UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONA E

MUCURI- CAMPUS DO MUCURI

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
BIOCIÊNCIAS APLICADA À SAÚDE

TOXICOLOGIA REPRODUTIVA DE CAMUNDONGOS MACHOS DA

LINHAGEM C57BL/6J EXPOSTOS AO ÁCIDO TEREFTÁLICO IN ÚTERO
E DURANTE A LACTAÇÃO

Mestrando: Gustavo Nazareno Monteiro

Orientadora: Profa. Dra. Sarah Auharek
Coorientador: Prof. Dr. Douglas Monteiro

Dezembro de 2017 1
INTRODUÇÃO

2
 Introdução

Distúrbios no sistema reprodutor masculino mais relatados nas últimas cinco décadas:

✓ câncer testicular;

Anormalidades com
✓ criptorquidismo;
origem comum na vida
fetal
✓ hipospadias;

✓ baixa contagem de espermatozoides.

Desreguladores endócrinos:
Mudanças no estilo de vida e exposição ftalatos, metais pesados, agroquímicos
aos desreguladores endócrinos:
3
 Introdução

Total sperm count (x𝟏𝟎𝟔 )

Years
(Adaptado de LEVINE et al.,2017)
4
OBJETIVOS

5
 Objetivos

Avaliar a toxicidade no desenvolvimento embrio/fetal de machos expostos in

útero e durante a lactação ao ácido tereftálico, em diferentes janelas do
desenvolvimento, com destaque na função testicular.

6
 Objetivos

Objetivos específicos:

✓ determinar a biometria, índice gonadossomático, índex anogenital dos

animais jovens, distância anogenital (animais sexualmente maduros), e
tamanho do pênis dos animais expostos ao ácido tereftálico;

✓ investigar a correlação do diâmetro tubular com a formação do lume

tubular;

✓ calcular o número de células de Sertoli e Leydig por testículo.

7
REFERENCIAL TEÓRICO

8
 Referencial teórico

Ácido tereftálico
O ácido tereftálico (TPA) representa um dos três isômeros de
posição do ácido ftálico, usada como matéria prima para produção e
confecção de diversos produtos: resinas, fibras de poliéster para utilização
em tapetes e roupas, películas utilizadas na produção de fitas magnéticas e,
aditivo para ração de aves

(BANG et al.,2011)
9
 Referencial teórico

Ftalatos
São compostos químicos que apresentam dois grupos éster ligados
a um anel benzeno e são utilizados como aditivos que proporcionam maior
maleabilidade aos plásticos.

10
(BANG et al.,2011)
 Referencial teórico

Estrutura testicular

Compartimentos:
- tubular
- intertubular

11
 Referencial teórico
Compartimentos tubular e intertubular

Espaço macrófago
Lume linfático

Epitélio seminífero

Vasos
sangüíneos
Túnica própria

Célula
de Leydig
Célula de Sertoli

12
Célula de Sertoli Referencial teórico

FUNÇÕES

• Suporte e nutrição de
células germinativas

• Secreção de fluido
para o lume testicular

• Fagocitose de fragmentos
citoplasmáticos de
espermátides

• Intermediação da ação
hormonal (T e FSH)

13
(RUSSELL; GRISWOLD, 1993)
 Referencial teórico

Interferferência do ftalato di(n-butil)ftalato (DBP) na função testicular

e19.5 e21.5 Pnd8 Pn25

SC number 𝟏𝟎𝟔

Control DBP Control DBP Control DBP Control DBP

(AUHAREK et al.,2010)

14
 Referencial teórico
Célula de Leydig

FUNÇÕES

Secreção de andrógenos, com

destaque na produção de
testosterona.

15
(REDINS et al, 2002) (Autor)
 Referencial teórico

Janela de “programação de masculinização”

16
(SHARPE et al., 2011)
 Referencial teórico

Desreguladores endócrinos

Desreguladores endócrinos (DEs) Naturais/sintéticos

Interferência no sistema endócrino

(GHISELLI; JARDIM, 2007) 17

 Referencial teórico

Espermatogênese

Espermatogênese

3-Diferenciação
3-Diferenciação ou
ou
Espermiogênica
Espermiogênica Espermátides

2-Meiótica
2-Meiótica ou
ou Espermatócitos
Espermatocitária
Espermatocitária

Célula ou
1-Proliferativa
1-Proliferativa de Sertoli
ou Espermatogônias
Espermatogonial
Espermatogonial
As Apr Aal A1
18
Materiais e métodos

19
 Materiais e métodos

Preparo das dispersões

- Controle : 0,5 % v/v carboximetilcelulose

- 𝑇𝑃𝐴1 : 0,0014 g/mL em 0,5 % v/v carboximetilcelulose 10 vezes

- 𝑇𝑃𝐴2 : 0,56 g/ml em 0,5 % v/v carboximetilcelulose 4000 vezes

A dose diária
estimada (1,4 mg/kg
de peso corpóreo)
em humanos que
não proporciona
risco de efeitos
deletérios (ACGIH,
1996 apud CUI et
al., 2004, p. 60)
(Autor)
20
 Materiais e métodos

1 /4 N ≥4

1 /4 N ≥4

1 /4 *
10 *
50 1 /4 *
animais *
40 *
*
*
*
*
*

* *

21
 Materiais e métodos
❖Camundongos C57BL/6J (n=50)

• Grupo I- in útero, no período fetal (DG 10.5-18.5), com eutanásia

aos 18.5 dias;
• Grupo II- in útero, no período fetal (DG 10.5-18.5), e no período
lactacional (PND-15), com eutanásia aos 15 dias
• Grupo III- in útero, no período fetal (DG 10.5-18.5) com eutanásia
aos 70 dias (idade de maturidade sexual);
• Grupo IV- in útero, no período fetal (DG 10.5-18.5), e no período
lactacional (PND-15), com eutanásia aos 70 dias.

22
 Materiais e métodos

Delineamento experimental
Legenda

Acasalamento
GRUPO I
Dia do plug (DG 0.5)

Início do tratamento
GRUPO II (DG 10.5)

Eutanásia (DG18.5)

Eutanásia (PND15)
GRUPO III
Nascimento (PND1)

GRUPO IV Período Lactacional

(PND1-PND15)

Eutanásia (PND70)

Período de tratamento

23
 Materiais e métodos
Plug/tampão vaginal

(Autor) 24
 Materiais e métodos

Coleta e processamento dos testículos

✓ 18.5 dias os testículos foram fixados por imersão

✓ 15.5 e 70.5 dias os testículos foram fixados por perfusão

Animais anestesiados + heparina (125 UI/kg)

Perfusão v.e.
Solução salina 0,9%
4-5 minutos

Glutaraldeído 5% em Testículos coletados

tampão fosfato 0,05 M e pesados
pH 7,3 ; 25 - 30 minutos

25
 Materiais e métodos
Coleta e processamento dos testículos

Armazenados a -200C para futuras análises

Coleta do testículos

Imersão no fixador
por cerca de 24 horas

Armazenados em
tampão a 40C
até o processamento
histológico (inclusão)

Desidratação dos fragmentos

em concentrações crescentes Inclusão metacrilato
de álcoois

Secções de 4m Corados com azul de Análise histológica

de espessura toluidina e quantitativa 26
 Material e métodos

Perfusão
dos animais
de 15 e 70
dias.

(Autor)
27
 Materiais e métodos

Animais de 18.5 dias

(Autor) 28
 Procedimento experimental

Animais de 18.5 dias

(Autor) 29
 Materiais e métodos
Análise histológica/quantitativa e estatística

30
RESULTADOS E DISCUSSÃO

31
 Resultados e discussão
Dados biométricos

32
 Resultados e discussão

• Index/distância anogenital

B D is t â n c ia a n o g e n it a l
A In d e x a n o g e n it a l

a C o n tro le
a

a II IV TPA 1
a

TPA 2
a a

b
a

a I III
a

a a

.0 .5 .0 .5 .0
0

10

15
0 0 1 1 2

33
 Resultados e discussão
Morfometria testicular
CONTROLE TPA1 TPA1

II

III
I

IV

34
 Resultados e discussão

Parâmetro Grupo I Grupo II Grupo III Grupo IV

Controle TPA 1 TPA 2 Controle TPA 1 TPA 2 Controle TPA 1 TPA 2 Controle TPA 1 TPA 2

Diâmetro Tubular 52,2 ± 0,8a 56,9 ± 3,0a 54,8 ± 1,4 a 87,6 ± 1,8 a 99,1 ± 0,4b 101,5 ± 1,9b 219,0 ± 0,7 a 208,0 ± 3,0 a 210 ± 5,2 a 200,6 ± 3,4 a 209,0 ± 3,5a 200,6 ± 6,4a

Proporção volumétrica (%)

Túbulos seminíferos 79,7 ± 0,8 a 81,2 ± 1,1 a 83,1 ± 0,6 a 88,6 ± 0,6a 94,4 ± 1,4b 94,0 ± 0,3b 94,3 ± 0,7 a 93,9 ± 0,35 a 93,4 ± 0,7 a 94,5 ± 0,4 a 94,4 ± 0,1 a 94,4 ± 0,1a

Túnica Própria 5,9 ± 0,1 a 5,8 ± 0,5 a 5,5 ± 0,3 a 4,0 ± 0,2 a 3,2 ± 0,10a 3,3 ± 0,2a 2,7 ± 0,2 a 2,4 ± 0,1 a 93,9 ± 0,4 a 2,4 ± 0,20a 2,7 ± 0,1a 2,7 ± 0,1a

Epitélio Seminífero 73,4 ± 0,7 a 75,4 ± 1,4 a 77,6, ± 1,0 a 79,2 ± 0,8 a 86,2 ± 0,8b 83,8 ± 0,3b 87,4 ± 0,7 a 88,4 ± 0,6 a 87,1, ± 0,1 a 88,3± 0,5a 89,0 ± 0,2a 88,0 ± 0,2a

Lume 0 0 0 5,8 ± 0,2 a 6,2 ± 0,1ab 6,9 ± 0,2b 4,2 ± 0,5 a 2,8 ± 0,6 a 3,9 ± 0,2 a 3,6 ± 0,3a 4,0 ± 0,1a 3,7 ± 0,1a

Compartimento 20,4 ± 0,8 a 18,7 ± 1,1 a 16,1 ± 0,7 a 11,4 ± 0,6a 4,3 ± 0,3b 6,0 ± 0,3b 5,7 ± 0,7 a 6,1 ± 0,1 a 6,6 ± 0,3 a 5,5 ± 0,4a 5,7 ± 0,1a 5,6 ± 0,1a

Intertubular

Células de Leydig 7,8 ± 0,3 a 8,2 ± 0,7 a 5,9 ± 0,3 a 4,9 ± 0,3a 3,2 ± 0,1b 3,4 ± 0,3b 4,6 ± 0,5 a 4,9 ± 0,3 a 5,0 ± 0,8 a 4,0 ± 0,2a 4,5 ± 0,3a 4,5 ± 0,1a

Vasos sanguíneos 4,1 ± 0,2 a 5,7 ± 0,3 b 5,5 ± 0,2 c 2,0 ± 0,2a 0,5 ± 0,1a 1,6 ± 0,7a 0,4 ± 0,1 a 0,5 ± 0,0 a 0,1 ± 0,8 a 0,5 ± 0,04a 0,4 ± 0,1a 0,4 ± 0,0a

Espaço linfático 1,6 ± 0,2 a 2,2 ± 0,1 a 2,7 ± 0,2 b 2,8 ± 0,1a 0,4 ± 0,1b 1,0 ± 0,1c 0,8 ± 0,1 a 0,3 ± 0,10 a 0,4 ± 0,6 a 0,6 ± 0,1a 0,3 ± 0,1a 0,3 ± 0,1a

Tecido conjuntivo 6,9 ± 0,6 a 2,6 ± 0,2 b 2,8 ± 0,1 b 1,7 ± 0,3ª 0,6 ± 0,1b 0,7 ± 0,1b 0,2 ± 0,1 a 0,4 ± 0,1 a 0,5 ± 0,1 a 0,3 ± 0,02ª 0,4 ± 0,0a 0,4 ± 0,06a

35
 Resultados e discussão

Célula de Leydig

B
V o lu m e c it o p lá s m a t ic o L e y d ig
V o lu m e n u c l e a r d e L e y d i g
1000
300
a
a a a
a 800 a
a a a a
a a a a a
a a
200 600 a
a

3
b a

m
3
m

b b
400
b
100
200

0 N
Núúm
mee rr o
o d
de cé
e c é lu
l u la
la s
s d
dee L
Leey
ydd ig
ig
0
610 06 N ú m e r o d e c é lu la s d e L e y d ig
6 10 06 C o n tr o le
G ru p o I Gar u p o I I G r u p o III G ru p o IV
6 10 06 a
C o n tro le
G ru p o I G ru p o II G r u p o III G ru p o IV a TP Atr1 o le
a a a C on
a a TPA 1
410 06 a
a
a
a TP
T PA
A 12
C a
410 06 a a
a TPA 2
V o lu m e c e lu la r d e L e y d ig N ú4 m1 0e r o d e c é lu la s d e L eay d ig
06
a TPA 2
1500 6 210 06

a
210 06
1250 210 06

a
a a a
a 0 a
1000 a a a 4 a
a a
6

G r u p o I II G ru p o IV
a 00
3

x 10

a
m

750 a a
b GGrruuppoo III
III G
G rruupp oo IIV
V
a
500 b 2

a
a
250
a b b
0
0
36
G ru p o I G ru p o II G ru p o III G ru p o IV G ru p o I G ru p o II G r u p o III G ru p o IV
 Resultados e discussão

Volume nuclear e número de células de Sertoli

B
A V o lu m e n u c le a r d e S e r t o l i C é lu la s d e S e r t o li

800 6
a a
a a a
a a
a a a
600 a a
4
3

6
m

10
400
a a
a a a a
a a a 2
200

a a
N ú m e r o d e c é lu la s d e L e y d ig 0
b
N ú m e ro d e c é lu la s d e L e y d ig
0

610 06
I II III IV I II III IV
6é 1lu
06
0 la s d e L e ay d ig C o n tr o le

a a a
C o n tro le TPA 1
a
410 06 a
a C
a o n tro le T Pa A 1 TPA 2
a
4 10 06 a
TPA 1 a TPA 2
a
210 06
a 37
a TPA 2
Considerações finais

38
 Considerações finais

• Os resultados encontrados mostraram que o ácido tereftálico

na concentração de 0,56 g/ml reduziu (p<0,05) peso
corporal, peso testicular, IGS e tamanho do pênis, referente
aos animais eutanasiados aos 18.5 dias. Para esse mesmo
grupo de desenvolvimento, o TPA2 reduziu o index
anogenital, que em conjunto com o comprimento do pênis,
são excelentes sinalizados da ação/exposição de
andrógenos no período gestacional. Ainda pode-se perceber
alterações (p<0,05) em elementos testiculares como
vasos/capilares sanguíneos, vasos linfáticos e tecido
conjuntivo, demonstrado na proporção volumétrica.

39
 Considerações finais

• Em conjunto com todas as alterações demonstradas pelo

TPA2, essa dispersão influenciou os números de células de
Leydig e Sertoli nos camundongos fetais. Entretanto, pôde-
se perceber uma recuperação compensatória demonstrada
pelos animais sexualmente maduros, eutanasiados aos 70
dias. No nosso entendimento o ácido tereftálico, assim como
alguns ftalatos, atuam em janelas específicas do
desenvolvimento, como foi mostrado no presente trabalho.

40
 Considerações finais

Em síntese, a investigação do TPA administrado em

camundongos C57BL/6J, demonstrou alterações sobre o
desenvolvimento fetal e pós natal do testículo. A recuperação
compensatória das alterações testiculares nos animais
sexualmente maduros demonstram que o TPA não atua como
desregulador endócrino.

41
Muito obrigado

42