UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS

FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS CLÍNICOS DO COMPLEXO Cryptococcus

neoformans-C. gattii DO ESTADO DO AMAZONAS-BRASIL

BABBYNGTTONN KHELL SOUZA DA SILVA

MANAUS
2009
 i

BABBYNGTTONN KHELL SOUZA DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO LABORATORIAL DE ISOLADOS CLÍNICOS DO COMPLEXO

Cryptococcus neoformans-C. gattii DO ESTADO DO AMAZONAS-BRASIL

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas em
convênio com a Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas para obtenção do
grau de Mestre em Doenças Tropicais e
Infecciosas.

Orientador (a): Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza

MANAUS
2009
 Ficha Catalográfica

S586c Silva, Babbyngttonn Khell Souza da

Caracterização laboratorial de isolados clínicos do
complexo Cryptococcus neoformans-C. gatti do Estado do
Amazonas – Brasil / Babbyngttonn Khell Souza da Silva. -
- Manaus: Universidade do Estado do Amazonas,
Fundação de Medicina Tropical, 2009.
40 f.: il.

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Medicina Tropical – UEA/FMT,
2009.
Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza.

1. Micose – Diagnóstico e tratamento. 2.

Cryptococcus neoformans-C I. Título.

CDU: 616-002.8

Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária da Escola Superior de Ciências da Saúde – UEA
Sheyla Lobo Mota.
 ii

FOLHA DE JULGAMENTO

CARACTERIZAÇÃO LABORATORIAL DE ISOLADOS CLÍNICOS DO

COMPLEXO Cryptococcus neoformans-C. gattii DO ESTADO DO
AMAZONAS-BRASIL.

BABBYNGTTONN KHELL SOUZA DA SILVA

“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em

Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa
de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado”.

Banca Julgadora:

_________________________________
Prof. João Vicente Braga de Souza, Dr.
Presidente

______________________________________
Profª. Ormenzinda Celeste Cristo Fernandes, Dra.
Membro

________________________________
Prof. Luiz Carlos de Lima Ferreira, Dr.
Membro
 iii

Dedico este trabalho a minha mãe, Suely.

 iv

AGRADECIMENTOS

A Deus pelo dom da vida! Obrigado por TUDO!!!

Ao João Vicente Braga de Souza, meu amigo, pela: oportunidade, incentivo,

dedicação, respeito, paciência, credibilidade, confiança e autenticidade, que
nortearam estes anos de trabalho e convivência. Eterna Gratidão!!!!!!!

A minha mãe Suely, por todo o amor, ensinamentos, exemplos e orações.

A minha família (Evandro, Suely, Mickel, Kellyanne, Vó Amélia, Vô

Bernardino, Tia Sid, Tio Lúcio, Estêvão, Jacqueline, Maria Fernanda (Abençoada!!!),
Andersom e Gilson pelos momentos ímpares de alegria e incentivos aos estudos.
Agradeço a Deus pela existência de todos.

A minha namorada Ingrid pelo amor, paciência, confiança, dedicação e

carinho.

Aos amigos Luiz Carlos, Marcos Fábio, Júlio César, León Fábio, Alex
Mesquita, Adson Pinto e Mauro Leandro pela caminhada árdua porém, gratificante.

Aos amigos, parentes e familiares das pessoas que nos cercam de muito
carinho e respeito, muito obrigado.

A família do João (pais, irmãs, cunhados), Esposa e Filho (Érica e João Pedro
– Féla) pela acolhida, dedicação e respeito. Obrigado pelo enorme carinho.

Aos amigos Alysson, Carlos André, Clarice do Acre, Agostinho e Zeca pelos
momentos de alegria e diversão, regados a muito churrasco e porque não... “ the
book on the table”, “Bob Marley” , rimas repentistas, jamón, rodízios de farofas…
momentos eternos!!!!
 v

Aos amigos dos esportes que sempre nos ensinam que ganhar ou perder é
uma conseqüência, mas o fato mais importante é a amizade que fica.

A todo Laboratório Multicenter, em especial ao Dr. Ramirez pela

compreensão, carinho, respeito e colaboração profissional.

Aos colegas de profissão (Bioquímicos, Técnicos, Administrativos e Todos de

A-Z) de todos os empregos, que contribuíram integralmente para o sucesso deste,
muito obrigado!!!

Ao Dr. Carlos Victor e Dr. José Messias pelo companheirismo e colaboração.

A Dra. Lucimar e Dra. Flávia pela oportunidade e colaboração profissional.

A todos os alunos do Centro Universitário do Norte pelos ensinamentos

compartilhados.

Aos professores e alunos do curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical

do Amazonas pela oportunidade de aprendizado.

Aos doutores da minha banca: Dr. Luiz Ferreira Lima, Dra. Ormezinda
Fernandes, Dra. Maria Paula Gomes Mourão. Muito Agradecido.

A coordenação do curso de Pós-Graduação: Dra. Maria das Graças Vale

Barbosa, Sra. Conceição Tufi e Sr. Marcos André, pela dedicação ao apoio no curso.

Ao corpo técnico do Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina

Tropical do Amazonas: D. Antonieta, D. Graça, D. Luiza, D. Telma e D. Jaqueline
pelos ensinamentos e disciplina.

A Bolsista de PAIC Srta. Mirlane Santos Silva, Srta. Ivanete Sampaio e ao Sr.
Roberto Leal pela incansável busca da perfeição na genotipagem das espécies.

Aos colegas de mestrado e doutorado do curso de Pós-Graduação pelo

agradável convívio e aprendizado contínuo.
 vi

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior -

CAPES, a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas -FAPEAM, a
FMURAKI, a Superintendência da Zona Franca de Manaus - SUFRAMA pelo apoio
financeiro.

A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM) e Universidade do

Estado do Amazonas (UEA) pela parceria de sucesso.

Os que não constam nesta lista de agradecimentos.

A você que está lendo estes agradecimentos.

MUITO AGRADECIDO!!!!!!!!!!
 vii

“Os ventos que às vezes tiram

algo que amamos, são os
mesmos que trazem algo que
aprendemos a amar...
Por isso não devemos chorar
pelo que nos foi tirado e sim,
aprender a amar o que nos foi
dado. Pois tudo aquilo que é
realmente nosso, nunca se vai
para sempre...”

Bob Marley
 viii

RESUMO

A diferenciação e classificação de espécies patogênicas do gênero Cryptococcus

fornece dados úteis para estudos epidemiológicos, clínicos e de diagnóstico. O
objetivo deste estudo foi caracterizar 40 isolados clínicos de Cryptococcus obtidos
de pacientes na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTM), no período
de 2006-2008. Foram utilizadas metodologias de fenotípagem (características
bioquímicas, produção de enzimas e resistência antifúngica) e de biologia molecular
(URA5-RFLP) para caracterização. Resultados: Pacientes com HIV/AIDS foram os
mais afetados pela criptococose. Trinta e um (75,5%) dos isolados clínicos foram
classificados como C. neoformans e 9 (22,5%) como C. gattii. Altos níveis de
proteases e fosfolipases foram produzidos pela maioria dos isolados. Utilizando o
teste de difusão em disco (CLSI M44-A), 81, 35 e 100% dos isolados de C.
neoformans foram caracterizados como susceptíveis ao fluconazol, itraconazol e
anfotericina B, respectivamente, enquanto que 78, 56 e 100% dos isolados de C.
gattii foram sensíveis a esses antimicrobianos. A média de Concentração Inibitória
Mínima (CIM) para C. neoformans e C. gattii isolados foi de 0,26 e 0,58 µ/ml,
respectivamente. 9 isolados de C. gattii demonstram um padrão de eletroforese
compativel com o tipo molecular VGII, enquanto todos os 31 isolados de C.
neoformans apresentaram um padrão compatível com o tipo VNI. Este estudo
confirma a importância do HIV/SIDA para a epidemiologia da criptococose, a
susceptibilidade dos isolados a anfotericina B e alta prevalência dos genótipos
molecular VNI e VGII no norte do Brasil.
Palavras chave: Cryptococcus spp., Epidemiologia, Fenotipagem e Genotipagem
 ix

ABSTRACT

The differentiation and classification of pathogenic Cryptococcus species provides

useful data for epidemiological studies and for the clinical diagnosis and treatment of
patients. The aim of this study was to characterize 40 clinical Cryptococcus obtained
from patients at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas (FMTAM) from 2006
to 2008. It was used phenotypic (i.e., enzyme production and antifungal resistance)
and molecular biological (URA5-RFLP) experiments. Patients with HIV/AIDS were
the most affected with cryptococcosis. Thirty one (75.5%) of the clinical isolates were
classified as C. neoformans and 9 (22.5%) as C. gattii. High amounts of protease and
phospholipase enzymes were produced by most of the isolates. Using the disk
diffusion test (CLSI M44-A), 81, 35 and 100% of the C. neoformans isolates were
characterized as susceptible to fluconazole, itraconazole and amphotericin B,
respectively, whereas 78, 56 and 100% of the C. gattii isolates were susceptible to
these antimicrobial agents. The average of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) for
C. neoformans and C. gattii isolates was 0.26 and 0.58 μg/mL, respectively. The 9
isolates of C. gattii had a fingerprint pattern comparable with the VGII molecular type,
while all 31 isolates of C. neoformans presented with a pattern consistent with the
VNI type. This study confirms the importance of HIV/AIDS for the cryptococcosis
epidemiology, the susceptibility of the isolates to amphotericin B and the high
prevalence of the molecular genotypes VNI and VGII in the north of Brazil.
Keys words: Cryptococcus spp., Epidemiology, Phenotyping, Genotyping
 x

LISTA DE TABELAS

TABELA 1- Características epidemiológicas dos pacientes com

criptococose............................................................................................................. 17

TABELA 2- Suscetibilidade de C. neoformans e C. gattii aos compostos

antifúngicos, medida pela difusão em disco...............................................................18
 xi

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA

HIV Vírus da imunodeficiência humana

mm Milimetro (s)

BC British Columbia

α Alfa

vα-MAT Mating type α

a-MAT Mating type a

SNC Sistema nervoso central

% Porcentagem

UV Ultravioleta

C. neoformans Cryptococcus neoformans

AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida

spp. Espécies

CMI Concentração Mínima Inibitória

µg Micrograma

mL Mililitro

min Minuto

ºC Graus Celsius

FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas

PCR Reação em cadeia de polimerase

h Hora

CGB Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol

Pz Atividade enzimática

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

mg Miligrama
 xii

μL Microlitro

ATL Tissue Lysis Buffer

AL Lysis Buffer

rpm Rotações por minuto

AE Elution buffer

DNA Ácido desoxirribonucléico

ng Nanograma

Tris 2- amino -2- hidroximetilpropano-1,3-diol

HC ℓ Ácido Clorídrico

mM Milimolar

pH Potencial de hidrogeniônico

KCl Cloreto de potássio

MgCl2 Cloreto de magnésio

dNTP Desoxirribonucleosídeo (s) trifosfato

U Unidade

Taq Termus aquaticus

μg Micrograma

s Segundos

V Volt (s)

pb Pares de base

var. Variedade
 xiii

SUMÁRIO

1 . INTRODUÇÃO................................................................................................... 01
1.1 Epidemiologia dos pacientes acometidos por Criptococose........................... 02
1.2 Características fenotípicas dos isolados clínicos do complexo entre
C.neoformans-C. gattii............................................................................................ 04
1.3 Grupos moleculares dos isolados de Cryptococcus spp.................................. 05

2. OBJETIVOS........................................................................................................ 06
2.1 Gerais................................................................................................................ 06
2.2 Específicos........................................................................................................ 06

3. METODOLOGIA................................................................................................. 07
3.1 Modelo de Estudo............................................................................................. 07
3.2 Universo de Estudo........................................................................................... 07
3.2.1 Local de Estudo............................................................................................. 07
3.2.2 Isolados do gênero Cryptococcus e linhagens de referência........................ 07
3.2.3 Aspectos éticos.............................................................................................. 07
3.2.4 Financiamento................................................................................................ 07
3.3 Procedimentos.................................................................................................. 08
3.3.1. Características epidemiologicas dos pacientes............................................ 09
3.3.2 Caracterização fenotípica ............................................................................. 09
3.4 Sensibilidade a antifúngicos............................................................................. 10
3.5 Caracterização genotípica................................................................................ 10
3.6 Análise dos resultados...................................................................................... 10

4. RESULTADOS.................................................................................................... 11

5. CONCLUSÃO..................................................................................................... 27

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 28

7. APÊNDICE.......................................................................................................... 31
 1

1. INTRODUÇÃO

A criptococose, antigamente conhecida como torulose ou blastomicose

Européia, é uma micose sistêmica que acomete órgãos profundos e a pele,
decorrente da aquisição de propágulos infectantes por via inalatória das espécies de
leveduras patogênicas do complexo C. neoformans apresenta-se de forma
subaguda ou crônica, afetando pacientes imunodeprimidos ou imunocompetentes,
caracterizada pelo tropismo meningoencefálico resultando em elevada mortalidade
na ausência de tratamento 1.

O primeiro caso de infecção humana provocada por Cryptococcus sp. foi

detectado há cerca de 100 anos por Busse e Buschke na Alemanha. Entretanto a
Criptococose começou a receber atenção especial a partir da década de 60. Com o
aumento da população imunocomprometida decorrente da pandemia de HIV e uso
de agentes imunossupressores para a terapia do câncer ou transplantes de órgãos,
a criptococose oportunista transformou-se em uma infecção relativamente comum
neste começo de milênio 2.

A nomenclatura dos agentes causadores da criptococose sofreu diversas

modificações. Sendo ques as mais recentes evidenciavam a existencia das
variedades C. neoformans var. neoformans, C. neoformans var. grubii e C.
neoformans var. gatti e, mais recentemente, entendeu-se a existencia do complexo
C. neoformans que engloba duas espécies de interesse patogênico: C. neoformans
3,4
e C. gattii .

Historicamente a criptococose por espécies do complexo C. neoformans foi

descoberta, descrita e estudada através de sua face oportunística associada a
sarcomas, corticóides, drogas imunossupressoras e co-morbidade. A criptococose
por C. gattii foi identificada pela primeira vez em uma criança com
5
meningoencefalite e sem fator predisponente na África Central .

A infecção criptocócica é adquirida por inalação das leveduras ressecadas

(<3mm) presentes na natureza. A patogenicidade é determinada pela cápsula do C.
 2

neoformans que impede a fagocitose e ativação do sistema complemento, e pela

presença da enzima fenil-oxidase dá-se o neurotrofismo do fungo no organismo 5.

O diagnóstico laboratorial é baseado em três fundamentos, todos tendo como

base a demonstração do fungo no material biológico: 1) o isolamento do fungo em
meio de cultura; 2) identificação microscópica; 3) a pesquisa de antígenos
plasmáticos circulantes 1.

Os melhores rendimentos de obtenção da positividade dos resultados para o

diagnóstico laboratorial da criptococose disseminada com acometimento do sistema
nervoso central foram obtidos da análise de Líquor (97,8%), já a forma disseminada
sem o acometimento meníngeo, o espécime biológico de melhor rendimento foi a
6
urina com 71,6%, superando os índices de hemocultura com 58,8%

O conhecimento da criptococose e dos seus agentes (espécies do complexo

C. neoformans) no Norte do Brasil ainda é muito limitado quando comparado às
regiões Sul e Sudeste do país e outras regiões do mundo 7.

1.1 Epidemiológia dos pacientes acometidos por Criptococose

C. neoformans possui distribuição geográfica mundial, enquanto que o C.

gattii é encontrado com maior freqüência em regiões tropicais e subtropicais. Há um
grande interesse em determinar as variedades e sorotipos das espécies do
complexo C. neoformans isolados de pacientes no Brasil, onde todas as espécies
são endêmicas 5.

Um recente surto de infecção por C. gattii, no clima temperado da Ilha de

Vancouver, BC, Canadá, deflagrou o início e a colaboração de pesquisadores no
esforço de investigação deste distúrbio em relação a descrições geográficas,
demográficas, microbiológicas e referenciando as características clínicas dos casos
de criptococose, como também identificar possíveis reservas ambientais
responsáveis pelo surto. Como a maioria dos pacientes eram imunocompetentes, a
infecção criptococcica foi listada como doença notificável em British Columbia,
Canadá. A incidência de infecção por C. gattii entre as pessoas da Ilha de
 3

Vancouver, de 1999 para 2003, ficou entre um intervalo de 8,5 a 37 casos por
milhão de residentes por ano. Esta incidência é significativamente grande, quando
comparada à infecção tropical de C. gattii observada na Austrália (0.94 casos por
milhão de residentes por ano) onde o C. gattii é endêmico 8.

Em pacientes hígidos a resposta imunológica celular e humoral delimita a

contaminação por espécies do complexo C. neoformans, caracterizando um quadro
assintomático da criptococose. A resistência da infecção depende da sensibilização
prévia de linfócitos e posterior ativação de macrófagos e neutrófilos, além de uma
resposta humoral mediada por anticorpos opisonizantes 1.

Uma maior susceptibilidade de infecção pelo fungo é manifestada por

alterações da imunidade celular ou humoral, ocasionando a penetração do
microorganismo nas vias respiratórias. A infecção pulmonar é o sintoma preliminar
da aquisição da criptococose, resultando em doença pulmonar progressiva ou foco
pulmonar assintomático, que pode conduzir à disseminação hematogênica e mais
freqüentemente a infecção do SNC ou comprometimento cutâneo. A infiltração
3,5
nodular pulmonar é o achado clínico mais freqüente da criptococose pulmonar .

A criptococose é a micose de caráter sistêmico mais freqüente em pacientes

com AIDS e a terceira causa de doença oportunista do sistema nervoso central
(SNC). Sua prevalência varia de 2,9 a 13,3% representando importante causa de
mortalidade na aids, apesar do tratamento específico. Estudos multicêntricos
internacionais realizados entre 1999 e 2001 demonstraram que a taxa de
mortalidade dos pacientes acometidos de HIV aproximou-se de 69%, sendo que a
maioria dos pacientes que foram ao óbito, ocorreu nos primeiros 30 dias de co-
infecção 9. Estudos prospectivos realizados na região Sudeste do Brasil no período
entre 1998 e 2003, relataram a presença de 96 pacientes com diagnóstico clínico-
laboratorial de criptococose, sendo que destes a maior predominância (81,3%) foi
de pacientes portadores de AIDS 10.

Husain et al11 determinaram que a média de infecção por espécies do

complexo C. neoformans em pacientes transplantados varia de 2,8 a 5,0% e que a
taxa de mortalidade é de 42%. Quanto as manifestações clínicas, os pacientes
 4

transplantados apresentaram infecção do Sistema Nervoso Central (SNC) (55%),

seguidos de acometimentos cutâneos (13%) e osteoarticulares (6%).

A literatura descreve que a adoção de terapia antifúngica em casos de

criptococose disseminada reduz a taxa de mortalidade para 20% dos casos e na
11
ausência da terapêutica o índice de mortalidade atinge 100% dos casos .

1.2 Características fenotípicas dos isolados clínicos do complexo entre C.

neoformans-C. gattii

Quatro classes foram identificadas pela reatividade de antígenos capsulares

1
a soros hiperimunes, denominados sorotipos A, B, C e D . C. neoformans
(sorotipos A, D e AD) de distribuição cosmopolita e encontrada com facilidade em
habitat de pombos (Columba sp.) e C. gattii (sorotipos B e C) predominante em
regiões tropicais e subtropicais e originalmente encontrado em restos vegetais de
Eucalyptus camaldulensis.

Espécies patogênicas do complexo C. neoformans são capazes de elaborar

uma estrutura adicional de polissacarídeos fora da parede celular, embora outros
fungos não-patogênicos e outras espécies do complexo C. neoformans também
possam produzir. A cápsula polissacarídica é um fator de virulência do C.
neoformans atuando na resistência à fagocitose mediada por macrófagos,
neutrófilos, sendo decorrente do potencial zeta negativo dos componentes
capsulares, o que provoca repulsão eletrostática 12.

As metodologias de caracterização utilizadas para a caracterização de

isolados de Criptococcus spp. são análise de proteases, fosfolipases, sorotipagem e
sensibilidade a antifúngicos 13.

Enzimas proteolíticas são produzidas pelo fungo em condições naturais e

patológicas, funcionando como fator de virulência das espécies do complexo C.
neoformans. As fosfolipases estão correlacionadas com a penetração tecidual. Os
sorotipos são discriminantes das linhagens prevalentes. A sensibilidade a
antifúngicos determina a evolução terapêutica do paciente frente
antibiótico/quimioterápico utilizado 13.
 5

1.3 Grupos moleculares dos isolados de Cryptococcus spp.

Métodos moleculares têm sido desenvolvidos para diagnóstico e

monitoramento de infecções fúngicas, bem como para tipificação dos isolados,
visando principalmente, estudos epidemiológicos. A reação em cadeia de
polimerase (PCR) tem sido a principal ferramenta utilizada no desenvolvimento de
protocolos de detecção de DNA de C. neoformans e C. Gatti i 8.

Além dos sorotipos de C. neoformans e C. gatti, análises moleculares,

incluindo impressões digitais M13, URA5-RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), identificaram
oito genótipos moleculares: VNI e VNII (sorotipo A); VNIII AD (híbrido); VNIV
14
(sorotipo D) e B VGI, VGII VGIII e VGIV (sorotipos e C) . A genotipagem molecular
contribui para uma melhor e mais preciso o diagnóstico clínico e caracteriza a
diversidade genética de realização de estudos epidemiológicos15.

Estudos de caracterização molecular em isolados clínicos de pacientes com

meningite criptococcica foram desenvolvidos no Estado do Pará – Brasil,
evidenciando uma prevalência absoluta de tipos , pertencente a espécies de C.
neoformans, além de contribuir com um possível novo perfil de híbridos desta classe
7
.
 6

2. OBJETIVOS

2.1 Gerais

Investigar as características laboratoriais de isolados clínicos do complexo

Cryptococcus neoformans-C. gattii do Estado do Amazonas - Brasil

2.2 Específicos

• Estudar as características epidemiológicas dos pacientes acometidos

por Criptococose.
• Investigar as características fenotípicas e de sensibilidade a
antifúngicos dos isolados clínicos de Cryptococcus spp causadores de Criptococose
no estado do Amazonas.
• Investigar quais os grupos moleculares dos isolados clínicos de
Cryptococcus spp causadores de Criptococose no estado do Amazonas.
 7

3. METODOLOGIA

3.1 Modelo de estudo

Foi realizado um estudo laboratorial e experimental com a finalidade de

caracterizar laboratorialmente isolados do complexo Cryptococcus neoformans-C.
gattii oriundos de pacientes atendidos na Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas – FMTAM.

3.2 Universo de estudo

3.2.1 Local de estudo

Este projeto de pesquisa foi realizado no Laboratório de Micologia da

Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.

3.2.2 Isolados do gênero Cryptococcus e linhagens de referência

Os 40 isolados foram obtidos de pacientes com Criptococose atendidos

entre março de 2006 a fevereiro de 2008. Estes isolados encontravam-se
preservados na coleção de fungos da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.
Para a reativação das culturas foi utilizado o cultivo em Ágar Sabouraud a 30 oC por
48h.

Para genotipagem molecular, as seguintes estirpes padrão foram utilizadas:

WM 148 (sorotipo A, VNI), WM 626 (sorotipo A, VNII), WM 628 (sorotipo AD, VNIII),
WM 629 (sorotipo D, VNIV), WM 179 ( sorotipo B, VGI), WM 178 (sorotipo B, VGII),
WM 161 (sorotipo B, VGIII) e WM 779 (sorotipo C, VGIV). Essas cepas de
referência foram gentilmente cedidas pela Micoteca da FIOCRUZ-Rio de Janeiro-
Brasil. Além disso, as amostras de referência WM WM 148 e 178, foram utilizadas
como referência para os ensaios de determinação de espécies com o meio
Canavanina Glicina Azul de Bromotimol (CGB), produção de enzimas e
susceptibilidade a antifúngicos.
 8

3.2.3 Aspectos éticos:

Este projeto de pesquisa foi registrado e aprovado pelo CEP-FMT/AM,

Processo n°. 626/2007-FMT-AM, CAAE – 0007.0.114.000-10 (Apendice 1).

3.2.4 Financiamento:

Este estudo foi financiado pela FAPEAM, através do edital N°.014/2006

PPSUS 2006.

3.3 Procedimentos

3.3.1 Características epidemiológicas dos pacientes acometidos por

Criptococose
O perfil epidemiológico dos pacientes (idade, gênero, imunocomprometimento
e procedência) foi obtido através da análise das solicitações de exame existentes no
Laboratório de Micologia da FMTAM.

3.3.2 Caracterização fenotípica

Para diferenciar as espécies de C. neoformans e C. gattii foi utilizado o

meio Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol (CGB) como proposto por Kwon-
Chung 5. As colônias de C. gattii utilizam a glicina como fonte de carbono e
nitrogênio e são resistentes à canavanina, produzindo durante sua incubação em
meio CGB uma coloração azul-cobalto, enquanto que C. neoformans não demonstra
mudança na coloração do meio.
A produção de proteinase e fosfolipase foi verificada segundo Ruchel et al.
16
e Price17, respectivamente. Os isolados foram inoculadas em pontos eqüidistantes
em placas de Ágar proteinase e Ágar fosfolipase e a atividade enzimática (Pz) foi
medida através da razão entre o diâmetro da colônia e o diâmetro da colônia mais a
zona de precipitação.

18
A prova de sensibilidade foi realizada de acordo com o método de Bauer ,
recomendado pela Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) documentos
 9

M44-A19. Foram utilizados discos impregnados com Fluconazol, Itraconazol e

Anfotericina B. A determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para a
Anfotericina B foi realizada pela metodologia E-test-AB BIODISK 20.

3.3.3 Caracterização genotípica

Extração do DNA

Utilizou-se a metodologia de membrana de sílica, a extração do DNA foi

realizado com o kit comercial QIAamp Tissue and Blood – Qiagen. A metodologia foi
realizada como descrita pelo fabricante. As linhagens de Cryptococcus sp. foram
semeadas em meio de cultura contendo Ágar Sabouraud, com antecedência de 48
horas ao início da extração. A biomassa de Cryptcoccus sp. (90 mg) foi retirada dos
meios de cultura e adicionada em microtubo (1,5 mL) contendo 180 μL de tampão
ATL (Tissue Lysis Buffer) e 20 μL de proteinase K (20 mg/mL). Esta mistura foi
incubada por 30 minutos a 56 oC o residual foi macerado com esferas de vidro de
0,5mm até se obter uma mistura homogênea. 200 μL de tampão AL (Lysis Buffer)
foram adicionados e a mistura foi incubada a 70 oC durante 10 minutos. 200 μL de
etanol foram adicionados a mistura que, em seguida, foi transferida para o
microtubo contendo a coluna de sílica. O conjunto foi centrifugado a 8.000 rpm por
um minuto e a coluna foi lavada com 500 µL das soluções AW1 (8.000 rpm por 1
min) e AW2 (12.000 g por 3 min). O DNA foi eluído pela adição de 100 μL de
tampão AE (Elution buffer).

PCR-RFLP doGene URA5

A caracterização genotípica foi realizada conforme previamente descrito

Meyer et al. 8. A PCR do gene URA5 foi realizada em um volume final de 50 uL de
solução e em cada reação continha: 50 ng de DNA, tampão PCR 1X (10 mM Tris-
HCl, pH 8,3, 50 mM KCl e 1,5 mM MgCl2), 0,2 mM de cada um dos dATP, dCTP,
dGTP e dTTP, 3 mM de acetato de magnésio, 1,5 U AmpliTaq DNA polimerase
(Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) e 50 ng de cada primer URA5
(5'ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG3') e SJ01
(5'TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC3'). A PCR foi realizada em um termociclador
 10

Perkin Elmer-térmico (modelo 480), foi realizada uma desnaturação inicial de 2 min
a 94 °C, e em seguida foram realizados 35 ciclos de, 45 s desnaturação a 94 °C, 1
min de anelamento a 61 °C e 2 min de extensão a 72 °C, seguido por um ciclo de
extensão final por 10 min a 72 °C. Os produtos de PCR foram digeridos com dupla
Sau96I (10 U / mL) e HhaI (20 U / mL) por 3 horas ou durante a noite e separados
por 3% agarose eletroforese em gel de 100 V por 5 h.

.
Eletroforese

Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel-

agarose 1,4%, por 6 h à 60 V, corados com brometo de etídio (0,5 μg/ml) e
visualizados sob a luz ultravioleta do transluminador de UV Safe Imager ™
Invitrogen. O marcador O'RangeRuler™50bp DNA Ladder (Fermentas) foi utilizado
para determinação do tamanho dos produtos de PCR fingerprinting. Duas amostras
padrão previamente caracterizadas FMT1733 (C. neoformans-VNI) e FMT1827 (C.
gattii B- VGII) foram utilizadas como amostras padrão.

3.4 Análise dos resultados

Os dados epidemiológicos (idade, gênero, imunocomprometimento e

procedência), obtidos das solicitações de exame, foram tabulados no Programa
Excel – Office Microsoft co objetivo de calcular as freqüências.

Os ensaios de caracterização fenotípica foram feitos em triplicata. No caso

da atividade enzimática e de sensibilidade, o dados quantitativos foram tratados
com o objetivo de determinar média e desvio padrão.

A PCR-fingerprinting foi realizada em duplicata e em triplicata, quando foram

obtidos resultados divergentes.
 11

4. RESULTADOS

Os resultados estão apresentados na forma de Artigo Científico que foi

publicado na Revista Iberoamericana de Micología, v. 29, p. 40-43, 2011
(Apêndice 2) e as Normas de formatação dessa revista estão descritas no
Apêndice 3.

Caracterização laboratorial de isolados clínicos do complexo Cryptococcus

neoformans-C. gattii do Estado do Amazonas no Brasil

Babbyngttonn Khell da Silvaa, Ana Karla Freirea, Amaury dos Santos Bentesb,

Ivanete de Lima Sampaioa, Lucilaide Oliveira Santosa, Mirlane Silva dos Santosa and

João Vicente de Souzab

a
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas , Manaus/AM, Brasil

b
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus/AM, Brasil

Corresponding Author: Prof. João Vicente Braga de Souza, Laboratório de

Micobacteriologia, Coordenação de Pesquisas em Ciências da Saúde, Instituto de

Nacional de Pesquisas da Amazônia, AM . Av. André Araújo, 2936, 69060-001,

Manaus, AM, Brasil.

Tel: 55 92 3643-3057; Fax: 55 92 3643-3057

e-mail: joaovicentebragasouza@yahoo.com.br

Running title:

Characterisation of clinical isolates of the Cryptococcus sp.

Caracterización de aislados clínicos del Cryptococcus sp.

 12

INTRODUÇÃO

A criptococose é uma doença fúngica oportunista causada por leveduras

encapsulada espécies C. neoformans e C. gattii [17]. A infecção é adquirida pela

inalação das leveduras ou esporos dessecados e pode desenvolver para o cérebro

ou outros órgãos sistêmicos [18]. A infecção por Cryptococcus spp. é a principal

causa de meningite por fungos em pacientes imunocomprometidos, resultando em

elevada morbidade e mortalidade [21]. O status de imunocomprometimento é o fator

de risco mais comuns para a infecção com C. neoformans. Além disso, há um

número crescente de pacientes imunocompetentes com meningite causada por C.

gattii [21,32]. O tratamento preferido para a meningite criptocócica é a anfotericina

B, no entanto, a nefrotoxicidade desta droga limita seu uso clínico e aumenta a

importância dos testes de suscetibilidade antifúngica [10,12].

Baseado em estudos sorológicos, utilizando anticorpos contra a cápsula de fungos,

sete sorotipos de Cryptococcus foram identificados: A, B, C, D, AB, AD e BD

[3,5,20]. C. neoformans sorotipos A, D e AD encontram-se nas cidades, enquanto o

C. gattii sorotipos B e C estão predominantemente localizados em regiões tropicais

e subtropicais [1,13,19]. Em 1999, um surto de C. gattii ocorreu no Canadá,

destacando a possibilidade de que ele possa ser localizados em climas tropicais e

temperados [11].

Além dos sorotipos de C. neoformans e C. gatti, análises moleculares, incluindo

impressões digitais M13, URA5-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), identificaram oito genótipos

moleculares: VNI e VNII (sorotipo A); VNIII AD (híbrido); VNIV (sorotipo D) e B VGI,

VGII VGIII e VGIV (sorotipos e C) [17]. A genotipagem molecular contribui para uma
 13

melhor e mais preciso o diagnóstico clínico e caracteriza a diversidade genética de

realização de estudos epidemiológicos [24].

O objetivo deste trabalho foi caracterizar isolados Cryptococcus obtidos de

pacientes da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTM), durante 2006-

2008, usando ferramentas fenotípicas e moleculares.

MATERIAIS E MÉTODOS

Isolados e linhagens

Quarenta isolados foram obtidos de pacientes com criptococose, que foram

internados na FMTM entre março de 2006 e fevereiro de 2008. Uma única amostra
o
foi coletada de cada paciente e os isolados foram armazenados a 4 C, na coleção

de fungos FMTM. Os isolados foram reativados em ágar Sabouraud a 30 º C por 48

h. Para genotipagem molecular, as seguintes estirpes padrão foram utilizadas: WM

148 (sorotipo A, VNI), WM 626 (sorotipo A, VNII), WM 628 (sorotipo AD, VNIII), WM

629 (sorotipo D, VNIV), WM 179 ( sorotipo B, VGI), WM 178 (sorotipo B, VGII), WM

161 (sorotipo B, VGIII) e WM 779 (sorotipo C, VGIV). Essas cepas de referência

foram gentilmente cedidas pela Micoteca da FIOCRUZ-Rio de Janeiro-Brasil. Além

disso, as amostras de referência WM WM 148 e 178, foram utilizadas como

referência para os ensaios de determinação de espécies com o meio Canavanina

Glicina Azul de Bromotimol (CGB), produção de enzimas e susceptibilidade a

antifúngicos.

Informações ao paciente

O perfil epidemiológico dos pacientes (idade, sexo, estado imunológico e de

residência) foi obtida pela análise da requisição de exame.

 14

Identificação das espécies

Agar CGB foi utilizado para diferenciar as espécies C. neoformans e C. gattii, como

descrito anteriormente [13]. C. gattii utiliza a glicina como fonte de carbono e

nitrogênio, são resistentes à canavanina e produzem uma cor azul cobalto, durante

a incubação, ao passo que C. neoformans não promove alteração de cor no meio.

Quantificação enzimatica

A produção de proteases e fosfolipases foram quantificadas como previamente

descrito [23,25,33]. Os fungos isolados foram inoculados em pontos eqüidistantes

em placas de agar protease e Agar fosfolipase e atividade enzimática (Pz) foi

calculada a relação entre o diâmetro da colônia (dc) e o diâmetro da colônia e na

zona de precipitação (DCP) . Os resultados foram classificados como negativos (Pz

= 1), positiva (0,64 ≥ Pz <1) ou fortemente positiva (Pz <0,64).

Suscetibilidade aos antifúngicos

Os testes de suscetibilidade foram realizados de acordo com o Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI), documento M44-A [4]. Discos impregnados

com fluconazol (25 mg), itraconazol (10 mg) ou anfotericina B (100 mg) (Cecon-

Sensifungidisc, São Paulo, Brasil) foram utilizados nos ensaios. O diâmetro dos

halos de inibição foi utilizado para determinar a susceptibilidade das leveduras aos

compostos antifúngicos valores de corte foram os seguintes: anfotericina B> 10 mm

- suscetível (S), <10 mm-resistente (R);> itraconazol 20 mm - S, 19 -12 mm -

intermediário (I), <11 mm - R e fluconazol> 19 mm - S; 19-14 mm - I; <14 mm - R. A

determinação do CIM para anfotericina B foi realizada usando o método BIODISK E-

test-AB, como descrito anteriormente [14].

 15

Caracterização molecular de genotipagem

A caracterização genotípica foi realizada conforme previamente descrito [17]. O

DNA fúngico foi extraído com o Tissue Kir QIAamp (Qiagen, Alemanha), de acordo

com o protocolo do fabricante para a extração de DNA de levedura, incluindo a

digestão com lyticase e RNAase. A PCR do gene URA5 foi realizada em um volume

final de 50 uL de solução e em cada reação continha: 50 ng de DNA, tampão PCR

1X (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl e 1,5 mM MgCl2), 0,2 mM de cada um dos

dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 3 mM de acetato de magnésio, 1,5 U AmpliTaq DNA

polimerase (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) e 50 ng de cada primer URA5

(5'ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG3') e SJ01

(5'TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC3'). A PCR foi realizada em um termociclador

Perkin Elmer-térmico (modelo 480), foi realizada uma desnaturação inicial de 2 min

a 94 °C, e em seguida foram realizados 35 ciclos de, 45 s desnaturação a 94 °C, 1

min de anelamento a 61 °C e 2 min de extensão a 72 °C, seguido por um ciclo de

extensão final por 10 min a 72 °C. Os produtos de PCR foram digeridos com dupla

Sau96I (10 U / mL) e HhaI (20 U / mL) por 3 horas ou durante a noite e separados

por 3% agarose eletroforese em gel de 100 V por 5 h

RESULTADOS

As características epidemiológicas dos pacientes com criptococose foram avaliadas.

Os homens foram mais comumente infectados (70%) que o sexo feminino, e a faixa

etária mais acometida foi entre 16-30 anos (53%, mediana = 28,5 anos) (Tabela 1).

A maioria dos pacientes com criptococose estavam também infectados com o HIV

(72%) e residiam na zona leste da cidade de Manaus (25%) (Tabela 1). Na maioria
 16

dos pacientes (93%) os microrganismos foram isolados do líquido cefalorraquidiano

(LCR). Os isolados foram inoculados em meio CGB, sendo que 9 foram

caracterizados como C. gattii e 31 como C. neoformans.

Todos os isolados apresentaram alta produção de proteases (Pz <0,64) e média de

Pz = 0,3 para ambas as espécies Cryptococcus. Todos, com exceção de um

isolado, foram positivod para a produção de fosfolipases (Pz média = 0,53). Vinte e

seis isolados de C. neoformans (83,8%) apresentaram resultados forte positivos (Pz

<0,64) e 4 isolados (12,9%) apresentaram resultados positivos (Pz ≥ 0,64 e <1,0),

enquanto todos os 9 isolados de C. gattii foram classificados como fortes produtores

de fosfolipase.

Utilizando o teste de difusão em disco (CLSI M44-A), 81, 35 e 100% dos isolados de

C. neoformans foram identificados como suscetíveis ao fluconazol, itraconazol e

anfotericina B, respectivamente, e 78, 56 e 100% dos isolados de C. gattii foram

sensíveis a esses compostos antifúngicos (Tabela 2). O MIC média para a

anfotericina B foi avaliada pela metodologia E-test, foi de 0,26 ± 0,22 mcg/mL para

C. neoformans e 0,58 ± 0,53 mcg/mL para C. gattii.

 17

Tabela 1 - Características epidemiológicas dos pacientes com criptococose.

C. neoformans C. gattii Total %

Gênero

Feminino 9 3 12 30

Masculino 22 6 28 70

Idade (Anos)

0 – 15 0 3 3 8

16 – 30 18 3 21 53

31 – 45 8 2 10 25

46 – 60 3 1 4 10

> 60 1 1 2 5

Infecção pelo HIV

Negativa 0 4 4 10

Positiva 24 5 29 73

Desconhecida 7 0 7 18

Áreas da Cidade de Manaus

Norte 4 1 5 12

Sul 2 1 3 8

Leste 8 2 10 24

Oeste 1 0 1 2

Centro Sul 2 1 3 8

Centro Oeste 4 1 5 12

Desconhecida 10 3 13 33

Amostra Biológica

Líquido cefalorraquidiano 29 8 37 92

Hemocultura 2 0 2 5

Escarro 0 1 1 3
 18

Tabela 2- Suscetibilidade de C. neoformans e C. gattii aos compostos

antifúngicos, medida pela difusão em disco.

Antifúngico Suceptível N Intermediário N Resistente N

C. neoformans Fluconazol 80.6% 25 16.1% 5 3.3% 1

Itraconazol 35.4% 11 64.6% 20 0

Anfotericina B 100% 31 0 0

C. gattii Fluconazol 77.7% 7 0 22.3% 2

Itraconazol 55.5% 5 44.5% 4 0

Anfotericina B 100% 9 0 0

O DNA foi extraído de todos os isolados clínicos e foi utilizado para identificar os

genótipos moleculares por URA5-RFLP. Todos os 9 isolados de C. gattii

apresentaram um padrão de eletroforese compatível com o genótipo VGII molecular

e todos os 31 isolados de C. neoformans apresentaram um perfil do tipo molecular

VNI (Figura 1).

DISCUSSÃO

O número total de habitantes no estado do Amazonas é de aproximadamente 3,5

x106 e de acordo com o Serviço de Micologia da Fundação de Medicina Tropical de

Manaus, 20-25 novos casos de criptococose ocorrem anualmente na região.

Manaus, capital do Estado do Amazonas, está localizada próximo do centro da

 19

bacia amazônica, na margem esquerda do Rio Negro, constituído por sedimentos

terciários em terra areno-argilosos. A região tem uma precipitação média de 2.300

mm / ano e, portanto, possui um clima quente e úmido e uma vegetação exuberante

[31]. Neste estudo, a incidência de criptococose não foi relacionada a estas

condições meteorológicas, como o número de isolados foi semelhante ao longo do

ano. A identificação de possíveis fontes ambientais de C. neoformans e C. gatii

requer uma investigação mais aprofundada. É de se supor que as fontes de

contaminação são semelhantes às descritas em outros países: infecção humana

com o tipo Cryptoccocus VNI ocorre principalmente por contato com fezes de aves,

e infecção com o tipo VGII geralmente ocorre após o contato com a decomposição

da biomassa vegetal.

Este é um dos primeiros estudos para caracterizar a criptococose no estado do

Amazonas no Brasil. Este estudo determinou que os pacientes mais afetados pela

criptococose eram do sexo masculino, jovem (16-30 anos), o HIV-positivos e os

habitantes da zona leste da cidade de Manaus.

O número de casos de HIV/AIDS notificados anualmente no Estado do Amazonas é

de aproximadamente 700, dos quais metade receberá tratamento com HAART [30].

AIDS é o principal fator de risco para a criptococose, devido à supressão da

resposta imune pelo vírus HIV [9,13,26]. C. neoformans foi à espécie mais

freqüentemente isolada (n = 31; 77,5%), o que é consistente com os 82,3%

relatados na literatura [17,19]. C. neoformans causa quase que exclusivamente a

doença em pacientes imunocomprometidos, e a maioria dos isolados que obtivemos

foi de pacientes com AIDS [17,19]. Entre os nove isolados de C. gattii, três foram

obtidos de pacientes imunocompetentes, quatro de pacientes com AIDS e dois

pacientes sem caracterização quanto ao estado imunológico.

 20

Neste estudo, foram obtidos três isolados de crianças com idades entre 0-15 anos.

C. gattii foi o principal agente causador de meningite nestes pacientes. Em um

estudo anterior no Estado Amazonas de 1988-1998, Martins et al. [15] relatou que a

freqüência de criptococose em crianças representavam 33% do total de casos. No

estado do Pará, vizinho do Estado do Amazonas, 19-24% dos casos de

criptococose foram relatados em crianças nos últimos 10 anos [28,29]. Esses

estudos demonstram que na Amazônia, a prevalência da criptococose em crianças

é alta e também está associada com o tipo molecular VGII. Outros estudos

epidemiológicos e amostras ambientais são necessários para definir a importância

das condições ambientais na incidência de casos de criptococose em crianças.

A produção de lipases e proteases está relacionada com a virulência de

Cryptococcus spp [7,8]. Essas enzimas estão envolvidas na destruição das

estruturas celulares do hospedeiro com a finalidade de obter nutrientes para o fungo

e para facilitar a disseminação pelos tecidos. Tanto C. neoformans e C. gattii

produziram proteases e lipases em quantidades semelhantes.

Os testes de sensibilidade antifúngica revelaram que 80 e 77% de sensibilidade ao

Fluconazol de C. neoformans e C. gattii, respectivamente. Essa droga é comumente

usada em pacientes com AIDS, para o tratamento de doenças fúngicas oportunistas

e evitar o surgimento de infecções fúngicas [6,9]. C. neoformans e C. gattii

apresentaram 35 e 55% de sensibilidade para Itraconazol, respectivamente, e de

todos os isolados clínicos foram sensíveis a Anfotericina B. Estes resultados são

consistentes com estudos anteriores [14,22,27]. A Anfotericina B é considerada

padrão-ouro para o tratamento da criptococose [2]. Em um estudo determinação de

resistência a Anfotericina B foi observado que 10% dos isolados clínicos eram

resistentes [5], mas outros estudos demonstram baixa resistência in vitro a este
 21

composto [14,27]. Embora todos os isolados tenham sido considerados sensíveis à

Anfotericina B (MIC <2 mg / ml), o MIC média do C. gattii isolados (0,56 mcg / mL)

foi maior que a de C. neoformans isolados (0,26 mcg/mL). Este resultado foi

relatado previamente [14] e destaca a necessidade de diferenças na terapêutica de

infecções por C. neoformans e C. gattii.

A identificação das espécies patogênicas Cryptococcus e sub-espécies são

importantes para a orientação clínica e para a epidemiologia a doença.

Recentemente, resultados falso-positivos para identificação de C. gattii foram

reportados utilizando o método de diferenciação CGB convencionais, devido à

existência de C. neoformans isolados que são resistentes a canavanina [13].

Enquanto isso, a PCR fingerprinting e PCR-RFLP estão sendo utilizadas com mais

freqüência [9,20,24]. No presente estudo, a PCR-RFLP caracterizou os

Cryptococcus isolados como o tipo molecular VNI e VGII. Estes resultados são

consistentes com estudos anteriores que identificaram C. neoformans VNI como o

principal agente da criptococose [13,16,19]. Em um estudo que caracterizaram 63

isolados brasileiros, observou-se a prevalência dos tipos molecular VNI (82,3%),

VGII (13,6%) e VNII (3,0%) [17] e estudos mais recentes no estado do Pará

reforçam a prevalência de VNI e VGII como sendo os principais tipos moleculares

de C. neoformans e C. gattii, respectivamente, na região norte do Brasil [17].

Os dados deste estudo podem ajudar com a gestão atual e futura de criptococose

no Norte do Brasil, identificando a freqüência de C. neoformans e C.gattii em

pacientes bem como a sua suscetibilidade a drogas antifúngicas comumente

usadas. Estes dados também contribuem para estudos epidemiológicos sobre a

distribuição dos diferentes tipos molecular de Cryptococcus spp, na Amazônia

brasileira.
 22

AGRADECIMENTOS

Os autores são gratos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas

(FAPEAM) pelo apoio financeiro.

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 27

5. CONCLUSÕES

Este estudo confirma a importância do HIV/AIDS para a frequência da criptococose,

demonstrou a susceptibilidade dos isolados a Anfotericina B e a prevalência dos
genótipos molecular VNI e VGII no norte do Brasil.
 28

6. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS

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1998
 31

7 APÊNDICES
1
7.1 Parecer do Comitê de Ética

Fundação de Medicina Tropical do

Amazonas

Comitê de Ética em Pesquisa em Seres

Humanos

Av. Pedro Teixeira, 25 – Dom Pedro

APROVAÇAO Nº 1852
Cep: 69040-000
Registro CEP Nº 0626-07
Manaus – Amazonas - Brasil

CAAE – 0009.0.114.000-07 Processo Nº0626/2007-FMT-AM

Projeto de Pesquisa: Avaliação da concentração mínima de Anfotericina B,

Fluconazol, Intraconazol e Voriconazol necessária para inibição de linhagens de
Cryptococcus neofarmans causadoras de neurocriptococose..\

Pesquisador responsável: João Vicente Braga de Souza

Instituição Sediadora: Fundação de Medicina Tropical do Amazonas

Instituição Vinculada: Não se aplica

Área Temática Especial: Não se aplica

Ao se proceder à análise relativo do Projeto em questão, o Comitê de Ética em
Patrocinador: FAPEAM/PAIC
Pesquisa em Seres Humanos (CEP) da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
Registro
(FMT-AM),para armaz.ordinária
em sessão de mat. Biológico
do dia 24 humano:
de agosto Não se aplica
de 2007 e de acordo com as
atribuições definidas na Resolução CNS 196/96, manifesta-se pela aprovação do
projeto de pesquisa proposto, bem como o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido.

Situação do Protocolo: APROVADO

Manaus, 24 de agosto de 2007.

Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira

Coordenador de Ética em Pesquisa

FMT-AM

Obs: Cabe ao pesquisador elaborar e apresentar ao CEP, os relatórios parciais e final sobre a pesquisa
(Resolução do Conselho Nacional de Saúde nº196, de 10.10.1996, inciso IX.2, letra “c”) conforme o
Formulário de acompanhamento dos Projetos aprovados no CEP, disponível em nossa home Page.
 32

7.2 Artigo Publicado

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 36

7.3 Normas para publicação na Revista Ibero Americana de

Micologia
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