LUIS FERNANDO DE ALVARENGA

QUALIDADE DE SEMENTES HIBRIDAS DE

MILHO SUBMETIDAS À ESTRESSE HIDRICO

                                         
LAVRAS- MG
2014
 LUIS FERNANDO DE ALVARENGA

QUALIDADE DE SEMENTES HIBRIDAS DE MILHO SUBMETIDAS À

ESTRESSE HIDRICO

Monografia apresentada ao Departamento de

Agricultura da Universidade Federal de Lavras,
para a obtenção do título de bacharel em
Agronomia.

Profa. Dra. Heloísa Oliveira dos Santos

(Orientadora)

LAVRAS – MG
2014
 4

LUIS FERNANDO DE ALVARENGA

QUALIDADE DE SEMENTES HIBRIDAS DE MILHO SUBMETIDAS À

ESTRESSE HIDRICO

Monografia apresentada ao Departamento de

Agricultura da Universidade Federal de Lavras,
para a obtenção do título de bacharel em
Agronomia.

APROVADA em ___________________

Dra. Carla Massimo Caldeira UFLA

Msc. Raquel Maria de Oliveira Pires UFLA

Profa. Dra. Heloísa Oliveira dos Santos

(Orientadora)
Raquel Maria de Oliveira Pires
(Coorientadora)
LAVRAS – MG
2014
 5

AGRADECIMENTOS
À minha amada mãe, Maria Cláudia de Alvarenga, não somente por
ser uma Mãe carinhosa, protetora e atenciosa. Mas também por ser minha
melhor amiga sempre extrovertida e divertida. Obrigado por sempre me apoiar.
À meus avós: Maria Izolina Alvarenga e Carmo de Alvarenga. Por
todo cuidado, dedicação e amor. Pelas boas lembranças. Obrigado por serem
uma mãe e pai para mim e formarem nossa linda família.
Ao meu pai, Celso Henrique Ferreira, pelo apoio e suporte.
À meus tios e tias: Ana, Antônio Luiz, Célio, Celso, Cleusa, Izabel,
Fátima, Fernanda João, Jorge, José Morais, Neusa e Nilma. Obrigado por
cuidarem tão bem de mim e por todos momentos divertidos.
À meus primos e primas, Bianca, Beto, Bruna, Celso de Alvarenga Jr
Douglas, Fabiana, Gabriel, Jennifer, Junia, Jorge Henrique, Joice, Marilia,
Rodrigo, Patricia e Yasmin, por toda bagunça e ótima infância.
À minha namorada, Karen Magalhães Abreu, por estar do meu lado
me completando, apoiando, divertindo e amando.
À minha orientadora e amiga, Heloisa Oliveira dos Santos, obrigado
por me orientar e por toda ajuda e momentos divertidos.
À minha coorientadora, Raquel Pires, obrigado por toda ajuda.
Aos meus amigos, Arthur, Alan, Carlos Biagolini, Eric Schwan,
Emanuelly, Felipe, Francisco, Guilherme, Henrique, Jeferson, Luis
Briguelli, Ricardo Kenji, Rodrigo e Yuri. Pela amizade, ajuda e todos os bons
momentos.
À Universidade Federal de Lavras, pela oportunidade e acolhimento.
Eric Schwan, Hebe, Leandro Mariotto e Raquel Pires pela ajuda na
condução dos experimentos.
À Raquel Pires e Carla Massimo Caldeira pela participação na banca.
À empresa Dow AgroSciences pelas sementes híbridas de milho.
 6

RESUMO

O milho é o cereal mais produzido no mundo, podendo ser produzido o

ano todo no Brasil. Porém a produtividade pode ser reduzida devido a diversos
fatores, sendo um dos mais importante o deficit hídrico. O deficit hídrico pode
causar estresse oxidativo e alteração na permeabilidade de membranas reduzindo
a porcentagem de plântulas normais em campo. O presente trabalho teve como
objetivo avaliar o estresse hídrico induzido por polietileno glicol nas
concentrações de 0,0 MPa, -0,2MPa, -0,4MPa, -0,6MPa e -0,8MPa, em três
diferentes lotes de sementes híbridas de milho. Além disso, foram avaliadas
expressão das enzimas catalase, superóxido dismutase e esterase. Foi observado
que a porcentagem de germinação, primeira contagem de plântulas normais,
comprimento do sistema radicular e parte aérea reduziram conforme o aumento
da contração de PEG 6000, além disso, houve variação das respostas dos
híbridos à esse estresse. As enzimas superóxido dismutase, catalase e
esterase têm expressão mais intensa conforme o aumento do estresse
hídrico.
 7

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO............................................................................7
2.REFERENCIAL TEÓRICO..........................................................9
2.1 Importância econômica da cultura do milho..........................9
2.2 Métodos de Pettenkofer e Titulação.....................................12
2.3 Qualidade e vigor de sementes.............................................13
2.4 Atividade respiratória em sementes.....................................14
3 MATERIAL E MÉTODOS..........................................................15
3.1 Local e materiais..................................................................15
3.2 Teor de água.........................................................................15
3.3 Teste de germinação.............................................................15
3.4 Índice de velocidade de emergência......................................16
3.5 Primeira contagem de germinação.......................................16
3.6 Teste de envelhecimento acelerado.......................................17
3.7 Atividade respiratória..........................................................17
3.8 Procedimentos estatísticos....................................................23
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................24
5. CONCLUSÕES..........................................................................28
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................29
 8

1. INTRODUÇÃO

Segundo dados da CONAB (2014), o milho é o cereal mais produzido no

mundo e pode ser cultivada o ano todo no Brasil desde que haja as condições
climáticas ideais para o desenvolvimento da planta (BRUNINI et al., 2001).
Porém nota-se grande variabiliade de rendimento tendo como causa a falta da
água decorrente a instabilidade no regime de chuvas (CRUZ et al., 2010).
A demanda de água pela cultura do milho é alta e varia conforme o
estádio de desenvolvimento da planta, normalmente cada ciclo, do plantio a
colheita, a planta consome cerca de 600mm de água, e o maior consumo diário
ocorre no espigamento e maturação sendo cerca de 5 a 7,5 mm diários (CRUZ et
al., 2010).
De acodo com Ávila 2007, a falta de água no campo é uma das
principais causas de baixa emergência no campo. Além disso, o atraso na
germinação aumenta a probabilidade das sementes serem atacadas por patógenos
e pragas (MORAES, 2006).
O teste de germinação é o principal teste de qualidade fisiológica, porém
por ser realizado em condições ideais não condiz com as adversidades que
ocorre em campo. Para suprir essa deficiência do teste de germinação é utlizado
diversas substâncias com capacidade de emular o estresse em condições em
campo, uma delas é o polietileno glicol (PEG 6000) que visa simular o estresse
hídrico e o teste de primeira contagem de plântulas normais (Souza e Cardoso,
2000).
O estresse hídrico pode resultar em maior produção de radicais livres
que podem danificar as sementes e causar alterações nas membranas celulares. A
atividade isoenzimas catalase e superóxido dismutase esta relacionada com a
proteção das sementes contra radicais livres (BELIGNI e LAMATTINA, 1999).
 9

Já a atividade da iosenzima esterase está relacionada com a oxidação de lipideos

de membranas (BRANDÃO JUNIOR et al., 1999).
Previsões ambientais indicam mudança no regime hidrológico com
concentração de chuvas e maiores periodos de estiagem (MELO, et al., 2012).
Portanto, faz se necessário, cada vez mais, ferramentas que identifiquem lotes de
sementes que resistam às condições de falta d’água. Para que as empresas do
setor sementeiro possa escolher racionalmente o destino de cada lote de
sementes, de acordo com o regime hídrológico de cada região.
No presente trabalho tem-se como objetivo de avaliar os efeitos do
estresse hídrico induzido por polietileno glicol em três diferentes lotes de
sementes híbridas de milho.
 10

2.REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Origem e importância da cultura do milho

Pertencente à família Poaceae, o milho (Zea mays L.), segundo Conab
2014 é o cereal mais produzido no mundo. É uma espécie de origem
Mesoamericana e sua domesticação iniciou-se há cerca de 5.000 anos na
América Central, principalmente no México (BUCKLER e STEVENS, 2005).
De acordo com Andrade (1995), o milho apresenta um elevado potencial
produtivo, porém seu cultivo necessita ser rigorosamente planejado e
criteriosamente manejado, pois esse potencial pode não se manifestar devido a
acentuada sensibilidade da cultura ao estresse de natureza biótica e abiótica,
aliado a pequena plasticidade foliar, reduzida prolificidade e baixa capacidade de
compensação efetiva
A cultura do milho tem enorme variabilidade genética que tem sido
explorada pelo melhoramento genético, resultando em uma grande quantidade
de cultivares, que são adaptadas à uma diversidade de ambientes que permitem o
seu cultivo desde o Equador até o limite das terras temperadas e desde o nível do
mar até altitudes superiores a 3.600m (MAGALHÃES et al., 2002), prosperando
em climas tropicais, subtropicais e temperados. No Brasil, inicialmente o cultivo
do milho consolidou em termos de aumento de área e produtividade, nas regiões
Sul, Centro-oeste e Sudeste (FANCELLI; DOURADO NETO, 1997).
Porém na última década, devido ao acesso às novas tecnologias na
região norte e nordeste houve aumento de produtividade de 72,03% e 142,99%,
respectivamente, influenciada principalmente pelos ganhos de produtividade nos
estados do MATOPIBA, Rondônia, Pará e Sergipe, que são responsáveis por
mais de 90% da produção da Região Norte/Nordeste.
 11

Segundo o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos(USDA), na

safra 2013/14 a produção mundial deve chegar a 981 milhões de toneladas do
grão. Os americanos são os que mais produzem esse cereal no mundo porém a
maior parte dessa produção, cerca de 85%, é destinada ao consumo interno
principalmente devido a produção de etanol e apenas 10% é exportado, porém
devido a grande produção é o suficiente para colocar os Estados Unidos como
maior exportador mundial.
Já o Brasil é o terceiro maior produtor mundial e segundo maior
exportador, ficando atrás da China que é o segundo maior produtor, deve
finalizar a atual safra com colheita próxima a 80 milhões de toneladas e com
consumo interno de menos de 55 milhões de toneladas.
Neste contexto, com uma previsão de exportação de 21 milhões de
toneladas, mantendo a posição de segundo maior exportador. Ressalta se que o
Brasil chegou a posição de segundo maior produtor através do uso de tecnologia
na produção, pois a área cultivada aumentou 11,7% nos últimos 20 anos e a
produção 140,9% e o ganho de produtividade foi de 115,7%. A atual
produvidade do Brasil estimada é de 5044 kg/ha (CONAB, 2014). Os principais
paises importadores de milho do Brasil são Irã, Egito e Coréia do Sul
(YAGUSHI, 2012).
O milho é um insumo de grande importância para industria, utilizado em
rações, produção de amido, bebidas e produção de etanol principalmente nos
Estados Unidos. Para utilização industrial o milho pode passar por dois
processos de moagem: A moagem de via úmida, o milho após limpeza e
secagem, o milho é macerado separando em germe, fibra e endosperma, o ultimo
é separado em amido e glutén. O amido é destinado a produção de xaropes,
amidos especiais e modificado em dextrinas e o glutén é seco e misturado com
farelo e posteriormente utilizado em rações. É um processo com maior custo e
exige maior tecnologia. O segundo processo é a moagem de via seca o milho é
 12

separado em endosperma e germe. O primeiro é destinado a fabricação de

diversos produtos como cereais, canjica, salgadinhos e do outro é extraído óleo e
o farelo após a extração é utilizado em rações e na alimentação de bovinos. É
um processo que exige menor uso de tecnologia (PINAZZA, 2007).
O crescimento econômico dos paises asiáticos tem impulsionado a
produção de milho no Brasil, ja que com o aumento da renda nesses países
ocorre maior consumo de proteína animal, principalmente aves e suínos que são
importados do Brasil, ou seja, esse consumo ocorre na forma de ração cujo
milho é o principal macroconstituinte. Estima-se que cerca de 84% do milho seja
utilizado na produção de ração (PINAZZA, 2007). De acordo com Beefpoint,
(2013), as exportações de carne cresceram mais de 40% em menos de 10 anos
com previsão de recorde para 2014.
O mercado de sementes de milho tem se mostrado muito promissor com
um aumento significativo de 172.000 toneladas em 2001/2002 para 425.000
toneladas em 2014. Sendo disponibilizada para a safra 2014 um total de 467
cultivares de milho (253 transgênicas e 214 convencionais). Cerca de 24% das
cultivares ofertadas foram “superprecoces” (89,5% de OGM) e 67% de ciclo
precoce(88,7%OGM). E em termos de nível de tecnológico 73,5% dos materiais
comercializados eram de nivel 1 (alta tecnologia) e 20,4% de nivel 2 (média
tecnologia). Além disso, é notório o maior uso de cultivares transgênicas em
hibrido simples e simples modificado devido ao seu alto valor agregado
(ABRASEM, 2014).

No ano de 2013, a taxa de utilização de sementes de milho foi de 90% e

a demanda potencial e efetiva foram respectivamente 313.724 e 282.532
toneladas. A taxa de adoção de biotecnologia foi de 81,5% (ABRASEM, 2013).
Na maioria dos casos, são sementes de híbridos simples (CRUZ et al., 2014).
 13

É válido ressaltar que o grande motivo do sucesso dos hibridos simples

de milho é efeito heterótico obtido pelo cruzamento de linhagens com boa
capacidade combinatória, normalmente, esse efeito está relacionado com o
aumento de rendimento (ALLARD, 1971).

2.2 Qualidade de sementes

Com a aprovação da Lei de Sementes, n°10.711 de 05 de agosto de
2003, a preocupação com a qualidade das sementes foi intensificada,
aumentando a fiscalização da produção e a comercialização de sementes no país,
além de deixar o sistema de certificação por conta de entidades privadas e aos
próprios produtores de sementes (PADILHA et al., 2004).
A qualidade de um lote semente é dada pelo somatório dos atributos
genéticos, físicos, fisiológicos e sanitários, responsáveis por sua capacidade de
originar plântulas altamente produtivas (MARCOS FILHO, 2005).
A qualidade genética é relativa ao potencial produtivo, resistência a
pragas e doenças, pureza genética e varietal, sendo que a pureza genética pode
ser prejudicada por contaminações envolvendo polén indesejado fecundando o
parental feminino, resultando em alterações nas características genéticas
intrínsecas da cultivar, ou seja, perda das caracteriscas da mesma. Já a pureza
varietal, é reduzida quando ocorre mistura de sementes da mesma espécie,
porém de diferentes cultivares resultando em um lote heterogêneo. Normalmente
ocorre devido a tigueras ou durante o beneficiamento (PESKE et al., 2012).
Pureza física, umidade, danos mecânicos, peso de 1000 sementes,
aparência e peso volumétrico, são os atributos que compõe a qualidade física de
um lote de sementes. “A pureza física reflete a composição física ou mecânica
de um lote de sementes”. Esse atributo pode informar o grau de contaminação de
um lote com a presença sementes de plantas daninhas, outras espécies e material
inerte. O grau de umidade, expresso em porcentagem, é a quantidade de água
 14

contida na semente dividido pelo seu peso úmido. Há uma faixa ideal para
colheita mecanizada, além disso, pode afetar a ativadade metabólica durante os
processos de germinação e em caso de armazenamento acelerar a deterioração.
Durante colheita, beneficiamento e plantio a semente pode sofrer
injúrias mecânicas que afetam seu desempenho no armazenamento e no campo.
Danos no tegumento podem facilitar a entrada de microrganismos patogênicos,
desbalancear a troca de gases e solutos para interior da semente e danificar o
embrião reduzindo a taxa germinação e/ou vigor. Ressalta-se que nem sempre o
dano mecânico é visivel. Sendo essencial para cálculo de quantidade de
sementes gasta por área de plantio, o peso de 1000 sementes é uma característica
que informa o tamanho da semente. Com a adoção da classificação de sementes
de soja pelos produtores de sementes, esse atributo físico torna-se muito
importante. A aparência do lote de sementes atua como um forte elemento de
comercialização, um lote com boa aparência é facilmente aceito pelo comprador,
o produtor tem menor aceitação de lotes de sementes com ervas daninhas,
materiais inertes e com sementes mal formadas e opacas. Fornecendo o grau de
desenvolvimento de uma semente, o peso volumétrico é uma caracteristica que
pode indicar melhor qualidade da semente, quanto maior o peso de um certo
volume de sementes melhor (PESKE et al., 2012).
Atributo fisiológico é que aquele envolve o metabolismo da semente na
expressão de seu potencial. Germinação é a capacidade uma semente emitir suas
estruturas essenciais para sobrevivência originando uma plântula normal, em
condições ideais. É expressa em porcentagem sua determinação é padronizada
no mundo todo para cada espécie. Obrigatório para a comercialização de um lote
de sementes. Porém a germinação nem sempre se manifesta em condições de
campo pois não são condições ideais, é necessário ter conhecimento de quão
vigoroso é aquela semente. Vigor é definido como a junção da caracteristicas da
 15

semente que permitem obtenção de um estande adequado em campo (PESKE et

al., 2012).
O teste de germinação apresenta um alto grau de confiabilidade, possui
boa reprodutibilidade dos resultados e serve como parâmetro para fiscalização
do comercio e normatização da produção. Porém, ele não reproduz as condições
de campo ou de armazenamento (MARCOS FILHO, 2001)
Para avaliação de vigor em sementes de milho, um teste bastante usado
é o de primeira contagem de germinação. Ele é baseado no principio que
amostras que apresentarem, na primeira contagem, maior número de plântulas
normais, de acordo com a Regra de Análise de sementes é mais vigorosa
(BRASIL, 1992).
A qualidade sanitária de um lote de sementes está relacionada com a
presença de patógenos. Um lote deve ser sadio pois as sementes podem não
germinar ou manifestarem seu vigor quando doentes. Além disso, sementes
podem ser um veiculo de disseminação de doenças (PESKE et al., 2012).
A uniforme de estande, estabelecimento da cultura e conquemente
produtividade é influencia pela qualidade da semente (KIKUT et al., 2003). Por
causa disso, é de grande importância de utilizar a análise de sementes como
ferramenta para obter dados para uso no controle de qualidade de sementes
(KRZYZANOWKI et al., 1999).
As isoenzimas cairam em desuso após o surgimento de marcadores de
DNA, porém com o novo conceito de gene (RESENDE et al., 2011), as
isoenzimas voltam a ser utilizadas com maior frequência principalmente pelo
seu polimorfismo estar mais próximo da expressão fenotipca do que resultado do
que o DNA (TORGGLER et al., 1995 e SOUZA et al., 2005).
Atualmente, por exigirem apenas uma pequena quantidade de amostras,
permitirem análises simultâneas e conferirem rápida separação e alta resolução,
as técnicas isoenzimáticas têm sido muito utilizadas na avaliação de de
 16

alterações bioquímicas relacionadas à qualidade de sementes (ROOD &

LARSEN, 1988).
Para se proteger de radicais livres, gerados sob condições de estresse, a
planta produz enzimas capazes de “neutraliza-los”. Nesse sistema enzimático
estão as enzimas: superóxido dismutase, capaz de catalisar a conversão de
radicais superóxidos em peróxido de hidrogênio e a enzima catalase responsável
por converter peróxido de hidrogênio a água e oxigênio (BELIGNI e
LAMATTINA, 1999).
Através da hidrólise de ésteres, a enzima esterase tem participação direta
nas reações de metabolismo de lipídeos, incluindo os fosfolipídios de membrana
celular (SANTOS et al., 2005). Uma alteração do número e intensidade de
bandas no gel de eletroforese, dessa enzima, pode indicar perda de viabilidade
em sementes (BRANDÃO JUNIOR et al., 1999).

2.3 Estresse Hídrico

Apesar de ser o componente mais abundante na natureza, a água é um
dos principais fatores limitantes na agricultura mundial, (KRAMER, 1969), sua
falta é um problema que ocorre constantemente em condições de campo
afetando negativamente o crescimento e desenvolvimento das culturas
(LECOEUR & SINCLAIR, 1996).
Quantificar a capacidade de armazenamento de água no solo, é essencial
para um melhor entendimento das respostas das plantas ao déficit hídrico. Além
disso, é preciso analisar como a redução da disponibilidade de água influência
nos mecanismos de tolerância a estresse hídrico (LEVITT, 1980). De acordo
com Kiehl (1979), essa quantidade pode variar de acordo com as características
físicas do solo.
Para que o processo germinativo ocorra é fundamental a absorção de
água pelo processo de embebição (MARCOS FILHO, 2005; BEWLEY et al.,
 17

2013). Esse processo ocorre em três fases: A fase 1 é comandada pelo potencial
matricial da semente seca (Ψm), é um processo puramente físico e rápido em
que a água atravessa o tegumento se ligando a matriz da semente (BEWLEY et
al., 2013). Na Fase 2, ocorre equilibrio entre potencial hídrico da
semente(Ψsemente) e a pressão de turgor(Ψp) estabilizando o conteúdo aquoso
da semente (CASTRO et al, 2004; MARCOS FILHO, 2005).
Além disso, ocorre os processos de restauração celular, reparo
mitocondrial, aumento significativo da respiração, reparo e síntese de DNA,
digestão das reservas e síntese de mRNAs que serão essenciais para o
desenvolvimento do embrião (BEWLEY et al., 2013). A Fase 3 é alcançada
apenas pelas sementes vivas e não dormentes, caracterizando-se visivelmente
pela protusão da raiz primária. Nessa fase, a semente volta a absorver água e
ocorre aumento da taxa respiratória devido principalmente ao rompimento do
tegumento (BEWLEY e BLACK, 1985).
O déficit hídrico pode causar retardamento do processo germinativo e
um lento desenvolvimento de plântulas. Porém, em casos mais severos pode
prejudicar a porcentagem final de germinação devido ao metabolismo lento ou a
não ocorrência dos processos metabólicos necessário à germinação (BRACCINI
et al, 1998; RAHIMI, 2013). Além disso, o estresse hídrico prolongado pode
ocasionar diversas reações que podem resultar em geração de espécies reativas
de oxigênio que podem ser danosas ao metabolismo celular (BARTELS e
SUNKAR, 2005; WANG et al., 2009).
De acordo com Thakur e Sharma, 2005, é de grande importância a
identificação prévia de genótipos que possuem resistência a estresse hídrico
durante a germinação em campo. A avaliação da qualidade fisiológica e dos
sistemas enzimáticos podem auxiliar na identificação de cultivares tolerantes a
estresse hídrico (FARIA et al., 2002).
 18

Um teste bastante promissor é o de estresse hídrico ou osmótico, que

tem como princípio de que sementes com mais vigorosas podem tolerar
condições mais severas de deficiência hídrica. Esse método tem como vantagem
a não necessidade de equipamento novo ou treinamento adicional. Entretanto, o
potencial osmótico, da solução, deve ser determinado em função da espécie,
tendo em vista que sementes menores requerem menos água para germinar pois
se isso não for feito os resultados podem ser enganosos (AOSA, 1983 e EIRA &
MARCOS-FILHO, 1990).
Através de técnicas de eletroforese, pode se avaliar qualidade fisiológica
da semente de milho, pois ela relaciona-se com a expressão de enzimas
(BRANDÃO-JUNIOR et al., 1999).
O polietilenoglicol (PEG 6000) é um polimero formado a partir de
etilenoglicol, por não difundir para o interior da semente devido ao alto peso
molecular, esse polimero, não mascara os resultados. Por isso, é um dos
principais polimeros utilizados na indução de estresse hídrico em sementes
(PARMAR e MOORE,1968). De acordo com Avila et al. (2007), as sementes de
milho sujeitas a esse estresse induzido apresentaram redução no comprimento de
plântulas. Além disso, sementes de milho pipoca apresentaram redução em até
87% na porcentagem de germinação (MOTERLE et al, 2008).
As empresas do ramo sementeiro necessitam de ferramentas que
auxiliem no direcionamento do lote de sementes para diversas regiões com
diferentes tipos de clima e condições de solo. As isoenzimas superóxido
desmutase, catalase e esterase em conjunto com o teste de germinação e primeira
contagem realizados sob condições de estresse hídrico induzido por PEG 6000
podem auxiliar nessa tomada de decisão, indicando a tolerância a estresse
hídrico em sementes de cultivares de milho. Ressalta-se sucesso de qualquer
empresa de sementes depende da qualidade e integridade de seus lotes de
sementes.
 19

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Local e materiais

A pesquisa foi conduzida no Laboratório Central de Sementes do
Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras (UFLA), em
Lavras, MG.
Foram utilizados três lotes de sementes de milho híbridas com diferentes
níveis de qualidade, porém com o mesmo genitor feminino e produzidos na
mesma área e sistema de irrigação. As sementes foram cedidas pela empresa
Dow AgroSciences.

3.2 Teor de água

Utilizando-se duas repetições de 50 sementes de cada tratamento, o teor
de água das sementes foi determinado pelo método de estufa a 105°C por 24
horas (BRASIL, 2009). Após esse período as sementes foram levadas para
dessecadores até o resfriamento das amostras e em seguida foi efetuado o peso
seco das mesmas. Os resultados foram expressos em porcentagem.

3.3 Teste de germinação sob condições de estresse hídrico

O teste de germinação foi conduzido com quatro repetições de 50
sementes, com a semeadura em papel Germitest umedecido com água destilada
e polietileno glicol (PEG 6000) na proporção de 2,5 mL por grama de papel, os
potenciais osmóticos induzidos foram de -0,0, -0,2, -0,4, -0,6, -0,8 Mpa. Os
potenciais foram estabelecidos pela equação de Van’t Hoff, citado por Salisbury
e Ross (1991). Para que o potencial osmótico não se alterasse, os rolos com
tratamentos de mesma concentração de polietileno glicol foram colocados dentro
do mesmo saco plastico. Os sacos plásticos foram mantidos em câmeras BOD
 20

com a temperatura regulada para 25ºC. As avaliações foram feitas no quarto e

sétimo dia após semeadura.

3.4 Primeira contagem de germinação

Concomitantemente com o teste de germinação, após quatro dias, foi
contabilizado o número de plântulas normais com o intuito de avaliar o vigor das
sementes utilizadas. As sementes que não germinaram foram mantidas no papel
germitest para contagem final que foi feita oito dias após semeadura. O resultado
foi expresso em porcetagem (BRASIL, 2009). Foram consideradas plântulas
normais aquelas que têm potencial para originar uma planta produtiva.

3.5 Enzimas
De cada tratamento, no terceiro dia após semeadura, foram retirados
duas amostras de 10 sementes que tiveram seu endosperma retirado e mascerado
num cadinho sobre gelo, na presença de PVP e nitrogênio líquido.
No processo de extração da enzima foi adicionado o tampão de extração
(Tris HCl 0,2 M pH 8 + 0,1% de β-mercaptoetanol) na proporção de 250ϻL por
100mg de pó das sementes. O material foi homogeneizado em vortex e mantido
em geladeira durante a noite seguido de centrifugação a 14000 rpm por 30
minutos a 4ºC. Foram aplicados 60 μL do sobrenadante no gel.
A corrida eletroforética foi realizada em sistema de géis de
poliacrilamida a 7,5% (gel separador + 1% de amido solúvel) e 4,5% (gel
concentrador). A corrida foi efetuada a 150 V por 5 horas. No final da corrida, os
géis foram revelados para a enzima esterase, catalase e superóxido dismutase
conforme Alfenas et al. (2006). O sistema gel/eletrodo utilizado foi o Tris-
glicina pH 8,9. A avaliação dos géis foi realizada sobre transluminador, sendo
considerada a variação de intensidade das bandas.
 21

3.6 Procedimentos estatísticos

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado
com 5 materiais e 4 repetições. A interpretação dos dados foi feita por meio da
análise de variância e as médias, comparadas pelo teste de Scott Knott ao nível
de 5%. Estas análises foram feitas no programa estatístico Sisvar ® (Ferreira,
2000). Foram determinados os coeficientes de correlação linear simples (r) de
Pearson, entre os valores obtidos nos testes utilizados para avaliação da
qualidade fisiológica de sementes.
 22

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com base na análise de variância foi possível observar diferenças

significativas entre as sementes híbridas de milho e entre potenciais osmóticos,
assim como para a interação dos fatores avaliados (p <0,05).
O teor de água médio das sementes no momento dos testes foi de
12,3% com variação máxima de 1%. Vale ressaltar a importância de se ter o teor
de agua entre os materiais testados com a menor variação possível, uma vez que
quando ocorre de ter variações entre os valores de teor de agua pode haver
variações que venham a acelerar o processo de deterioração, e formação de
produtos que acarretam danos mediatos, a exemplo dos radicais livres,
mascarando o resultado final, conforme descrito por Marcos Filho et al. (2005).
Analisando a Tabela 1, não foi observado diferença estatisticamente
significativa na concentração de 0 MPa entre os Híbridos H1, H2 e H3. Porém
no tratamento -0,2 MPa notamos que o Híbrido 1(H1) e Híbrido 2(H2)
apresentaram resultados semelhantes, mas estes diferiram do H3 que apresentou
uma menor porcentagem de germinação. O Híbrido 2 mostrou comportamento
superior aos outros na concentração de -0,4 e o Híbrido 3(H3) apresentou
melhor resultado que o Híbrido 1 na mesma concentração. Na concentração de
-0,6 MPa, notamos um comportamento semelhante ao resultado anterior onde o
H2 é superior ao H3 e este com maior germinação que o H1. O Híbrido 1 foi que
o teve menor porcentagem germinação no tratamento de -0,8 MPa, além disso,
notamos que os Híbridos 2 e 3 não diferiram entre si significativamente.
 23

Tabela 1: Porcentagem de germinação de três sementes hibridas de milho,

submetidas a 5 níveis de potencial osmótico. UFLA, Lavras-MG, 2014.
Concentração Híbridos
(MPa) H1 H2 H3
0 98aA 100aA 96aA
-0,2 96aA 97aA 90bB
-0,4 78cB 87aB 84bC
-0,6 50cC 82aC 73bD
-0,8 39bD 68aD 70aD
CV (%) 7,3
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha, e maiúscula na coluna, não
diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Scott Knott.

Comparando a variação do Híbrido 1 ao longo do aumento de

concentração observou-se que não houve variação significativa entre a
concentração de 0 e -0,2, porém nas de -0,4, -0,6, -0,8 MPa a redução na
porcentagem de germinação foi significativa. O Híbrido 2, apesar de apresentar
maior porcentagem de germinação que o primeiro, o comportamento foi
semelhante pois não houve variação nas duas concentrações iniciais, porém nos
tratamentos -0,4, -0,6 e -0,8 MPa ocorreu variação significativa com redução na
germinação conforme o aumento do estresse hídrico. É notável a variação
significativa de germinação da testemunha até o -0,6 MPa, no entanto, não
ocorre o mesmo entre o tratamento -0,6 e -0,8 MPa.

Tabela 2: Porcentagem de plântulas normais na primeira contagem do teste de

germinação de três hibridos de milho, submetidas a 5 niveis de potencial
osmótico. UFLA, Lavras – MG, 2014.
 24

Concentração Híbridos
(MPa) H1 H2 H3
0 68aA 70aA 71aA
-0,2 60bB 61bB 64aB
-0,4 38bC 48aC 49aC
-0,6 24cD 36aC 32bD
-0,8 12bE 16aD 12bE
CV (%) 12,8
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha, e maiúscula na coluna, não
diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Scott Knott.

De acordo com a Tabela 2, na concentração de 0 Mpa (apenas água

destilada) não houve diferença significativa entre os três híbridos. Já na
concentração de -0,2 MPa notamos que o Híbrido 3(H3) apresentou maior
porcentagem de plântulas normais em relação ao Híbrido 1(H1) e Híbrido
2(H2). O Híbrido 1 apresentou menor porcentagem de emergência no tratamento
de -0,4, porém para esse mesmo tratamento os outros não diferiram
significativamente entre si. No tratamento de concentração -0,6 MPa notamos
um melhor resultado do híbrido 2 que até então apresentava um comportamento
semelhante ou inferior ao híbrido 3. Na concentração mais elevada de -0,8 MPa,
o Híbrido 2 apresentou significativamente o melhor resultado, e o Híbrido 1 e 3
não diferiram entre si.
No Híbrido 1 e 3, houve redução significativa no número de plântulas
normais em todos tratamentos conforme a concentração aumentou. Já o Híbrido
2, apesar de porcentagem de plântulas normais caírem conforme o estresse
hídrico aumenta, não houve diferença significativa nos tratamentos -0,4 e -0,6
MPa.

Tabela 3: Comprimento (cm) do sistema radicular das plântulas de três

hibridos de milho, submetidas a 5 niveis de potencial osmótico. UFLA, Lavras
– MG, 2014.
Concentração Híbridos
(MPa) H1 H2 H3
 25

0 13,16aA 13,57aA 12,98aA

-0,2 10,54aB 10,47aB 9,32bB
-0,4 8,43aC 8,58aC 7,43bC
-0,6 6,98aD 6,79aD 6,08bC
-0,8 3,57aE 2,95bE 2,42cD
CV (%) 11,43
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha, e maiúscula na coluna, não
diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Scott Knott.

É notório, na Tabela 3, que não houve variação no comprimento

radicular entre os três híbridos analisados no tratamento 0 MPa. Na
concentração -0,2, -0,4 e -0,6 MPa, os Híbridos 1 e 2 apresentaram resultados
estatisticamente semelhantes, no entanto o Híbrido 3 apresentou menor
comprimento radicular. No tratamento de -0,8 MPa, o Híbrido 1 teve maior
comprimento que o Híbrido 2 e este maior que o Híbrido 3. Além disso,
comparando as variações dentro de cada híbrido nos Híbridos 1 e 2 ocorreu
redução significativa do comprimento de raiz conforme o aumento do estresse
hídrico em cada tratamento. E no Híbrido 3 houve variação nos tratamentos com
redução no tamanho do sistema radicular conforme aumentava a concentração
de PEG, porém não houve variação significativa entre os tratamentos -0,4 e -0,6
MPa.

Tabela 4: Comprimento (cm) da parte aérea das plântulas de três hibridos de

milho, submetidas a 5 niveis de potencial osmótico. UFLA, Lavras – MG,
2014.
Concentração Híbridos
(MPa) H1 H2 H3
 26

0 10,43aA 9,54bA 9,47bA

-0,2 8,38aB 7,43bB 7,49bB
-0,4 6,72aC 6,41aC 5,63bC
-0,6 5,05aC 4,75aD 4,27bC
-0,8 2,37bD 2,65aE 1,98cD
CV (%) 12,48
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na linha, e maiúscula na coluna, não
diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Scott Knott.

Na Tabela 4, não houve diferença entre os três híbridos na concentração

de 0 Mpa, o Híbrido 1 apresentou maior comprimento de parte aérea em relação
aos outros híbridos na concentração de -0,2 Mpa. No entanto na concentração de
-0,4 e -0,6 MPa os híbridos 1 e 2 não diferiram significativamente e
apresentaram maior comprimento de parte aérea que o híbrido 3. Na
concentração de -0,8 MPa o maior comprimento foi o do Híbrido 2, seguido pelo
Híbrido 1 e o menor foi o do Híbrido 3. Todos os híbridos apresentaram redução
no comprimento de parte aérea conforme o potencial osmótico diminuía. No
Híbrido 1 e 3 apresentou comprimento estatisticamente semelhante nas
concetrações de -0,4 e -0,6 MPa, já o Híbrido 2 apresentou redução sigficativa
em todos os tratamentos.
Spinola et al (1998) em seus experimentos com sementes de cenoura
notou redução na germinação de sementes e porcentagem de plântulas normais
no teste de primeira contagem conforme o aumento do estresse hídrico. No
entanto, somente o teste de germinação e primeira contagem não é o suficiente
para diferenciar lotes de sementes resistentes ao estresse hídrico. Embora o teste
primeira contagem indique vigor, o atraso na germinação não está entre os
primeiros eventos do processo de deterioração de sementes. (Delouche &
Baskin, 1973)
O tempo de início da germinação é maior em condições de menores
potenciais hídricos ( PHILIPS, 1969; SILVA, 1989). Esse atraso resulta em
 27

plântulas com menor comprimento e espessura, ou seja, com crescimento

prejudicado. (PARMAR & MOORE, 1968; YOUNG et al., 1983).
De acordo com Bruni & Leopold (1992), a redução na porcentagem de
germinação pode ser explicada pelo efeito do déficit de água que provoca a
perda progressiva da turgescência protoplasmática e um aumento na
concentração de soluto resultando, inicialmente, em um distúrbio na função
celular e, por fim, danos no sistema de biomembranas. Segunda Hadas (1976), a
germinação em sementes de leguminosas sob deficit hídrico é reduzida devido a
diminuição da atividade enzimática que reduz a desenvolvimento meristemático.
Testes de germinação e primeira contagem com sementes de milho
submetidas à restrição hídrica por PEG 6000 indicaram correlação com testes de
germinação e primeira contagem sob estresse hídrico realizados em condição de
campo. Em ambos os casos houve redução de germinação e plântulas normais
no teste de primeira contagem (PIANA & SILVA, 1997).
Trigo et al. (1999), através do condicionamento osmótico de sementes
de cebola em soluções de polietileno glicol (PEG 6000) e de manitol, indicou
que a germinação de sementes de cebola diminuíram conforme o potencial
osmótico foi reduzido de -1,0 até -1,4MPa. O mesmo foi observado em canola,
porém sem protusão radicular em potenciais hídricos menores -1MPa. E além
disso, como estratégia para superar o déficit hídrico, houve maior tendência de
crescimento radicular em detrimento da parte aérea conforme o potencial hídrico
diminuía (ÁVILA et. al, 2007). O mesmo foi observado por Braccini et al.,
1996, em sementes de soja.
Com o aumento da concentração dos sais e manitol das soluções, houve
um decréscimo nos valores de biomassa seca das plântulas, comprimento da raiz
primária e comprimento do hipocótilo (ALVARENGA et al., 1991).
Além de afetar a embebição, velocidade e percentagem de germinação o
estresse hídrico pode causar redução no tamanho de plântulas. Isso ocorre
 28

devido a sensibilidade do processo de síntese e alongamento da parede celular a

falta de água pois para que esse evento ocorra é necessario que a célula absorva
água e fique turgida. Ocorre uma grande variação de respostas entre as espécies
ao estresse hídrico, desde aquelas com sementes muito sensíveis até as mais
resistentes. (BEWLEY e BLACK, 1994).
Torres (1996) avaliou a qualidade fisiológica de sementes de pimentão,
submetidas ao teste de estresse hídrico. Verificou que, à medida que o potencial
osmótico diminuiu, ocorreu redução na taxa de crescimento e redução no
comprimento das plântulas. Os pimentões tiveram maior taxa de crescimento
relativo no potencial osmótico igual a zero MPa, havendo reduções progressivas
com o decréscimo para -0,3; -0,6 e -0,9MPa.
As imagens dos géis de eletroforese, da figura 1 e 2, evidencia que
conforme houve variações nos potenciais osmóticos, obteve-se diferentes
respostas dos híbridos em termos de expressão enzimática em cada híbrido.
As enzimas superóxido dismutase e catalase estão envolvidas na defesa
celular contra radicais livres, a superóxido dismutase é responsavel por
converter radicais superóxido em peróxido de hidrogênio e a enzima catalase
atua complementando a catalase convertendo o peróxido de hidrogênio que é
tóxico para a célula em água e oxigênio. (BELIGNI e LAMATTINA, 1999).
Foi observado, em todos os lotes de sementes híbridas utilizadas no
presente trabalho, aumento da atividade das isoenzimas protetoras contra
radicais livres (Superóxido dismutase e catalase) conforme o potencial hídrico
diminuía. Foi observado, por Leprince et al. (1990), diminuição na expressão
das enzimas superóxido dismutase e catalase em sementes de milho durante o
processo de embebição e secagem. Price et al. (1989), em seu trabalho observou
que com o aumento do estresse hídrico ocorreu aumento da expressão das
enzimas superóxido dismutase e catalase com o intuito de proteção contra
radicais livres. Já Viana et al (2001), não observou variação significativa, na
 29

atividade dessas enzimas, em sementes de milho em condições de campo com

disponibilidade hídrica do solo de até 50% da capacidade de campo, porém
abaixo de 50% a expressão aumentou. O mesmo aumento foi observado em
folhas de milho (PASTORI e TRIPPI, 1992).

Figura 1: Expressão da enzima Superoxido dismutase em sementes hibridas de

milho submetidas a diferentes níveis de concentração de PEG 6000.
 30

Figura 2: Expressão da enzima Catalase em sementes hibridas de milho

submetidas a diferentes níveis de concentração de PEG 6000.
De acordo com a Figura 3, houve variação na expressão da enzima
esterase entre as sementes híbridas. No presente trabalho, de maneira geral,
ocorreu aumento da expressão da esterase conforme o aumento do estresse
hídrico. Por ser uma enzima envolvida na peroxidação de lipídeos de
membranas, variação na sua atividade pode indicar deterioração de membranas e
consequentemente possível perda de solutos para solução aquosa do solo
(BASAVARAJAPPA et al., 1991; SANTOS et al., 2004).
Sementes de alface que foram resvestidas com micronutrientes não
apresentaram variação nos padrões de esterase.(ALBUQUERQUE et al., 2010).
Shatters et al. (1994) trabalhando com sementes de soja observaram redução de
77% da atividade da esterase após 48 horas de envelhecimento.

Figura 3: Expressão da enzima Esterase em sementes hibridas de milho

submetidas a diferentes níveis de concentração de PEG 6000.
31
 32

5. CONCLUSÕES

As sementes dos três híbridos apresentaram redução na porcentagem

germinação, primeira contagem de plântulas normais, comprimento
radicular e de parte aérea quando submetidas a condições de menor
potencial hídrico.
O Híbrido 2 apresentou maior porcentagem de germinação e
plântulas normais na primeira contagem.(DUVIDA???? QUEM É O
MAIS RESISTENTE?)
A expressão das enzimas superóxido dismutase, catalase e esterase
foram acentuadas conforme o aumento do estresse hídrico.
 33

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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