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BRUNO CAMOLESE VIVANCO

CCR5 EXPRESSO EM CÉLULAS B-1 PROMOVE

RESISTÊNCIA AO DESENVOLVIMENTO DO MELANOMA
MURINO

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo para obtenção
do título de Doutor em Ciências.

São Paulo
2012
 6
BRUNO CAMOLESE VIVANCO

CCR5 EXPRESSO EM CÉLULAS B-1 PROMOVE

RESISTÊNCIA AO DESENVOLVIMENTO DO MELANOMA
MURINO

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. José Daniel Lopes

Co-orientadora: Jane Tomimori
Co-orientadora: Patricia Xander Batista

São Paulo
2012
 iii

Aos meus pais e irmã...

...que sempre me ajudaram nos

momentos de angústia e se alegraram
diante de minhas conquistas
 iv

AGRADEÇO

Primeiramente ao meu orientador que me guiou durante anos

nos caminhos da ciência. Me acalmando em momentos de
desespero e me desesperando em momentos de uma calma
perigosa. O profissional que sou hoje como é em grande parte
devido a ele.
Aos meu pais, sem eles nunca teria ido tão longe e tampouco
teria tanto ainda para trilhar.
A minha irmã, que como todo irmão temos desavenças, mas
os que laços de amor inquebráveis nos une para toda a vida.
Meus avós, segundos pais, retentores das mais lindas e
gratificantes memórias de minha vida e que contribuiram para me
manter sensível em um mundo por muitas vezes hostil.
Ao prof. Mario, que me demonstrou, como prova viva, que o
amor pela ciência não precisa desaparecer com a vida adulta. A
profa. Paty que me ajudou durante todos os momentos turbulentos.
Aos outros professores da disciplina de Imunologia que sempre me
ajudaram.
A Márcia, minha companheira desde o início na vida
acadêmica e com a qual passei momentos bons, tristes,
engraçados, assustadores e “sabe-se lá mais o que”. Aos grandes
amigos que ganhei: David, Leandro, Maísa, Anuska, Juliana, Elisa,
Paty, Toshie, Vanessa, Lili, Fernanda, Lika, Talita, Flavio e muitos
outros.
Aos amigos de longa data: Pati, Jorge, Cedro, Rafael, Raquel
e Luana. E a meus amigos/irmãos: Michel e Kaé.
Aos funcionarios, sendo que sem eles, nada poderia ou seria
feito: Geo, Creuza, Dina, Rafa, Ivone, Cido e claro, Zélia.
Cada um de vocês é responsável pelo que sou hoje.
 v

“Millions saw the apple fall, but Newton was the one who asked
why.”

Bernard Mannes Baruch

New York Post, 24-06-1965
 vi

Resumo

O melanoma é a neoplasia resultante da malignização de melanócitos.

Após perda do controle exercido por queratinócitos, melanócitos
transformados deixam a epiderme, estabelecendo comunicação com
componentes estromais da derme e outras células. Foi demonstrado por nosso
grupo que células de melanoma murino da linhagem B16F10, quando em
contato físico com células B-1, têm seu potencial metastático aumentado.
Porém o mecanismo pelo qual células B-1 migram até o foco de melanoma é
desconhecido. Objetivo: avaliar a influência do CCR5 expresso em células B-1
na evolução do melanoma induzido por células B16F10. Resultados: o
presente trabalho demonstrou que células B16F10 liberam fatores solúveis, os
quais são quimioatraentes para células B-1. Demonstrou-se também que 10%
das células B-1 peritoneais expressam o receptor de quimiocina CCR5 em sua
superfície. Estas por sua vez, quando inoculadas em animais CCR5-/- resultam
em diminuição do número de nódulos metastáticos resultantes da inoculação
de células B16F10. Além disso, este tratamento promove menor taxa de
crescimento tumoral subcutâneo, aumentando a sobrevida destes animais.
Conclusão: o trabalho contribuiu para o melhor entendimento da quimiotaxia
de células B-1 e a influência desta migração em modelo de melanoma.
 vii

Abstract

Melanoma is a skin neoplasia arising from melanocytes that become

malignant. After loss of keratinocytes control, transformed melanocytes leave
the epidermis, establishing communication with stromal components of the
dermis and other cells. It has been shown by our group that B16F10 murine
melanoma cell line, after physical contact with B-1 cells have increased
metastatic potential. However the mechanism by which B-1 cells migrate
towards melanoma cells is unknown. Objective: The aim of the work was to
evaluate the influence of CCR5 expressed in B-1 cells on the course of B16F10
cells melanoma. Results: The present study demonstrated that B16F10 cells
release soluble factors that are chemoattractant for B-1 cells. It was
demonstrated that 10% of peritoneal B-1 cells express the chemokine receptor
CCR5 on their surface. These cells, when inoculated into animals CCR5-/-,leads
to in a decrease in the number of metastatic nodules resulting from inoculation
with B16F10 cells. Moreover, this approach promotes reduced rate of
subcutaneous tumor growth, increasing the survival of the animals.
Conclusion: this work contributed to a better understanding of B-1 cells
chemotaxis and the influence of migration in melanoma model.
 viii

Lista de figuras

Figura 1 - Análise de microarray entre células B16F10 e células B16F10 após o

contato com células B-1.. .......................................................................................... 31
Figura 2 - Presença de RANTES no sobrenadante da cultura de células
B16F10 ...................................................................................................................... 33
Figura 3 - Eficiência e especificidade dos primers para os genes ccr5 e arbp.. ........ 35
Figura 4 - Validação com gene de referência. ........................................................... 36
Figura 5 - Amplificação do cDNA de células B-1 para o gene decodificador de
CCR5 e ARBP ........................................................................................................... 37
Figura 6 - Expressão fenotípica de CCR5 na superfície de células B-1 .................... 39
Figura 7 - Quantificação de células B-1 migratórias. ................................................. 42
Figura 8 - Células B-1 wild-type modulam o potencial metastático de células
B16F10 em animais knockout para CCR5. ............................................................... 45
Figura 9 - Inoculação de B-1 wild type em animais wild type. ................................... 47
Figura 10 - Expressão de MHC de classe I em células B16F10. .............................. 53
 ix

Lista de tabelas

Tabela 1 - Marcadores utilizados para caracterização das populações celulares

inseridas à esquerda. NA - não se aplica. ................................................................. 21
Tabela 2 - Sequências oligonucleotídicas dos primers direto e reverso dos
transcritos estudados por RT-PCR em tempo real .................................................... 26
Tabelas 3 A e B – Diferenças populacionais entre animais C57Bl/6 wild type e
CCR5 knockout. ........................................................................................................ 46
 x

Lista de abreviaturas

APC - aloficocianina
BSA - albumina de soro bovino
cDNA - fita de DNA complementar
CT - cicle threshold
DEPC - dietilpirocarbonato
DNA - ácido desoxiribunocléico
EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA - enzyme linked immuno sorbent assay
FACS - fluorescence-activated cell sorting
FITC - isotiocianato de fluoresceína
g – força g
gDNA – DNA genômico
GFP – Green fluorescent protein
i.p. – intraperitoneal
i.v. - intravenoso
Ig - imunoglobulina
Kda - kilodalton
KO - knockout
MHC – major histocompatibility complex
min - minuto
mL - mililitro
mRNA – RNA mensageiro
N - normal
NK – natural killer
nm - nanômetro
OPD - O-Fenilenodiamina
pb – pares de base
PBS - phosphate buffered saline
PCR – reação em cadeia da polimerase
PE - ficoeritrina
PerCP - peridinin chlorphyll protein
PFA - paraformaldeído
q.s.p. - quantidade suficiente para
qPCR - PCR quantitativo
R-10 – RPMI acrescido de 10% de SFB
RANTES - Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and
Secreted
RNA – ácido desoxiribunocléico
RPM – rotações por minuto
SFB – soro fetal bovino
TRIS - tris(hidroximetil)aminometano
WT - wildtype
 xi

µl - microlitro
µm - micrômetro
 xii

Sumário

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 1
1.1. CONTEXTO HISTÓRICO ....................................................................................................... 1
1.2. FATORES PREPONDERANTES E DIAGNÓSTICO ................................................................. 2
1.3. DO MELANÓCITO NORMAL AO TUMORAL .............................................................................. 3
1.4. INTERAÇÕES CELULARES COM O MELANOMA ....................................................................... 6
1.5. CÉLULAS B-1 E SUAS CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS E FUNCIONAIS ................................... 7
1.6. QUIMIOCINAS E SUA INFLUÊNCIA EM TUMORES .................................................................. 10
2. OBJETIVO .............................................................................................................................. 14
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................... 14
3. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 15
3.1. SOLUÇÕES PRINCIPAIS E ROTINEIRAS ................................................................................... 15
3.1.1. Soluções para ensaio de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ............... 15
3.1.2. Soluções para citometria e purificação ...................................................................... 16
3.1.3. Soluções para biologia molecular .............................................................................. 16
3.2 REAGENTES ......................................................................................................................... 16
3.3. ANTICORPOS:...................................................................................................................... 17
3.4 MEIOS DE CULTURA .............................................................................................................. 17
3.5. ANIMAIS .............................................................................................................................. 18
3.6. CULTURA DE CÉLULAS DE MAMÍFERO .................................................................................... 18
3.6.1. Cultura de células ...................................................................................................... 18
3.6.2 Congelamento e descongelamento de células de mamíferos .................................... 19
3.7 OBTENÇÃO DE CÉLULAS B-1 PERITONEAIS ............................................................................. 19
3.8 FENOTIPAGEM CELULAR........................................................................................................ 20
3.9. PURIFICAÇÃO DE CÉLULAS ................................................................................................... 21
3.10. ENZIME-LINKED IMMUNESORBENT ASSAY (ELISA) PARA DETECÇÃO DE CCL5 .................... 22
3.11. REAL-TIME PCR................................................................................................................ 22
3.11.1. Obtenção de RNA total ............................................................................................ 23
3.11.2 Produção do cDNA ................................................................................................... 24
3.11.3 Extração de DNA genômico (gDNA)......................................................................... 24
3.11.4 Análise quantitativa por RT-PCR em tempo real ...................................................... 25
3.12. ENSAIO DE MIGRAÇÃO CELULAR IN VITRO DE CÉLULAS B-1................................................... 26
3.13 EXPERIMENTOS DE TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE LINFÓCITOS B-1......................................... 27
3.14 ENSAIOS DE METÁSTASE EXPERIMENTAL: ............................................................................ 28
3.15 ANÁLISES ESTATÍSTICAS: .................................................................................................... 28
4. RESULTADOS ........................................................................................................................ 30
4.1. CÉLULAS B16F10 TRANSCREVEM O GENE PARA RANTES .................................................... 30
4.2. CÉLULAS B16F10 SECRETAM CCL5 CONSTITUTIVAMENTE .................................................... 32
4.3. PCR QUANTITATIVO (QPCR) DO GENE CODIFICADOR DE CCR5 EM CÉLULAS B-1 ................... 34
4.4. EXPRESSÃO FENOTÍPICA DE CCR5 NA SUPERFÍCIE DE CÉLULAS B-1 ...................................... 38
4.5. CÉLULAS B16F10 ATRAEM CÉLULAS B-1 MEDIANTE FATORES SOLÚVEIS ................................ 40
4.6. CÉLULAS B-1 WILD-TYPE INFLUENCIAM A EVOLUÇÃO DA METÁSTASE PULMONAR EM ANIMAIS
KNOCKOUT PARA CCR5 ............................................................................................................. 43
4.6. EXPRESSÃO DE MHC DE CLASSE I EM CÉLULAS B16F10 ...................................................... 48
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 54
6. CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 63
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 64
 1

1. INTRODUÇÃO

O melanoma é uma neoplasia potencialmente letal que acomete

populações relativamente jovens (até 30 anos) (Parker, Tong et al., 1997). No

Brasil, neoplasias cutâneas são as mais frequentes, contabilizando 25% dos

tumores registrados. Destes, 4% são representados por melanoma. Em 2009,

foram registradas 1.392 mortes pela neoplasia e estima-se que em 2012

haverá 6230 novos casos segundo o Instituto Nacional de Combate ao Câncer

(INCA).

1.1. Contexto histórico

Seu primeiro registro é creditado a Hipócrates (século 5 A.C). A

próxima menção do tema é creditada a Rufo de Éfeso (60? – 120? A.C.),

médico grego conhecido por sua influência nos campos da anatomia e

patologia, nos quais contribuiu fornecendo descrições de efeitos fisiológicos,

orgãos e alguns canceres cutâneos, incluindo o melanoma (Urteaga e Pack,

1966). Em seu livro “Physiognomie and Chiromancie, Metoposcopie, The

Symmetrical Proportions and signal Moles of the Body”, Saunders (1671, apud

Bennett e Hall, 1994), relacionou a cor e localização anatômica de nevo com a

personalidade do indivíduo; um exemplo segundo ele é que um nevo

localizado entre a pálpebra esquerda e o nariz, significa que o indivíduo é um

assassino e, no caso do nevo ser negro, denota que a vítima será/foi um

parente. Urteaga e Pack (1966) mostraram achados arqueológicos nos quais

múmias Incas exibiam metástases por melanoma nos ossos.

 2

Somente em 1806 o melanoma foi descrito efetivamente como doença

por René Laennec, cirurgião da Faculdade de Medicina de Paris em memorial

não publicado da mesma faculdade. Seis anos depois, o melanoma foi

caracterizado com detalhes e nomeado "la melanose", devido à sua cor

(Laennec, 1812 apud Bernnett e Hall, 1994). Em 1820, William Norris

descreveu em seu artigo “A case of fungoid disease” a progressão do

melanoma por 3 anos até a morte do indivíduo, sendo uma rica descrição

clínica para a época (Norris, W., 1820 apud Pemberton, O., 1858; Norris, W.,

1820 apud Bernnet e Hall, 1994).

Em 1858, Pemberton executou e publicou o caso de largas e

profundas excisões de melanoma maligno, conceito considerado 100 anos

após como a técnica cirúrgica amplamente utilizada como tratamento para

melanoma maligno cutâneo e ocular (Pemberton, 1858).

1.2. Fatores preponderantes e diagnóstico

De acordo com a Sociedade Americana de Câncer (American

Cancer Society : ACS), alguns fatores são muito influentes no estabelecimento

e evolução da doença: (i) exposição ao sol : índices maiores que 2 de UV são

nocivos; (ii) síndrome do nevo displásico: nevos atípicos geralmente com

bordas mal definidas e pigmentação diferenciada; (iii) sardas; (iv) cabelos

claros: individuos ruivos tem maior tendência a desenvolver melanomas; (v)

histórico familiar da doença; (vi) imunosupressão; (vii) idade: indivíduos com

menos de 30 anos têm maior facilidade de desenvolver melanoma,

diferentemente dos outros tipos de tumores; (viii) sexo: homens são mais

predispostos; (ix) xeroderma pigmentoso: condição resultante de defeito em

enzima de reparo do DNA, facilitando assim, mutações no código genético;

 3

(x) histórico de melanoma: pessoas que já tiveram a doença são rnais

propensas a desenvolvê-Ia novamente.

Segundo o American Joint Committee on Cancer (AJCC), o estágio da

evolução do melanoma no indivíduo é dado mediante a classificação TNM. O

estágio T compreende o tumor na pele; o estagio N significa que células de

melanoma podem ser encontradas no(s) linfonodo(s); e a fase M corresponde a

metástase para outros tecidos distantes. Para a avaliação de T, hoje, são

utilizados os seguintes fatores: profundidade do tumor (Breslow, 1969);

presença ou não de ulceração e índice mitótico, que substituiu o nível de Clark

(Clark, From et al., 1969) no último manual de classificação (Balch,

Gershenwald et al., 2009). Sua classifiação vai de T1 a T4 (espessura maior

que 4mm). A categoria N é avaliada quanto ao números de linfonodos

comprometidos por metástase. Este nível segue de N0 a N3. “M” corresponde

à mestástase per se. Esta classificação possui dois itens: ausência de

metástase (M0) ou presença (M1) de metástase em outros locais que não

linfonodos. A diferença entre as subdivisões de M está no local metastatizado

(M1a: pele distante e subcutâneo; M1b: pulmões) ou nos níveis séricos de

lactato desidrogenase (LDH) ), cuja concentração no sangue está inversamente

relacionada com a sobrevida de indivíduos com metástase. Dependendo das

características das categorias TNM, atribui-se um nível, de I a IV, ao estágio da

neoplasia referente à mortalidade ocorrida em indivíduos com aquelas

características. Desta forma o estágio IV corresponde ao último nível do

melanoma, no qual as células tumorais desenvolveram capacidade metastática

e a taxa de mortalidade é bastante alta (Balch, Gershenwald et al., 2009).

1.3. Do melanócito normal ao tumoral

 4

Melanoma corresponde à neoplasia resultante da malignização de

melanócitos. Advindos da crista neural, eles migram durante desenvolvimento

embriológico para a pele, mucosa ectodérmica, úvea e meninges. De acordo

com sua origem e evolução, o melanoma pode ser cutâneo, ocular, de

mucosas e de meninges (Gomes, 1997).

A progressão tumoral, transformação de um melanócito normal a um

neoplásico, é o resultado de uma cascata de eventos mutacionais. Mediante

fatores como raios Ultra-violeta do tipo B (UVB) (De Fabo, Noonan et al.,

2004), ocorrem mutações em um ou mais genes, conferindo algumas

alterações fenotípicas à célula, até então, normal. Segundo Hanahan e

Weinberg, 2000 há seis alterações essenciais na funcionalidade da célula

normal para conferir-lhe malignidade: auto-suficiência para sinais de

proliferação; insensibilidade à sinais anti-proliferativos; evasão de apoptose;

potencial replicativo ilimitado; angiogênese; e invasão tecidual/metástase.

Na pele, melanócitos normais permanecem sob controle de

queratinócitos por intermédio de contato célula-célula mediado por E-caderina,

molécula cuja expressão é bem diminuída em melanomas. Após perda do

controle exercido por queratinócitos, melanócitos transformados deixam

a epiderme, estabelecendo comunicação com fibroblastos, células

endoteliais e outros componentes estromais da derme. Estes por sua vez,

liberarn fatores de crescimento e produzem proteínas da matriz-extracelular,

que promovem crescimento e aumento da invasividade em melanócitos

transformados (Bogenrieder e Herlyn, 2002).

 5

Oba-Shinjo et al. (2006) demonstraram que, ao bloquear a adesão de

melanócitos normais à placa de cultura por 5 passagens, estas células

passaram a desenvolver capacidade tumorigênica, tornando-se células de

melanoma. Aparentemente o bloqueio de anoikis, termo cunhado por Frisch e

Francis, 1994 representando a morte pelo impedimento de adesão, ocorre em

resposta ao estresse oxidativo, causando desmetilação do DNA juntamente

com o aumento de expressão de TIMP1 (inibitor tecidual de metaloproteinase

1) (Campos, Molognoni et al., 2007; Ricca, Liang et al., 2009).

Durante desenvolvimento da neoplasia, as metástases correspondem

à fase mais crítica da doença e de maior dificuldade às intervenções

terapêuticas com agentes quimioterápicos (Mays e Nelson, 1999;

Rusthoven, Quirt et al., 1996), uma vez que pacientes sucumbem aos

múltiplos tumores secundários e não necessariamente ao tumor primário

(Weiss, 1977). Segundo Dorland (1965), metástase pode ser definida como

migração de células tumorais a partir de sua origem até órgãos secundários,

espalhando-se pelo organismo através do sistema sanguíneo ou linfático

para colonização de novos tecidos, estabelecendo colônias à distância e em

outros tecidos (Dorland, 1965; (Qian, Zhang et al., 2005).

A partir da linhagem parental B16, células de melanoma geradas

espontaneamente em camundongos C57Bl/6 e isoladas por Isaiah Fidler

(1973), foi desenvolvida a variante B16F10, amplamente utilizada como modelo

de metástase experimental. Para tanto, células B16 foram injetadas

endovenosamente em camundongos singênicos e, após três semanas, as

primeiras colônias formadas no pulmão foram dissecadas e cultivadas in vitro.

Esta primeira variante selecionada in vivo, B16F1, foi re-injetada em novos

 6

animais e após três semanas colônias pulmonares foram retiradas para

recultivo. Deste modo, dez variantes com crescente potencial metastático

foram criadas, uma vez que células B16F10 apresentaram capacidade

bastante superior à linhagem parental para metastatização (Fidler, 1978).

1.4. Interações celulares com o melanoma

Diferentes elementos influenciam a evolução do melanoma. Zheng et

al. (2009) demonstraram que plaquetas recobrem células tumorais com

camadas de fibrinogênio, evitando o contato e/ou citotoxicidade de células NK.

Macrófagos também podem influênciar o melanoma. Gazzaniga et al. (2007),

quando inibiram a migração de macrófagos para o sítio do melanoma por

proteína quimiotática de monócitos (MCP-1), reduziram o crescimento tumoral

e geraram grande massa tumoral necrótica. Também foi demonstrado que

mastócitos modulam crescimento tumoral de células de melanoma mediante

produção de heparina, inibindo a trombose local (Samoszuk, Corwin et al.,

2003). Além destas, outras células contribuem para a promoção ou inibição do

crescimento e/ou metástase das células tumorais (De Visser, Eichten et al.,

2006).

Foi demonstrado por nosso grupo que células de melanoma murino

da linhagem B16F10, quando colocadas em contato com células B-1 in vitro,

têm seu potencial metastático aumentado, conforme observado in vivo após

inoculação de células B16F10 do co-cultivo em camundongos isogênicos

C57Bl/6 (Staquicini, Tandle et al., 2008). Demonstrou-se também a

importância do contato célula-célula para induzir aumento da malignidade de

células B16F10, uma vez que, quando cultivadas separadamente em ensaio de

transwell®, não houve qualquer aumento da capacidade metastática

 7

daquelas células. Esses resultados mostraram que, in vitro, células B-1

participam do desenvolvimento metastático de células B16F10 e esta atividade

não depende de fatores solúveis liberados no sobrenadante, porquanto

depende da interação física entre as células estudadas, aparentemente

mediante glicoproteína MUC-18, encontrada na superfície de ambas as células.

Mills e col. (2002) mostraram que ao bloquear MUC-18 em células de

melanoma humano, a capacidade destas células penetrarem em Matrigel® é

diminuída, indicando que MUC- 18 também influencia na sua capacidade

metastática.

Nosso grupo também demonstrou que a interação física entre células

B-1 e B16F10 leva ao aumento da expressão de genes relacionados com

metástase (mmp-9 e cxcr4) (Perez, Machado et al., 2008).

1.5. Células B-1 e suas características fenotípicas e funcionais

A nomenclatura de células B-1 e B-2 (células B convencionais) foi

proposta por Herzenberg e Kantor (1992) para designar duas populações

distintas de células B. Células B-1 são caracterizadas por apresentarem em sua

superfície, CD43, CD11b, CD19, ausência de CD23, IgMHI além de B220LO e

IgD. Células B-2 (células B convencionais) expressam B220HI, IgD, CD23 e IgMLO

(Herzenberg, Stall et al., 1986); (Hardy e Hayakawa, 2001). Além da

diferença de marcadores de superficie, células B-1 apresentam altos níveis de

expressão dos genes VH11 e VH12 da cadeia pesada variável, enquanto

células B-2 não compartilham esta característica. Estas cadeias, expressas

em 10-15% das células B-1 peritoneais, proporcionam especificidade contra

o fosfolipídeo de membrana fosfatidilcolina, característica ausente em células

B-2 (Mercolino, Locke et al., 1989). Enquanto linfócitos B-2 necessitam da

 8

interleucina-7 (IL-7) para seu desenvolvimento, células B-1 são geradas

mediante linfopoietina tímica estromal (TSLP) na ausência de IL-7

(Dorshkind e Montecino-Rodriguez, 2007)

Em camundongos adultos, células B-1 são encontradas principalmente

nas cavidades peritoneal e pleural e em menor quantidade no baço e estão

ausentes nos linfonodos e no sangue periférico (Hayakawa, Hardy et al., 1983;

Hayakawa, Hardy et al., 1986; Marcos, Huetz et al., 1989). Outrossim,

secretam constitutivamente anticorpos naturais com maior afinidade pelo

antígeno que os secretados por células B-2 e estes tornam-se parte da defesa

pela imunidade inata contra patógenos (Baumgarth, Tung et al., 2005). Podem

também adquirir função de osteoclastogênese e reabsorção óssea semelhante

a osteoclastos (Pugliese, Gonçalves et al., 2012). Células B-1 esplênicas nem

sempre apresentam a característica fenotípica das B-1 peritoniais, não

expressando CD11b. Sendo assim, identificação dessas células baseia-se em

outros marcadores que incluem CD5, CD21, CD23, CD43 e AA4.1 (Montecino-

Rodriguez e Dorshkind, 2006). Depois de gerados, os linfócitos B-1 possuem

longo período de vida e capacidade de auto-renovação. Estudos recentes com

camundongos SCID, injetados com progenitores celulares marcados,

revelaram que fígado fetal é fonte tanto de linfócitos B-1 quanto de B-2

(Haughton, Arnold et al., 1993).

Células B-1 podem ser divididas em dois subgrupos de células, B-1a e

B-1b. O primeiro subgrupo, B-1a, difere fenotipicamente por expressar CD5

em sua superfície. Também possui função especifica no combate a certos

patógenos, como Streptococcus pneumoniae. Neste contexto B-1a, mediante

produção da anticorpos naturais, protege inicialmente camundongos

 9

infectados com a bactéria em fase aguda, e é falha na proteção por longo

período. Kendall et al. (2004) mostraram que células B-1 podem influenciar o

processo de diabetes. Segundo eles, a depleção de células B-1a peritoneais

levou a um atraso na evolução de diabetes.

Células B-1b exercem papel crucial na resposta adaptativa mediada

por anticorpos, pela proteção por longos períodos e memória

imunológica(Haas et al., 2005). Haas et al. (2005) demonstraram que animais,

com populações de células B-1b e sem a subpopulação B-1a, imunizados com

antígeno timo-independente específico, são protegidos contra posteriores

infecções contra Streptococcus pneumoniae mediante IgM e IgG3 específicos

contra PPS-3 (polisacarídeo pneumocócico do tipo 3). Possuem potencial

para se diferenciarem em fagócitos mononucleares in vitro e expressar

fatores de transcrição inerentes a células mielóides e linfóides (Popi, Motta

et al., 2009). Também têm melhor capacidade reconstitutiva de sua

população do que de células B-1a. Foi demonstrado em camundongos Xid

(animais desprovidos de células B-1) que interleucina 9 (IL-9) pode induzir

expansão de células B-1b, porém não as funções totais das células B-1.

Em camundongos wild-type, ambas populações (B-1a e B-1b) são expandidas

e mantém suas funções normalmente (Knoops, Louahed et al., 2004).

Além dessas duas subpopulações já caracterizadas, foi descrita por

Hastings et al. (2006) uma terceira, na ocasião nomeada por B-1c: células

CD5+ e CD11b- peritoneais que secretam altos níveis de IgM

espontaneamente. Porém, em 2008, Ghosn et al. demonstraram que células

com fenótipo de células B-1 exceto pela ausência de CD11b correspondem a

 10

um estágio de sua maturação, surgindo anteriormente às CD11b+ durante a

ontogenia.

Almeida et al. (2001) demonstraram que células B-1 estão presentes

no sobrenadante de cultura de células peritoneais aderentes do camundongo.

Demonstraram ainda que essas células multiplicam-se in vitro e são

morfologicamente pequenas (8 a 30 µm), arrendondadas, radio-sensíveis,

sendo que a irradiação dos animais (700 cGy) depleta os linfócitos B-1 da

cavidade peritoneal. O recultivo dessas células induz a expressão de

características fenotípicas e fisiológicas de fagócitos mononucleares. O papel

destas células na resposta inflamatória ainda é desconhecido. Contudo,

Bogsan et al. (2005) demonstraram migração para foco inflamatório

inespecífico induzido pela implantação de lamínula subcutaneamente no dorso

de camundongos Balb/C.

Novas evidências sugerem que células B-1 podem abandonar a

cavidade peritoneal e migrar para outros tecidos, conforme observado em

lesões do peridonto em seres humanos; em lesões intermediadas por

hipersensibilidade tardia em camundongos (Askenase, Kawikova et al., 1999);

em linfonodos mesentéricos e em lâmina própria (Fagarasan, Shinkura et al.,

2000; Watanabe, Ikuta et al., 2000).

1.6. Quimiocinas e sua influência em tumores

A migração de células, em sua maioria, não é aleatória e depende de

fatores solúveis liberados no sítio para qual as células devem se deslocar.

Estes fatores solúveis compreendem as quimiocinas, que podem ser

produzidas por ampla variedade de tipos celulares, do sistema imunológico ou

não (Roitt, 2003). São moléculas relativamente pequenas (~8–14 kDa) que
 11

geram quimioatração (tropismo químico) mediante ligação a receptores com

sete passagens transmembrânicas e acoplados à proteína G. São agrupadas

e nomeadas com base na disposição de seus dois primeiros, dos quatro

iniciais, resíduos N-terminais de cisteína. Para uma quimiocina com as duas

primeiras cisteínas adjacentes, nomeia-se CC. Já CXCs possuem outro

aminoácido que não cisteína entre as duas e CX3C possuem três entre

ambas. Algumas quimiocinas carecem de 3 das 4 encontradas na grande

maioria, logo recebem a denominação C. Resultam-se então 4 famílias (C,

CC, CXC e CX3C) seguidas da letra L, de ligante, ou R, referente a receptor

(Zlotnik e Yoshie, 2000).

A família das CCLs compreende grande quantidade de componentes.

Dentre eles está inserida a CCL5, também chamada de RANTES (regulated

upon activation, normal T-cell expressed, and secreted). Foi descrita

inicialmente por Schall et al. (1988) como uma molécula secretada

especificamente por células T, auxiliares ou citotóxicas, ativadas por

anticorpos e interleucina 2 (IL-2). Possui massa molecular de

aproximadamente 8 kDa e carga positiva.

Atualmente é conhecido que RANTES atua como quimioatraente para

eosinófilos, monócitos, células T de memória, basófilos, células natural killer

(NK) ativadas ou não e células dendríticas (Kameyoshi, Dorschner et al.,

1992; Schall, Bacon et al., 1990; Conti, Pang et al., 1997; Robertson, 2002;

Levy, 2009). Além disso, RANTES modula atividade de diferentes células.

Células T de animais deficientes de RANTES apresentam baixa capacidade

proliferativa (policlonal e antígeno-específica) e reatividade, além da baixa

produção de interferon-gama (IFN-γ) e IL-2 (Makino, Cook et al., 2002).

 12

Crawford et al. (2011) também demonstraram que células T CD8 RANTES-/-

têm seu potencial citotóxico vírus-específico debilitado e Villata et al. (1998)

observaram que RANTES gera atividade microbicida contra tripanossoma

pela indução de óxido nítrico em macrófagos.

Produção de RANTES é uma característica inerente à inflamação.

Sua expressão aumentada tem sido correlacionada com ampla variedade de

distúrbios de inflamação (Glabinski, Tuohy et al., 1998; Appay e Rowland-

Jones, 2001). Além destes distúrbios, o receptor CCR5 (receptor para

RANTES) pode influenciar o curso de diversos tumores. González-Martín et

al. (2011) demonstraram que o CCR5 potencializa a resposta de células T

contra tumor modulando a ativação de células T CD8 dependente de T

helpers. Tan et al. (2009) observaram que ao inibir a liberação de RANTES

pelas células tumorais ou a captação da mesma pelo receptor CCR5

resultava em menor crescimento tumoral devido à quebra do eixo RANTES-

CCR5 nas células T reguladoras. Níveis elevados de RANTES têm sido

observados em estágios avançados de carcinoma mamário, aumentando o

potencial invasivo destas células tumorais (Raman, Baugher et al., 2007).

Na evolução do melanoma, RANTES e CCR5 têm-se demonstrado

como elementos influentes. Indivíduos com melanoma em estágio IV com

CCR5 truncada (CCR5∆32) tinham maior mortalidade que indivíduos com

CCR5 normal quando tratados com pelo menos um imunoterápico, enquanto

o inverso ocorria quando os pacientes não eram submetidos ao tratamento

(Ugurel, Schrama et al., 2008). Mellado et al. (2001) observaram um

mecanismo de escape da célula de melanoma mediado por RANTES, onde

células de melanoma induzem apoptose de linfócitos infiltrantes pela

 13

interação RANTES-CCR5. Nesta situação a quimiocina provém das próprias

células infiltrantes em resposta à CXCL12 liberada pela célula tumoral.

Gough et al. (2005) observaram em seu modelo que a interação

CCL3-CCR5 induz infiltrado de células T aumentando a eficácia com que

células efetoras destroem o tumor. Richmon (2002), tendo em vista que

melanomas com alta secreção de RANTES são mais metastáticos, propõe

intervenção terapêutica pelo bloqueio de NF-κB visando a regulação negativa

de RANTES, uma vez que a quimiocina é induzida por NF-κB.

Dados na literatura demonstram que macrófagos previamente

incubados com células B-1 secretam níveis superiores de RANTES quando

comparados com macrófagos não pré-incubados. Estes também passam a

exibir perfil M2 (Wong, Puaux et al., 2010), conhecido por promover a

progressão tumoral em diversos modelos tumorais (Mantovani, Sozzani et al.,

2002).

Diante destes dados vê-se que células B-1 influenciam o aumento do

potencial metastático do melanoma. Porém os mecanismos pelos quais células

B-1 migram, resultando no contato físico com células de melanoma, é

desconhecido. Possivelmente quimiocinas medeiam este processo

direcionando células B-1 para o foco tumoral. Este trabalho traz contribuições

para melhor compreensão de pelo menos um destes mecanismos.

 14

2. OBJETIVO

O objetivo do trabalho foi avaliar a influência do receptor de

quimiocina CCR5 expresso em células B-1 na evolução do melanoma.

2.1. Objetivos específicos

- Avaliar potencial migratório de células B-1 direcionado para

células B16F10;

- Verificar a expressão do receptor CCR5 na superfície de células

B-1 peritoneais;

- Analisar a influência do CCR5 expresso em células B-1 na

frequência de nódulos pulmonares induzidos por células B16F10, crescimento

de tumor subcutâneo e sobrevida de animais.

 15

3. MATERIAL e MÉTODOS

3.1. Soluções principais e rotineiras

Neste item estão descritas as soluções rotineiramente utilizadas durante

o desenvolvimento deste trabalho. Soluções para circunstâncias específicas

estão apresentadas no capítulo correspondente.

• Solução estoque de tampão fosfato-salina (PBS): NaCl 2,7378 M, KCl

0,053 M, Na2HPO4 0,10301 M e K2HPO4 0,0229 M. A solução estoque
foi diluída 20 vezes para o uso (PBS 1X).

• PBS EDTA: PBS 1x contendo EDTA 0,002M. A solução fois estocada a

4°C e protegida da luz.

• Tampão de hemólise: NH4Cl 150mM, NaHCO3 10mM, EDTA 0,1mM

diluídos em H2O destilada.

• Tampão fosfato: 195mL de solução A (NaH2PO4.H2O 0,08M em H2O

destilada), 305mL de solução B (Na2HPO4.H2O 0,02M em H2O
destilada)e 1000mL q.s.p. de H2O destilada.

• Tampão glicina: C2H5NO2 0,15M, NaCl 0,5M. O pH foi ajustado para 2,8.

• Tampão Tris-HCl: Tris-HCl 1M em H2O destilada. O pH foi ajustado para

9.

3.1.1. Soluções para ensaio de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent

Assay)

• Solução de bloqueio: PBS 1X contendo 5% de leite desnatado em pó. A

solução foi preparada no momento do uso.
 16

• Solução de lavagem: 5% de leite desnatado em pó e Tween G (Merk)

0,1% em PBS 1x.
• Solução de revelação: OPD (o-Phenylenediamine) 0,001 M diluído em
PBS 1X.

3.1.2. Soluções para citometria e purificação

• Solução fixativa: paraformaldeído (PFA) 1% diluído em PBS 1X. Solução

estocada a -20°C.
• PBS-BSA: Albumina de soro bovino (BSA) 1% diluído em PBS 1X. A
solução foi estocada a -20°C.

• Tampão para coluna magnética (MAC): EDTA 2mM e BSA 1% diluídos

em PBS 1X. A solução foi conservada a 4°C.

3.1.3. Soluções para biologia molecular

• Água RNAse free (Sigma)

• TBE 5x: 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (Tris Base)

0,45M, ácido bórico 0,45M e 20mL de solução EDTA 0,5M (pH 8,0)

em água RNAse free. Para uso (1x) comum o TBE 5x foi diluído em

água RNAse free na proporção de 1:4.

3.2 Reagentes

Os reagentes (qualidade P.A.) utilizados foram adquiridos da Merck

(S/A), Synth, GE, Invitrogen, Applied Biosystems, Sigma Chemical CO, BD e

BioRad.
 17

3.3. Anticorpos:

Para purificação de células por sorting foram utilizados anticorpos anti-

CD23 acoplado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BD Pharmingen), anti-

CD19 acoplado a aloficocianina (APC) (BD Pharmingen) e anti-NK1.1-

acoplado a PerCP (peridinin-chlorophyll-protein complex) (BD Pharmingen).

Em purificação por beads magnéticas, foram utilizados anticorpos anti-

CD19 (acoplados a bead magnética) (Miltenyi Biotec), anti-CD23 biotinilada

(BD Pharmingen) e anti-biotina (acoplado a bead magnética).

Os anticorpos utilizados para analise de populações por citometria de

fluxo foram: anti-CD3-APC (eBioscience), anti-CD4-PerCP (eBioscience), anti-

CD8-PerCP (eBioscience), anti-NK1.1-PerCP (BD Pharmingen), anti-CD19-

APC (BD Pharmingen), anti-CD23-FITC (BD Pharmingen) e anti-CCR5

acoplado a ficoeritrina (PE).

Para ensaio de ELISA e western blotting foram utilizados anticorpos anti-

RANTES de camundongo (Abcam) e anti-IgG de rato com enzima peroxidase

acoplada (Sigma).

3.4 Meios de cultura

Os meio utilizados para cultura de células de mamíferos foram

preparados com água Mili-Q e esterilizados por filtração positiva em filtros de

0,22 µm.

• Meio RPMI: RPMI 1640 (Sigma) acrescido de ácido N-2-

hidroxietilpiperazina-N-2-etasulfônico 10 mM (HEPES – Gibco), bicarbonato

de sódio 24 mM (Sigma) e 40 µg/mL de garamicina (Schering).

 18

• Meio RPMI suplementado (R10): meio RPMI suplementado com 10% de

soro fetal bovino (SFB, Cultilab, Campinas).

• Meio de congelamento: RPMI (v/v) 45%, SFB (v/v) 45% e DMSO

(dimetilsulfóxido; diluído v/v) 10%. O meio de congelamento foi mantido

congelado a -20°C abrigado da luz.

3.5. Animais

As linhagens de camundongos C57Bl6 e BALB/c com 2 a 3 meses de

idade foram adquiridos do Centro de Desenvolvimento de Modelos Animais

(CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo. Camundongos C57Bl/6

knockouts para CCR5 (CCR5-/-) foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. João

Santana da Silva do Centro de Criação de Camundongos Especiais da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP). Todos os animais

foram mantidos no biotério da Disciplina de Imunologia do Departamento de

Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da UNIFESP e manipulados de

acordo com procedimentos padrão (NHI Guide for Care and Use of Laboratory

Animals).

3.6. Cultura de células de mamífero

3.6.1. Cultura de células

A linhagem de células de melanoma B16F10, gentilmente cedida pelo

Instituto Ludwig e linfócitos B-1 peritoneais foram cultivadas em meio R-10.

 19

Todas as culturas celulares foram mantidas em atmosfera úmida com 5 % de

CO2 a 37°C,

Células B16F10 crescidas em garrafas de cultura foram repicadas após

atingirem 90% de confluência. Para tanto, as células foram desaderidas por

incubação com PBS-EDTA, centrifugadas a 250 x g por 5 minutos e

transferidas para novas garrafas.

3.6.2 Congelamento e descongelamento de células de mamíferos

Para cada 1mL de meio de congelamento, foram suspensas 2 x 106

células B16F10 e alocadas em criotubos (Nunc). Os tubos foram armazenados

a -70°C.

Ao descongelar, a suspensão de células foi diluída 10x em RPMI e

centrifugadas a 1300 RPM por 5 minutos. O precipitado de células, ou pellet, foi

ressuspendido em 5 mL de R-10 e colocado em frasco para cultura de 25 cm2

(TPP - Techno Plastic Products).

3.7 Obtenção de células B-1 peritoneais

Células totais da cavidade peritoneal de camundongos C57Bl/6 e CCR5-

/-
foram removidas em condições assépticas com 10 ml de RPMI gelado por

animal. Em seguida as células foram transferidas para tubos cônicos de 15 ml

em banho de gelo. Após centrifugação a 370 x g por 5 min, o sobrenadante foi

retirado, as células ressuspendidas e contadas em câmara de Neubauer. Após

contagem, as células foram marcadas para citometria, purificadas ou

acondicionadas em cultura.
 20

Em alguns experimentos foram utilizadas culturas enriquecidas com

células B-1. Para tanto, células totais do peritôneo foram coletadas por lavado

peritoneal com meio RPMI-1640. As suspensões de células obtidas foram

transferidas para garrafa de cultura, onde permaneceram incubadas a 37°C por

1 hora, período de adesão celular ao plástico. Em seguida, o sobrenadante foi

removido, e meio de cultura R10 adicionado à garrafa com células aderidas. As

células foram mantidas em garrafas de cultura e incubadas a 37°C sob

atmosfera úmida de 5% de CO2 por 5 dias. Após esse período, as células B-1,

presentes no sobrenadante de cultura (ALMEIDA et al., 2001), foram utilizadas

para experimentação. A pureza da cultura foi sempre analisada por citometria

de fluxo utilizando os marcadores CD23- e CD19+.

3.8 Fenotipagem celular

Para fenotipagem, aproximadamente 106 células foram incubadas com

CD16/CD32 (BD Pharmingen) na diluição de 1:100 em 100uL por 20 minutos,

para bloqueio de receptor Fc. Em seguida, as células foram lavadas com 1 mL

de PBS-BSA. Para as marcações, foram adicionados anticorpos específicos

para os marcadores desejados em 100uL, utilizando a diluição recomendada

pelo fabricante. Após 30 minutos de incubação a 4°C as células foram lavadas

novamente e seus fenótipos adquiridos em citômetro FACSCalibur (BD -

Becton, Dickinson and Company) utilizando o software CellQuest (BD - Becton,

Dickinson and Company) ou FACSCantoII (BD - Becton, Dickinson and

Company) utlizando o software FACSDIva (BD - Becton, Dickinson and

Company). Para análise dos dados, foi utilizado o software FlowJo (Tree Star,

Inc.).
 21

Abaixo segue tabela com os marcadores utilizados para caracterização

de cada população de linfócitos (tabela 1).

CD19 CD23 CD3 CD4 CD8 NK1.1

B-1 + - NA NA NA NA
B-2 + + NA NA NA NA
NK NA NA NA NA NA +
T CD4 NA NA + + NA NA
T CD8 NA NA + NA + NA
Tabela 1 - Marcadores utilizados para caracterização das populações celulares inseridas à esquerda.
NA - não se aplica.

3.9. Purificação de células

Para separação de células B-1 por beads magnéticas, foram lavados

peritônios de camundongos com 5 a 8 mL de PBS ou RPMI. Células obtidas

deste lavado foram centrifugadas (370 x g por 5 min.) e o pellet incubado com

CD16/CD32, para bloqueio de receptor de Fc, por 15 minutos na diluição de

1:50. Resíduo de CD16/CD32 livre foi lavado e as células incubadas com

anticorpo específico para CD23 acoplados a bead magnética (Miltenyi Biotec –

Germany) na proporção de 1:100 em tampão MAC (PBS + BSA 1% + EDTA

2mM) por 30 minutos a 4°C. As células foram então p assadas por coluna

magnética (Miltenyi Biotec – Germany). A fração não aderida à coluna, ou seja,

CD23 negativas, foi lavada com tampão MAC e incubada com anti-CD19

biotinilado (Miltenyi Biotec – Germany) na diluição de 1:100 em tampão MAC

por 30 minutos a 4°C. As células foram então lavada s, incubadas novamente

 22

com anti-biotina acoplado a bead magnética e introduzidas na coluna

magnética. As células aprisionadas na coluna (CD19+) foram eluídas, lavadas e

utilizadas nos experimentos descritos.

Quando separadas por sorting, células provenientes do lavado peritonial

foram marcadas com anticorpos anti-CD23 acoplado a ficoeritrina (PE) e anti-

CD19 acoplado a aloficocianina (APC), conforme descrito no item 3.8

Utilizando o citômetro FACS ARIA e software FACSDiva, foram selecionadas

as células com expressão positiva para CD19 e negativa para CD23.

3.10. Enzime-Linked ImmuneSorbent Assay (ELISA) para detecção de

CCL5

Placas de ELISA foram sensibilizadas com 50uL de sobrenadante

proveniente da cultura de células B16F10 e com igual volume de meio de

cultura R-10 (RPMI + 10% SFB) por 48 horas a 4°C. O s poços utilizados foram

lavados 3x com 200uL de PBS e incubados com anticorpo de rato anti-mouse

CCL5 (abcam) por 1 hora a 37°C na diluição de 1:500 em PBS acrescido de

5% de BSA. Os poços foram então lavados 3x com 200uL de PBS + 5% de

BSA + Tween G a 0,1% e incubados com anticorpo secundário anti-IgG de rato

(Sigma) por 1 hora a 37°C e lavados novamente por 3 x.

A revelação foi feita adicionando 50uL de tampão OPD na concentração

de 1mg/mL. A reação de revelação foi parada com a adição de 50uL de H2SO4

a 4N.

3.11. Real-time PCR

 23

3.11.1. Obtenção de RNA total

O RNA total foi extraído de cultura enriquecida de células B-1, obtidas de

acordo com a metodologia descrita no item 3.7. O Trizol® Reagent (Invitrogen)

foi utilizado para a obtenção do RNA total, seguindo as especificações do

fabricante com algumas modificações. Aproximadamente 1 x 106 linfócitos B-1

foram incubados com 1,0 mL de Trizol. Após homogeneização, as amostras

foram incubadas por 5 min a temperatura ambiente para completa dissociação

dos complexos nucleoprotéicos. A cada tubo foram adicionados 200 µL de

clorofórmio, os tubos agitados vigorosamente por 15 seg e então incubados a

temperatura ambiente por 3 min. As amostras foram centrifugadas a 12.000g

por 15 min a 4°C para separação das fases orgânica e aquosa. A fase aquosa,

que contem o RNA, foi transferida para outro microtubo de 1,5 mL, 500 µL de

isopropanol foi adicionado, a mistura homogeneizada e o RNA precipitado por

24 h a -20°C. Os tubos foram centrifugados a 12.000 g por 10 min a 4°C. O

RNA precipitado foi lavado 2 vezes com etanol 70% em água tratada com dietil

pirocarbonato (DEPC), desidratado por evaporação a temperatura ambiente e

diluído em água tratada com DEPC.

A quantificação do RNA foi realizada por espectrofotometria ultravioleta

a 260 nm em espectrofotômetro de espectro completo Nanodrop® ND-1000. A

contaminação por proteínas (razão entre as leituras 260 e 280 nm) e por outros

compostos (razão entre as leituras 260 e 230 nm) também foi avaliada.

Amostras que tiveram razão entre as leituras 260/280 nm entre 1,6 e 2,0 foram

analisadas em gel de agarose a 1,5% para verificar contaminação por DNA

genômico e degradação do RNA. As amostras foram armazenadas a -70°C.

 24

3.11.2 Produção do cDNA

Os procedimentos utilizados para obtenção do cDNA foram realizados

com o kit Super Script tm III First-Strand Synthesis Super Mix (Invitrogen). Após

tratamento do RNA com DNAse, foi preparado um mix de reação utilizando 2,5

µg de RNA total tratado com DNAse, 1 µL do primer oligo(dt)20, 1 µL do

tampão de anelamento e RNAse/DNAse-free water 8 µL q.s.p.. As amostras

foram incubadas no termociclador a 65°C por 5 minut os e então resfriadas a

4°C por 1 minuto. Posteriormente, foram adicionados aos tubos 10 µL 2X First-

Stand Reaction Mix e 2 µL de Super Script tm III/ Rnase Out tm Enzyme Mix,

seguido de spin. As amostras foram então incubadas a 50°C por 50 minutos e

a reação finalizada, a 85°C por 5 minutos. Em segui da, as amostras foram

armazenadas a temperatura de -20°C.

3.11.3 Extração de DNA genômico (gDNA)

Para extração de DNA genômico células B-1 foram desaderidas da

garrafa e então centrifugadas por 5 minutos a 1.300 rpm. Após centrifugação,

adicionou-se 500 µL da solução de lise (TrisHCl 50nM, pH 8,0; EDTA 62,5mM,

pH 9,0; LiCl 2,5M; TritonX-100 4% v/v) e os tubos homogeneizados por

inversão durante 5 minutos. O volume de 500 µL de fenol saturado em Tris 0,1

M pH 8 foi acrescentado e após homogeneização durante 5 minutos, os tubos

foram centrifugados a 10.000 rpm por 10 minutos a 4°C. A parte aquosa

(superior), cerca de 500 µL, foi então retirada e transferida para outro tubo. Em

seguida, os tubos foram novamente centrifugados a 10.000 rpm por 10 minutos

a 4°C. A fase aquosa das amostras foi coletada e ad icionada a 1 ml de etanol

 25

absoluto. As amostras ficaram incubadas a -20°C dur ante 20 minutos e

posteriormente centrifugadas a 13.000 g por 10 minutos. Logo após esse

período, o pellet foi lavado em 1 mL de etanol 70% e centrifugado a 13.000 g

por 10 minutos. O novo pellet formado foi ressuspendido em água Milli-Q

autoclavada e as amostras, incubadas a 56°C durante 10 minutos.

Acrescentou-se 20 µL/mg de RNAse e em seguida, os tubos foram incubados

por 15 minutos a 37°C.

A quantificação do DNA foi realizada por espectrofotometria ultravioleta

a 260 nm em espectrofotômetro de espectro completo Nanodrop® ND-1000. A

contaminação por proteínas (razão entre as leituras 260 e 280 nm) e por outros

compostos (razão entre as leituras 260 e 230 nm) também foi avaliada.

Amostras que tiveram razão entre as leituras 260/280 nm entre 1,6 e 2,0 foram

analisadas em gel de agarose a 1,5% para verificar degradação do DNA

genômico. As amostras foram armazenadas a -20°C.

3.11.4 Análise quantitativa por RT-PCR em tempo real

A reação de PCR em tempo real foi realizada com o reagente Sybr

Green (Applied Biosystems). A partir da reação de transcrição reversa, utilizou-

se 1 µL de cDNA, 5,0 µL de master mix Sybr Green, 2,0 µL de cada

oligonucleotídeo (1,0 µM): foward e reverse (Tabela 1). Em seguida, as reações

para PCR em tempo real foram realizadas utilizando ABI 7500 Real Time PCR

System (Applied Biosystems), nas seguintes condições: 10 minutos a 50°C

para ativação da enzima, desnaturação por 5 minutos a 95°C, e 40 ciclos de

95°C por 30 segundos e 60°C por 1 minuto. Após aval iar a qualidade da reação

com base nas curvas de dissociação, os resultados foram analisados utilizando

 26

o programa ABI 7500 SDS software (Applied Biosystems). Para a quantificação

relativa, foi realizado o seguinte cálculo: inicialmente determinou-se o cycle

threshold (CT), dado pelo número do ciclo em que o sinal de fluorescência

atingiu a linha limiar (threshold line), ou seja,a linha em que a emissão de

fluorescência está acima do ruído de fundo (background). Os valores de CT

dos genes de interesse foram normalizados em relação ao CT do gene

constitutivo (GAPDH ou ARBP), resultando o ∆CT, representado pelo CTgene

– CTconstitutivo. Por fim, calculou-se o 2-∆CT, sendo este valor a ser

trabalhado como representante da expressão relativa para cada gene

(Vandesompele et al., 2002). Os primers utilizados para amplificação dos

genes de interesse estão descritos na tabela a seguir.

Gene Seqüência

CCR1 (142 pb) 5’-CTCATGCAGCATAGGAGGCTT-3’ (Direto)

*(Primer Bank ID: 31542352a1) 5’-ACATGGCATCACCAAAAATCCA -3’ (Reverso)
CCR5 (158pb) 5’-TTTTCAAGGGTCAGTTCCGAC -3’ (Direto)
*(Primer Bank ID: 31542356a1) 5’-GGAAGACCATCATGTTACCCAC-3’ (Reverso)

GAPDH (107pb)
5’- AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3’ (Direto)

5’- TGAAGGGGTCGTTGATGG -3’ (Reverso)

5′-AGCTGAAGCAAAGGAAGAGTCGGA-3´(Direto)
ARBP (Rplp0) (84pb)
5’-ACTTGGTTGCTTTGGCGGGATTAG-3´ (Reverso)
Tabela 2 - Sequências oligonucleotídicas dos primers direto e reverso dos transcritos estudados por RT-PCR
em tempo real. Os tamanhos dos fragmentos amplificados estão apresentados em pares de bases (pb).
*Identificação das sequências de oligonucletídeos iniciadores depositadas no Primer Bank
(http://pga.mgh.harvard.edu/cgi-bin/primerbank/)

3.12. Ensaio de migração celular in vitro de células B-1

 27

Para este estudo, linfócitos B-1 foram plaqueados na câmara superior de

placas de 24 wells e na câmara inferior foram plaqueadas células de melanoma

B16F10 ou apenas sobrenadante de cultura de 3 dias de células de melanoma.

Para tanto, 8x105 células B-1 purificadas conforme descrito no item 3.9, foram

inseridas na câmara superior de insertos com porosidade de 8.0 µm (BD –

Falcon) específicos para estudo de migração celular. Os isertos foram

adicionados a placas de 24 poços imersas em 200uL de RPMI suplementado

com SFB a 5%. Na câmara inferior foi incubado 500uL de R-10, R-10

proveniente de cultura de células B16F10 (meio condicionado) ou 8 x 104

células B16F10 em R-10 novo. Após 24 horas, os insertos foram retirados

cuidadosamente com a ajuda de pinça e o conteúdo da câmara inferior

coletado, lavado com 200uL de PBS + EDTA 2mM e coletado novamente.

Todas as células em suspensão foram contadas visto que células B-1 não são

aderentes nestas condições.

3.13 Experimentos de transferência adotiva de linfócitos B-1

Células B-1, obtidas de lavado peritoneal de camundongos C57Bl/6

(wildtype) e purificadas em colunas magnéticas ou por cell sorter, foram

injetadas intraperitonialmente, em camundongos, CCR5 KO ou nos controles

(wild type). s. Nestes estudos, após a purificação, as células foram contadas

em câmara de Neubauer, suspensas em 100uL de PBS na concentração de

3,4 x 105 ou 106/100 mL e então transferidas para os animais. Todos os

procedimentos, incluindo coleta das células, ressuspensão e injeção nos

camundongos foram realizadas dentro de fluxo laminar, priorizando a

esterilidade do procedimento.
 28

3.14 Ensaios de Metástase experimental:

Após 24 h da transferência adotiva de células B-1 para os animais

CCR5-/- e em todos os grupos 105 células de melanoma murino B16F10 foram

inoculadas intravenosamente na veia caudal lateral. O volume final da

suspensão celular foi ajustado para 100uL em tampão (Staquicini et al, 2008)

Depois de 15 dias, os animais foram sacrificados e seus pulmões excisados.

Foi então realizada a contagem de nódulos pulmonares por indivíduo

capacitado e sem o conhecimento dos grupos (teste cego).

3.15. Implantação de tumor subcutâneo:

Cada animal dos 3 grupos foi injetado com 2,5x105 células de melanoma

suspensas em 100µL de PBS no flanco esquerdo subcutaneamente. No

momento que os tumores de todos os animais tornaram-se palpáveis, passou-

se a medir, com ajuda de paquímetro, a maior e menor dimensão do tumor. Os

valores foram submetidos à seguinte fórmula de modelo matemático idealizado

por Feldman et al. (2009):

 

  .  ã  . ã 
6

Os volumes foram mensurados diariamente até o momento da morte do

primeiro animal. Desde então foi realizada a curva de sobrevida, sendo

arquivadas as datas da morte de cada integrante de cada grupo.

3.17 Análises estatísticas:

Para análise de crescimento tumoral, foi realizada análise de variância

seguido do teste de Bonferroni. As curvas de sobrevida foram calculadas

 29

segundo o método de Kaplan-Meier e as diferenças entre as curvas foram

avaliadas pelo teste log-rank. Para os demais experimentos, foi utilizada

análise de variância seguida do teste de Tukey para comparação entre as

médias dos grupos. Para todas as análises o nível de significância foi fixado em

mínimo de 0,05.
 30

4. RESULTADOS

4.1. Células B16F10 transcrevem o gene para RANTES

Estudos anteriores de microarray em nosso laboratório compararam a

expressão gênica de células de melanoma B16F10 antes e após contato com
células B-1 (Xander P, 2012 em preparação). A partir dos dados de microarray,
realizamos uma análise e agrupamento de genes diferencialmente expressos
em células de melanoma após contato com linfócitos B-1 envolvidos com
migração celular e resposta imunológica. A Figura 1a apresenta o cluster obtido
a partir dessas análises. Conforme nela apresentado, células de melanoma
aumentam a expressão do transcrito para as quimiocinas CCL9, CXCL2 e
CCL5 após aquele contato. Este resultado forneceu um indício de que tais
proteínas poderiam promover a quimioatração das células B-1, levando ao
contato físico, necessário para o aumento do potencial metastático das
B16F10. Considerando a quantidade de dados encontrados na literatura a
respeito da CCL5 e também de sua influência em processos tumorais, a
mesma foi escolhida como foco do trabalho.
Análise por qPCR confirmaram que células de melanoma B16F10
transcrevem o gene para CCL5 (Figura 1B), e sua expressão aumenta ainda
mais após contato com linfócitos B-1.
 31

Figura 1 - Análise de microarray entre células B16F10 e células B16F10 após o contato com células
B-1. Dos genes totais (dado não mostrado), foram agrupados (cluster) os envolvidos com resposta
imunológica (A). A cor vermelha denota o aumento da expressão do gene correspondente e verde a baixa
expressão. Na caixa em amarelo consta a expressão relativa do mRNA para RANTES dentre os outros genes
do cluster. A validação foi feita por RT-PCR em tempo real (B) corroborando esses dados (barras) com os
de microarray (linha).
 32

4.2. Células B16F10 secretam CCL5 constitutivamente

Embora a expressão do gene de CCL5 tenha se apresentado maior nas

células B16F10 após o contato com B-1, isso não demonstra que exista a
secreção de CCL5, quer antes ou após tal contato. Uma vez que a secreção da
quimiocina CCL5 é estritamente necessária para iniciar uma resposta
migratória de células B-1 e posterior aumento da secreção de CCL5 devido ao
contato com B-1, a análise dessa proteína seria necessária.
Considerando essa questão, foi verificada a presença de CCL5 no
sobrenadante de cultura aderente de células B16F10. As células foram
incubadas em condições normais de cultura em fase de crescimento
exponencial por 2 dias, quando então o sobrenadante foi coletado e submetido
a ensaio de ELISA para detecção da proteína RANTES em comparação com
meio de cultura apenas. Como apresentado na Figura 2A, sobrenadante de
células B16F10 apresentam valor 4 vezes superior quando comparado ao
controle negativo (R10). Este resultado confirma a hipótese de que as células
B16F10 sao capazes de secretar constitutivamente a quimiocina CCL5 em
cultura, corroborando a idéia de que poderiam atrair células B-1 e, portanto,
promover o contato físico de ambas, aumentando tanto o potencial metastático
da B16F10 quanto a secreção de CCL5.
 33

0.25
*
0.20

0.15
D.O.

0.10

0.05

0.00
0 nte
R1 da
a
en
obr
S

Figura 2 - Presença de RANTES no sobrenadante da cultura de células B16F10. Sobrenadante da

cultura de células B16F10 foi coletado e submetido a ensaio de ELISA (A), comparando-o com R10 não
utilizado para cultivo. * p<0,05
 34

4.3. PCR quantitativo (qPCR) do gene codificador de CCR5 em células B-1

Células B-1 possuem capacidade de migrar para foco inflamatório; no

entanto, os mecanismos pelos quais essas células são atraídas para esses
locais ainda é desconhecido. Nesse sentido, avaliar a expressão de receptores
de quimiocinas por essas células é passo fundamental para verificar se
linfócitos B-1 podem migrar para locais específicos, como para o micro-
ambiente tumoral. Considerando que células de melanoma secretam CCL-5, a
expressão do receptor para esta quimiocina (CCR5) foi avaliada em células B-
1. Para tanto, análises de qPCR foram realizadas

Inicialmente, foi realizada a padronização dos primers utilizados

utilizando gDNA. A curva padrão foi desenvolvida com 5 pontos diluídos em
razão 10, cada um utilizando triplicata da amostra. A Figura 3a e b mostram as
curvas padrão dos genes ccr5 e arbp juntamente com seu slope e eficiência.
Todos os primers apresentaram eficiência dentro dos limites esperados, 95,791
% para ccr5 e 92,471 % para arbp. Os valores de slope de cada uma das
curvas padrão também esteve dentro da variação aceitável: -3,427 e -3,517. A
especificidade dos primers também foi avaliada e ambos foram específicos
para seus genes alvo (figuras 3c e d).

Considerando que para avaliar a expressão gênica utilizando o método

do ∆∆CT a eficiência de amplificação do alvo deve ser aproximadamente igual
à do gene de referência, realizamos um experimento de validação para testar
os dois genes de referência que seriam utilizados nos experimentos
subsequentes. Neste tipo de validação, primeiramente fizemos um gráfico
colocando o valor de ∆CT (média de Ct do alvo subtraída à média de Ct do
gene de referência) no eixo Y e o log da quantidade de mRNA no eixo X. Após
empregar a regressão linear e obter a equação da reta, o valor de slope é
avaliado. Apenas são considerados válidados curvas que apresentam os
valores de slope entre -0,1 e 0,1. Como mostrado na figura 4, ccr5 foi validado
com o gene de referência arbp, cujo valor de slope foi 0,0535 (figura 4).

Células B-1 apresentam transcrição para gene do receptor CCR5.

Gráfico da figura 5 representa o ciclo no qual iniciou-se a amplificação (CT)para
o gene de CCR5 e arbp. Um CT menor significa maior concentração de mRNA
do gene.
 35

A B

C D

Figura 3 - Eficiência e especificidade dos primers para os genes ccr5 e arbp. Curvas realizadas com
DNA genômico de células B-1 1 com cinco pontos diluídos em razão 10 com triplicatas. Curvas de eficiência
dos primers para ccr5 (A) e de gapdh (B). Figuras C e D apresentam a curva de melting dos primers para
ccr5 e arbp respectivamente. O pico menor se dá ao anelamento de primers e o pico maior ao amplicon.
Como a reação resultou em apenas um amplicon, houve especificidade.
 36

Figura 4 - Validação do ARBP como gene endógeno. Foi produzido cDNA advindo de células B-1
enriquecidas de cultura. Deste cDNA foi realizada Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em tempo-real
(qPCR). O slope (0,0535) menor que 1 significa que a inclinação da reta de eficiência de ambos os genes
são semelhantes.
 37

30

20
CT

10

0
r5

bp
cc

ar

Figura 5 - Amplificação do cDNA de células B-1 para o gene decodificador de CCR5 e ARBP. Foi
produzido cDNA advindo de mRNA de células B-1 enriquecidas de cultura. Deste cDNA foi realizada
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em tempo-real (qPCR). O gráfico demonstra o ciclo (CT) no qual
se iniciou a amplificação do cDNA utilizando os primers para os genes indicados.
 38

4.4. Expressão fenotípica de CCR5 na superfície de células B-1

A transcrição dos genes para os receptores de CCL5 não assegura que

a proteína seja traduzida e expressa normalmente, uma vez que pode passar
por eventos pós-transcricionais. Em vista disso, verificamos a expressão de
CCR5 por citometria de fluxo em células B-1 purificadas ex vivo e provenientes
de cultura de 5 dias.
Como esperado, células B-1 em cultura contabilizam 86,7% dos
linfócitos totais, sendo um método eficiente de enriquecimento. Quanto à
população de células B-1 ex vivo, estas correspondem a 40,4% do total de
linfócitos recém adquiridos por lavado peritoneal.
Como demonstrado pela figura 6b, 10% das células B-1 encontradas na
cavidade peritoneal expressam CCR5. Tendo em vista que a transcrição do
gene para CCR5 foi observada em células B-1 de cultura, foi realizada também
a análise fenotípica de CCR5 em células B-1 de cultura por citometria de fluxo
(Figura 6a). Observou-se que apenas 2,5% células B-1 de cultura expressam
CCR5 constitutivamente em sua membrana, apresentando frequência de
expressão menor que em B-1 ex vivo.
Devido a estas observações, optou-se pela utilização de células B-1
purificadas ex vivo nos experimentos posteriores. Vale ressaltar que
experimentos utilizando células obtidas diretamente da cavidade peritoneal, ex-
vivo, são submetidas a menor manipulação (passagem por cultura), além de
apresentar maior freqüência de células expressando CCR5, tendo assim maior
possibilidade de responder à RANTES.
 39
A

104

86.7 50

3
10
40

FL4-H: CD19

# Cells
10
2 30

20
1
10
10
97.5 2.5

100 0
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
FL1-H: CD23 FL2-H: CCR5

104
80

3
10
60
FL4-H: CD19

40.4
# Cells

102
40

101 20
89.3 10.7

100 0
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
100 101 102 103 104
FL1-H: CD23 FL2-H: CCR5

Figura 6 - Expressão fenotípica de CCR5 na superfície de células B-1. Células B-1 de cultura (A) ou
ex vivo(B) provenientes de camundongos C57Bl/6 foram marcadas com anticorpos anti-CD23 e anti-
CD19 acoplados a fluorocromos. Células mostradas no quadro da esquerda provém do gate de
+ -
linfócitos. Deste, foram selecionadas células B-1 (CD19 /CD23 ) e plotadas em histograma para a
expressão de CCR5 (quadro a direita).
 40

4.5. Células B16F10 atraem células B-1 mediante fatores solúveis

A liberação de RANTES pelas células B16F10 e a expressão de CCR5

na superfície de células B-1 reforça a idéia da quimioatração das células B-1
pelas B16F10. Destarte, foi realizado ensaio de migração in vitro, o qual
consistiu em sistema artificial no qual uma membrana com porosidade de 8um
separa dois compartimentos: do quimioatraente (câmara inferior) e das células-
alvo do ensaio (câmara superior) para verificar se células B-1 poderiam ser
atraídas pelo sobrenadante ou por células de melanoma. Para tanto, os
quimioatraentes utilizados no ensaio foram: R-10 (controle); R-10 condicionado
por B16F10 (sobrenadante); e 2x103 células B16F10.
Células B-1 foram atraídas 8 vezes mais pelo meio condicionado de
células B16F10 e 10 vezes mais pelas B16F10 quando comparado ao controle
basal. Portanto, células B-1 são atraídas por fatores solúveis secretados por
células B16F10 (figuras 7 e 8). Nota-se que além de migrarem mais na direção
das células B16F10, as células B-1 formaram clusters ao redor das células
tumorais.
 41

R10

Sobrenadante

Figura 7 - Ensaio de transwell.

B16F10

Figura 7 – Ensaio de transwell. Células B-1 fluorescentes (GFP) foram purificadas e incubadas em três
condições: com R-10 (controle negativo); sobrenadante de células B16F10 de cultura; ou células B16F10
aderidas na câmara inferior. Figura A mostra imagem do fundo da câmara em microscópio ótico de
fluorescência sob aumento de 20x. Os campos selecionados estão em zoom digital a direita. O aumento da
última imagem mostra células B-1 formando clusters.
 42

*
150
*

100
N° células

50

0
10

te

0
F1
an
R

16
ad

B
en
br
So

Figura 8 - Quantificação de células B-1 migratórias. Células que migraram para câmara inferior do ensaio
de transwell foram contadas e os valores plotados no gráfico apresentado. Resultado representativo de três
experimentos independentes. *P<0,05.
 43

4.6. Células B-1 wild-type influenciam a evolução da metástase pulmonar

em animais knockout para CCR5

Visto que células B16F10 secretam RANTES e que células B-1

expressam CCR5 e são quimioatraídas por células B16F10, verificamos in vivo
a influência de células B-1 wild type (WT) na modulação do potencial
metastático do melanoma em animais knockout para CCR5 (CCR5 KO).
Animais WT, CCR5 KO e CCR5 KO que receberam intraperitonealmente
3,5 x 105 células B-1 WT foram inoculados com 105 células B16F10 na veia
caudal lateral, seguindo o modelo de metástase experimental. Passados 15
dias, foram contabilizados os nódulos tumorais visíveis nos pulmões dos
animais.
Após retirada dos pulmões e contagem dos nódulos, não houve
diferença estatística entre o grupo dos animais wild type e KO para CCR5.
Porém, em animais KO para CCR5 que receberam 3,4 x 105 células B-1 WT no
peritônio, o número de nódulos pulmonares decresceu drasticamente chegando
até completa ausência em alguns animais (figura 9a e c).
O experimento foi realizado também com transferência de 106 células B-
1 WT para a cavidade peritoneal. Neste caso, surpreendentemente nenhum
animal desenvolveu metástase pulmonar (figura 9b). Este resultado revela um
indício da influência de CCR5 em células B-1 na regulação do potencial
metastático do melanoma e/ou sua eliminação.
Foram criados dois grupos experimentais para verficar se a sobrecarga
de células B-1 no peritônio dos animais CCR5KO com células B-1 WT poderia
influenciar no resultado do experimento: animais WT e animais WT que
receberam transferência adotiva de 1 x 106 células B-1 WT. Desta forma se
responderia se o simples fato de injetar células B-1 em um animal que já possui
esta população causaria o decréscimo de nódulos apresentado na figura 9.
Como esperado, e já publicado por Staquicini e col., a sobrecarga de células B-
1 aumenta o potencial metastático das B16F10 (figura 10). Este resultado é o
inverso daquele encontrado mostrado nas figuras 9a, b e c.
O fato dos animais possuírem diferença genética poderia influenciar a
população peritoneal e consequentemente um desequilíbrio resultaria em ação
diferenciada das células B-1. Para verificar esta possibilidade, a população
peritonial de células B-1 nos animais WT e KO foi avaliada por citometria de
 44

fluxo. Ambos os animais foram semelhantes em número absoluto e na

porcentagem com relação à população de linfócitos B-1.
Outras populações celulares da cavidade peritoneal também foram
avaliadas. As populações de células B-2, T CD4 e T CD8 estão em maior
número nos animais KO (ver tabela 3a). Este fenômeno provavelmente foi
devido à falta de migração e consequentemente um represamento das
mesmas. Porém, populações peritoneais diferiram entre animal transgênico e o
WT, exceto células NK que apresentam diferença entre os animais (tabela 3b).
 45

A * BB *
*
* *
50 150

Nº nódulos pulmonares
Nº nódulos pulmonares

40
100
30

20
50
10

0 0

T
KO

S
KO

T
T

PB
W

W
W
1W

R5
1

+
B-

B-

CC

T
+

W
KO

KO
R5
CC

Figura 9 - Células B-1 wild-type modulam o potencial metastático de células B16F10 em animais
5
knockout para CCR5. O grupo CCR5 + B-1 KO consiste em animais CCR5 KO injetados i.p. com 3,4x10 (A;
6
n=5) ou 1x10 (B; n=3) células B-1 purificadas de animais wild type. O grupo WT + PBS foi injetado i.p. com
5
PBS apenas. No dia seguinte todos os grupos foram inoculados com 1x10 células B16F10 i.v.. Passados 15
dias, os animais foram sacrificados, seus pulmões excisados e os nódulos tumorais por pulmão contados.
*p<0,05. (C) Fotos dos pulmões excisados dos grupos apresentados na figura A.
 46

KO (nº de células) WT (nº de células) Significativo

B-1 2.935 ± 0.9350 1.550 ± 0.1274 NÃO

B-2 2.115 ± 0.08500 0.5333 ± 0.08819 SIM P=0.001

NK 8.670 ± 0.6700 7.473 ± 0.6933 NÃO

T CD4 0.7600 ± 0.1800 0.2833 ± 0.04372 SIM P=0.046

T CD8 0.1650 ± 0.0150 0.1033 ± 0.006667 SIM P=0.022

KO (%) WT (%) Significativo

B-1 43.40 ± 8.100 55.57 ± 5.134 NÃO

B-2 31.95 ± 2.650 21.37 ± 2.948 NÃO

NK 1.330 ± 0.2600 2.680 ± 0.2804 SIM P=0.046

T CD4 11.86 ± 4.140 10.11 ± 1.454 NÃO

T CD8 3.990 ± 1.510 3.947 ± 0.2656 NÃO

Tabelas 3 A e B – Diferenças populacionais entre animais C57Bl/6 wild type e CCR5 knockout. Células peritoneais
foram identificadas quanto à suas características fenotípicas e comparadas entre animais WT e CCR5 KO. A tabela A
expõe a quantificação de células em números absolutos e tabela B a porcentagem dentre as células totais de linfócitos.
Para a identificação de cada população foram utilizados os seguintes parâmetros para fenotipagem: B-1, CD19+/CD23-;
B-2, CD19+/CD23-; NK, NK1.1+; T CD4, CD3+/CD4+; T CD8, CD3+/CD8+.
 47

200 *

150
n° nódulos

100

50

0
1 S
B- PB
6
Figura 10 - Inoculação de B-1 wild type em animais wild type. Foram inoculadas 1x10 células B-1 ex vivo
purificadas procedente de animais WT no peritônio de animais WT. Animais compondo o grupo controle
5
foram injetados com PBS. No dia seguinte foram inoculadas 1x10 células B16F10 i.v. em todos os grupos.
Passados 15 dias, os animais foram eutanasiados, seus pulmões excisados e os nódulos tumorais por
pulmão contados. *p<0,05.
 48

4.6. Células B-1 wildtype diminui taxa de crescimento tumoral em animais

CCR5-/-

Como observado, animais CCR5-/- inoculados com células B-1 que

expressam o receptor de CCR5 desenvolvem menos nódulos metastáticos.
Sendo assim, verificamos se a mesma proteção ocorreria na formação de
tumor subcutâneo. Para tanto, animais wildtype, CCR5-/- e CCR5-/- injetados
com células B-1 wildtype foram injetados subcutaneamente com 2,5x105
células B16F10. As medições das dimensões do tumor iniciaram-se então
quando todos os tumores subcutâneos tornaram-se palpáveis. As medições
tiveram fim no óbito do primeiro animal.

Animais wildtype e CCR5-/- apresentaram crescimento tumoral

subcutâneo semelhante. Em contraste, animais CCR5-/- injetados com células
B-1 wildtype demonstram baixo crescimento tumoral, estabilizado comparado
aos outros dois grupos (figura 11).
 49

Figura 11 - Crescimento tumoral subcutãneo. Animais foram submetidos a injeção

subcutânea de 2,5x105. O crescimento do tumor sólido foi avaliado por medições com
auxílio de paquímetro de duas dimensões do tumor. Os valores foram submetidos a modelo
matemático que estima o volume tumoral. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001.n=3.
 50

4.7. Células B-1 wildtype aumentam sobrevida em animais CCR5-/-

Observamos se o mesmo tratamento promoveria aumento da

expectativa de vida nos animais CCR5-/- inoculados com células B-1 wildtype. A
data de morte de cada animal utilizado no experimento do item anterior foi
plotada em gráfico de sobrevivência (figura 12). Novamente animais CCR5-/-
injetados com células B-1 wildtype foram mais resistentes ao melanoma.
Enquanto o grupo WT e CCR5-/- apresentaram zero de sobrevivência já nos
dias 34 e 30 respectivamente, este grupo começou a diminuir a sobrevivência
no 35º dia e até o momento (55º dia), um integrante do grupo mantém-se vivo.
A diferença entre a curva de sobrevida dos animais CCR5-/- inoculados com
células B-1 é estatisticamente diferente dos outros grupos. Sendo assim, a
inoculação de células B-1 wildtype em animais knockout para CCR5-/- confere
proteção frente o desenvolvimento do melanoma murino.
 51

Figura 12 - Gráfico de sobrevida de animais. Animais foram submetidos a crescimento tumoral

subcutâneo e taxa de sobrevivência avaliada. Diariamente os animais foram verificados quanto a
morte de qualquer integrante dos grupos. Os dias pós inoculação foram plotados no gráfico.
CCR5-/- + B-1 WT apresenta diferença estatística frente aos grupos WT e CCR5-/- (P<0,03),
enquanto não há diferença significativa entre CCR5-/- e WT; n=3.
 52

4.6. Expressão de MHC de classe I em células B16F10

Com o intuito de verificar quais células efetoras poderiam em nosso

modelo estar envolvias com a eliminação das células tumorais, foi analisada a
expressão de MHC de classe I (MHC I) nas células de melanoma. Para tanto,
células B16F10 em crescimento exponencial foram recuperadas de cultura e
marcadas com anticorpo anti-MHC I. Observou-se que células B16F10
possuem baixa expressão de MHC I quando comparados com células melan a,
que são melanócitos não tumorigênicos (figura 13). De acordo com Abbas,
Lichtman & Pillai (2007), tumores com baixa ou ausência de expressão de
MHC I em sua superfície tornam-se potenciais alvos para células natural killer
(NK).
 53

Figura 13 - Expressão de MHC de classe I em células B16F10. Melanócitos não tumorigêncicos

(histograma à esquerda) e células B16F10 (histograma à direita) foram obtidos de cultura e marcados com
anticorpo anti-MHC I acoplado a fluorocromo.
 54

5. DISCUSSÃO

A evolução do melanoma é influenciada pelo microambiente tumoral.

Este é composto por células tumorais, do tecido conectivo e do sistema

imunológico; elementos como vasos linfáticos e sanguíneos; ampla variedade

de macromoléculas de caráter estrutural como colágeno, fibronectina, fibrina,

proteoglicanos e ácido hialurônico, além de outras moléculas como fatores de

crescimento, mitógenos e quimiocinas (Dvorak, Weaver et al., 2011; Hanahan

& Weinberg, 2000). Quimiocinas agem no microambiente tumoral primário

atraindo leucócitos e este infiltrado tem papel importante na carcinogênese

(Bonecchi, Locati e Mantovani, 2011). Um exemplo bem documentado é a

atuação de RANTES e CCL2 em câncer de mama, onde ambas quimiocinas

inflamatórias atraem macrófagos para o local do tumor e estes por sua vez

secretam fatores que aumentam a malignidade das células neoplásicas (Soria

e Ben-Baruch, 2008). Há indícios de que outras células inflamatórias infiltrantes

como linfócitos T e B ativados, eosinófilos, mastócitos, neutrófilos e fibroblastos

estromais também contribuem para a malignidade da célula neoplásica

mediante secreção de fatores de crescimento, proteases e fatores

angiogênicos (Melnikova e Bar-Eli, 2009). Cada vez mais células têm sido

apontadas como elementos importantes na evolução de tumores.

A relação entre células de melanoma e células B-1 constitui uma das

linhas de pesquisa principais de nosso laboratório. Nosso grupo é responsável

pelo início das publicações sobre o tema, tornando-o pioneiro neste modelo de

modulação do potencial metastático via interação célula B-1/B16F10.

Inicialmente, Staquicini et al. (2008) demonstraram que células B16F10 co-

cultivadas com células B-1 geravam mais nódulos pulmonares em

 55

camundongos. Observaram também que esta modulação do potencial

metastático é mediada por contato físico e não por fatores solúveis. Na mesma

publicação, Staquicini et al (2008) demonstraram que o contato físico entre

células B-1 e B16F10 é mediado pela glicoproteína MUC18. Mostraram ainda

que melanoma humano com maior expressão de MUC18 possui maior infiltrado

de células B-1, corroborando com os achados em modelo murino. Este

aumento de potencial metastático é marcado pela expressão positiva dos

genes para CXCR4 e MMP-9, genes que contribuem para metastatização

(Pérez, Machado et al., 2008). O processo também é conhecido por ser

mediado pela sinalização via ERK no contato entre ambas as células. Cabe

aqui mencionar que esses estudos foram realizados in vitro; contudo, não pode

ser excluída a possibilidade de que in vivo células B-1 poderiam migrar para o

local de células B16F10, influenciando o potencial metastático dessas células.

Vale também mencionar que para o processo de migração, células B16F10

necessitariam secretar fatores solúveis (quimiocinas) os quais poderiam

promover a atração de células B-1.

Apesar de haver muitos estudos sobre sua fisiologia, ainda pouco se

conhece a respeito de quimioatração de células B-1. Até o atual momento,

sabe-se que estas são células com potencial migratório, visto que migram da

cavidade peritoneal para foco inflamatório à distância iniciado por lesão tecidual

(Oliveira, Popi et al., 2008) ou foco inflamatório inespecífico (Almeida et al.,

2001). Neste foco inflamatório inespecífico, células B-1 dão origem a células

gigantes (Bogsan, Brito et al., 2005). Recentemente, migração de células B-1

foi descoberta também em modelo de diabetes, no qual são encontradas em

ilhotas pancreáticas (Alvares, comunicação pessoal). Porém, os mecanismos

 56

responsáveis para que células B-1 sejam guiadas para estes locais

permanecem desconhecidos.

Nossos dados de microarray, comparando células B16F10 antes e

depois do contato com células B-1, demonstraram aumento da expressão dos

genes de RANTES, CCL9 e CXCL2 (Figuras 1A e B). A expressão de

quimiocinas pelas células de melanoma mostra que estas células têm potencial

para atrair leucócitos para o sítio de crescimento e desenvolvimento do tumor.

Dentre as proteínas produzidas pelas células B16F10 destaca-se RANTES,

uma quimiocina amplamente descrita na literatura e relacionada com evolução

tumoral (Vaday, Peehl et al., 2006; Soria e Ben-Baruch, 2008; Mishra, Banerjee

et al., 2011). Neste trabalho foi demonstrado que nossa linhagem de B16F10

secreta RANTES no sobrenadante de cultura (Figura 2A). Este dado não

apenas corrobora os estudos de expressão gênica realizados pelo nosso

laboratório como também confirmam observações de outros autores. Harlin e

colaboradores (2009) mostraram que células de melanoma linhagem específica

ou proveniente de indivíduos com a doença produziam altas taxas de RANTES

e que isto gerava o recrutamento de células T CD8+. Mrowietz et al. (1999)

observaram que quanto maior a quantidade de RANTES secretada por

linhagens de melanoma humano, maior é seu crescimento tumoral e potencial

metastático em animais nude. Nestes, células de melanoma com maior

secreção de RANTES geram tumores maiores e mais agressivos. Dessa forma,

há forte correlação entre a produção de RANTES e a agressividade das células

de melanoma, possivelmente influenciada pela maior capacidade dessas

células em atrair leucócitos para o ambiente tumoral.

 57

Sabe-se que a atração de células via quimiocinas depende da expressão

de receptores na superfície da célula a ser atraída. Demonstramos no presente

trabalho que células B-1 expressam tanto o mRNA para CCR5 (figura 5) quanto

a proteína traduzida em sua superfície celular (figura 6A e B). Esta é a primeira

descrição de receptores para RANTES neste subtipo celular. A expressão de

CCR5 em sua superfície celular é um indício que células B-1 podem migrar in

vivo em direção a células de melanoma, as quais expressam RANTES. A

caracterização deste receptor na superfície de células B-1 é importante para

entender como estas células migram para foco inflamatório, local onde há

ampla produção de RANTES (Conti e Digioacchino, 2001).

Neste estudo, foi mostrado que células B-1 migram in vitro em direção a

fatores solúveis produzidos por células B16F10 (Figuras 7 e 8), formando

clusters ao redor das células de melanoma aderidas (Figura 7). Este fenômeno

de “clusterização” foi observado por Staquicini (2004) no co-cultivo in vitro entre

ambas células. Portanto, é possível que o mecanismo de migração das células

B-1 seja realmente mediado por RANTES ou outra quimiocina/fator liberada(o)

por células B16F10.

Em estudo de nosso grupo, células B-1 foram encontradas em focos

tumorais de B16F10 no oitavo dia (manuscrito em preparação) de inoculação

do tumor. Este resultado não apenas demonstra que migram para o tumor, mas

que também possuem intervalos específicos para isto. Ao decorrer dos dias, o

infiltrado destas células parece diminuir e células B-1 não são mais

encontradas. Uma explicação para esta diminuição pode ser devida à mudança

do fenótipo original de célula B-1 (CD23-/CD19+) para de fagócito mononuclear

(CD19- / CD23- / F4/80+ / CD11b+) (Popi, Motta et al., 2009; Popi, Zamboni et
 58

al., 2009). Como descrito acima, melanomas com alta secreção de RANTES

têm pior prognóstico, isto devido ao infiltrado de macrófagos no local. Porém,

ao identificar macrófagos utilizam-se marcadores que células B-1 também

apresentam em sua superfície ao se tornar fagócitos. Isto nos remete à idéia de

que fagócitos derivados de células B-1, e não macrófagos, poderiam gerar esta

malignização de células neoplásicas.

Até o momento muito se sabe a respeito de migração de linfócitos,

células NK e macrófagos para focos tumorais; contudo, nenhum mecanismo da

migração de células B-1 foi suficientemente estudado. Há poucos trabalhos

mostrando sua migração. Nestes, o foco dos estudos no processo migratório é

secundário. Primariamente os autores buscam descrever a consequência de

uma possível migração. Desta forma, não há trabalhos descrevendo o próprio

mecanismo e analisando a via e/ou proteínas envolvidas. Demonstramos até o

momento um mecanismo de migração de células B-1 utilizando eixo CCR5-

RANTES. Em estudos nos quais é necessário o bloqueio da migração de

células B-1 esta via pode ser então considerada.

Para avaliar o papel de CCR5 expresso pelas células B-1 no modelo de

metástase experimental, foram utilizados animais CCR5-/-. Em nosso modelo,

animais CCR5-/- que receberam células B-1 por transferência adotiva

surpreendentemente tiveram uma drástica diminuição no número de nódulos

pulmonares. Vale ressaltar que em alguns animais o número de nódulos

encontrados foi zero. Este fato merece destaque uma vez que de alguma forma

as células B-1 de animais WT modularam, ou melhor, influenciaram a

implantação e/ou desenvolvimento dos nódulos metastáticos.

 59

Dados da literatura mostram o impacto do infiltrado celular influenciado

pelo eixo CCR5-RANTES na evolução do melanoma utilizando animais CCR5-/-

(Van Deventer, O'connor et al., 2005). Neste modelo, animais CCR5-/-

inoculados com 106 células de melanoma desenvolveram menos metástases

pulmonares do que animais WT. Os autores consideram este fenômeno como

dose-dependente visto que ao injetar 2,5 x 105 não havia diferença entre os

grupos. A hipótese apresentada pelos autores é que células estromais e não

células do sistema imunológico poderiam ser as responsáveis pelo fenômeno,

uma vez que animais CCR5-/- depletados de leucócitos por irradiação e que

receberam adotivamente células da medula óssea (exceto células vermelhas)

de animais WT continuaram apresentando diferenças no número de nódulos

pulmonares. Vale ressaltar que, nesse trabalho, a população da cavidade

peritoneal não foi avaliada após depleção, uma vez que células B-1 possuem

capacidade de auto-renovação independente da medula óssea. Sendo assim, é

possível que células B-1 repopulem as cavidades pleural e peritoneal destes

animais durante o período de 5 semanas pós irradiação (tempo utilizado no

trabalho), influenciando na evolução e número das metástases pulmonares

encontradas. Ng-Cashin et al. (2005) demonstraram que a vacinação de

animais CCR5-/- com células dendríticas WT pulsionadas com extrato de

B16F10 necróticas retardou o crescimento tumoral em comparação a animais

WT. Sendo assim, a simples ausência do CCR5 nas células do animal

influencia a modulação de toda a resposta imunológica do organismo frente à

célula tumoral.

Assim como descrito por van Deventer, nossos animais CCR5-/-

inoculados com 105 células de melanoma obtiveram igual freqüência de

 60

nódulos que o grupo WT. Inesperadamente animais CCR5-/-, quando

transferidos adotivamente com células B-1 desenvolveram poucos ou nenhum

nódulo metastático (figura 8). Este dado poderia ser dito contraditório com o

encontrado pelo nosso grupo (Perez, Machado et al., 2008; Staquicini, Tandle

et al., 2008), no qual células B-1 aumentam o número de nódulos metastáticos

de camundongos WT. Porém ao injetarmos células B-1 CCR5+/+ em animais

CCR5-/-, todas as outras células do sistema imunológico do animal receptor que

dependem do receptor CCR5 para migrarem e/ou exercer sua função, não o

farão. Desta forma estabelecemos um novo modelo para o estudo da interação

de células B16F10 e B-1, visto que ao transferirmos células B-1 CCR5+/+ para

animais normais ocasiona o inverso do encontrado em nosso modelo. Nódulos

pulmonares são mais frequentes nos animais transferidos adotivamente,

corroborando com os dados até hoje encontrados pelo nosso grupo (figura 9).

Demonstramos então que o fenômeno é real e dependente da ausência de

CCR5 nas células B-1.

Observamos que em animais WT esta baixa de nódulos pulmonares não

ocorre. Fato curioso visto que estes são a fonte das células B-1 injetadas nos

CCR5-/-, ou seja, os animais WT possuem células com igual fenótipo das

injetadas em animais CCR5-/-. Porém em animais CCR5-/- estas células ajudam

a eliminação do melanoma e em animais WT não. A diferença entre esses

animais é que todas as suas células são deficientes em CCR5, incluindo as do

sistema imune que expressam de forma constitutiva ou regulada.

Possivelmente outras células, que nos animais WT são normais, têm sua

função alterada nos animais CCR5-/-. Sendo assim, células que tivessem

função reguladora sobre células eliminadoras do tumor em animais WT podem

 61

não ter sua atividade reguladora nos CCR5-/- por não serem capazes de migrar.

Neste contexto, nos animais KO, células com funções citotóxicas poderiam agir

livremente sem a modulação por células reguladoras ou ainda poderiam ter

diretamente a função citotóxica aumentada pela falta do receptor CCR5. Uma

vez que células B-1 não foram até então descritas como efetoras na

erradicação de tumores, sua função neste modelo pode ser potencializando a

célula efetora na erradicação do tumor.

Esta mesma proteção ocorre no crescimento tumoral subcutâneo. Os

animais CCR5-/- injetados com células B-1 contêm o crescimento tumoral,

sendo mais lento. Como observado, estes animais apresentam pouco aumento

no volume do tumor sólido ao decorrer dos dias, enquanto os outros grupos

apresentam crescimento rápido (figura 10). Seguindo a mesma linha, estes

mesmos animais que desenvolveram o tumor mais lentamente apresentaram

maior sobrevida (figura 11).

Como dito anteriormente, de alguma forma células B16F10 estão sendo

eliminadas e possivelmente há influência de alguma célula efetora. Também

que sua função na eliminação de células tumorais seria influenciada pela

expressão de CCR5. Sabe-se que células NK, ou pelo menos NKT, em animais

CCR5-/- são mais citotóxicas e proliferam mais que em animais WT (Ajuebor,

Aspinall et al., 2005; Ajuebor, Wondimu et al., 2007). Além disso, células NK

são importantes para eliminação células de B16F10 em diversos modelos

experimentais, como com tratamento com indometacina e interleucina-2 (IL-2)

ou por depleção de células NK (Parhar e Lala, 1987; Grundy, Zhang e

Sentman, 2007). Dessa forma, não podemos descartar a possibilidade de que

sejam influenciadas pelas células B-1 WT e com isso levar à eliminação do

 62

melanoma em nosso sistema. Corroborando com esta hipótese encontra-se o

dado de que as células B16F10 empregadas nos experimentos expressam

baixos níveis de MHC de classe I (figura 10), conforme já descrito por outros

autores (Seliger, Wollscheid et al., 2001). Além disso, Mazumder e Rozemberg

descreveram em 1984 fenômeno semelhante ao encontrado neste trabalho.

Eles demonstram diminuição drástica de nódulos pulmonares ao tratar os

animais com células LAK (célula killer ativada por linfocina), que abrangem em

sua maioria células NK e TCD8.

O presente trabalho apresenta fenômeno de erradicação de tumor visto

em poucos estudos até hoje. Este modelo, que se mostrou eficiente na

eliminação do melanoma, poderá se tornar um potencial alvo para manipulação

da atividade de células B-1 no estudo da evolução do melanoma experimental.

Além disso, contribui para o melhor entendimento da quimiotaxia de células B-

1, informações que até o momento são escassas, assim como interações entre

células B-1 e células NK. Demonstramos também que esta interação resulta na

diminuição de nódulos pulmonares por melanoma. Com isto, propomos um

novo modelo da interação entre células B-1 e melanoma, onde as primeiras

auxiliam a resposta imunológica a responder efetivamente frente a uma

linhagem tumoral pouco imunogênica. Uma possível potencialização desta

interação pode resultar em futuros estudos clínicos e consequentemente em

possíveis intervenções terapêuticas na modulação da resposta imunológica

para tratamentos de pacientes com melanoma.

 63

6. CONCLUSÕES

- Células B16F10 transcrevem o gene para CCL5 e sua expressão é

aumentada após contato com células B-1;
- Células B16F10 são capazes de liberar a quimiocina CCL5 em cultura;
- Células B-1 apresentam transcrição para o gene de CCR5;
- Aproximadamente 10% da população de células B-1 ex vivo
apresentam o CCR5 em sua superfície e 2,5% das células B-1 de cultura
apresentam o receptor;
- Fatores solúveis liberados por células B16F10 atraem células B-1,
formando clusters ao redor das células tumorais;
- A injeção de células B-1 wildtype em animais knockout para CCR5
levou a uma diminuição do crescimento tumoral, taxa de metástase e aumento
da sobrevida.
- Células B16F10 possuem baixa expressão de MHC I, comparados à
células MelanA.

Em resumo, um novo modelo foi descrito visando participação da

interação quimiotática em células B-1 e de melanoma. Deste ponto em diante
esperamos novas propostas envolvendo outras quimiocinas atuantes em
células B-1 no modelo de melanoma e outros tumores.
 64

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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