Estudo da Obtenção de Ácido Cítrico por Aspergillus niger a

partir de Hidrolisado Hemicelulósico de Eucalipto.

Arnaldo Márcio Ramalho Prata, Rogério da Silva Santos

Faculdade de Engenharia Química de Lorena – Depto. de Biotecnologia - DEBIQ

CEP.:12600-000 Lorena – SP
E-mail: roger_engenheiro@yahoo.com.br

RESUMO

O presente trabalho estudou o processo fermentativo de produção de ácido cítrico, a partir de

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, tendo este a xilose como principal constituinte. Foram
empregadas seis linhagens do fungo Aspergillus niger. Todos os ensaios foram conduzidos em sistema
descontínuo, em frascos Enlenmeyer de 125 mL, com tampão de algodão hidrófilo, contendo 25 mL
de meio, em pH 4,0 e incubados a uma frequência de agitação de 200 min-1 na temperatura de 30  ºC
por um período de cinco a sete dias.Verificou-se logo de início a necessidade de tratamento do
hidrolisado devido a falta de crescimento no mesmo sem tratamento. No hidrolisado tratado, após 5
dias, todas linhagens apresentaram crescimento sendo que as linhagens NRRL 334, NRRL 328, NRRL
551 e NRRL 567 se destacaram devido ao seu crescimento, com destaque maior para a linhagem
NRRL 328, com maior produção de ácido cítrico. Foi verificado portanto através de cromatografia
líquida, o consumo de toda a xilose e glicose do meio e com a produção de traços de ácido cítrico por
parte de todos as linhagens. Estudos complementares foram realizados a fim de se determinar as
condições ideais para produção de ácido cítrico, estudos nos quais se determinou a influência do
Ferrocianeto de potássio e a de determinados metais no meio fermentativo.
INTRODUÇÃO

O ácido cítrico, foi isolado por Sheele pela primeira vez em 1884, do suco de limão, sendo o principal
constituinte dos frutos cítricos. O acúmulo do ácido cítrico por alguns fungos foi descoberto por volta
de 1893 quando Wehmer, descobriu que o Citromyces (hoje identificado como Penicillium sp) possuía
a capacidade de acumular este ácido durante seu cultivo (SIEBERT e SHULZ, 1979).
Atualmente, a fermentação industrial para a produção do citrato é conduzida através da fermentação
em superfície ou submersa utilizando geralmente a espécie de fungo Aspergillus niger (REED,1991).
Hoje, cerca de 70% da produção é utilizada pela indústria de alimentos e bebidas; 12% pela indústria
farmacêutica e 18% por outras indústrias (BOHDZIEWEICZ, et al., 1992).
O presente trabalho foi inserido na linha de pesquisa que visa o aproveitamento de resíduos
lignocelulósicos para a obtenção de insumos químicos de interesse econômico e social. Os resíduos
agrícolas e as madeiras vêm sendo intensamente estudados como fonte de carboidratos para processos
fermentativos, pois estes materiais constituem uma fonte renovável, tanto natural como através de
programas de reflorestamento, sendo que o mesmo não ocorre com o petróleo (Vallander &
Eriksson,1990, citados por MISHRA & SINGH, 1993; SHAN & LEE,1994). Devido a natureza
polissacarídica, os materiais lignocelulósicos não são diretamente utilizados pelos microrganismos
produtores de substâncias de interesse industrial, tendo a necessidade de proceder a hidrólise dos seus
componentes para os respectivos monômeros. Esta hidrólise dos materiais lignocelulósicos pode ser
realizada por processos físicos, químicos , biológicos e combinação destes (BULCHOLZ et al., 1981;
KUMAKURA & KAETSU, 1983). No presente trabalho, foi submentida à hidrolise ácida, aparas de
eucalipto provenientes de indústrias de papéis, no qual se obteve um hidrolisado hemicelulósico de
eucalipto com um teor de xilose no meio em torno de 27,2 g/L e de glicose em torno de 2,0 g/L .Os
hidrolisados hemicelulósicos, obtidos por hidrólise ácida dos materiais lignocelulósicos, têm se
mostrado de grande interesse. De acordo com DALE (1987), O custo de vários produtos de
fermentação dependem muito do custo da fonte de carboidratos. Segundo este, a conversão da
lignocelulose oferece potencial para a obtenção de açúcares fermentencíveis de menor custo.
O objetivo geral deste trabalho foi estudar a obtenção de ácido cítrico a partir do hidrolisado
hemicelulósico de eucalipto, tendo este a xilose como principal açúcar fermentencível, através da
fermentação por Aspergillus niger. Os estudos de crescimento de todas as linhagens de Aspergillus
niger com o hidrolisado hemicelulósico de eucalipto sem tratamento, demonstraram que os
microrganismos não tiveram um ambiente favorável para seu crescimento e desenvolvimento celular
devido a certos inibidores presente no meio fermentencível. Estes inibidores foram identificados como;
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furfural, hidroxi-metil-furfural e compostos fenólicos. Variações de pH e tratamento com carvão ativo
reduzem o teor dessas impurezas assim como uma pequena fração de açúcares. Estudos realizados por
RITA C.L.B. RODRIGUES demonstraram uma remoção de de 97% das impurezas e de 5% a 25% de
açúcares, elevando-se o pH a 11,0 e com a adição de carvão ativo. Sendo assim, foi realizado um
tratamento físico-quimico do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto a fim de reduzir a concentração
de inibidores presentes no meio.
O estudo dos crescimentos de todas as linhagens de Aspergillus niger com o hidrolisado
hemicelulósico de eucalipto tratado, monstraram que os microorganismos tiveram um ambiente muito
favorável para seu crescimento e desenvolvimento celular, com isso, todas as linhagens tiveram
crescimento considerado em apenas cinco dias. Este resultado mostra que, dependendo da concentração
de certos inibidores presentes no meio fermentencível, o crescimento destas linhagens é totalmente
prejudicado. Apesar de todas as linhagens apresentarem crescimento elevado, observou-se que as
características morfológicas dessas linhagens ainda não seriam adequadas para produção de ácido
cítrico. Também as informações citadas por SHWEIGER (1961), KISSER et al. (1980) e SODECK et
al. (1981), afirmaram que o micélio que apresenta crescimento em forma de “pellets” resistentes, com
hifas curtas, ramificadas e entrelaçadas, caracterizam-se como essencial para a produção de ácido
cítrico por Aspergillus niger, em fermentação submersa, sendo portanto este o critério empregado para
definição das condições de cultivo. Segundo GOMES et al. (1987), para atingir “pellets” com essas
características são necessários: baixa viscosidade do meio, melhores condições de aeração e
homogeneização. O crescimento adequado para a produção de ácido cítrico é aquele em que o micélio
se desenvolve com hifas curtas, ramificadas e entrelaçadas..
Como a morfologia do meio não apresentava características ideias do critério definido no presente trabalho, foram feitos
estudos com ferrocianeto de potássio em diversas proporções a fim de se verificar uma melhor morfologia e redução do
elevado crescimento celular apresentado pelas linhagens de Aspergillus niger no meio. Devido a todas as linhagens
apresentarem praticamente o mesmo crescimento celular e morfologia nas fermentações anteriores, foi escolhido a linhagem
de Aspergillus niger NRRL 511 para se iniciar os testes com ferrocianeto de potássio a níveis de 0 ppm, 50 ppm e 100 ppm.
Os resultados apresentados evidenciaram a influência do ferrocianeto no meio sobre a produção de ácido cítrico, a linhagem
apresentou uma diminuição do crescimento em forma filamentosa com baixa produção de ácido cítrico. Os resultados obtidos
coencidem com as observações de CLARK et alli (1959) que afirmam que a produção de ácido cítrico por Aspergillus niger é
evidentemente reduzida, quando se observa o crescimento em forma filamentosa. O resultados mostraram também que o
fungo não se desenvolveu com as características desejadas, mesmo com a quantidade de 100 ppm de ferrocianeto de potássio,
o fungo apresentou crescimento em forma filamentosa, detectando uma baixa concentração de ácido cítrico no meio
fermentado.
Foi estudado também a influência na produção de ácido cítrico pela presença de metais pesados, que constitui um dos
aspectos mais discutidos e estudados na literatura pertinente. Na maioria dos trabalhos é citado o controle dos elementos ferro,
cobre, zinco e manganes e a importância de cada um para o processo.
Portanto foi realizado o estudo com todas as linhagens a fim de determinar a influência dos metais sobre cada linhagem. A
Fermentação foi realizado por um período de cinco dias e pelas mesmas condições das fermentações anteriores. Foi
observado através dos resultados, que as linhagens NRRL 328, NRRL 334 e NRRL 567 não apresentaram crescimento
durante a fermentação, sugerindo que possa ser o efeito associativo entre o ferrocianeto de potássio e os metais presentes no
meio sobre essas linhagens. Observa-se também ausência de ácido cítrico por quase todas as linhagens de Aspergillus niger,
isso ocorreu devido ao crescimento na forma filamentosa, não ideal a produção de ácido cítrico em meio submerso. Em todos
os casos observou-se que as características morfológicas de crescimento foram semelhantes. O fato de ocorrer crescimento em
forma filamentosa indica que os metais não estão relacionados com esse tipo de crescimento, conforme observado por
CLARK et alii (1959).
Para tentar encontrar a condição de crescimento morfológico ideal, a fermentação seguinte foi conduzida a um pH=6,0 e
com a adição de manganes no meio de fermentação. O teste foi feito a fim de avaliar a funcionalidade dos metais em
conjuntos no meio de fermentação. Avaliando-se os resultados apresentados com essa mudança observa-se um ótimo resultado
em relação ao crescimento do fungo no meio, sendo que todas as linhagens apresentaram crescimento na forma de pellets com
hifas curtas resistentes, entrelaçadas e ramificadas, condição fundamental para a produção de ácido cítrico por Aspergillus
niger, em meio submerso. As obervações feitas em relação a morfologia apresentadas pelo fungo foram supreendentes com a
mudança de pH, pois apesar do crescimento ideal , houve ausência de produção de ácido cítrico praticamente em quase todos
os testes, sendo que apenas no teste onde continha manganes e zinco, apareceram traços de ácido cítrico. O fato de não
aparecimento de ácido cítrico pode ser explicado pela baixa concentração de açúcares utilizados durante as fermentações, pois
sabe-se que a faixa ideal de açúcares para produção de ácido cítrico deve ser em torno de 120-150 g/L.

MATERIAIS E MÉTODOS

Obtenção e tratamento do hidrolisado

O hidrolisado hemicelulósico de eucalipto foi obtido utilizando um reator cilíndrico, tipo eixo
rotativo, com capacidade para 10 Kg de aparas de eucalipto, que foi operado nas seguintes condições:
temperatura de 155 ºC; tempo de hidrólise de 25 minutos; relação água:máteria-seca igual a 4:1 com
solução de ácido sulfúrico 0,35%. Para a remoção de inibidores, foi realizado o tratamento fisico-
químico de acordo com RITA C.L.B. RODRIGUES. Assim, óxido de cálcio PA foi adicionado ao
hidrolisado, sob agitação, elevando-se o pH de 2,0 até 11,0. O hidrolisado permaneceu em repouso
durante 24 horas e depois filtrado para a remoção dos precipitados. O pH foi ajustado novamente até
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4,0 com auxílio de ácido sulfúrico concentrado. Após repouso de 24 horas o hidrolisado foi filtrado
novamente. Em frascos Erlenmeyer de 250 mL, contendo 100 mL de hidrolisado tratado com elevação
e abaixamento de pH, adicionou-se 15% de carvão ativado (área superficial de 500-600 m 2/g,
densidade aparente de de 0,25 a 0,30 g/cm3 e de 30 a 35% de particulas retidas em malha 325). Os
frascos foram agitados a 200 min-1 em shaker rotatório, por 1,0 hora, a 30º C e em seguida o
hidrolisado foi filtrado à vácuo em papel de filtro Klabin (qualitativo), para a remoção do carvão.

Microorganismos e método de inoculação

No presente estudo, foram utilizadas as linhagens de Aspergillus niger NRRL 328, NRRL 334,

NRRL 350, NRRL 511, NRRL 567 e NRRL 599, provenientes do Northern Regional Research
Center, Peoria, Illinois, USA. As culturas foram mantidas em ágar inclinado (0,5% de peptona, 0,3% de
extrato de carne e 2% de ágar-ágar), onde também ficaram por um periodo de sete dias em estufa à
30ºC e depois mantidas sob refrigeração (4 oC). Para inoculação, uma suspensão de esporos não
germinados, obtida de uma cultura cultivada em ágar inclinado, foi utilizada como inóculo. Foram
adicionados 2,0 mL de uma solução de TWEEN 80 0,8% (v/v) ao tubo contendo a cultura esporulada
e, após agitação, o conteúdo foi transferido para outro tubo esterilizado. Este procedimento foi repetido
por duas vezes e a suspensão obtida agitada vigorosamente para a destruição de aglomerados de
esporos. Após contagem de esporos na câmara de Neubauer, foi procedida a diluição da suspensão.
Cada frasco de erlenmeyer de 125 mL foi inoculado com 1 mL desta suspensão, de modo a se obter
uma concentração inicial de 1 x 108 - 1 x 109 esporos/mL, no meio de cultivo.

Condições de fermentação

O meio de cultivo foi preparado suplementando-se o hidrolisado hemicelulósico, previamente

aquecido em banho-maria fervente por 20 minutos, com nitrato de amônio 2,5 g/L, sulfato de magnésio
heptahidratado 0,25 g/L e fosfato de potássio 1,0 g/L em relação ao meio. Para os testes de controle de
crescimento com ferrocianeto de potássio, este foi adicionado, inicialmente, nas proporções de 0, 50 e
100 ppm.
Todos os ensaios foram conduzidos em sistema descontínuo, em frascos Enlenmeyer de 125 mL,
com tampão de algodão hidrófilo, contendo 25 mL de meio, em pH 4,0 e por último em pH=6,0
ajustado com Hidróxido de sódio 1,0N. Os frascos foram incubados em incubadora de movimento
circular, a uma frequência de agitação de 200 min-1, temperatura de 30 ºC e por um periodo de cinco a
sete dias.

Análises qualitativas e quantitativas

Para todas as análises, as amostras foram preparadas filtrando-se o meio de cultivo em papel de filtro
qualitativo e coletando-se alíquotas para as diluições necessárias. Para a cromatografia líquida, após a
diluição, as amostras foram filtradas em cartuchos SEP-PAK C18. Durante os cultivos com hidrolisado
tratado, foram retiradas amostras dos micélios dos fungos para análise do seu crescimento. O
crescimento foi medido pelo método de peso-seco e as características morfológicas de crescimento
foram avaliadas por observações microscópicas, empregando-se a técnica de preparação à fresco. A
determinação da concentrações de xilose, glicose e ácido cítrico foram realizadas por HPLC, operado
nas seguintes condições: Coluna Aminex BIORAD HPX 87H (300 x 7,8 mm); temperatura de 45 ºC;
eluente sendo o ácido sulfúrico 0,01 N; fluxo do eluente de 0,6 mL/min; volume da amostra de 20 L e
índice de refração do detector igual a (16x).

RESULTADOS E DISCUSSÕES

O trabalho iniciou-se com a obtenção do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto no qual foram

analisadas as concentrações de açúcares no mesmo por cromatografia líquida de alto desempenho,
apresentando as seguintes concentrações: Xilose 27,2 g/L; glicose 2,0g/L e inibidores 3,4 g/L.
Os estudos de crescimento de todas as linhagens de Aspergillus niger com o hidrolisado
hemicelulósico de eucalipto sem tratamento, demonstraram que os microorganismos não tiveram um
ambiente favorável para seu crescimento e desenvolvimento celular devido a certos inibidores presente
no meio fermentencível. Estes inibidores foram identificados como; furfural, hidroxi-metil-furfural e
compostos fenólicos. Devido a esses resultados, procedeu-se o tratamento físico-químico de acordo
com RITA C.L.B. RODRIGUES. O hidrolisado anteriormente apresentava-se com uma aparência
escura e com quantidade indesejável de inibidores para o crescimento do fungo. Após tratamento o
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mesmo ficou com uma aparência bem satisfatória, com clareamento do hidrolisado e redução de 88,23
% dos inibidores, tabela 1.0. O estudo dos crescimentos de todas as linhagens de Aspergillus niger
com o hidrolisado hemicelulosico de eucalipto tratado, monstraram que os microrganismos tiveram um
ambiente muito favorável para seu crescimento e desenvolvimento celular, com isso, todas as linhagens
tiveram crescimento considerado em apenas cinco dias. Este resultado mostra que, dependendo da
concentração de certos inibidores presentes no meio fermentencível é totalmente prejudicado o
crescimento destas linhagens.
Tabela 1.0 Tratamento do hidrolisado Tabela 2.0 fermentação cítrica depois de sete dias
Tratamento Xilose (g/L) Glicose (g/L) Inibidores (g/L)Linhagens χ Ác. cítrico (g/L) YX/S
Antes 27,20 2,00 3,40 NRRL 328 0,2990 0,263 0,5914
Depois 24,88 1,73 0,40 NRRL 334 0,2845 0,253 0,5627
% redução 8,52% 13,50% 88,23% NRRL 350 0,2825 0,210 0,5587
NRRL 511 0,3150 0,185 0,6235
NRRL 567 0,3350 0,222 0,6630
NRRL 599 0,3005 0,168 0,5945
Yx/s = massa celular/massa inicial de açúcares; χ – massa celular

Os valores de Yx/s foram calculados a partir dos resultados encontrados por peso-seco e a quantidade
de açúcares no início da fermentação (carboidratos totais). Baseado nos resultados, observa-se que
todas as linhagens cresceram e as linhagens que mais se destacaram em seu crescimento celular foram;
NRRL 328, NRRL 511, NRRL 567 e NRRL 599. A linhagem NRRL 328, apresentou as melhores
características de crescimento, mas ainda sim na forma filamentosa. As linhagens NRRL 511, NRRL
567 e NRRL 599, também se destacaram pelo seu crescimento, sendo a linhagem NRRL 567 que
apresentou o maior crescimento dentre todas as linhagens, mas com baixa produção de ácido cítrico em
relação as outras linhagens. Apesar de todas linhagens apresentarem traços de ácido cítrico, pode-se
perceber um crescimento um pouco elevado e sem as características morfológicas exigidas para uma
boa produção de ácido cítrico. O crescimento adequado para a produção de ácido cítrico é aquele em
que o micélio se desenvolve na forma de “pellets” com hifas curtas, ramificadas e entrelaçadas.
Devidos aos resultados foram feitos estudos com ferrocianeto de potássio em diversas proporções a fim
de se verificar uma melhor morfologia e controle do crescimento por parte das linhagens de Aspergillus
niger no meio. Como a todas as linhagens apresentarem praticamente o mesmo crescimento celular e
morfologia nas fermentações anteriores, foi escolhido a linhagem de Aspergillus niger NRRL 511 para
se iniciar os testes com ferrocianeto de potássio. Foram feitos testes com, 0 ppm, 50 ppm e 100 ppm de
Ferrocianeto de potássio.
Tabela 3.0 - Testes com Ferrocianeto de Potássio
K4Fe(CN)6 Xilose final g/LGlicose final g/L Ácido Cítrico g/L χ Média de χ
0,3075 0,1473 0,02 11,76
0 ppm 2,785 0,1150 0,3252 9,91 10,78
0,3707 0,1709 0,3530 10,68
9,355 0,1015 1,166 6,72
50 ppm 1,248 0,1348 0,9549 6,28 5,93
9,081 0,0951 0,8197 4,81
13,28 0,1220 1,206 4,68
100 ppm 14,04 0,1337 1,3050 4,25 4,84
10,73 0,1182 0,9052 5,62
χ – crescimento celular g/L; xilose inicial 16,05 g/L; glicose inicial 0,90 g/L

Os resultados apresentados evidenciaram a influência das condições do meio sobre a produção de ácido cítrico. Nesta
fermentação, a linhagem apresentou crescimento em forma filamentosa com baixa produção de ácido cítrico. Os resultados
obtidos (Tabela 3.0) coencidem com as observações de CLARK et alli (1959) que afirmam que a produção de ácido cítrico
por Aspergillus niger é evidentemente reduzida, quando se oberva o crescimento em forma filamentosa. Da mesma forma
SCHWEIGER (1961) e SODECK et alli (1981) citaram que o crescimento dem forma de “pellets“ resistentes, com hifas
curtas, ramificadas e entrelaçadas, é condição fundamental para a produção de ácido cítrico por Aspergillus niger, em meio
submerso.Também pode-se notar pelos resultados que o fungo não se desenvolveu com as características desejadas, mesmo
com a quantidade de 100 ppm de ferrocianeto de potássio, o fungo apresentou crescimento em forma filamentosa. No meio
sem ferrocianeto, o fungo apresentou crescimento filamentoso demasiado, com esporulações na parede do frasco, ocorrendo
até mesmo o desprendimento do fungo da parede sobre o meio. Já no meio contendo 50 ppm de ferrocianeto, ocorreu também
crescimento na forma filamentosa, mas com um crescimento mais moderado. No meio com 100 ppm de ferrocianeto ocorreu
crescimento celular tambem na forma filamentosa, mas sem esporulação nas paredes e apresentando uma quantidade de ácido
citrico maior em relação aos outros meios. Observou –se portanto que o ferrocianeto de potássio controla o crescimento de
Aspergillus niger na fermentaçao, alterando sua capacidade de produção de ácido cítrico.

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 O trabalho teve prosseguimento com o estudo da influência na produção de ácido cítrico pela presença de metais pesados,
que contitui um dos aspectos mais discutidos estudados na literatura pertinente. Na maioria dos trabalhos é citado o controle
dos elementos ferro, cobre, zinco e manganes e a importância de cada um para o processo. O teste foi realizado utilizando 0,2
ppm de Fe+3, 2,0 ppm de Zn+2 e 0,5 ppm de Cu+2. A Fermentação foi realizado por um período de cinco dias e pelas mesmas
condições da fermentação realizada com os testes de ferrocianeto.

Tabela 4.0 - Testes com metais utilizando 0,2 ppm de Fe+3, 2,0 ppm de Zn+2 e 0,5 ppm de Cu+2
Linhagem Metais Xilose final g/L Glicose final g/L χ Ácido cítrico
NRRL 328 Presente 17,02 1,15 0,00 0,00
NRRL 328 Ausente 15,21 0,90 2,12 0,00
NRRL 334 Presente 17,11 1,02 0,00 0,00
NRRL 334 Ausente 14,51 0,82 2,48 0,12
NRRL 350 Presente 15,12 0,95 1,94 0,00
NRRL 350 Ausente 14,25 1,13 1,60 0,00
NRRL 511 Presente 14,36 0,88 2,55 0,00
NRRL 511 Ausente 15,25 1,10 2,15 0,22
NRRL 567 Presente 16,55 1,12 0,00 0,00
NRRL 567 Ausente 15,45 0,86 4,05 0,00
NRRL 599 Presente 14,84 1,03 1,22 0,00
NRRL 599 Ausente 15,22 1,14 1,88 0,00

Foi observado pelos resultados na tabela 4.0, que as linhagens NRRL 328, NRRL 334 e NRRL 567 não apresentaram
crescimento durante a fermentação, isso pode demonstrar o efeito associativo entre o ferrocianeto de potássio e os metais
presentes no meio sobre essas linhagens.Agora, o baixo crescimento apresentado por todas as linhagens deve-se ao fato da
presença de ferrocianeto de potássio no meio fermentencível.Observa-se também ausência de ácido cítrico por quase todas as
linhagens de Aspergillus niger, isso ocorreu devido ao crescimento na forma filamentosa, não ideal a produção de ácido cítrico
em meio submerso.
Em todos os casos observou-se que as características morfológicas de crescimento foram semelhantes. O fato de ocorrer
crescimento em forma filamentosa indica que os metais não estão relacionados com esse tipo de crescimento, conforme
observado por CLARK et alii (1959).Nesta etapa do trabalho começamos a observar o fraco desempenho por partes das
linhagens. Estudos realizados anteriormente com Aspergillus niger em meio submerso para produção de ácido cítrico feitas
por PRATA, A.M.R (1989), demonstraram claramente o baixo rendimento das linhagens provenientes do provenientes do
Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA.
Para tentar encontrar a condição de crescimento morfológico ideal, a fermentação seguinte foi
conduzida a um pH=6,0 e com a adição de manganes no meio de fermentação. O teste foi feito a fim de
avaliar a funcionalidade dos metais em conjuntos no meio de fermentação. O pH foi acertado com
Hidróxido de sódio 1N, iniciando, portanto a fermentação em pH=6,0. Escolheu-se a linhagem NRRL
511, por apresentar melhores resultados na etapa anterior.

Tabela 5.0 - Testes com diversos conjuntos de metais,( 20,0 ppm de Fe+3, 1,0 pm de Mn+2 , 2,0 ppm de Zn+2 e 4,0 ppm de
Cu+2.) em pH inicial =6,0
Teste Mn Fe Cu Zn Xilose inicial Glicose inicial Xilose final Glicose Final χ Ac. Cítrico
1 15,2 g/L 1,5 g/L 0,85 1,10 13,406 Ausente
2 x x 15,2 g/L 1,5 g/L 0,88 1,08 12,922 0,224 g/L
3 x x 15,2 g/L 1,5 g/L 0,96 1,09 10,128 Ausente
4 x x 15,2 g/L 1,5 g/L 1,54 1,21 13,056 Ausente
5 x x 15,2 g/L 1,5 g/L 1,78 1,32 13,705 Ausente
6 x x 15,2 g/L 1,5 g/L 0,78 1,02 13,995 Ausente
7 x x 15,2 g/L 1,5 g/L 0,66 1,00 13,364 Ausente
8 x x x x 15,2 g/L 1,5 g/L 1,56 1,23 13,646 Ausente
pm o o o o 15,2 g/L 1,5 g/L 1,12 1,05 13,66 Ausente
pm o o o o 15,2 g/L 1,5 g/L 1,65 1,07 11,92 Ausente
pm o o o o 15,2 g/L 1,5 g/L 1,79 1,28 12,35 Ausente
X - Metal adicionado ao meio
O - Metal adicionado ao meio com a metade da concentração inicial.
Pm – ponto médio

Avaliando-se os resultados apresentados na tabela 5.0, observa-se um ótimo resultado em relação ao crescimento do fungo
no meio, sendo que todas as linhagens apresentaram crescimento na forma de pellets com hifas curtas resistentes, entrelaçadas
e ramificadas, condição fundamental para a produção de ácido cítrico por Aspergillus niger, em meio submerso. Obervações
feitas em relação a morfologia apresentadas pelo fungo foram supreendentes, pois apesar do crescimento ideal , houve
ausência de produção de ácido cítrico praticamente em quase todos os testes, sendo que apenas no teste onde continha
manganes e zinco, apareceram traços de ácido citrico. O fato de não aparecimento de ácido cítrico pode ser explicado pela
baixa concentração de açúcares presente no meio fermentativo.

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 Atualmente estão sendo feitos testes com concentração de açúcares acima de 60 g/L para melhor avaliação das linhagens.
Resumindo, percebe-se que o fungo atingiu as características morfológicas esperadas no projeto, infelismente as linhagens
estudas não apresentam boa produção de ácido cítrico, devido ao fato da baixa concentração inicial de açúcares no início da
fermentação.

CONCLUSÕES

Seis linhagens de Aspergillus niger foram utilizadas para os testes e numa primeira etapa os fungos foram
cultivados no hidrolisado hemicelulósico de eucalipto sem tratamento no qual não foi observado crescimento de
nenhuma das linhagens no hidrolisado sem tratamento, esses resultados demonstraram claramente o efeito dos
inibidores presentes no hidrolisado. Já no hidrolisado tratado houve intenso crescimento, com total consumo dos
açúcares. Neste caso detectou-se a presença de ácido cítrico no meio, embora em quantidades diferentes para cada
linhagem. Estes resultados indicam que os fungos testados são capazes de consumir os açúcares predominantes no
hidrolisado hemicelulósico de eucalipto e produzir ácido cítrico a partir dos mesmos. O tratamento realizado no
hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, apresentou ótimos resultados em relação a diminuição da concentração
de inibidores presentes no mesmo. Os testes com ferrocianeto evidenciaram seu papel de controle sobre o
crescimento das linhagens e também sobre a morfologia apresentada. Em relação aos metais estudados não foi
possível determinar a influência dos mesmos sobre o crescimento como visto na tabela 4.0 e nem sua influência na
produção de ácido cítrico. Conclui-se que o baixo rendimento de ácido cítrico apresentado foi devido ao fato da
baixa concentração de açúcar no meio fermentativo, pois estudos que estão sendo realizados já apresentaram
resultados que confirmam esse fato.

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