1 APLICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA DE PERMEAÇÃO EM GEL (GPC) NA

DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR DE POLISSACARÍDEOS DE

ORGIEM VEGETAL E MICROBIANA
1.1 HPSEC

Utilizada na determinação de massa molecular de uma ampla diversidade de

polímeros sintéticos e naturais. Contudo, para polissacarídeo, a mesma necessita
de ser aprimorada ou acoplada a técnicas como espalhamento de luz.
(RODRIGUES, 1997).

Figura 1: (a) matriz para empacotamento de coluna de exclusão sobre tamanho. (b) mecanismo
de cromatografia de exclusão.
FONTE: RODRIGUES, 1997

1.2 ESPALHAMENTO DE LUZ

Aplicável a maior gama de massas moleculares, esta técnica possui ampla

utilização quando acoplado a métodos eficientes de separação, como o HPSEC,
fornecendo informações a nível molecular, permitindo determinação não só de
massa, mas também de forma, dimensão de partícula (NICOLAU et al., 2009)
Quando a luz incide sobre uma partícula, ela pode ser desviada, absorvida ou
transmitida. Para as partículas que são grandes em comparação com o
comprimento de onda da luz emitida, ocorre a reflexão, refração ou difração. Para
as partículas menores ou de mesmo tamanho do comprimento de onda incidente,
ocorre o espalhamento de luz (JONES, 1999).

Figura 2: Espalhamento de luz e seus detectores em um fotômetro

FONTE: RODRIGUES, 1997

1.3 HPSEC-MALLS

A combinação de técnicas permitiu não só a determinação da massa molar, bem

como a distribuição dessa massa. Além disso, buscando melhores resultados e
confiabilidade, parte dos pesquisadores e autores de muitos artigos, exploram a
utilização da multidetecção acoplada ao espalhamento de luz.
O detector de espalhamento de luz estático utiliza o princípio de que a intensidade
de luz polarizada por uma molécula é diretamente proporcional à massa molecular,
conceito que caracteriza o espalhamento de Rayleigh. Este sistema mede a média
total de intensidade de espalhamento em um determinado período e proporciona
análises rápidas, depende de apenas uma solução para emitir resultados e
determina os parâmetros contidos na equação básica do espalhamento de luz, a
equação de Rayleigh (WYATT, 1993; KOSTANSKI, KELLER, HAMIELEC, 2004;
AL-ASSAF, PHILLIPS, WILLIAMS, 2006; SEMENOVA, 2007; GABORIEAU et al.,
2008).
Para que tudo isso seja possível, é necessário trabalhar com os melhores
parâmetros para dada amostra, com soluções ideias, onde as interações do
solvente com o material de interesse possam ser consideradas nulas.

1.4 FUNDAMENTOS DA ANÁLISE

A análise em GPC acoplada aos infinitos detectores, tem por objetivo o estudo de
partículas em solução.
O polissacarídeo em solução a ser analisado é carreado pelo solvente até uma
coluna, ou uma série de colunas recheadas de material poroso. A separação ideal,
por tamanho, dar-se pela permeabilidade diferencial pelos poros. Em geral,
moléculas maiores possuem tempo de retenção reduzido quando comparado as
demais, aparecendo primeiro no período de eluição, a qual é contemplado ao final
por moléculas bem menores. (KOSTANSKI, KELLER, HAMIELEC, 2004).
Como a coluna em gel realiza a separação das massas por tamanho, cada fração
obtida é enviada ao detector, a luz laser. Assim, os multiângulos medem
instantaneamente a intensidade espalhada.
Caso possua um detector de refração (IR) acoplado ao conjunto, o mesmo fornece
a concentração da solução polimérica e a taxa de recuperação, que corresponde
a subtração da massa estimada (solubilizada e previamente purificada) pela
concentração real (material detectado pelo detector IR)(SALVALAGGIO, 2010)

1.4.1 Mw e Mn
Mw- Massa ponderal media em peso
Mn- Massa ponderal média em número
1.4.2 dndc
Dndc, trata-se da variação do índice de refração(dn) em relação a variação da
concentração (dc) de cada solução polimérica a ter a massa molecular absoluta
determinada. ( RODRIGUES, 1997)
1.4.3 Raio de giro
Trata-se da distância de rotação em torno de um eixo fixo no espaço. Assim,
qualquer partícula em solução ou em suspensão pode apresentar um número
infinito de raios de giro. Temos assim, que o raio de giro estipula o tamanho da
cadeia polimérica (WYATT, 1993).
Galactomananas altamente substituídas resultam em valores de viscosidade
intrínseca e raio de giro reduzidos, quando comparados a polissacarídeos pouco
substituídos.

1.4.4 Polidispersão
A polidispersão ou a dispersão bruta de massa molar, obtida pela relação de Mw/Mn,
que ocorre devido a variações estruturas, como: grau de substituição, padronização
da substituição e grau de polimerização. Variações essas, importantes para a
aplicabilidade comercial, dependente da biossíntese da fonte de reserva da planta
relacionada as distribuições intra e intermoleculares.

1.5 PEPARO DE AMOSTRA

Por se tratar de uma técnica que exige alto grau de pureza nas amostras injetadas,
tem-se a necessidade de filtração e tratamento da amostra.
Sabe-se que polissacarídeos tendem a formar agregados quando solubilizados em
água, devido as numerosas ligações de hidrogênio intermoleculares. A agregação
dificultada a caracterização de polímeros nas soluções poliméricas. Para isso, é
possível utilizar alguns métodos físicos para amenizar a presença de agregados,
como: filtração, aquecimento, centrifugação, entre outros.
Segundo estudos, observa-se que a presença de agregados influi na
reprodutividade dos resultados obtidos pelo GPC, para massa molar, a qual, quando
amenizados, aumento tal reprodutividade. Tem-se assim, uma estreita relação
entre solubilização e formação de agregados.
Existe a defesa que, a presença de agregados em soluções poliméricas muito
concentradas ou quando ocorre baixa solubilização, não apresentam possível
caracterização por espalhamento de luz. O fato se deve que mesmo uma pequena
quantidade de agregado pode gerar resultados discrepantes de massa molar,
sabendo-se que intensidade de luz espalhada é proporcional a massa molecular
média.
A detecção por Malls-IR, mostra-se sensível a presença de agregados em soluções
e polímeros como galactomananas. Agregados , que em geral são
“ombros” no pico de espalhamento de luz, indicam massas muito polidispersas
devido a diferentes populações(LANG, BURCHARD, 1993; CHENG, BROWN,
PRUD’ HOMME, 2002).
Segundo Ganter e Wang, a presença de agregados em soluções polimérica,
envolvendo galactomananas, é inevitável. Tendo a ocorrência de ligações de
hidrogênio entre os grupos hidroxilas. (GANTER, SABBI, REED, 2001; WANG et
al., 2005).
Buscando obter êxito na análise, Salvalaggio et. al. 2010, incluiu ao protocolo de
análise por espalhamento de luz, a centrifugação, filtração em membrana com
porosidade de 1,2 µm e seguida por 0,45 µm.
Outro fator interessante quando tratamos de preparo da amostra é a escolha da
fase móvel, e dos parâmetros que nos mostra isso é o segundo coeficiente virial
(A2) está presente na equação de Rayleigh/Debye/Gans e busca a relação entra a
intensidade de luz espalhada com propriedades físico-químicas da molécula.Com
isso, o mesmo classifica a qualidade do solvente. Quanto menor for o valor de A2,
melhor será o solvente (KOSTANSKI, KELLER, HAMIELEC, 2004). Logo, este
parâmetro é obtido pela interação polímero-solvente.

1.6 OBSTÁCULOS A ANÁLISE DE POLISSACARÍDEO POR GPC

SALVALAGGIO et al. 2010, realizou um estudo para otimizar a análise e sua
confiabilidade, estudando o efeito da filtração sobre a concentração e a formação
de agregados, já que sua desconfiança era que houvesse uma redução na
concentração e nos agregados presentes nas mesmas com as sequenciais
filtrações. Seu estudo permitiu concluir que há variação dos aspectos de massa
observado e nos sinais nos detectores para cada origem de galactomananas, Mas
observa-se uma ligeira redução de RI em materiais menos substituídos, sugerindo
diminuição na concentração com a redução do porosidade do filtro em outros caso,
um aumento no sinal de RI combinado a redução na intensidade do sinal de
espalhamento de luz, levando a crer que a amostra apresentava pouco agregados,
que fora desfeitos, diminuindo o efeito de espalhamento , mas aumentando a
concentração do bipolímero em solução, contudo não significativo estatisticamente.
Quanto a recuperação de massa, sua redução dar-se por alguns possíveis fatores:
parâmetro em função ao tempo, sugerindo que a quantidade de polissacarídeo
reduz ao longo do tempo; teor de polímero presente na amostra e sua impureza;
solubilização insuficiente; perda de amostra por adsorção na coluna e percentual de
concentração perdidos pela coluna, que é a concentração real de análise(
POLLARD, 2010).
Referente há presença de agregados e sua influência sobre a massa molar, tem-se
o uso do estudo de parâmetros de raio de giro(z) proveniente da análise por GPC
com o raio de giro proveniente de análise reológica Rg(ղ) é interessante para dada
análise.
Além de tudo isso, é válido ressaltar que estudos revelam que os polímeros sofrem
cisalhamento na coluna , durante sua passagem, eliminando assim possíveis
agregados.

2 BIBIOGRAFIA
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structure of food hydrocolloids. Food hydrocolloids, v. 20, p. 369-377, 2006.
 CHENG, Y.; BROWN, K.M.; PRUD’HOMME, R.K. Characterization and
intermolecular interactions of hydroxypropyl guar solutions.
Biomacromolecules, v. 3, p. 456–461, 2002.
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GILBERT, R.G.; CASTIGNOLLES, P. Separation of complex branched
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 GANTER, J.L.M.; ZAWADZKI-BAGGIO, S.F.; LEITNER, S.C.S.;
SIERAKOWSKI, M.-R.; REICHER, F. Structural studies on galactomannans
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Biochemical and Biophysical Methods, v. 58, p. 159-186, 2004.
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techniques. Materials Science and Engineering, v. 29, n. 2, p. 452-457, 2009.
 RODRIGUES, N.R. Desenvolvimento analítico e determinação da
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Dimorphandra mollis, por cromatografia de permeação em gel. Dissertação
(Mestrado em tecnologia de alimentos). Universidade Estadual de Campinas,
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 SALVALAGGIO,M.O. galactomananas de sementes de espécies brasileiras:
otimização da extração, caracterização físico-quimica e por espalhamento de
luz. Dissertação (Pós-graduação em Ciências – Bioquímica). Universidade
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 SEMENOVA, M.G. Thermodynamic analysis of the impact of molecular
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Doutorado em Ciências – UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE
JANEIRO.
 WYATT, P.J. Light scattering and the absolute characterization of
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