Protocolos Microbiologia 2010 PDF

MANUAL DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA
Ana Mendes Ferreira, António Inês, Maria José Saavedra, Arlete Mendes Faia
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
2009
Manual de aulas práticas de Microbiologia
1 - NORMAS A ATENDER NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
As aulas práticas visam ensinar aos alunos as metodologias utilizadas num laboratório de
Microbiologia. Nessas aulas serão utilizados vários grupos de microrganismos, bactérias e fungos,
alguns dos quais poderão ser patogénicos pelo que os alunos devem seguir um conjunto de regras
de modo a evitar qualquer tipo de contaminações.
1 - A roupa deve ser sempre protegida por uma bata ;
2- Não fumar nem comer no laboratório. Não levar à boca qualquer objecto nomeadamente lápis,
canetas, etc. Não humedecer etiquetas com a boca;
3 - Manter a superfície da bancada livre de todo o material que não for utilizar durante a
experiência;
4 - Antes de iniciar qualquer trabalho bem como ao terminá-lo lavar e desinfectar as mãos;
5 - Desinfectar a superfície da bancada que irá utilizar com álcool a 70%, antes e após a execução
do trabalho;
6 - Evitar que objectos ou produtos inflamáveis fiquem próximos da chama;
7 - Todo o material usado (pipetas, lâminas, lamelas, etc...) deve ser colocado dentro do
recipiente com desinfectante colocado na bancada para o efeito. As placas de Petri serão
colocadas dentro do balde para posterior inactivação;
8 - O estudante com cabelos longos deve apanhá-los, sobretudo quando o trabalho exige a
utilização do bico de Bunsen, de forma a não os queimar.
9 - Comunicar imediatamente ao professor caso entorne alguma cultura ou efectue aspirações

indevidas ;
10 - Comunicar imediatamente qualquer acidente do género corte, queimadura, etc.
11 - Nunca esquecer de flamejar as ansas antes de as guardar no suporte.
12- Antes de utilizar qualquer aparelho deve ler as normas de utilização;
13 - O microscópio deve ser manuseado com cuidado :

a) Guardar a capa debaixo da bancada e voltar a colocá-la no final;
b) As lâminas já observadas devem ser colocadas dentro do recipiente que está em cima da
bancada para o efeito;
c) Só deverá remover a lâmina da platina, depois deslocação da objectiva;
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d) Nunca deixar a lente de imersão suja de óleo, limpando-a com o lenço de papel seco,
depois com o lenço embebido em xilol e novamente com o lenço seco.
14 - Não misturar material conspurcado com o material esterilizado.
15 - Durante os trabalhos práticos evitar falar e deslocar-se desnecessariamente.
16 - Etiquetar cuidadosamente as culturas antes de as colocar na estufa.
2- MATERIAL UTILIZADO NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
Microscópio- amplifica e ilumina objectos tal como bactérias e outros microrganismos que de outro
modo seriam invisíveis;
Autoclave - equipamento destinado à esterilização de materiais e meios de cultura utilizados em

Microbiologia, por vapor de água sob pressão;
Estufas- equipamento para esterilizar material de vidro (forno de Pasteur), com temperaturas
máximas até 180-200°C; para incubações, 5°C acima da temperatura ambiente, com temperaturas
máximas de 70-100°C;
Incubadora- equipamento de temperatura controlada (0 a 50°C) para cultivo de microrganismos;
Jarra de anaerobiose- câmara que permite remover o oxigénio do ar, substituindo-o por outro gás,
para crescimento de microrganismos anaeróbios;
Caixas de Petri- caixas de vidro com tampa rasa, onde se colocam os meios de cultura sólidos
(Placa de Petri) para o crescimento dos microrganismos;
Tubos de cultura- tubos de vidro para o cultivo dos microrganismos em meios líquidos e sólidos;
Tubos Durham- tubos de vidro de dimensões reduzidas utilizados para o aprisionamento do gás
produzido pelos microrganismos, em meios líquidos;
Pipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, etc. Devem ter um tampão de
algodão na extremidade superior;
Micropipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, quando se pretendem

volumes muito reduzidos;
Lâminas e lamelas- para observações ao microscópio;
Câmaras de contagem- lâminas de vidro padronizadas e desenhadas para permitirem a contagem

de microrganismos totais numa suspensão;

Ansas e agulhas – instrumento com um fio de platina, enrolado ou recto, esterilizável à chama
antes e após utilização, usado para transferir culturas de microrganismos;
Para além deste material, há outro tipo de equipamento que é necessário ter num laboratório de
Microbiologia nomeadamente – frigorífico, balança, aparelho de destilação e desionização de água,
banho-maria, centrífuga, agitadores magnéticos, filtros de esterilização.
3- LIMPEZA E PREPARAÇÃO DE MATERIAL
Num laboratório de Microbiologia devem ser mantidas condições de higiene apropriadas na medida
em que se trabalha com uma grande variedade de microrganismos, alguns dos quais poderão ser
patogénicos.
O chão deve ser lavado e desinfectado diariamente;
As bancadas e todas as superfícies devem ser convenientemente desinfectadas com álcool a 70%;
As placas de Petri com culturas devem ser previamente esterilizadas (121°C durante 20-25 min.)
para inactivação das culturas. Após a esterilização o meio de cultura é escorrido e as caixas são
lavadas com água e detergente e posteriormente mantidas algumas horas nesta solução. Depois
são escorridas, passadas por água da torneira, e no fim por água destilada. As caixas são
embrulhadas em papel e esterilizadas a 180°C durante 2 horas num forno de Pasteur;
Os tubos com culturas são submetidos ao procedimento descrito anteriormente. São esterilizados
a 180°C durante 2 horas num forno de Pasteur. Quando contêm meios de cultura são esterilizados
em autoclave a 121°C durante 15 min.
As pipetas são lavadas com água corrente e posteriormente mantidas algumas horas numa
solução com detergente. Depois são escorridas, passadas por água da torneira, e no fim por água
destilada. Depois de secas, coloca-se um tampão de algodão na parte superior. São colocadas em
caixas apropriadas ou embrulhadas em papel antes da esterilização a 180°C durante 2 horas num
forno de Pasteur;
As lâminas e lamelas utilizadas nas observações ao microscópio são colocadas numa solução com
detergente. Depois de lavadas devem ser colocadas numa mistura cromo-sulfúrica durante a noite
e posteriormente lavadas.
Notas importantes:
Flamejar as ansas antes e depois do contacto com as culturas. Deixar arrefecer a ansa antes de
tocar na colónia da cultura;

Flamejar as aberturas dos tubos de ensaio, após a abertura e antes da colocação da tampa.
Manter a tampa na mão por pressão do dedo mínimo;
A abertura da tampa da placa de Petri deve ser cuidadosa, devendo ser manuseada junto à
chama.
4 - PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

O crescimento microbiano está dependente da presença de água e de nutrientes indispensáveis à
biossíntese de material celular e à obtenção de energia. As exigências nutritivas e as condições
ambientais que asseguram o crescimento são dependentes do tipo de microrganismo. No cultivo
de microrganismos são utilizadas soluções de substâncias que funcionam como nutrientes
necessários ao seu crescimento e multiplicação celular. Estas soluções designadas por meios de
cultura têm uma composição variável com as exigências nutricionais de cada espécie. Os meios de
cultura podem ser líquidos (caldo), semi-sólidos ou sólidos (1,5 a 2% de agar). O agar é um
agente gelificante, de baixo valor nutritivo, extraído de algas marinhas, que se liquefaz a 100°C e
solidifica a 40°C. Quanto à composição química, são designados por meios sintéticos – quando
quimicamente definidos; e complexos - com composição química desconhecida (com extracto de
levedura, extracto de carne, extracto de malte, peptona, ou triptona, por exemplo). Quanto à
função, os meios de cultura podem ser: meios de enriquecimento – formulados para permitirem o
crescimento de microrganismos mais exigentes; meios selectivos – formulados para o crescimento
de uns em detrimento de outros; e meios diferenciais – formulados para distinguir microrganismos
que possuam determinada característica bioquímica.
Material necessário: Erlenmeyer; Balança; Água destilada; Peptona; extracto de carne; Tubos
de ensaio
Preparação de agar nutritivo (Como exemplo)

1- Pesar individualmente 5 g de peptona e 3 g de extracto de carne (usar espátulas bem limpas e
limpar entre pesagens). Não voltar a introduzir o excesso no frasco.
2- Adicionar os ingredientes a 500 ml de água destilada colocada num Erlenmeyer de 2000 ml.
3- Homogeneizar cada um deles em separado e agitar a mistura até que se verifique a dissolução
completa dos ingredientes.
4- Adicionar 15 a 20 g de agar aos outros componentes e homogeneizar.
5- Adicionar água destilada de modo a perfazer o volume de 1000 ml.
6- Acertar a pH 7.0 com hidróxido de sódio ou ácido clorídrico 1N, a uma temperatura de 60 °C.
Lavar rapidamente os eléctrodos do potenciómetro.

7- Repartir o meio por 3 balões de 500 ml, previamente esterilizados. Rolhar e esterilizar em
autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
Composição do agar nutritivo:

• Extracto de carne ................................ 3g
• Peptona .............................................. 5g
• Agar ................................................... 15 g
• H2O destilada ................................... 1000 ml
Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos
Notas importantes:
A adição do agar aos meios deve ser sempre feita no final, depois de todos os ingredientes
estarem dissolvidos;
O meio de cultura deve ser esterilizado logo após a sua preparação;
Os fracos não devem conter mais de metade do seu volume;
Os frascos não devem ter as rolhas completamente apertadas durante a esterilização;
5 - TÉCNICAS UTILIZADAS NA CULTURA DE MICRORGANISMOS

O estudo de microrganismos no laboratório envolve o seu crescimento e manutenção em meios de
cultura. Há um conjunto de técnicas básicas de repicagens e sementeiras de modo a preservar o
organismo. Para isso é necessário obter em primeiro lugar uma cultura pura do isolado (colónia
obtida a partir de uma única célula). A principal fonte de contaminação externa é a atmosfera por
isso a manipulação dos organismos terá que ser efectuada em condições de assepsia.
Material necessário
-Culturas de microrganismos
-Placas de Petri com agar nutritivo
-Tubos com caldo nutritivo
-Tubos com agar nutritivo inclinado
-Tubos com agar nutritivo
-Ansas e agulhas
-Pipetas
-Estufa
Procedimento
1- Isolamento de colónias em meio sólido

Por espalhamento- Retirar 0,1 ml de uma cultura líquida para a superfície da placa de Petri.
Espalhar uniformemente com auxílio de um semeador (vareta de vidro dobrada) ou com pérolas
de vidro esterilizadas de modo a que as células fiquem afastadas umas das outras e se obtenham
colónias individualizadas. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas
à temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.
Sementeira por esgotamento (streak plate) – isolamento e obtenção de cultura pura -

Com auxílio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida, retire uma porção de
colónia que pretende isolar e espalhe à superfície da placa de Petri de modo a que as células
fiquem afastadas umas das outras e se obtenham colónias individualizadas. Identificar a placa com
o nome do operador e a data. Incubar as placas à temperatura apropriada para o microrganismo
em estudo.
2- Repicagem de colónias
Para agar inclinado- Com auxílio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida,
retire uma porção de colónia que pretende guardar e ou fazer crescer e espalhe à superfície do
agar inclinado. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos à
temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.
Para agar em tubo- Com auxílio de uma agulha previamente aquecida ao rubro e arrefecida,
retire uma porção de colónia que pretende guardar e/ou fazer crescer e introduza por picada
dentro do agar. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos à
temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.

Figura 1- Sementeira à superfície da gelose inclinada

Nota:
Após a obtenção de uma cultura pura de um isolado, a cultura deve ser mantida em laboratório de modo a que as células
permaneçam viáveis e sem contaminações. Podem ser refrigeradas a 4°C ou congeladas (-18°C) por períodos curtos ou por
períodos mais longos a -70°C ou liofilizadas.

Trabalho prático 1
Diversidade e ubiquidade dos microrganismos
Os microrganismos existem no ar, na água e principalmente no solo. Do solo podem ser
arrastados pelo vento através das partículas de poeira. Desenvolvem-se logo que as condições
ambientais (nutrientes, humidade e temperatura) sejam favoráveis ao seu crescimento. Cada
organismo aparece pelo menos num habitat natural específico no qual pode ser normalmente
encontrado, pode crescer e do qual pode ser isolado.
Objectivos:
Comprovar a diversidade e a ubiquidade dos microrganismos
-Placas de Petri com meio de agar nutritivo
-Pipetas
-Estufa
-Zaragatoas
Procedimento
1- Pesquisa de microrganismos do ar
Retirar a tampa de várias placas de Petri com agar nutritivo e manter abertas durante 5, 10 e 15
minutos. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3
dias.
2- Pesquisa de microrganismos das superfícies da sala de aulas

Passar um cotonete estéril sobre uma superfície da bancada antes e após a sua desinfecção com
álcool a 70%. Passar o cotonete (zaragatoa) sobre a superfície do meio de cultura. Identificar a
placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias.
3- Pesquisa de microrganismos de outros ambientes

Passar um cotonete estéril entre os dedos, antes e após a lavagem das mãos. Passar o cotonete
sobre a superfície do meio de cultura. Identificar a placa com o nome do operador e a data.
Incubar as placas a 37°C durante 3 dias.
4- Pesquisa de microrganismos do solo

Pipetar 100ul da solução de solo e colocar numa placa de Petri com o meio de cultura. Espalhar a
solução à superfície do meio com a ajuda de um semeador.

Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias.
Resultados:
-Examinar as placas e contar o número de colónias totais e o número de colónias diferentes em
cada placa;
-Descrever o tipo de colónias com base na descrição apresentada na Fig.1.
-Registar os resultados.
Quadro – Caracterização das colónias observadas

Características das colónias
Dimensão Cor Forma Elevação Margem Representação
(mm)
Escolher 2 ou 3 colónias que considere mais interessantes. Colocar uma alíquota de líquido ou uma
porção de colónia (homogeneizar) numa lâmina e cobrir com uma lamela. Observar ao
microscópio. Desenhe cada uma das suas observações no Quadro:
Observação das células retiradas da Observação das células retiradas da Observação das células retiradas da
colónia 1 colónia 2 Colónia 3


FORMA
Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Pevide
ELEVAÇÃO
Plana Elevada Convexa Em abóbada Mamilonada
MARGEM
Inteira Ondulada Lobada Irregularmente Filamentosa Frisada

crenada
Figura 2- Descrição de vários tipos de colónias

Trabalho prático 2
Morfologia bacteriana e métodos de coloração
As bactérias são organismos unicelulares que podem apresentar formas esféricas (cocos),
cilíndricas (bacilos) e espirais (espirilos e espiroquetas). Reproduzem-se por cisão binária. Após o
alongamento da célula, forma-se um septo que vai gradualmente progredindo até à formação de
duas células. Estas podem separar-se ou não umas das outras. Com base no número e no plano
de divisão celular, as células podem apresentar-se sob as seguintes formas: Diplococcos (cocos
aos pares); Streptococcus (cocos em cadeia); Staphylococcus (cocos em cacho); tétradas
(agrupamentos de quatro cocos); sarcinas (agrupamentos de oito cocos em cubo). Os bacilos
também podem aparecer isolados, aos pares e em cadeia. O tamanho das células é variável. O
exame das bactérias pode ser feito directamente da suspensão, através de preparações a fresco
em gota pendente. As preparações coradas permitem observar características morfológicas e
evidenciar diferenças entre espécies (Bactérias Gram positivo e Gram negativo).
Figura 3- Morfologia: Tamanho, forma e arranjos bacterianos
Objectivos:
Observar células vivas e mobilidade, distinguir microrganismos por coloração do meio envolvente e
distinguir microrganismos Gram positivo e Gram negativo.

-Microscópio
-Ansas
-Lâminas e lamelas
-Azul de metileno
-Tinta da China
-Reagentes para a coloração de Gram
Procedimento
Retirar as lâminas limpas do contentor que se encontra em cima da bancada. Limpar com papel
absorvente. Manipular tocando apenas nos bordos das lâminas. Identificar a lâmina numa
extremidade.
Observação a fresco- Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar
com água) numa lâmina e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio.
Observação de mobilidade (preparação de gota pendente) - Colocar uma alíquota de

líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar com água) numa lamela. Colocar nos cantos da
lamela um bocado de vaselina. Cobrir com uma lâmina de modo a que a gota fique no centro da
zona escavada. Observar ao microscópio.
Coloração simples- Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar
com água) numa lâmina, adicionar uma gota de azul-de-metileno e cobrir com uma lamela.
Observar ao microscópio.
Preparação dos esfregaços
-Marcar na parte inferior da lâmina uma pequena área onde se irá fazer a preparação;
-Colocar uma gota de água na secção delimitada;
-Esterilizar a ansa, colocando-a verticalmente à chama de um bico de Bunsen até ficar ao rubro.
Deixar arrefecer;
-Retirar com a ansa uma porção da colónia e misturar com a água colocada na lâmina;
- Deixar secar ao ar;
-Fixar passando a face inferior da lâmina 3 vezes através da chama. Deixar arrefecer;
-Corar pelo método escolhido;

Coloração simples com fixação- Após fixar, deixar arrefecer e adicionar uma das soluções
apresentadas de seguida, deixando actuar durante o tempo referido para cada uma delas.
-Cristal de violeta (1 minuto)
-Azul de metileno de Loeffler (5 minutos)
-Fucsina (30 segundos).
-Lavar cuidadosamente e deixar secar ao ar
Coloração negativa- Após fixar, espalhar muito bem uma gota de nigrosina (10%) sobre a
preparação. Deixar secar o corante e observar com a lente de imersão. Esta coloração poderá ser
usada na observação de cápsulas. Neste caso a preparação é previamente corada com fucsina,
lavada e seca antes de se adicionar a nigrosina.
Coloração diferencial de Gram

Colocar a lâmina com o esfregaço fixado sobre 2 varetas na tina de lavagem,
Colocar algumas gotas de cristal de violeta. Deixar actuar durante 1 minuto; Retirar o excesso do
corante e passar por água;
Colocar algumas gotas de Lugol (mordente que aumenta a reacção entre o cristal de violeta e as
células). Deixar actuar durante 1 minuto;
Passar por água e secar com papel de filtro;
Descorar com álcool a 95% durante 10 a 20 segundos;Passar por água e secar;
Cobrir com safranina. Deixar actuar durante 30 segundos. Lavar com água e secar com papel
absorvente;
Examinar ao microscópio com a objectiva de imersão.
Coloração de esporos
Colocar a lâmina com o esfregaço fixado sobre 2 varetas sobre o contentor com água em ebulição;
Cobrir o esfregaço com um quadrado de papel de filtro;
Colocar algumas gotas de verde malaquite (solução aquosa a 5%). Deixar actuar durante 5
minutos; Passar por água;
Cobrir com safranina. Deixar actuar durante 30 segundos. Lavar com água e secar com papel
absorvente;
Examinar ao microscópio com a objectiva de imersão.

Trabalho prático 3
Morfologia e estrutura dos fungos
Os fungos são organismos não-fotossintéticos que podem apresentar uma forma filamentosa
(fungos filamentosos) ou unicelular (leveduras). Alguns fungos podem ser dimórficos,
apresentando uma estrutura micelial ou unicelular dependendo das condições do meio.
Objectivos:
Observação das estruturas de vários fungos – hifas, micélio, células e estruturas de reprodução.
1- Fungos filamentosos
Os fungos são constituídos por uma massa de filamentos muito finos (micélio). Cada filamento
(hifa) assemelha-se a um longo tubo cilíndrico em que as células se distinguem umas das outras
devido à existência de septos (hifa septada) ou sem separação das células (hifas cenocíticas). Os
fungos são constituídos por hifas vegetativas designadas por talo. Estas hifas penetram no
substrato, tendo algumas funções semelhantes às raízes das plantas (rizoides). Reproduzem-se
por esporos que podem ser formados sexuada ou assexuadamente. As hifas fertéis exibem
normalmente as estruturas de reprodução que permitem classificar e identificar os fungos.
Figura 4- Morfologia e estrutura de alguns fungos filamentosos

-Culturas de fungos
-Microscópio
-Ansas
-Lâminas e lamelas
-Lupa
Procedimento
Comparar macroscopicamente as colónias de diversas culturas de fungos que lhe são fornecidos;
Para o exame microscópico a fresco colocar uma gota de água sobre a lâmina, adicionar uma
porção de colónia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio.
Preparar lâminas com e sem adição de lactofenol.
Resultados
Descrever as características das colónias observadas,
Descrever as estruturas reprodutivas dos vários fungos (fazer um desenho), hifas, etc.
2- Leveduras
As leveduras são fungos unicelulares que se reproduzem assexuadamente por gemulação ou cisão.
Por vezes, as gémulas não se separam da célula mãe formando longas cadeias de células que se
designa por pseudomicélio. Outras, quando cultivadas em determinadas condições formam
verdadeiro micélio (dimorfismo). A morfologia das leveduras é bastante variada. Apresentam
células esféricas, ovais elípticas, cilíndricas, em forma de limão, triangular e até em forma de
garrafa.
-Culturas de leveduras;
-Microscópio;
-ansas;
-Lâminas e lamelas;
Procedimento
Examinar macroscopicamente as colónias de diversas leveduras;
Para o exame microscópico a fresco colocar uma gota de água sobre a lâmina, adicionar uma
porção de colónia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio.

MORFOLOGIA DAS LEVEDURAS

OVOIDE
Dekkera bruxellensis
ESFÉRICA
CILÍNDRICA
Saccharomyces cerevisiae Pichia membranaefaciens
GARRAFA
Pitysporum ovale
APICULADA
TRIANGULAR
Kloeckera apiculata
Trigonopsis variable
Figura 5- Morfologia das leveduras

Trabalho prático nº4

Titulação de uma suspensão de bacteriófagos líticos por contagem de placas fágicas
Os vírus são entidades biológicas acelulares constituídos apenas por um ácido nucleico (DNA ou
RNA) designado por nucleóide, envolvido por uma cápsula proteica, designada por cápside. O
conjunto da cápside e nucleóide designa-se por nucleocápside. Alguns, podem ainda ser revestidos
por um invólucro (envelope) constituído por proteínas e fosfolípidos, adquiridos da membrana da
célula hospedeira, aquando do processo de libertação das partículas virais.
Todos os vírus podem apresentar dois estados: extracelular ou intracelular. O estado extracelular,
designado por partícula viral ou virião, corresponde à forma inerte do vírus, sob a qual é
transmitido entre células hospedeiras. No estado intracelular ocorre a replicação do ácido nucleico
viral e a produção de novas partículas virais. Deste modo, os vírus são considerados parasitas
intracelulares obrigatórios uma vez que o processo de multiplicação viral é estritamente
dependente da maquinaria da célula hospedeira. Existe uma enorme especificidade entre os vírus
e as suas células hospedeiras compatíveis. Assim existem vírus que se replicam apenas no interior
de células animais, outros em células vegetais, outros em fungos, outros em algas e outros em
protozoários. Os bacteriófagos1, ou simplesmente fagos, são vírus que se replicam apenas no
interior de bactérias. A replicação dos fagos está ainda restrita a certas espécies/estirpes
bacterianas. O ciclo de multiplicação dos fagos envolve as seguintes fases: (1) adsorção a
receptores específicos da superfície; (2) injecção do genoma do fago para o interior da bactéria;
(3) replicação do genoma viral; (4) maturação em que após a formação de todos os
componentes virais e consequente montagem dá origem à formação de novos fagos; (5)
libertação dos novos fagos com ruptura da célula infectada. Este processo de multiplicação é
designado por ciclo lítico e os bacteriófagos são designados por fagos líticos. Por vezes o
genoma do fago não se replica mas integra-se no cromossoma bacteriano, sendo transmitido à
descendência bacteriana como parte integrante do seu genoma. Este processo é designado por
ciclo lisogénico e os bacteriófagos são designados por fagos temperados. As bactérias que
transportam no seu cromossoma um genoma viral (profago) são designadas por lisogénicas.
Em determinadas circunstâncias um profago pode ser activado, replicar-se e induzir o ciclo lítico
dando origem à libertação de novos fagos. Os vírus líticos provocam a lise da célula bacteriana
hospedeira aquando da sua libertação. Por isso podem ser detectados por diluição e espalhamento
em superfícies de agar inoculadas com células hospedeiras para a formação de placas fágicas.
Estas placas são zonas transparentes sobre uma camada de células hospedeiras, e representam o
ponto sobre o qual uma partícula viral infecciosa foi depositada. Como resultado de ciclos líticos
subsequentes, as células hospedeiras nessas zonas são destruídas. O tamanho das placas é
dependente dos tempos de replicação quer dos vírus quer das bactérias hospedeiras. A contagem
de placas fágicas é por isso análoga à contagem de colónias bacterianas em caixa de Petri, e deste
1
Os bacteriófagos (fago: do grego phagein: comer) “comedores de bactérias” foram descobertos por Frederick Twort e
Felix d’Herelle na 2ª década do sec. XX

modo, a contagem de placas fágicas pode ser usada para determinar o título, i.e. a concentração
de partículas fágicas, na suspensão inicial.
Objectivos:
Contagem de placas fágicas
Por grupo:
8 eppendorfs com 0.9 ml de meio LB
8 tubos com 5 ml de meio LBss (mantidos em banho a 50 ºC)
8 tubos vazios esterilizados
1 erlenmeyer com 100 ml de meio LBs (mantido em banho a 50 ºC)
8 caixas de Petri esterilizadas
1 micropipeta
1 caixa com pontas amarelas esterilizadas
1 tubo com a cultura de células hospedeiras (Escherichia coli 5911)
1 eppendorf com a suspensão do fago T72
Procedimento
No ínicio da aula, distribuir o meio de cultura LBs (sólido) pelas caixas de Petri formando uma
camada fina no fundo. Deixar solidificar.
Fundir o meio LBss (semi-sólido) e manter os tubos em banho a 50 ºC. (Consulte o fluxograma em
anexo como um auxiliar durante o procedimento experimental)
1. Preparar diluições seriadas (10-1 até 10-8) da suspensão fágica, adicionando (0.1 ml) da
suspensão inicial ao meio líquido estéril LB (0.9 ml/eppendorf).
2. Identificar os tubos vazios esterilizados com as diluições realizadas. Retirar 0.1 ml de cada
diluição e colocar nos respectivos tubos.
3. Adicionar 0.1 ml da cultura bacteriana hospedeira (DO600nm≈1.0) a cada um dos tubos
anteriores.
4. Identificar as caixas de petri previamente preparadas com as diluições efectuadas (10-1 até 10-
8
).
5. Adicionar a cada um dos tubos (ponto 3.) 5 ml do meio LBss contido nos tubos mantidos em
banho a 50 ºC. Misturar os conteúdos dos tubos por agitação suave (evitar a formação de bolhas)
e em seguida derramar e espalhar uniformemente sobre a superfície da camada de LBs das caixas
2
O fago T7 é um dos vários colifagos que infecta estirpes de Escherichia coli. Possui uma molécula linear de DNA em
cadeia dupla. Apresenta cabeça, cauda curta, não contráctil e pertence à família Podoviridae (Para mais informações
consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/54010001.htm)

de petri correspondentes. (Nota: deve preparar 1 tubo de cada vez para evitar que o meio
solidifique).
6. Inocular 0.1 ml da cultura de células hospedeiras isoladamente como controlo.
7. Deixar que o agar solidifique e incubar as caixas a 37 ºC durante 24 horas.
Resultados
Observar as caixas e determinar o nº de placas fágicas (“plaque-forming units”-pfu), partículas
fágicas infecciosas, por ml da suspensão original. Apenas as caixas contendo 30-300 placas fágicas
devem ser consideradas.
pfu/0.1 ml = nº de placas fágicas x factor de diluição
Como apenas foram plaqueados 0.1 ml deve multiplicar-se por 10 para obter pfu/ml
pfu/1.0 ml = nº de placas fágicas x factor de diluição x 10
placa fágica
“camada” de E. coli

Procedimento experimental

Trabalho prático 5
Avaliação do crescimento microbiano
O perfil de crescimento de uma população microbiana pode ser avaliado através da determinação
periódica do número de indivíduos, da massa celular ou através da actividade celular. O processo
mais usual é o de contagem directa ao microscópio, utilizando câmaras de contagem que
permitem determinar o número total de células. Para distinguir células viáveis (com capacidade
para se multiplicar) de não viáveis é necessário cultivar as células num meio de cultura adequado
ao crescimento da espécie em causa. Para o efeito, um volume conhecido de uma suspensão
microbiana é espalhado uniformemente à superfície do meio de cultura (técnica de espalhamento)
ou misturado com o meio ainda liquefeito (método de incorporação). Após alguns dias à
temperatura adequada, as colónias são contadas (30 a 300) e os resultados são expressos em
unidades formadoras de colónias (ufc). O número de células viáveis pode ser também estimado
através de diluições sucessivas da suspensão em análise (3 a 5 tubos para cada diluição). Nas
diluições mais elevadas não haverá crescimento em todos os tubos. O cálculo do número mais
provável de microrganismos será efectuado com base no número de tubos positivos, recorrendo às
Tabelas de MacGrady.
A massa celular pode ser determinada directamente através do peso seco ou indirectamente por
turbidimetria.
Figura 6- Curva que representa o crescimento microbiano em sistema fechado, em batch (sistema
descontínuo)
Objectivos:
Comparação de métodos de avaliação do crescimento microbiano

1- Avaliação quantitativa de uma população microbiana - Contagem em câmara

-Microscópio
-Câmara de contagem
Procedimento
Colocar na câmara uma gota da suspensão de microrganismos;
Cobrir com a lamela;
Contar o número de células por quadrado (Na zona central estão gravadas duas grelhas que são
constituídas por um quadrado dividido em 400 pequenos quadrados, cada um com uma área de
1/400 mm2); Para que o valor seja mais preciso fazer contagens em diferentes quadrados e
determinar a média;
Resultados
1
O número de microrganismos/ml = Nx x1000 ;
profundidadexáreadoquadrado
N= valor médio de microrganismos por quadrado
Numa câmara em que a profundidade seja de 0,1 mm e a área do quadrado de 1/400 = 0.0025
mm2, o número de microrganismos/ml será igual ao valor médio por quadrado x 4 x 106.
Figura 7- Procedimento para avaliação quantitativa de uma população microbiana - Contagem de

células em câmara

2- Determinação do número de células viáveis - Contagem em placas
-Tubos de ensaio com 9 ml de água estéril (solução salina)
-Placas de Petri com meio apropriado à cultura
-Agitador de tubos
-Pipetas esterilizadas de 1 ml
Figura 8 - Determinação do número de células viáveis – contagem em placa
Procedimento
Pipetar 1 ml da suspensão da cultura para um tubo com 9 ml de água estéril (diluição de 1:10);
Homogeneizar muito bem num agitador;
Transferir 1ml do tubo da diluição 1 para um segundo tubo 2 com 9 ml de água estéril (diluição de
1:100);Homogeneizar muito bem num agitador
Fazer isto sucessivamente até obter a diluição desejada que permita contar as ufc;
Espalhar uniformemente em placas de Petri 0,1 ml de cada uma das diluições (Identificar cada
uma das placas com a diluição respectiva, data e nome do operador);
Incubar as placas a 30°C durante 3 dias;

Resultados
Escolher o número de placas que contenham 30 a 300 colónias e efectuar a contagem. Determinar
o valor médio de colónias por placa e multiplicar pelo factor de diluição. O resultado será expresso
em ufc/ml.
3- Avaliação do crescimento por turbidimetria

-Tubos de ensaio com água estéril (solução salina)
-Agitador de tubos
-Pipetas esterilizadas de 1 ml
-Espectrofotómetro
Procedimento
Ligar o espectrofotómetro e acertar o comprimento de onda a 640 nm;
Transferir para a cuvete caldo não inoculado e acertar a absorvância a zero;

Transferir as suspensões bacterianas para cuvetes do espectrofotómetro (pode ser necessário
diluir as amostras); Proceder à leitura da absorvância (DO).
Figura 8 – Avaliação do número de células por turbidimetria

Resultados
Relacionar os valores obtidos por contagem directa ao microscópio, por contagem em placa e por
turbidimetria, para a mesma suspensão de células.

Tabelas de MacGrady para determinação do NMP de microrganismos

- 3 tubos por diluição
Nº Nº Nº Nº Nº Nº Nº Nº
Caract. Microrg. Caract. Microrg. Caract. Microrg. Caract. Microrg.
000 0,0 120 1,1 221 3,0 311 7,5
001 0,3 121 1,5 222 3,5 312 11,5
010 0,3 130 1,6 223 4,0 313 16,0
011 0,6 200 0,9 230 3,0 320 9,5
020 0,6 201 1,4 231 3,5 321 15,0
100 0,4 202 2,0 232 4,0 322 20,0
101 0,7 210 1,5 300 2,5 323 30,0
102 1,1 211 2,0 301 4,0 330 25,0
110 0,7 212 3,0 302 6,5 331 45,0
111 1,1 220 2,0 310 4,5 332 110,0
333 140,0
- 5 tubos por diluição

Nº Nº Nº Nº Nº Nº Nº Nº
Caract. Microrg. Caract. Microrg. Caract. Microrg. Caract. Microrg.
000 0,0 203 1,2 400 1,3 513 8,5
001 0,2 210 0,7 401 1,7 520 5,0
002 0,4 211 0,9 402 2,0 521 7,0
010 0,2 212 1,2 403 2,5 522 9,5
011 0,4 220 0,9 410 1,7 523 12,0
012 0,6 221 1,2 411 2,0 524 15,0
020 0,4 222 1,4 412 2,5 525 17,5
021 0,6 230 1,2 420 2,0 530 8,0
030 0,6 231 1,4 421 2,5 531 11,0
100 0,2 240 1,4 422 3,0 532 14,0
101 0,4 300 0,8 430 2,5 533 17,5
102 0,6 301 1,1 431 3,0 534 20,0
103 0,8 302 1,4 432 4,0 535 25,0
110 0,4 310 1,1 440 3,5 540 13,0
111 0,6 311 1,4 441 4,0 541 17,0
112 0,8 312 1,7 450 4,0 542 25,0
120 0,6 313 2,0 451 5,0 543 30,0
121 0,8 320 1,4 500 2,5 544 35,0
122 1,0 321 1,7 501 3,0 545 45,0
130 0,8 322 2,0 502 4,0 550 25,0
131 1,0 330 1,7 503 6,0 551 35,0
140 1,1 331 2,0 504 7,5 552 60,0
200 0,5 340 2,0 510 3,5 553 90,0
201 0,7 341 2,5 511 4,5 554 160,0
202 0,9 350 2,5 512 6,0 555 180,0

Trabalho prático 6
Avaliação do efeito de alguns factores físicos no crescimento microbiano
O crescimento de um microrganismo é afectado pela disponibilidade de nutrientes e por um
conjunto de factores físicos como a temperatura, o pH, a pressão osmótica e o potencial de
oxidação/redução do meio. A temperatura é um dos factores que mais afecta o crescimento e a
sobrevivência dos microrganismos. Cada espécie, em condições experimentais bem definidas, é
caracterizada por três temperaturas cardeais – temperatura mínima, máxima e óptima de
crescimento. Estes valores permitem agrupar os microrganismos em psicrófilos, mesófilos e
termófilos e hipertermófilos. O comportamento dos microrganismos relativamente ao oxigénio
disponível é heterogéneo, existindo microrganismos aeróbios e anaeróbios estritos, aeróbios
facultativos, aerotolerantes e micro-aerofílicos.
Figura 9 – Classificação dos microrganismos com base na temperatura óptima
Objectivos:
Avaliar o efeito dos factores físicos (temperatura e pH) no crescimento microbiano.
-Placas com meio de cultura
-Tubos com meio de cultura com diferentes valores de pH – 3, 5, 7, 9

Procedimento
1- Efeito do pH
Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura a diferentes valores
de pH,
Comparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo.
2- Efeito da temperatura
Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura;
Incubar a 5, 25 e 55°C durante 3 a 7 dias;
Comparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo.
Resultados
Verificar os efeitos do pH e da temperatura no crescimento de cada um dos microrganismos.
Figura 10 – Classificação dos microrganismos com base nos valores de pH óptimo de crescimento

Trabalho prático 7
Controlo do crescimento e morte dos microrganismos por métodos físicos
A morte de microrganismos, isto é, a perda irreversível da viabilidade, é um aspecto fundamental
no controlo de microrganismos no laboratório e na Indústria, Farmacêutica e Alimentar. A
esterilização pode ser atingida por processos físicos e químicos. Entre os processos físicos pode
utilizar-se o calor, a filtração e as radiações.
Objectivos:
Avaliar o efeito letal de alguns agentes físicos - temperatura e radiações UV.
-Placas com meio de cultura
- Tubos com meio de cultura líquido
Procedimento
1- Efeito da temperatura
Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura;
Introduzir os tubos num banho-maria a 70 °C durante 5, 10 e 15 minutos;
Após o tempo referido, semear 0,1 ml de cada uma das culturas submetidas a temperaturas
diferentes para uma placa;
Observar o crescimento do microrganismo nas três condições.
2- Efeito das radiações UV

Semear 3 placas com o mesmo microrganismo;
Retirar as tampas e colocar as placas sobre uma lâmpada UV, protegida com cartolina;
Retirar uma placa ao fim de 10, 20 e 30 minutos;
Incubar as placas 30°C durante 3 dias;
Comparar o crescimento em cada placa.
Resultados
Verificar os efeitos da alta temperatura e do tempo no crescimento de cada um dos
microrganismos.
Verificar o efeito das radiações no crescimento de cada um dos microrganismos.

Trabalho prático 8
Actividade enzimática dos microrganismos
As enzimas são proteínas promotoras de reacções químicas específicas na célula. Estes
catalisadores permitem o transporte e utilização de nutrientes indispensáveis à síntese de material
celular e à obtenção de energia. A utilização de um determinado substracto pode ser característica
de uma dada espécie, permitindo a sua identificação. Algumas bactérias fermentam hidratos de
carbono simples, produzindo ácidos, álcoois e gás como produtos finais. Outros utilizam moléculas
mais complexas como a celulose e o amido. A capacidade de utilização de substratos específicos,
pela análise dos metabolitos finais produzidos ou pela pesquisa de determinada enzima, associada
à observação morfológica das células microbianas e às suas características culturais em meios de
cultura sólidos e/ou líquidos, são alguns indicadores utilizados em Microbiologia na identificação de
microrganismos.
Objectivos:
Avaliação de actividades enzimáticas em alguns microrganismos. Apresentação de alguns testes
bioquímicos usados na detecção e ou identificação de alguns microrganismos
1- Hidrólise de polímeros
Amilases
Proteases
2- Reacções de fermentação
Fermentação de açúcares
Produção de sulfetos
Reacções ImVic
3- Reacções respiratórias
Catalase
Citocromo oxidase
4- Outras reacções
Urease
1- Pesquisa de amilase
Alguns microrganismos hidrolizam moléculas orgânicas de elevado peso molecular, como por
exemplo o amido, utilizando os seus componentes (glucose e maltose) nos diversos processos
metabólicos. Ao juntar-se uma solução de iodo a um meio de cultura com amido forma-se um
complexo com cor azul se não tiver sido hidrolizado. Caso contrário, não há reacção com o iodo.

-Culturas de Escherichia coli e Bacillus subtilis
-Solução de iodo
-Placas de Petri com meio de agar de amido
Procedimento
Inverter uma placa de Petri e dividi-la em duas secções com um marcador.
Semear uma das secções com E. Coli e a outra com Bacillus subtilis;
Identificar as secções;
Incubar as placas a 37ºC durante 24 a 48 horas;
Resultados:
Após o aparecimento das colónias, colocar algumas gotas de solução de iodo e verificar o
aparecimento ou não da cor azul.
2- Fermentação de açúcares simples

Os principais critérios fisiológicos de identificação de microrganismos assentam na fermentação e
na assimilação de fontes de carbono. A fermentação de açúcares simples é avaliada em tubos com
meio de cultura líquido, aos quais se adiciona o açúcar a testar. Para verificar a produção de gás é
introduzido (antes da esterilização), um tubo Durham invertido. A produção de ácidos é
confirmada pela alteração da cor do indicador.
-Culturas de Escherichia coli e Proteus vulgaris;

-Tubos de Caldo com vermelho de fenol e glucose (Com tubos Durham);
-Tubos de Caldo com vermelho de fenol e lactose (Com tubos Durham);
-Tubos de Caldo com vermelho de fenol e sacarose (Com tubos Durham);
Procedimento
Inocular separadamente cada uma das culturas nos tubos com os diferentes meios;
Identificar cada um dos tubos com a espécie inoculada e com açúcar adicionado;
Incubar as placas a 37ºC durante 24 horas;

Resultados:
Tomar nota das reacções obtidas no quadro com base nos seguintes símbolos:
A- produção de ácido;
B- alcalinização do meio
G- produção de gás
N- sem modificação de cor do indicador
Espécie Modo de utilização dos açúcares

Glucose Lactose Sacarose
3- Reacções respiratórias
Pesquisa de Catalase
Este teste bioquímico é utilizado para comprovar a presença de catalase, enzima que destrói o
peróxido de hidrogénio, originando H2O e O2. A maioria dos seres vivos possui catalase.
-Lâminas;
-Culturas de Bacillus sp;
-Culturas de Lactobacillus sp.;
-Água oxigenada (3%);
Procedimento:
Colocar numa lâmina uma porção de cultura;
Adicionar uma gota de água oxigenada a 3%;
Resultados:
Verificar se há ou não desprendimento gasoso;
Tomar nota dos resultados obtidos em cada uma das espécies.
Pesquisa do Citocromo oxidase

A citocromo oxidase é uma enzima que transfere electrões para o O2 no final da cadeia de
transporte de electrões. A detecção desta enzima é particularmente útil para fazer a distinção
entre algumas espécies Gram negativo. Pseudomonas aeruginosa de Escherichia coli, por exemplo.

A presença de citocromo oxidase é detectada pela oxidação de um receptor artificial de electrões

(p-fenilenodiamina).
-Cultura microbiana a testar
-Papel de filtro
-Tetrametil-parafenildiamina.HCl (1% W/V em água).
Procedimento
Misturar a cultura em estudo com uma solução de tetrametil-parafenildiamina.HCl numa folha de
papel de filtro.
Resultados:
Verificar a alteração da cor. Este indicador é incolor na forma reduzida e adquire uma cor púrpura
na forma oxidada (resultado positivo)
4- Pesquisa de outras enzimas

Pesquisa de Urease
Alguns microrganismos utilizam a ureia como fonte de azoto. A sua hidrólise origina duas
moléculas de amónia e a libertação de uma molécula de CO2. A enzima é detectada pela
modificação da cor do indicador provocada pelo aumento de pH (vermelho de fenol, a pH 6,4 tem
cor amarela e a pH 8,2 tem cor violácea).
-Culturas de Proteus vulgaris e Escherichia coli;
-Tubos com Agar de ureia;
Procedimento
Inocular um tubo com ureia agar com Proteus vulgaris e outro com Escherichia coli ; Incubar a 37
˚C durante 24 horas.
Resultados:
Verificar a alteração da cor do meio e preencher o quadro:
Espécie Cor inicial do meio Cor final do meio Urease
Considera-se reacção positiva o aparecimento de uma cor rosa forte.

Trabalho prático 9
Avaliação da contaminação fecal de águas
A pesquisa periódica de microrganismos fecais numa rede de abastecimento de águas é essencial

para se verificar a pureza da água. Escherichia coli é um bom indicador da contaminação fecal – é
fácil de identificar, é hospedeiro habitual do intestino e não aparece normalmente na água.
Escherichia coli pertence ao grupo dos coliformes que se apresentam como bacilos não-
esporulados, Gram negativo, aneróbios facultativos que fermentam a lactose com produção de
gás.
Objectivos:
Pesquisa de coliformes em águas e determinação do NMP de coliformes
Pesquisa de Escherichia coli
Material necessário:
-Tubos com caldo de lactose
-Placas com Agar Endo

-Tubos com caldo MR-VP
-Tubos com água peptonada
-Tubos com Agar de Citrato-Simmons
-Filtros de 0,45
1- Pesquisa de Coliformes:
1.1 Teste presuntivo: pesquisa de fermentadores de lactose
Procedimento
Pipetar 1 ml da amostra de água para cada um dos tubos com caldo de lactose, com tubo Durham
invertido. Incubar a 35 ºC durante 24 a 48 horas.
Resultados:
Observação dos tubos ao fim de 24 a 48 horas. A presença de gás em pelo menos 1/4 do tubo
Durham é indicativa da presença de coliformes. Neste caso fazer a determinação do NMP de
coliformes por 100 ml de água com base nas tabelas de MacGrady.

1.2 Pesquisa de Escherichia coli (membrana filtrante)
Procedimento
Filtrar 100 ml da amostra de água para placas de Agar Endo; Incubar a 44 ºC durante 24 a 48
horas.
Resultados:
O aparecimento de colónias carmim é indicativo da presença de Escherichia coli. Deverão ser
efectuados os testes IMViC.
2- Teste de confirmação de fermentadores de lactose
Procedimento
Semear 0,1 ml dos tubos positivos para placas com Agar Endo;
Incubar a 35 ºC durante 24 horas;
Resultados:
O aparecimento de colónias carmim é indicativo da presença de coliformes não ficando
estabelecido contudo que seja Escherichia coli. Poderá ser Enterobacter aerogenes.
3- Testes IMViC
A distinção entre as duas espécies, Escherichia coli e Enterobacter aerogenes pode ser feita
efectuando um conjunto de testes designados por IMViC: o I de Indol, o M de Methyl-red, o V de
Voges-Proskauer e o C de Citrato.
Espécies Indol Methyl-red Voges-proskauer Citrato

Escherichia coli + + - -
E. aerogenes - - + +
3.1- Pesquisa da formação de indol a partir do triptofano

Num meio de cultura contendo triptofano, algumas bactérias com triptofanase produzem indol. O
indol é detectado pelo reagente de Kovacks. Este teste permite distinguir Escherichia coli, que tem
reacção positiva, de Enterobacter que tem reacção negativa.
Procedimento
Pipetar 0, 1 ml da amostra de água para um tubo com água peptonada;

Incubar a 30 ºC durante 48 horas;
Resultados:
A reacção é positiva quando aparece um anel vermelho à superfície resultante da reacção do p-di-
metil-aminobenzaldeído (reagente de Kovacs) com o indol; a reacção é negativa quando após a
adição do reagente o anel se mantém amarelo/alaranjado.
3.2- Formação de ácidos por fermentação da glucose

Num meio de cultura contendo glucose, as Enterobacteriaceae produzem ácidos a partir do
piruvato, ácido acético, fórmico, láctico e etanol (fermentação ácido-mista), o que vai provocar
uma acidificação do meio. A fermentação da glucose com produção de ácidos provoca a redução
de pH e a alteração da cor do indicador de vermelho de metilo (MR - Methyl red).
Procedimento
Pipetar 0,1 ml de amostra de água para um tubo com caldo MR-VP;
Incubar a 37ºC durante 5 dias.
Resultados:
Confirmar o crescimento no meio de cultura. Adicionar ao meio inoculado, algumas gotas de
vermelho de metilo. Se houver produção de ácidos, há um abaixamento de pH para valores
inferiores a 4,4. Quando se adiciona o indicador de pH (vermelho de metilo), a pH 4,4 fica
vermelho e a pH 6,2 amarelo.
3.3- Fermentação da glucose e produção de acetoína a partir do piruvato (Teste Voges

Proskauer)
No mesmo meio de cultura contendo glucose, algumas espécies de Enterobacteriaceae produzem
a partir do piruvato, para além dos ácidos referidos anteriormente, outros metabolitos como a
acetoína. Se existir acetoína no meio, a adição de α-naftol e hidróxido de potássio (10%), tornam
o meio avermelhado - teste Voges Proskauer (VP) positivo.
Procedimento
Pipetar 0,1 ml da amostra de água para um tubo com caldo MR-VP
Incubar a 37 ºC durante 5 dias.
Resultados:
Confirmar o crescimento no meio. Adicionar ao meio, α-naftol a 6% e hidróxido de potássio
(40%). Misturar bem. Se existir acetoína no meio, a adição de α-naftol e hidróxido de potássio,

tornam o meio avermelhado (reacção positiva). Se o meio de cultura mantiver a cor original a
reacção é negativa.
3.4- Utilização do citrato como fonte de carbono e energia

O meio de Citrato-Simmons contém citrato e azul de bromotimol como indicador de pH. Nas
Enterobacteriaeceae o desprendimento de CO2, reagindo com os catiôes Na+ existentes no meio,
vai provocar um aumento do pH visível pela modificação da cor do indicador.
Procedimento
Repicar a amostra para placa com Agar de Citrato-Simmons;
Incubar a 37 ºC durante 5 dias;
Resultados:
A utilização de citrato provoca uma alcalinização do meio que é detectada pela modificação da cor
do indicador (azul de bromotimol). Verificar se houve ou não modificação da cor do meio (verde
para azul).
Escherichia coli - reacção negativa; Enterobacter, Salmonella - reacção positiva
Notas:
A identificação de Enterobacteriaceae pode ser efectuada através de galerias API 20E que é uma versão miniaturizada dos
testes convencionais. Este sistema utiliza uma estrutura plástica com 20 compartimentos separados que consistem em
micro tubos contendo meios desidratados. A inoculação é efectuada por introdução da suspensão do organismo nos
microtubos com uma pipeta de Pasteur. Para se obter anaerobiose colocam-se algumas gotas de óleo mineral em cada um
dos tubos. Após 18 a 24 horas registam-se os resultados positivos, obtém-se um número com 7 a 9 dígitos a partir do qual,
através de um programa informático, se determina o nome do microrganismo em causa.

Trabalho prático 10
Avaliação da eficácia a antibacterianos: antibióticos
Os antibióticos são compostos químicos que podem ser administrados em doses sub-terapêuticas
ou de forma terapêutica em Medicina Humana e Animal. Uma vez que a célula bacteriana é uma
célula procariota, os antibióticos usados na terapêutica devem explorar as diferenças bioquímicas
entre as células bacterianas e as células hospedeiras. Os antimicrobianos são um grupo bastante
heterogéneo, existindo antibióticos que actuam na parede celular e outros durante a síntese
proteica, provocando a lise das células e, portanto, matando as bactérias (efeito bactericida) ou
inibindo a sua multiplicação (efeito bacteriostático).
Objectivos:
Determinar o fenótipo a diferentes grupos de antibióticos
Analisar o perfil de susceptibilidade segundo as normas do CLSI
Material necessário:
- Zaragatoas
- Pinças estéreis
- Ansas
- Régua
- Discos de antibióticos (Oxoid)
- Meio de Cultura (Muller-Hinton agar)
- Soro fisiológico
- Para testar a eficácia aos antibióticos serão utilizadas três espécies bacterianas (E. coli,
Pseudomonas spp. - Gram-negativo e Enterococcus faecalis - Gram-positivo).
Procedimento
Técnica de Kirby-Bauer
Preparar uma suspensão bacteriana de cada uma das espécies em estudo, a partir de 3 – 4
colónias em soro fisiológico estéril (A suspensão deve ter uma turvação equivalente a 0,5 da escala de
MacFarland)
Mergulhar uma zaragatoa na suspensão bacteriana retirando o excesso; Semear placas de agar
Mueller-Hinton;
Aplicar os discos dos antibióticos a testar (utilizar o “dispenser” como se representa na Figura)
sobre a superfície do meio de cultura, após a secagem do inóculo;
Incubar a 37 °C, durante 24 horas.

Resultados:
Com uma régua ou craveira medir os diâmetros dos halos de inibição para cada antibiótico.
Classificar de acordo com as normas do CLSI, 2006 (ex: NCCLS National Committee for Clinical
Laboratory Standards). Assim, a medida do halo de inibição será comparada com os valores da
tabela, onde a bactéria é classificada, nas categorias de sensível (S), intermédia (I) ou resistente
(R).
Figura 11 – Representação da aplicação de discos de antibióticos num meio de cultivo inoculado com uma
estirpe em análise (à esquerda). Resultados obtidos após crescimento bacteriano (à direita).
Avaliação da susceptibilidade a antibióticos

Amostra A (Gram -)_________________________________________________________
Antibiótico Diâmetro do halo Classificação

Amostra B (Gram -)_________________________________________________________
Amostra (Gram +)____________________________________________________________

Trabalho prático 11
Simbiose de microrganismos com plantas
A disponibilidade de azoto no solo é o maior factor limitante na Agricultura, apesar da atmosfera
ser constituída por 80% de azoto. A molécula de azoto é quimicamente muito estável e apenas
alguns procariotas têm capacidade de a reduzir a uma forma biologicamente assimilável. A
associação Rhizobium x leguminosa é o mais eficiente sistema de fixação de azoto atmosférico. As
espécies do género Rhizobium são bactérias do solo capazes de provocarem o aparecimento de
órgãos especializados nas raízes das plantas, os nódulos, nos quais ocorre a redução do azoto
(Figura 12).
As espécies do género Rhizobium apresentam a forma de bacilos curtos, isolados ou aos pares,
não esporulados, Gram negativo, móveis por flagelos polares ou peritriquiais, apresentando
grânulos de poli-β-hidroxibutirato nas culturas mais envelhecidas. No interior do nódulo as células
apresentam formas diversificadas designando-se por bacteróides.
Mecanismo de infecção e formação do Legohemoglobina no nódulo

nódulo
Figura 12 – Mecanismo de formação do nódulo nas leguminosas
Objectivos:
Observação da nodulação em diferentes leguminosas. Observação dos bacteróides.
Isolamento de Rhizobium a partir dos nódulos.
-Microscópio
-Lâminas e lamelas
-Caixas de Petri esterilizadas
-Ansa, Pinça e tesoura
-Álcool a 70%

-Água esterilizada distribuída em tubos com 20ml
-Solução de lixívia a 1%
-Placas com Agar de Manitol-levedura
1- Observação da nodulação em diferentes leguminosas

Identificar as plantas;
Cortar a parte aérea da planta;
Lavar o sistema radicular em água corrente;
Colocar sobre uma folha de papel;
Observar e tomar nota:
Plantas Forma dos Disposição ao longo do Constituição interna Observações

Nódulos sistema radicular
2- Observação dos bacteróides

Cortar com uma tesoura várias secções da raiz de 1cm que contenham nódulos saudáveis (rosa);
Mergulhar as secções dentro de uma caixa de Petri com lixívia a 1%, durante 15 min.;
Retirar as secções da solução e mergulhar em 20 ml de etanol a 70% durante 1 min.;
Retirar as secções do etanol e mergulhar em 20 ml de água estéril durante 1 min.;
Repetir as lavagens com água estéril pelo menos 3 vezes;
Transferir um dos nódulos para uma caixa de Petri estéril e esmagar com uma vareta de vidro;
Observar o suco extraído ao microscópio;
Semear por riscado à superfície de uma placa de Petri com meio de Manitol levedura;
Incubar as placa de Petri a 25˚C durante 3 a 5 dias.
Resultados:
Tomar nota e desenhar as formas das células observadas ao microscópio directamente do nódulo;
Registar as características das colónias formadas no meio de manitol levedura simples e com
adição dos indicadores - vermelho do Congo e azul de Bromotimol;
Retirar uma porção de uma colónia para uma lâmina e misturar com uma gota de água estéril;

Fazer o esfregaço e proceder à coloração de Gram;

Observar as preparações ao microscópio;
Registar a morfologia celular e a reacção à coloração;
BIBLIOGRAFIA
Benson, H. 1994. Microbiological applications. 6th ed. WCB Publishers, Dubuque, IA 52001.
Martinko, J. Madigan, M. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition. Prentice-Hall Inc.,
New Jersey.
Canas-Ferreira, W. e J.C.F. de Sousa, 1998. microbiologia. Vol 1. Lidel Editora, Lisboa.
Schelegel, H. 1993. General Microbiology. 7th ed. Cambridge University Press, Cambridge
Stanier, R., E. Adelberg,J. Ingraham e M. Wheelis 1979. Introduction to the microbial world.
Prentice-Hall Inc., New Jersey.
Wheelis, M. e W.Segel 1979. Introduction to the microbial world – Laboratory manual. Prentice-
Hall Inc., New Jersey.

ANEXO 1 - Meios de cultura
Meio de agar nutritivo:

• Extracto de carne ..................................... 3g
• Peptona ................................................... 5g
• Agar ........................................................ 15 g
• Água destilada ....................................... 1000 ml
Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos
Caldo nutritivo:
• Peptona ................................................... 5g
Acertar a pH final 6,8-7,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos
Agar de dextrose Sabouraud

• Peptona ................................................... 10 g
• Dextrose .................................................. 40 g
• Agar ........................................................ 15 g
• Água destilada ..................................... 1000 ml
Acertar a pH 5,6. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos.
Y Malte Agar
• Extracto de malte ..................................... 3g
• Extracto de levedura ................................. 3g
• Peptona ................................................... 5g
• Glucose ................................................... 10 g
• Agar ......................................................... 20 g
Y Malte Caldo
• Extracto de malte ..................................... 3g
• Extracto de levedura ................................. 3g
• Peptona ................................................... 5g
• Glucose ................................................... 10 g
Acertar a pH 5,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos.
Agar de amido
• Amido solúvel ........................................... 10 g

• Agar ........................................................ 15 g
Caldo com vermelho de fenol – meio base

• Peptona ................................................... 10 g
• Cloreto de sódio ....................................... 5g
• Vermelho de fenol ..................................... 0,018 g
Nota: para avaliar a fermentação de açúcares adicionar, separadamente, 5 g/l de glucose, lactose ou
sacarose.
Agar de ureia
• Peptona ................................................... 1g
• Dextrose ................................................... 1g
• Fosfato de potássio .................................... 2g
• Ureia ....................................................... 20g
• Vermelho de fenol ..................................... 0,012 g
Acertar a pH 6,8. Esterilizar a mistura por filtração (A). Esterilizar a mistura de 15 g de agar com 900 ml de
água a 121˚C durante 15 minutos (B). Deixar arrefecer B e adicionar os 100 ml de ª Distribuir em tubos e
inclinar.
Caldo de lactose
• Extracto de carne ...................................... 3g
• Peptona .................................................... 5g
• D-lactose ................................................. 5g
Água peptonada
• Peptona .................................................... 10 g
Nota: Para pesquisar a fermentação de açúcares adicionar 1,8 ml de vermelho de fenol.
Agar Endo
• Peptona ................................................... 10 g

• D-lactose .................................................. 10 g
• Sulfito de sódio ........................................ 2,5 g
• Fosfato de potássio .................................... 3,5 g
• Agar ........................................................ 15 g
• Fucsina básica ........................................... 0,5 g
Agar de Citrato- Simmons

• Sulfato de magnésio .................................. 0,2 g
• Cloreto de sódio ........................................ 5g
• Fosfato de amónio .................................... 1g
• Citrato de sódio ......................................... 2g
• Agar ........................................................ 15 g
Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos.
Caldo MR-VP
• Peptona .................................................... 7g
• Dextrose ................................................... 5g
Acertar a pH 6,8-7,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos.
Agar de Manitol-levedura
• Fosfato de potássio .................................... 0,5 g
• Sulfato de magnésio .................................. 0,2 g
• Cloreto de sódio ........................................ 0,1 g
• Manitol ..................................................... 10 g
• Extracto de levedura ................................. 0,4 g
• Agar ........................................................ 15 g
Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos.
Nota: Poderão ser adicionados, separadamente, os seguintes corantes: Vermelho do Congo (1%) ou Azul de
Bromotimol (0,5%).
Meio de LB (Luria-Bertani Medium)

• Triptona 10 g
• Extracto de levedura 5g
• NaCl 10 g
• Água destilada 1000 ml

Agitar até à completa dissolução. Ajustar o pH a 7,0 com 5N NaOH (~0.2ml). Esterilizar em
autoclave durante 15 minutos a 121ºC.
Meio de LBss (Luria-Bertani semi-sólido)

• Triptona 10 g
• NaCl 10 g
• Agar 7g
LBss = LB + 0.7% Agar
Meio de LBs (Luria-Bertani sólido)

• Triptona 10 g
• NaCl 10 g
• Agar 15 g
LBs = LB + 1.5% Agar

ANEXO 2 – Corantes e soluções
Solução de azul de metileno

• azul de metileno ....................................... 0,3
• Álcool etílico a 95 % ............................... 30 ml
• Hidróxido de potássio 1% ........................ 1 ml
Solução de Cristal de violeta

• Cristal de violeta ....................................... 0,5 g
• Água destilada ....................................... perfazer a 100 ml
Soluto de Lugol
• Cristais de iodo ......................................... 1,0 g
• Iodeto de potássio .................................... 2,0 g
Solução de Safranina
• Safranina .................................................. 2,5 g
• Álcool etílico a 95% ........................... 10 ml
Dissolver a safranina em etanol. Perfazer a 100ml em água destilada.
Solução de Fucsina
• Fucsina básica ........................................... 1g
• Etanol ..................................................... 10 ml
• Fenol 5% (solução aquosa) ..................... 100 ml
Distribuir em frascos e esterilizar a 121˚C durante 15 minutos.
Solução de Nigrosina
• Nigrosina ................................................. 10 g
• Água destilada .................................. perfazer a 100 ml
Filtrar.
Solução de verde malaquite

• Verde malaquite ....................................... 5g
• Água destilada .................................. perfazer a 100 ml
Filtrar.
Solução de iodo
• Cloreto de sódio ....................................... 2,25 g
• Cloreto de cálcio ....................................... 0,12 g
• Cloreto de potássio .................................... 0,105 g
• Bicarbonato de sódio ................................ 0,05 g

• Água destilada ....................................... perfazer a 1 L
Solução de tetrametil-parafenildiamina.HCl
• Tetrametil-parafenildiamina.HCl ............. 0,1 g

• Água destilada ....................................... até 10 ml
Solução de vermelho de metilo

• Vermelho de metilo ................................... 0,1 g
• etanol ....................................................... 300 ml
• Água destilada ....................................... 200ml
Reagente de Kovacs
• Álcool amílico .......................................... 150 ml
• p- dimetil-aminobenzaldeído ....................... 10 g
• Ácido clorídrico ....................................... 50 ml
Dissolver o aldeído no álcool, a 60 C, deixar arrefecer e adicionar o ácido gota a gota. Guardar no frigorífico.
Solução de α-Naftol
• α-Naftol .................................................... 5 ml
• Álcool etílico a 95% ........................... perfazer a 100 ml
Solução salina de Ringer

• Cloreto de sódio ....................................... 2,25 g
• Cloreto de cálcio ....................................... 0,12 g
• Cloreto de potássio .................................... 0,105 g
• Bicarbonato de sódio ................................ 0,05 g
• Água destilada ....................................... perfazer a 1 L
Distribuir em frascos e esterilizar a 121˚C durante 15 minutos.
Solução de lactofenol-azul de algodão

lactofenol
• Ácido láctico ............................................. 100 ml
• fenol ....................................................... 100 g
• glicerol ..................................................... 100 ml
Dissolver o fenol em água, sem aquecer. Adicionar depois o ácido láctico e o glicerol.
azul de algodão
• sol. Saturada de azul de algodão ................ 10 ml
• glicerol ..................................................... 10 ml
Misturar em partes iguais o lactofenol e o azul de algodão.

Corantes (Coloração de Gram variante de Chan)

A - Solução de cristal de violeta
• Cristal de violeta ........................................... 10 g
• Oxalato de amónio ......................................... 4g
• Etanol ........................................................... 100 ml
• Água destilada ............................................... 400 ml
B - Solução de iodo
• Iodo ............................................................ 1 g
• Iodeto de potássio ........................................ 2 g
• Etanol .......................................................... 25 ml
• Água destilada .............................................. 100 ml
C - Álcool iodado
• Solução de iodo ............................................ 5 ml
• Etanol .......................................................... 95 ml
D - Safranina
2,5% de safranina em álcool .......................... 10 ml
Água destilada .............................................. 100 ml


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MANUAL DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

1 - NORMAS A ATENDER NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

1 - A roupa deve ser sempre protegida por uma bata ;

6 - Evitar que objectos ou produtos inflamáveis fiquem próximos da chama;

9 - Comunicar imediatamente ao professor caso entorne alguma cultura ou efectue aspirações

10 - Comunicar imediatamente qualquer acidente do género corte, queimadura, etc.

11 - Nunca esquecer de flamejar as ansas antes de as guardar no suporte.

12- Antes de utilizar qualquer aparelho deve ler as normas de utilização;

13 - O microscópio deve ser manuseado com cuidado :

c) Só deverá remover a lâmina da platina, depois deslocação da objectiva;

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 2

16 - Etiquetar cuidadosamente as culturas antes de as colocar na estufa.

2- MATERIAL UTILIZADO NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

Autoclave - equipamento destinado à esterilização de materiais e meios de cultura utilizados em

Incubadora- equipamento de temperatura controlada (0 a 50°C) para cultivo de microrganismos;

Micropipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, quando se pretendem

Lâminas e lamelas- para observações ao microscópio;

Câmaras de contagem- lâminas de vidro padronizadas e desenhadas para permitirem a contagem

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 3

3- LIMPEZA E PREPARAÇÃO DE MATERIAL

O chão deve ser lavado e desinfectado diariamente;

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 4

4 - PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

Preparação de agar nutritivo (Como exemplo)

4- Adicionar 15 a 20 g de agar aos outros componentes e homogeneizar.

5- Adicionar água destilada de modo a perfazer o volume de 1000 ml.

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 5

Composição do agar nutritivo:

Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos

5 - TÉCNICAS UTILIZADAS NA CULTURA DE MICRORGANISMOS

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 6

Sementeira por esgotamento (streak plate) – isolamento e obtenção de cultura pura -

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 7

Figura 1- Sementeira à superfície da gelose inclinada

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 8

2- Pesquisa de microrganismos das superfícies da sala de aulas

3- Pesquisa de microrganismos de outros ambientes

4- Pesquisa de microrganismos do solo

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 9

Quadro – Caracterização das colónias observadas

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 10

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 11

Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Pevide

Plana Elevada Convexa Em abóbada Mamilonada

Inteira Ondulada Lobada Irregularmente Filamentosa Frisada

Figura 2- Descrição de vários tipos de colónias

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 12

Figura 3- Morfologia: Tamanho, forma e arranjos bacterianos

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 13

Observação de mobilidade (preparação de gota pendente) - Colocar uma alíquota de

Preparação dos esfregaços

-Colocar uma gota de água na secção delimitada;

- Deixar secar ao ar;

-Corar pelo método escolhido;

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 14

-Azul de metileno de Loeffler (5 minutos)

-Fucsina (30 segundos).

-Lavar cuidadosamente e deixar secar ao ar

Coloração diferencial de Gram

Passar por água e secar com papel de filtro;

Descorar com álcool a 95% durante 10 a 20 segundos;Passar por água e secar;

Examinar ao microscópio com a objectiva de imersão.