1 - Avaliao da Contaminao de Diferentes Grupos de Alimentos

por Hidrocarbonetos Policclicos Aromticos

Extrao:

O mtodo de extrao e purificao utilizado foi aquele proposto por SPEER et

al. (1990). Vinte e cinco gramas de amostra completamente homogeneizados foram
pesados (sem adio de gua) em balo de fundo redondo de 500ml, adicionando-se
em seguida 100ml de KOH metanlico 2mol/L e pedras de ebulio. Aps refluxo de 5
horas, o material saponificado foi transferido para um funil de separao de 500ml e o
frasco lavado com 100ml de metanol-gua (9:1, v/v). O filtrado foi extrado com 2
pores de 150ml de cicloexano e a fase orgnica lavada primeiramente com 100ml
de metanol-gua (1:1, v/v) e, em seguida, com 100ml de gua bidestilada. A fase
orgnica foi transferida para um balo de fundo redondo e o volume reduzido a cerca
de 50ml em um rota evaporador a 40C. Em seguida, os HPAs foram sucessivamente
extrados do cicloexano com 3 pores de 50, 25 e 25ml de dimetilformamida-gua
(9:1, v/v). O extrato combinado foi diludo com 100ml de sulfato de sdio a 1% em
gua e reextrado com pores de 50, 35 e 35ml de cicloexano. Procedeu-se, ento,
lavagem com 40ml de gua bidestilada (2 vezes) e retirada da gua residual com 2,5g
de sulfato de sdio anidro. Depois disso, o extrato foi concentrado at um volume de
5ml em um rota evaporador a 40C. Todas as amostras foram analisadas em duplicata.
Anlises de controle sobre os reagentes (anlise do branco) foram simultaneamente
realizadas com cada srie de amostras.

Limpeza do extrato:
Para a limpeza do extrato, utilizou-se uma coluna de vidro (21 x 1,1cm d.i. e
reservatrio de 8 x 3,1cm d.i.) recheada com 5g de slica gel 60 (70-230 mesh, ASTM,
Merck AS Indstrias Qumicas) e 40ml de cicloexano, adicionando-se sulfato de sdio
anidro no topo da mesma. A slica gel utilizada foi desativada com 15% gua para
evitar a degradao dos HPAs. O extrato foi aplicado coluna e a frao, aps ser
eluda por gravidade com 85ml de cicloexano, foi recolhida em um balo de fundo
redondo de 250ml. O volume foi concentrado em um rota evaporador, a 40C, at
aproximadamente 2ml, que foi seco sob corrente de nitrognio. Adicionaram-se ao
resduo 2ml de acetonitrila, os quais foram transferidos para o frasco de amostras do
cromatografo

Anlise Cromatogrfica: (?)

Utilizaram-se um cromatgrafo com bomba quaternria Waters modelo 600 e injetor

automtico Waters modelo 717, com ala de amostra de 30ml. O sistema tambm
estava equipado com detector de fluorescncia Waters 474, com comprimentos de
onda de 290nm (excitao) e 430nm (emisso). Para a separao dos HPAs foi usada
uma coluna cromatogrfica C18 (Vydac 201 TP), 25cm x 4,6mm d.i.,partculas de 5mm,
termestvel a 30C, e fase mvel isocrtica composta de acetonitrila-gua (75:25, v/v),
a uma vazo de 1,0ml/minuto. O integrador utilizado foi um Spectraphisics, modelo
SP4400. Uma identificao preliminar dos HPAs nas amostras analisadas foi feita pela
comparao dos tempos de reteno dos picos obtidos com os dos respectivos
padres e tambm por adies padro com a sobreposio dos cromatogramas (co-
cromatografia).

Confirmao da identidade dos HPAs:

A confirmao da identidade dos HPAs nas amostras foi efetuada por cromatografia
gasosa acoplada a espectrmetro de massas (CG-MS), por meio do monitoramento de
ons selecionados (SIM). As anlises foram conduzidas em um sistema CG-MS QP5000
da Shimadzu, equipado com injetor automtico split/splitless (AOC-17, Shimadzu Co.) e
coluna capilar de slica fundida SPB-5 (Supelco) de 30m x 0,25mm d.i., recoberta por
um filme de 0,25m com 95% dimetil 5% difenil polissiloxano. As seguintes condies
cromatogrficas foram utilizadas na identificao dos HPAs: detector e injetor com
temperatura de 280C; forno com programao de temperatura, iniciando-se com
120C, aumentando-se 5C/min at 280C e permanecendo nesse valor por 26
minutos, com tempo total de corrida de 60 minutos; injees de 3l de amostra feitas
no modosplitless e abertura da vlvula da purga aps 3 minutos. Hlio foi utilizado
como gs de arraste a uma vazo de 0,7ml/min.

Quantificao:

Para a determinao dos nveis dos HPAs nas amostras, utilizou-se o mtodo da
padronizao externa. A partir de uma soluo-estoque dos padres de Flu, Py, B(a)A,
Chy, B(e)P, B(b)F, B(k)F, B(a)P, D(ah)A e B(ghi)P obteve-se por diluio com acetonitrila
a faixa de concentraes desejadas para cada um deles. As curvas de calibrao
traadas (rea versus concentrao) mostraram-se lineares dentro das concentraes
de trabalho.

Validao da metodologia:

Recuperao:

Os testes de recuperao foram feitos adicionando-se quantidades conhecidas de cada

HPA, em diferentes concentraes (2,0; 4,0 e 8,0mg/kg), em amostras selecionadas de
cada um dos grupos de alimentos (leite, farinha de mandioca, po de forma integral,
feijo, cenoura, bacon, acar e pizza). As anlises das amostras fortificadas, assim
como dos controles, foram feitas em duplicata. As recuperaes foram calculadas pela
diferena entre os valores totais obtidos para os HPAs nas amostras fortificadas e no-
fortificadas. Os resultados analticos descritos no foram corrigidos em funo da
porcentagem de recuperao.
Resumo metodologia 01:
Reagentes:
KOH metanlico 2mol/L
metanol-gua (9:1, v/v).
cicloexano
metanol-gua (1:1, v/v)
dimetilformamida-gua (9:1, v/v)
sulfato de sdio a 1%
acetonitrila
Equipamentos:
Balo de fundo redondo de 500ml;
Equipamento de refluxo;
Funil de separao de 500ml;
Rota evaporador;
coluna de vidro recheada com 5g de slica gel 60
balo de fundo redondo de 250ml
cromatografia gasosa acoplada a espectrmetro de massas (CG-MS)
corrente de nitrognio
 2 - Concentrations and health risk of polycyclic aromatic
hydrocarbons in tea
2.2. Extrao de HAP de folhas de ch

As amostras de ch (6 g) foram extradas por ultra-som a 30C durante 30 min com 20 mL de

diclorometano (DCM). Os extratos foram ento decantados e coletados. Este processo foi
repetido em triplicado. Todos os extratos foram evaporados at secura por um evaporador
rotativo equipado com um banho de gua e depois dissolvidos em 2 mL de hexano. Esta
soluo (1 mL) foi filtrada atravs de uma coluna de gel de slica e eluida com 10 mL de
hexano e DCM (1: 1, v / v) e depois evaporada at secura. O resduo foi dissolvido em 2 mL
de acetonitrilo de grau HPLC para anlise.

2.3. Preparao para INFUSO de ch e extrao de HAP

Para preparar a infuso, 20 g da amostra de ch foram adicionados em 500 mL de gua

fervente ultra-pura e foram includos em um balo cnico de 500 mL. Em seguida, o balo foi
colocado em um banho de gua com a temperatura mantida a 90-92C por 10, 30, 60, 120
min, respectivamente. Posteriormente, a fase aquosa foi decantada em outro balo cnico
fechado e arrefecida at cerca de 30C.

O licor de ch arrefecido (400 mL) foi extrado por ultra-som a 30C por 30 minutos com 50
mL de DCM. Aps 10min, o DCM de baixo da gua foi fracionado e recolhido. Este processo foi
repetido em triplicado. Todos os extratos foram combinados e filtrados atravs de coluna de
Na2SO4 anidro, lavados com 10 mL de hexano e DCM (1: 1, v / v) e depois evaporados at
secura e dissolvidos em 2 mL de hexano. Esta soluo (1 mL) foi filtrada atravs de uma coluna
de gel de slica e eluda com 10 mL de hexano e DCM (1: 1, v / v) e depois evaporada at
secura. O resduo foi dissolvido em 2 mL de acetonitrilo de grau HPLC para anlise.

(Este artigo usou HPLC)

3. Controle de Qualidade

Um regime rigoroso de controle de qualidade foi operado no experimento. Antes do incio do

programa de extrao e anlise, os estudos de recuperao de HAPs foram realizados para
demonstrar a disponibilidade do mtodo.
As amostras de ch foram adicionadas com a soluo padro de HPA misturada, depois
extraram, purificaram e analisaram da mesma forma que as amostras. Os seis resultados de
experimentos paralelos indicaram que, as recuperaes para os 16 HPA das amostras de ch
variaram de 71,6% a 103%, e os desvios-padro relativos (RSD) dos 16 HAP estavam abaixo de
20,0%.
A soluo padro de HPA misturada foi adicionada no ch preto de 20 g e foi ento submersa
em 500 mL de gua fervente ultra-pura em um balo cnico de 500 mL. Posteriormente, o
balo foi colocado num banho de gua com a temperatura mantida a 90-92 C durante 60
minutos, depois arrefecida, extrada, analisada da mesma forma que as infuses de ch. Os
seis resultados de experincias paralelas indicaram que, as recuperaes eram cerca de 30%
para NA, 50-60% para os HAP de 3 anis, 80-85% para os PAHs de 4-6 anis, e o RSD dos 16
PAHs tambm estavam todos abaixo 20,0%.
Resumo metodologia 02:
Reagentes:
diclorometano (DCM).
Hexano
Acetonitrila
Equipamentos:
Coluna de gel de slica
Evaporador rotativo equipado com um banho de gua
balo cnico de 500 mL.
de coluna de Na2SO4 anidro
 3 - Metrological traceability of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs)
measurements in green tea and mate (2017)

Para as diferentes matrizes, foram utilizadas amostras de cerca de 1 g de folhas secas e

modas. A extrao de PAHs das amostras foi realizada por meio da extrao de Soxhlet com
dedinhos de fibras de celulose. Os extratores tinham um volume nominal de 30 ml e foram
equipados com frascos com fundo redondo de 100 ml. Esses extratores, com pequenas
dimenses, permitem reduzir o tempo de extrao e o volume de solvente necessrio. Para a
extrao, utilizou-se uma mistura de acetona / n-hexano (1: 1 v/v). As extraes duraram 8
horas, com uma mdia de 13-15 ciclos de extrao / h. No final da extrao, os extratos foram
coletados e filtrados em filtros de papel. A mistura de solventes permite a obteno de
extratos suficientemente limpos, dando picos cromatogrficos bem resolvidos e baixa relao
sinal / rudo, evitando assim o passo de limpeza e a pr-concentrao das amostras.

Resumo metodologia 03:

Reagentes:
acetona / n-hexano (1: 1 v/v).
Equipamentos:
Soxhlet
dedinhos de fibras de celulose
filtros de papel.
 4 - ANLISE DE HIDROCARBONETOS POLICCLICOS AROMTICOS (HPAs) NAS ETAPAS
DO PROCESSAMENTO DA ERVA-MATE (Ilex paraguariensis) E CARACTERIZAO
QUMICA DOS RESDUOS DA TRITURAO PARA O DESENVOLVIMENTO DE
PRODUTO.

A metodologia de extrao dos HPAs das amostras foi baseada em trs tcnicas de extrao
publicadas para outras matrizes vegetais, resultando no procedimento adotado neste trabalho
(BETTIN; FRANCO, 2005; HOUESSOU et al., 2005; LIN; TU; ZHU, 2005). As amostras de erva-
mate (0,5 g) foram adicionadas de 15 mL de soluo de hexano: acetona (94:6, v/v) e
sonicadas (freqncia 25 KHZ), em banho termostatizado a 30C (Maxi Clear 1650 A), por 15
minutos. O extrato obtido foi separado por filtrao por meio de membrana de nylon (0,45
m), concentrado em evaporador rotativo (Tecnal, TE - 211) a vcuo at secagem e, em
seguida, dissolvido em 5 mL de acetonitrila: gua (50:50, v/v). Para o fracionamento do
extrato organosolvente e remoo de impurezas, utilizou-se a extrao em fase slida em
suporte de fase-reversa (C18, 6 mL). Para completa eluio dos HPAs, 12 mL de metanol:
tetrahidrofurano (10: 90, v/v) foram utilizados como fase mvel. O extrato coletado foi
novamente seco e o resduo dissolvido em acetonitrila (1,0 mL). Este processo foi realizado
em triplicata.

Resumo metodologia 04:

Reagentes:
soluo de hexano: acetona (94:6, v/v)
acetonitrila: gua (50:50, v/v).
metanol: tetrahidrofurano (10: 90, v/v)
acetonitrila

Equipamentos:
sonicador (freqncia 25 KHZ), em banho termostatizado a 30C
membrana de nylon (0,45 m)
Concentrado em evaporador rotativo (Tecnal, TE - 211) balo cnico de 500 mL.
extrao em fase slida em suporte de fase-reversa (C18, 6 mL).
 5 - APORTE E REMOO DE HIDROCARBONETOS POLICCLICOS AROMTICOS EM
FRAGMENTOS FLORESTAIS NA REGIO METROPOLITANA DE CAMPINAS SP

Os testes foram realizados em 4 etapas, conforme descrito a seguir:

(1) Extrao por ultrassom com acetona (100%): A fim de verificar a eficincia da extrao de
HPAs por ultrassom, tendo acetona como solvente, nesta etapa utilizou a matriz ambiental
mais complexa para extrao e quantificao dos HPAs (plantas) e mais simples (filtros). Assim,
amostras de filtros e de folhas de planta (P.gonoachanta) foram impregnadas com a soluo
padro de HPAs, tomando-se amostras sem a adio de HPAs como controle, nomeado
como branco para filtros e o ambiente para folhas. A essas amostras, foram adicionados
100 mL de acetona como solvente extrator. Cada amostra, ento, foi sonicada durante 10
minutos em banho de ultrassom (modelo 1510, marca Bransom), por 3 vezes consecutivas,
adicionando-se 100 mL de solvente em cada etapa extratora. Os extratos obtidos dos filtros,
aps extrao, foram evaporados em evaporador rotativo, retomados com 2 mL de
acetonitrila grau cromatogrfico e ento congelados a -80 C para posterior anlise. Os
extratos obtidos das plantas foram evaporados, at obter aproximadamente 3 mL da soluo
extrao, e ento foi adicionado 0,2 g de sulfato de sdio em cada amostra, para remoo da
gua. Os extratos foram evaporados, centrifugados a -2C, por 15min e a 3500 rpm, para a
separao da frao com o solvente e os compostos em estudo, da cera e do sulfato de sdio.
Os extratos resultantes foram evaporados novamente e ento retomados com 2ml de
acetonitrila grau cromatogrfico e congelados a -80C para posterior anlise. As extraes
foram realizadas em quadruplicada, considerando cada amostra e solvente extrator e com os
seus respectivos controles. Aps extrao, seguiram-se os procedimentos descritos por Rinaldi
et al. 2012.

(2) Extrao por ultrassom com diclorometano (100%) e mistura de diclorometano e hexano
(3:1): Foram tomados os mesmos procedimentos do item anterior com a substituio dos
solventes extratores utilizando somente diclorometano e uma mistura de 3 partes de
diclorometano para uma de hexano, utilizando a matriz mais complexa (plantas)

(3) Extrao em Soxhlet: Nessa etapa, foi testada a extrao por Soxhlet para remoo dos
HPAs em matrizes slidas. Assim, filtros de quartzo, amostras de solo e de folhas foram
impregnadas com concentrao conhecida de HPAs. Foi utilizada como soluo extratora uma
mistura de diclorometano e hexano (3:1). Aps 24 horas no extrator Soxhlet, as amostras de
folhas e os filtros foram tratadas como descrito anteriormente. Para as amostras de solo,
seguiu-se o procedimento utilizado para os extratos foliares. Assim, os extratos, aps serem
concentrados e centrifugados eram evaporados, retomados com acetonitrila, congelados a -80
C, para posterior anlise.
Resumo metodologia 05:
Reagentes:
1-100 mL de acetona
1- 0,2 g de sulfato de sdio
1- acetonitrila
2 - diclorometano e mistura de diclorometano e hexano
3- mistura de diclorometano e hexano
3- acetonitrila
Equipamentos:
1 e 2- sonicador
1 e 2 -banho de ultrassom
1 e 2 -evaporador rotativo
1 e 2 -centrifuga
3 - Soxhlet
 6 - DETERMINAO DE HIDROCARBONETOS POLICCLICOS AROMTICOS (HPAs) EM
GUARAN EM P (Paullinia cupana)

Pesou-se 20 g de amostra em um balo de fundo redondo de 500 mL. Adicionou-se 200 mL de

KOH metanlico 1 M, e o material permaneceu sob refluxo por 40 min. Em seguida,
adicionou- se pelo condensador 200 mL de cicloexano permitindo-se uma ebulio de mais de
5 min. Aps atingir a temperatura ambiente, a soluo foi filtrada em funil de Buchner e o
material saponificado foi transferido para um funil de separao. Adicionou-se 200 mL de
gua e o funil foi agitado por aproximadamente 2 min. Aps a separao das fases descartou-
se a fase aquosa, lavou-se o extrato com trs pores de gua (100 mL) e retirou-se a gua
residual com 2,5 g de sulfato de sdio anidro. A seguir, concentrou-se a soluo a um volume
final de aproximadamente 5 mL em evaporador rotativo vcuo, com banho temperatura
de 40C

Resumo metodologia 05:

Reagentes:
KOH metanlico 1 M
cicloexano
2,5 g de sulfato de sdio anidro
Equipamentos:
balo de fundo redondo de 500 mL
funil de Buchner
evaporador rotativo