o oposto do que geralmente ocorre nas clulas, nas quais produzido RNA a
partir de DNA.
MATERIAIS E MTODOS

RT-PCR DSPP, DMP1, MEPE e GAPDH (Gene

normalizador)
40 ng RNA utilizado na reao RT-PCR (One-step Superscript TM
III Platinum, Invitrogen)

- denaturao, 94 C por 45s;

- anelamento, 55 C por 45s GAPDH;
50 C por 45s DSPP, DMP1, MEPE
- extenso, 72 C por 60s, 35 ciclos;
O isolamento da transcriptase reversa permitiu a adaptao da tecnologia da PCR, que
destinada a amplificao a partir de moldes de DNA, para permitir a amplificao a partir
de moldes de RNA, chamada RT-PCR (transcrio reversa - PCR)

A tcnica de RT-PCR amplamente utilizada para verificar a expresso gnica.

MATERIAIS E MTODOS

Transcriptase Reversa Reao de

Polimerase em Cadeia (RT-PCR)

-Os produtos do PCR foram separados em

eletroforese (gel de agarose 1.5%).
 Separao dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose

As molculas iniciam o processo de migrao induzido pelo diferencial de corrente eltrica

 Separao dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose
Os produtos do PCR iro migrar pelo gel de forma diferente, de acordo com seu peso
molecular

Molculas mais leves migram mais rpido pelo gel

 Separao dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose
Os produtos do PCR iro migrar pelo gel de forma diferente, de acordo com seu peso
molecular

Molculas mais leves migram mais rpido pelo gel

CONTEXTO

Reparo limitado da funo e esttica

dos tecidos afetados
Smith et al.,2008
Ferracane e Smith, 2010
ENGENHARIA TECIDUAL
 ENGENHARIA TECIDUAL
Campo interdisciplinar que funde princpios e inovaes da Engenharia e das Cincias Biolgicas
 Scaffolds

Engenharia
Tecidual

Molculas Clulas-
Bioativas Tronco

Langer and Vacanti (1993)

Nr (2006)
Demarco (2011)
ENGENHARIA TECIDUAL NA ODONTOLOGIA
 Vrias so as justificativas para a pesquisa
da engenharia tecidual na odontologia

Anormalidades congnitas necessitam reconstruo tecidual;

Maioria dos tecidos no regeneram aps as injrias;

Aqueles que regeneram espontaneamente (ex. pele, osso) podem no

regenerar se o defeito grande;

Transplantes so limitados pela escassez de doadores;

Implantes tem um histrico de sucesso, mas tambm uma srie de

problemas;
Os tecidos dentais possuem pouca ou nenhuma
capacidade regenerativa

Esmalte No possui capacidade reparativa

Dentina No possui capacidade reparativa

Polpa Pode produzir dentina reacional e reparativa

Cement Baixa capacidade reparativa/cementoblastos

o
Lig. periodontal Baixa capacidade reparativa/cementoblastos
Scaffold
O scaffold proporciona substrato em 3 dimenses
para desenvolvimento das clulas, atuando como
matriz para a regenerao tecidual (DEMARCO et al., 2011)

A seleo do material e tcnica para a confeco

de um scaffold de extrema importncia no
desenvolvimento e terapias regenerativas da
polpa dental.
SCAFFOLDS

Polmeros Sintticos Polmeros Naturais Base de Clcio Materiais Alternativos

PLLA Colgeno Tipo I HA/TCP Hidrogis Anffilos

PGA Quitosana Seda

PLGA cido Hialurnico

Poly Caprolactona
 Propriedades Fsicas dos Scaffolds

Para que possam mimetizar a MEC, os scaffolds

Forma Tamanho dos
dos Poros Poros devem possuir um tamanho mdio de poros que

permitam o crescimento, migrao e

diferenciao celular
Espessura das
Fibras
Modelo de estudo atual
Terceiros molares hgidos
Pacientes jovens

Corte com disco diamantado

Refrigerao (1X PBS)
Semeadura das clulas

- 5 x 104 (20l) - semeadas nas matrizes (placa

de cultura - 24 poos).

- 45 min - incubadora (37o C, 5% CO2).

- 500L de DMEM - adicionado a cada poo de
cultura, e as matrizes foram incubadas a 37o C.

- DMEM - trocado a cada 2 dias (7, 14, 21, 28

dias).

- Clulas de 4a a 6a passagem.
Proliferao celular (WST-1)

(5 x 104) semeadas nas matrizes e cultivadas durante

7, 14, 21 e 28 dias;

WST-1 adicionado ao meio na diluio 1:10 e

incubados durante 1 hora (37C em 5% CO2).

meio de cultura/WST-1 (100L) - transferidos para

placa de 96 poos de para leitura do nvel de
densidade tica (450nm)

one-way ANOVA seguido do teste de Tukey

(Sigmastat 2.0 software, SPSS, Chicago, IL, USA),
p<0.05.
Modelo de estudo in vivo
Modelo de estudo in vivo
Cordeiro MM, Dong Z, Kaneko T, Zhang Z, Miyazawa M, Shi S, et
al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated
deciduous teeth. J Endod. 2008;34(8):962-9.

Sakai VT, Zhang Z, Dong Z, Neiva KG, Machado MA, Shi S, Santos
CF, Nr JE. SHED Differentiate into Functional Odontoblasts and
Endothelium. J Dent Res. 2010 Apr 15.

Casagrande L, Demarco FF, Zhang Z, Araujo FB, Shi S, Nr JE.

Dentin-derived BMP-2 and odontoblast differentiation. J Dent
Res. 2010 Jun;89(6):603-8.