PCR e Electroforese em Gel de Agarose

Índice
1. Introdução ................................................................................................................................ 1

2. Objectivos ................................................................................................................................ 4

2.1. Objectivo geral: .................................................................................................................... 4

2.2. Objectivos específicos:......................................................................................................... 4

3. Material .................................................................................................................................... 5

3.1. Material para o PCR: ............................................................................................................ 5

3.2. Material para electroforese em Gel de Agarose: .................................................................. 5

4. Metodologia: ............................................................................................................................ 6

4.1. PCR: ..................................................................................................................................... 6

4.2. Electroforese em Gel de Agarose: ........................................................................................ 7

5. Resultados ................................................................................................................................ 9

6. Discussão ............................................................................................................................... 10

7. Conclusão .............................................................................................................................. 12

8. Referências bibliográficas ..................................................................................................... 13

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1. Introdução
A pedra angular da vida é designada de DNA, esse que é o material genético que contém a
informação crucial para a hereditariedade, determinando o fenótipo dos indivíduos. A descoberta
da sua estrutura representa um marco no desenvolvimento da biologia nos últimos dois séculos,
essa que começou com a descoberta das leis da herança por Mendel contribuindo para avanços
significativos no melhoramento de organismos vivos e no entendimento de processos biológicos
(Arias, 2004).
É nos cromossomas, mais especificamente no DNA, que se encontra armazenada a
informação que codifica a vitalidade de cada ser vivo. No caso de alguns vírus, as instruções que
permitem a sua replicação no hospedeiro que infectam (Bered, 1998).
A descoberta do DNA feita por James D. Watson e Francis H. Crick permitiu não só
compreender como as células regulam o seu metabolismo mas também como as características
hereditárias são transmitidas entre gerações. Para além das implicações directas no conhecimento
da biologia das células, as conclusões de estudos do DNA têm permitido grandes avanços na
compreensão da genética de doenças. Paralelamente, tem possibilitado o aparecimento de
inovadoras práticas biotecnológicas com impacto relevante (Sayre, 1975).
Após a descoberta da molécula de DNA e diante da importância dessa molécula para a
sobrevivência do ser humano e a conservação de suas características ao longo das gerações, vários
métodos de análises foram desenvolvidos para facilitar os estudos da mesma (Barth, 2005).

A Engenharia Genética constitui um conjunto de técnicas de analise molecular que

permitem estudos de caracterização, expressão e modificação do material genético (DNA e RNA)
dos seres vivos. Esta tem como finalidade alterar ou modificar a carga hereditária de alguma
espécie ou com o objetivo de produzir modificações ou transformações com fins experimentais,
isto é, de lograr (a concepção de) um indivíduo com características até esse momento inexistentes
sua na espécie (manipulação genética) (Cordeiro, 2003).

As técnicas de engenharia genética ou, mais corretamente, a tecnologia de DNA

recombinante (DNAr), começaram a ser definidas no início do ano de 1970, com a utilização de
vetores de clonagem, em geral, plasmídeos e genomas virais, lançando-se mãos das chamadas
enzimas de restrição que permitiam cortar o DNA em pontos bem definidos, isolando-se assim

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fragmentos de ácido nucléico passíveis de serem introduzidos no genoma de um organismo com
moléculas idênticas de DNA (Candeias, 1991).

Na engenharia genética vários métodos de estudos foram desenvolvidos com intuito de

conhecer e compreender a molécula de DNA, dentre eles estão: o Southern blot, o
Sequenciamento, a Reação em Cadeia da Polimerase-PCR e electroforese em gel (Dahm, 2005).

Reacção da polimerase em cadeia (PCR) é uma ferramenta metodológica muito utilizada

na biologia molecular e na engenharia genética. A PCR permite a síntese específica e exponencial
de uma região predeterminada do DNA em sistema in vitro. Ela é realizada em três etapas
fundamentais: desnaturação da dupla fita do DNA, hibridação de oligonucleotídeos iniciadores e
polimerização das novas cadeias de DNA (Nascimento et al., 2010).

A primeira é realizada à temperatura de 92ᵒC a 95ᵒC para separar completamente a dupla

cadeia (quebra das pontes de hidrogénio entre as bases nitrogenadas). A segunda é variável de
acordo com as sequências de oligonucleotideo iniciador (primer) que pode ser específico ou não.
Assim, a temperatura de anelamento do primer pode variar de 35ᵒC a 52ᵒC ou mais conforme
temperatura melting que depende da sua sequência. Finalmente submete-se à temperatura de 72ᵒC,
ótima para o funcionamento da DNA polimerase (Taq polimerase ou Pfu). Essas etapas são
repetidas em ciclos de 30 a 40 vezes, garantindo uma amplificação em progressão geométrica do
DNA a partir da quantidade inicial colocada no ensaio (Nascimento et al., 2010).

A visualização das bandas de DNA recém-sintetizadas é possível através da eletroforese

em gel (Nonaka, 2012). A análise de DNA por electroforese é uma das técnicas fundamentais nos
laboratórios de pesquisa. Para tal são utilizados corantes fluorescentes, que permitem visualização
do DNA quando submetido à luz U.V. (Brammer e Iorczeski, 2002).

A eletroforese trata-se de um processo de migração de uma partícula carregada sob

influência de um campo elétrico. Por apresentarem grupos funcionais ionizáveis, várias moléculas
adquirem carga positiva ou negativa em um determinado pH. Portanto, quando são submetidas a
um campo elétrico, essas moléculas carregadas migram para o cátodo ou ânodo, dependendo de
sua carga (Wilson e Walker, 2010).

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Para a realização desta metodologia é necessário uma fonte de tensão e uma unidade de
eletroforese que estão disponíveis na forma vertical e horizontal. Além destes itens, também é
necessário de um gel, que pode ser de poliacrilamida ou de agarose (Wilson e Walker, 2010).

A agarose é um polissacarideo neutro extraido da parede celular de determinadas algas. Sua

constituição química possibilita a formação de gel ou matriz altamente resistente e com tamanho
de poros que podem mudar a velocidade de migração dos ácidos nucléicos (Petecof, 2015).

A Anopheles stephensi é o principal vetor da malária em todo o subcontinente indiano e no

Oriente Médio, é um modelo emergente para estudos moleculares e genéticos das interacções
mosquito-parasita. A forma e tipo da espécie é responsável pela maior parte da transmissão urbana
da malária em toda a sua extensão. Um conjunto de genes do A.stephensi é utilizado para estudos
moleculares e genéticos como o gene RNA ribossomal (Jiang et al., 2014).

O gene do RNA ribossomal 18S (rRNA) está presente em todas as células eucarióticas. O
gene 18S rRNA é um alvo apropriado para a demonstração do conteúdo de DNA eucariótico em
uma variedade de espécies de amostras, tecidos e amostras alternativas (swabs), como esperado
com base na ampla conservação do gene 18S rDNA em eucariontes. Este gene é considerado
estranho, servindo de evidência definitiva de diferentes genes que fornecem estimativas
significativamente diferentes de filogenia em organismos superiores (Hugert, L. W. et al., 2014).

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2. Objectivos
2.1. Objectivo geral:
 Compreender a técnica de PCR na amplificação do gene 18S do DNA de Anopheles
stephensi.

2.2. Objectivos específicos:

 Aplicar os passos de PCR para amplificação da sequência do gene 18S do DNA de
Anopheles stephensi;
 Realizar a preparação do Gel de Agarose;
 Visualizar os produtos de PCR por electroforese em Gel de Agarose;
 Identificar a banda correspondente ao gene 18S do DNA de Anopheles stephensi.

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3. Material
3.1. Material para o PCR:
 Master mix: 50μl;
 DNA: 6μ;
 Primer forward: 5μl;
 Primer reverse: 5μl;
 H2O: 34μl;
 Tubo eppendorf de 3ml;
 Vortex;
 Micropipetas;
 Termociclador.

3.2. Material para electroforese em Gel de Agarose:

 Tina de electrofore;
 Molde em forma de pente (15 dentes);
 Cuba;
 Balão volumétrico;
 Balança;
 Micropipetas;
 Fonte de tensão ou Power supply;
 Micro-ondas;
 Espátula;

Solução:
 Agarose: 1.5g;
 Tampão TAE 1X: 100ml;
 Gel red: 10μl;
 Tampão Load;
 Loading Buffer (Tampão da amostra)
 Marcador positivo.

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4. Metodologia:
4.1. PCR:
Para a amplificação do gene 18S foram feitas duas amostras ou mix, distribuindo as soluções
em quantidades iguais nos dois tubos de PCR e tomando-se sempre o cuidado de trocar as pontas
da micropipeta a cada reagente;

 Primeiro adicionou-se 17μl água aos tubos de PCR;

 Em seguida pipetou-se 25μl de master mix, 2.5μl de primers forward e reserve e adicionou-
se a água presente em cada tudo;
 Homegeneizou-se a mix com ajuda de um vortex;
 Depois de garantir que todos componentes estivessem bem misturados, adicionou- se em
cada tubo 3μl da amostra de DNA tampou-se e misturou-se ligeiramente.
 Em seguida, foram colocados os tubos no termociclador e programou-se a recção seguindo
as condições da tabela abaixo:

Temperatura 95ᵒC 95ᵒC 60ᵒC 72ᵒC 72ᵒC 4ᵒC

Tempo 120" 30" 45" 45" 10" ∞
Ciclo 1 35 1
Tabela 1: Programa do termociclador

A tabela acima mostra as fases do processo de amplificação do gene onde a primeira é a

desnaturação do DNA e ocorre a 95ᵒC num intervalo de aproximadamente 150segundos; a
segunda fase ou emparelhamento ocorre a 60ᵒC num intervalo de 45segundos e a ultima fase
é extenção que ocorre a 72ᵒC num periodo de 10min:45seg. Todo o processo ocorre em torno
de 35 ciclos.

Após o processo de amplificação a amostra é mantida a uma temperatura de 4ᵒC.

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4.2. Electroforese em Gel de Agarose:
Para a preparação do gel de agarose e a posterior visualização dos produtos do PCR
procedeu-se da seguinte maneira:

 Montou-se a estrutura electroforética, colocando os pentes próprios na tina. Os pentes

serviram de molde para produzir as cavidades (poços) no gel para albergar e separar
diferentes amostras; A tina dá forma ao gel e suporta a corrida electroforética;
 Pesou-se numa balança 1.5g de agarose correspondente a 100ml de uma solução a 2%
e colocou-se no balão volumétrico;
 Com auxilio de uma proveta mediu-se 100ml de tampão TAE 1X e adiciounou-se a
agarose pesada e agitou-se levemente;
 Em seguida, levou-se a mistura ao micro-ondas para a solubilização da agarose por 2-
3 minutos até que a solução estivesse completamente translúcida (sem precipitados
gelificados);
 Com auxilio da micropipeta adicionou-se 10μl de agente intercalante, o gel red, no gel
de agarose e homogeinizou-se;
 Antes de despejar o gel na cuba, arrefeceu-se ligeiramente o gel com ajuda de água
(sistema banho-maria);
 Despejou-se o gel na cuba e aguardou-se 10-30 minutos para polimerização da matriz
da agarose, ficando ela com o aspecto turvo e com resistência diretamente proporcional
à concentração de agarose utilizada;
 Após a solidificação retirou-se os pentes com cuidado de modo a não danificar a matriz
do gel;
 Ao gel de agarose já solidificado foi adicionado novamente o tampão TAE 1X
mantendo a matrix submersa, garantindo desse modo que a corrente eléctrica distribua-
se em todo o tanque e mantem-se o movimento de iões na solução;
 Antes de aplicar as amostras nos poços, estas foram misturadas com uma gota de
tampão Loading buffer para dar densidade facilitando a sua aplicação nos poços e
permitindo que haja a visualização do DNA no gel;

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 De seguida, aplicou-se no primeiro poço do gel o marcador de peso molecular, no
segundo a amostra da BA e no terceiro a amostra da BS e com ajuda do power supply
migrou-se a 120V num intervalo de 35-45min;
 Passado esse periodo revelou-se as bandas sob luz Ultra-violeta e interpretou-se os
resultados.

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5. Resultados
Após os procedimentos descritos anteriormente e tendo como referência o marcador (positivo)
conhecido aplicado ao gel e a referência do gene amplificado que esta localizado nas bandas entre
100 a 200bp foi possível observar a migração dos fragmentos amplicon para o polo positivo e
tendo se fixado nas bandas entre 100-200bp como esperado para o tipo de gene tratado.

Imagem 1: Amostras de DNA, extraidas do mosquito Anopheles stephensi submetidas a

electroforese em gel de agarose a 2%.

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6. Discussão
Na presente aula prática, foi possível fazer a amplificação do gene 18S e posterior
visualização dos produtos do PCR em gel, tendo se verificado a migração desses genes para o polo
positivo especificamente para as bandas entre 100 e 200bp. Com ajuda do marcador positivo foi
possível confirmar a localização correcta ou esperada do gene amplicon, ou seja, foi possível
observar que o gene amplicon migrou para o polo e banda esperados, o que foi determinado por
vários factores tais como: extracção correcta do DNA, tal como sustenta Costa et al., (2008), ao
referir que o primeiro passo para o estudo da biotecnologia usando o ADN é mediante a extracção
do mesmo usando técnicas moleculares, já que qualquer problema nesse passo compromete o
passo subsequente. Neste aspecto, a qualidade e integridade do ADN são fundamentais para o
sucesso nas etapas posteriores.

O outro factor que favoreceu o sucesso na migração dos genes amplicon foi o uso de
instrumentos e reagentes certos e de qualidade. Segundo Nonaka (2012), vários fatores podem
determinar o sucesso ou fracasso de um protocolo de PCR. Dentre eles: a natureza dos tubos de
reação (devem possuir paredes finas, capacidade de conduzir calor e evitar a evaporação dos
reagentes); o uso de termocicladores com tampas aquecidas (garantem mais eficiência nas rampas
e evita evaporação dos reagentes presentes nos tubos); a qualidade e concentração dos reagentes e
DNA alvo (podem afetar a sensibilidade e especificidade da reação); o desenho dos primers e
sondas (diretamente relacionado com especificidade da reação); o uso de controles adequados
(positivos conhecidos, negativos e brancos) e registro de todo o procedimento.

Na electroforese em gel de agarose, foi possível a visualização de várias bandas criadas

pela migração de vários fragmentos incluindo o gene de interesse, fenomeno criado pela
capacidade macrorreticular (com aspecto de rede, formando malhas) do gel de agarose, que pode
ser ajustada pela variação na concentração de agarose. A concentração de agarose participa de
modo importante na separação eletroforética, porque é ela que determina a faixa de tamanho das
moléculas de DNA que podem ser separadas, onde quanto mais alta a concentração, menor o
tamanho dos poros (Silva, 2001).

Para além da concentração de agarose, um dos principais factores que determinou a

detecção dos ácidos nucleicos pelo processo de electroforese em gel é a adição de um corante de

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visualização, o Gel red; que é um corante fluorescente de ácidos nucleicos ultra-sensível,
extremamente estável e ambientalmente seguro, para a coloração de dsDNA, ssDNA e RNA em
géis de agarose ou poliacrilamida, permitindo a visualização desses ácidos nucleicos quando
submetido à luz U.V. (Brammer e Iorczeski, 2002).

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7. Conclusão
Contudo, PCR é considerada uma das técnicas de biologia molecular de grande importância
revolucionária. Esta técnica consiste na detecção e a amplificação in vitro de regiões específicas
de ácidos nucléicos. Para a sua realização são necessários vários reagentes e do aparelho
termociclador o qual permite variações na temperatura. O processo da amplificação ocorre em três
etapas: desnaturação, anelamento e extensão.

A revelação dos resultados ou produtos do PCR pode ser feita por eletroforese em gel de
agarose. Electroforese em gel de agarose é uma técnica que consiste na separação de fragmentos
de DNA de acordo com o tamanho. Além da agarose, para a realização desta metodologia é
necessário uma fonte de tensão e uma unidade de eletroforese que estão disponíveis na forma
vertical e horizontal.

Nesta prática foi possível constatar que o gene 18S do DNA de Anopheles stephensi
apresenta a sua localização entre as bandas 100pb à 200pb.

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8. Referências bibliográficas
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