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Combinando estratégias farmacológicas, células-

tronco mesenquimais (CTMs) e arcabouços


poliméricos no tratamento da lesão medular

Vera Paschon
vera.paschon@gmail.com
2017
SUMÁRIO
LESÕES NO SISTEMA NERVOSO

Introdução

Objetivos

Materiais e métodos

Resultados
INTRODUÇÃO

LESÕESMedula espinal
NO SISTEMA NERVOSO
POSTERIOR OU DORSAL

LATERAL LATERAL

ANTERIOR OU VENTRAL
INTRODUÇÃO

Nervos espinais

Dermatomos:
territórios cutâneos
inervados por uma
única raiz dorsal
INTRODUÇÃO

Altura do acometimento
INTRODUÇÃO

Substância branca – vias ascendentes


ou aferentes

Propriocepção consciente, tato epicrítico,


vibração e esterognosia
Fascículo grácil Fascículo cuneiforme

Tracto espino-cerebelar
posterior
Tracto espino-talâmico (proprioc. inconsciente)
anterior (tato protopático
e pressão)

Tracto espino-cerebelar anterior Tracto espino-talâmico


(proprioc. inconsciente) Lateral (temp. e dor)
INTRODUÇÃO

Substância branca – vias descendentes


ou eferentes

Tracto córtico-espinal lateral

Tracto rubro-espinal Tracto tecto-espinal

Tracto olivo-espinal
Tracto retículo-espinal
Tracto vestíbulo-espinal
Tracto córtico-espinal anterior
INTRODUÇÃO

Somatotopia e miotopia
INTRODUÇÃO

Classificação da lesão

 Tetraplegia - comprometimento total dos quatro membros.

 Paraplegia – comprometimento dos membros inferiores.

 Completa - perda de qualquer sensação e capacidade de


contração muscular.

 Incompleta (lesão parcial) – preserva-se algumas


sensações e contração voluntária da musculatura do esfíncter,
bem como de membros, porém sem força para realizar tarefas
como andar.
INTRODUÇÃO

https://www.kraftlaw.com/personal-injury-lawyer/spinal-cord-injuries-and-paralysis/
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO

 Causas: acidentes, tumores e doenças congênitas.


 Triagem (AACD) janeiro a setembro/ 2014 Total de 157 pacientes atendidos
 Do total, 70-80% - sexo masculino (média de idade 30 anos);

https://www.projectedge.org.au/about/sci/
INTRODUÇÃO

Diagnóstico em humanos

 A extensão e o efeito
da lesão é avaliada por
radiografia, tomografia
e exames
neurológicos.
INTRODUÇÃO

Fases de evolução da lesão

Ryan Salewski et al, 2013


INTRODUÇÃO

Fases
FASES de
DAevolução da lesão
LESÃO MEDULAR

Ruslan Rust and Julia Kaiser, 2017


INTRODUÇÃO

Ativação de células gliais


INTRODUÇÃO

Fator nuclear NF-KB

https://en.wikipedia.org/wiki/NF-%CE%BAB#/media/File:NFKB_mechanism_of_action.png
INTRODUÇÃO

Infiltração de células imunológicas

Michal Schwartz and Ravid Shechter, 2014


INTRODUÇÃO

Cicatriz glial
INTRODUÇÃO

Tratamentos

 Fisioterapia;

 Anti-inflamatórios – diminuir o dano secundário, protegendo as células


que restaram intactas;

 Células-tronco – substituir células mortas (neurônios e células gliais);

 Materiais poliméricos – suporte e guia para a regeneração axonal;

 Fatores de crescimento - mantendo o máximo potencial para


recuperação.
INTRODUÇÃO

Bloqueio da inflamação (bloqueador de TLR-4)


INTRODUÇÃO

Células-tronco hematopoiéticas
INTRODUÇÃO

Células-tronco mesenquimais
INTRODUÇÃO

Células-tronco pluripotente induzidas (iPSCs)


INTRODUÇÃO

•Lesão na região torácica e cervical com até dois anos;


•39 pacientes ( 11 mulheres, 28 homens);
•< 18 anos;
INTRODUÇÃO

Micro injeções com células-tronco recuperam


movimentos

100 micro injeções de células do bulbo olfatório foram feitas acima e abaixo da lesão.
INTRODUÇÃO

Hidrogéis
INTRODUÇÃO
New surgical approach for late complications
from spinal cord injury aracnóide
Antes Depois
Hidrogéis
SUMÁRIO
LESÕES NO SISTEMA NERVOSO

Introdução

Objetivos

Materiais e métodos

Resultados
Objetivos
1 – lesão medular 2 – lesão + tratamento
por compressão farmácológico Avaliar a recuperação da função motora por 12 semanas (BBB, Basso,
sem tratamento (bloqueio de TLR4)
Beattie e Bresnahan);
(controle)

TAK242
(resatorvid) Avaliar o espalhamento da morte celular secundária e a presença de fatores
inflamatórios 24h após lesão e tratamento (Iba1, iNOS, NF-KB e IL-1B) -
3 – lesão + 4 – lesão +
tratamento com tratamento com TUNEL e imunofluorescência (IF)
polímeros células tronco
mesenquimais
(CTMs) Quantificar os níveis proteicos de fatores inflamatórios 24h após lesão e
tratamento (Iba1, iNOS, NF-KB e IL-1B) – western blot (WB)

5 – lesão + combinação dos tratamentos: Avaliar a regeneração medular 12 semanas após lesão e tratamento – HE,
• Bloqueio de TLR4;
• Polímeros;
luxol fast blue, fMRI
• CTMs
Avaliação da resposta muscular após estimulação cortical 12 semanas após
lesão e tratamento – eletrodos
SUMÁRIO
LESÕES NO SISTEMA NERVOSO

Introdução

Objetivos

Materiais e métodos

Resultados
MATERIAIS E MÉTODOS

Rato Wistar

Vértebras Número
Cervicais 7
Torácicas 13
Lombares 6
Sacrais 4
Caudais 27-30
MATERIAIS E MÉTODOS

1 - lesão medular por compressão

 Isoflurano:  Impactor:

• Indução: 3-4% • Vértebra T8;


em 100% O2;
• Peso: 10g
• Manutenção:
1,5-2% em • Altura:
100% O2 12,5mm

Colaboração com Prof Alexandre Fogaça


Cristante (IOT-FMUSP)
MATERIAIS E MÉTODOS

Análises agudas (imunofluorescência – método qualitativo)


– 24h pós-lesão
Anticorpos primário e secundário

Fatores inflamatórios:
Iba1, iNOS, NF-KB e IL-1B
MATERIAIS E MÉTODOS

Análises agudas (western blot – método quantitativo)


– 24h pós-lesão

Eletroforese
Quantificação por
espectrofotometria anticorpos primário e secundário
Processamento
da amostra

Fatores inflamatórios:
Iba1, iNOS, NF-KB e IL-1B
MATERIAIS E MÉTODOS

Análises agudas (TUNEL) – 24h pós-lesão


TUNEL

apoptose
MATERIAIS E MÉTODOS

Escala de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) –


durante 12 semanas após-lesão

• A escala vai de 0 à 21 pontos:


• 0 – paraplégico
• 21 - normal;

• Considera-se a movimentação do tornozelo, joelho e bacia;


pisada dorsal ou plantar; com ou sem suporte de peso;
coordenação; desprendimento dos dedos; posicionamento
do tronco; e se o rabo fica abaixado ou levantado.
MATERIAIS E MÉTODOS

Análises crônicas – 12 semanas pós-lesão


fMRI

HEMATOXILINA-
EOSINA (HE)

LUXOL FAST
BLUE (LFB)
MATERIAIS E MÉTODOS

Estimulação cortical e eletromiograma -


12 semanas pós-lesão

Week 12
SUMÁRIO
LESÕES NO SISTEMA NERVOSO

Introdução

Objetivos

Materiais e métodos

Resultados
Projeto 1 - Avaliação do bloqueio de VDAC1 na compressão da medula espinhal de ratos

Beatriz Morena

VDAC é tipo celular – dependente, ou seja, está presente em


diversos tipos de células da medula espinal como astrócitos,
motoneurônios e interneurônios.
Projeto 1 - Avaliação do bloqueio de VDAC1 na compressão da medula espinhal de ratos

Níveis proteicos de VDAC1 não


se alteram após lesão medular
porém ocorre oligomerização e
externalização da porção N-
Beatriz Morena terminal
Projeto 1 - Avaliação do bloqueio de VDAC1 na compressão da medula espinhal de ratos

Beatriz Morena

O bloqueio de
VDAC1 não altera a
quantidade de
micróglia e nem a
ativação destas,
bem como a
intensidade da
marcação para
caspase 3.

Porém, diminui
significativamente a
apoptose 24h após
lesão medular.
Projeto 1 - Avaliação do bloqueio de VDAC1 na compressão da medula espinhal de ratos

Beatriz Morena

346.736 μm2 305.058 μm2

O bloqueio de VDAC1 foi eficiente para promover a recuperação da função motora com diferença significativa a
partir de 3 semanas após o tratamento.
Projeto 2 - Avaliação da inibição da metilação de histonas na propagação da morte
neuronal e na recuperação funcional após lesão medular

Felipe Correia
Projeto 2 - Avaliação da inibição da metilação de histonas na propagação da morte
neuronal e na recuperação funcional após lesão medular

DH
WM

Felipe Correia VH
Projeto 2 - Avaliação da inibição da metilação de histonas na propagação da morte
neuronal e na recuperação funcional após lesão medular

Felipe Correia

BBB
21 21

18 18

15 15

12 Veículo 12
9 GSK343 9
6 6
3 3
0 0
1 2 3 4 5 6 7
7ª semana1 após lesão

O bloqueio de EZH2 foi eficiente para promover a recuperação da função motora.


Projeto 3 – Avaliação do TLR4 não funcional na morte neuronal e na
recuperação da função motora após compressão medular

C3H-HePas C3H-HeJ
“controle” “TLR4 não
Natália Nogueira funcional”

Giovanna Beltrame

C3H/HeJ apresenta menor


marcação de TLR4
Projeto 3 – Avaliação do TLR4 não funcional na morte neuronal e na
recuperação da função motora após compressão medular

Natália Nogueira

GFAP não se alterou após 24h – período curto para que IBA1 não se alterou após 24h – podemos dizer que a
ocorra gliose reativa. quantidade de micróglia é a mesma.
Giovanna Beltrame

Caspase 3 diminuiu significativamente após 24h – período onde ocorre iNOS diminuiu significativamente após 24h – pode
a maior quantidade de morte celular programada após a lesão. indicar menor ativação microglial.
Projeto 3 – Avaliação do TLR4 não funcional na morte neuronal e na
recuperação da função motora após compressão medular

Natália Nogueira

Giovanna Beltrame

O TLR4 defeituoso foi capaz de permitir a rápida recuperação motora dos animais, com diferenças
bem acentuada já após a primeira semana.
Projeto 4 - Avaliação e caracterização da interação neural com arcabouços poliméricos,
visando regeneração medular

Colaboração com Profa Sônia Maria Colaboração com Profa Christiane


Malmonge (Engenharia Biomédica) Lombello (Engenharia Biomédica)

Victor Allisson

PCLf apresentou a maior rugosidade,


enquanto PLLA apresentou a menor.

Nenhum dos biomateriais testados apresentou


citotoxicidade para células Vero.

PCLf também apresentou a maior Altoclave alterou a superfície de vários


hidrofobicidade, enquanto todos os outros biomateriais além de alterar algumas ligações
apresentaram hidrofobicidade média. qupimicas.
Projeto 4 - Avaliação e caracterização da interação neural com arcabouços poliméricos,
visando regeneração medular

Victor Allisson

PCL e PLLA não apresentaram citotoxicidade para as


células da medula espinal PCL favoreceu a diferenciação de células gliais.
PLLA favoreceu a diferenciação de neurônios.
Projeto 5 - Avaliação da regeneração nervosa e da recuperação funcional após
implantação de arcabouços poliméricos em ratos com lesão medular

Aline Valéria

Colaboração com Profa Sônia Maria


Malmonge (IOT-FMUSP)
Planos Futuros
Células-tronco da polpa do dente de leite Bioimpressão 3D

• Multipotentes;
• Derivada da crista neural (diferenciam-se nas linhagens
osteogênicas, adipogênicas e neurogênicas);
• Proliferam bem in vitro, pois aderem ao plástico;
• Não são imunogênicas;
• Transplante alogênico (aparentado ou não);
• Efeito parácrino (secretam citocinas e fatores de
crescimento);
Laboratório Neurogenética
Agradecimentos
Spinal Cord Team

Prof.Dr. Alexandre Hiroaki Kihara, UFABC

Prof. Dr. Alexandre Fogaça


Cristante IOT-FMUSP

Natalia D. R. Nogueira; Beatriz C. Morena; Giovanna R. Beltrame; Victor


Profas. Dras. Sônia Allisson Silva; Felipe Fernandes Correia; Danilo Luna Campos.
Maria Malmonge e
Christiane Lombello, vera.paschon@gmail.com
UFABC