Engenharia Bioquímica

AULA 3

Profª Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato

 Sumário
Cinética microbiana

 Conceitos fundamentais de cinética microbiana

 Definição de parâmetros
 Cálculo das velocidades
 Curva de crescimento microbiano
 Classificação dos processos fermentativos
 Modelos cinéticos
 Efeito das condições ambientais
Cinética microbiana
 Cinética microbiana

 Cinética
É a parte que estuda a velocidade das reações de um processo e os
fatores que as influenciam

 Investigações de como diferentes condições experimentais

podem influenciar na velocidade de uma reação
 Informações de rendimento sobre o mecanismo de reação e
estados de transição
 Construção de modelos matemáticos que possam descrever as
características de uma reação
 Cinética microbiana
Conceito

Consiste na análise da evolução dos valores de concentração de um

ou mais componentes do sistema de cultivo, em função do tempo
de fermentação

 Ciniciais e Cfinais tem pouco valor

 Componentes do sistema de cultivo
 Microrganismo (biomassa) – X (g/L)
 Produtos do metabolismo (metabólitos) – P (g/L)
 Nutrientes do meio de cultivo (substratos) – S (g/L)
 Cinética microbiana
Obtenção de valores experimentais
 Cinética microbiana
Obtenção de valores experimentais

 Métodos de obtenção dos valores experimentais de concentração

 Microrganismo (biomassa) – X
 Métodos diretos - Massa seca, turbidimetria com espectrofotômetro, volume do material celular
após centrifugação
 Métodos indiretos – Dosagem de componentes celulares (nitrogênio-Kjeldahl; proteínas-Lowry),
medidas de componentes resultante da atividade microbiana (açúcares, O2, CO2, ácidos
orgânicos...)
 Produtos do metabolismo (metabólitos) – P
 HPLC

 Nutrientes do meio de cultivo (substratos) – S

 Açúcares – Métodos colorimétricos (DNS) ou HPLC

 Valores experimentais de concentração (X, P e S) – f(t) → curvas de ajustes

 Cinética microbiana

 Curvas de ajuste
Xm

Xm e Pm  valores máximo de X e P X
X0 , S0, P0  valores iniciais de X, S, P
X0
Sf valor final de substrato
S0
tf  tempo final de fermentação
S

 Produto de interesse econômico

 Substrato limitante Sf ≈ 0
Pm
P

P0
0 t tf tempo
 Cinética microbiana
Importância

 É fundamental para a transposição de escala

 Comparação quantitativa entre diferentes condições de cultivo
(parâmetros cinéticos)
 pH,T, aeração, concentração de nutrientes, espécies de microrganismo...
 Velocidades de transformação, fatores de conversão, produtividade
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação

 Velocidades instantâneas
 Produtividade
 Velocidades específicas
 Fatores de conversão
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação
 Velocidades instantâneas de transformação
(inclinações das tangentes)
Xm
 Crescimento do microrganismo
dX X
rX 
dt X0
 Consumo de substrato
S0
dS
rS   S
dt
 Formação de produto
Sf ≈ 0
dP
rP  Pm
dt P
Unidade: M/V.t
Não são os melhores parâmetros para se
avaliar o estado em que se encontram o
sistema. P0
0 t tf tempo
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação

 Avaliação de desempenho

 Produtividade em biomassa (PX)  Produtividade do produto (PP)

Xm  X0 Pm  P0
PX  PP 
tf t fp
Velocidade média de crescimento
tfp ≠ ou = tf
P0 é geralmente desprezível

Xm e Pm  valores máximo de X e P
X0 e S0  valores iniciais de X e P
P0 valores iniciais de P
tf  tempo final de fermentação Unidade: M/V.t
tfp  tempo onde ocorre Pm
 Cinética de processos fermentativos
Parâmetros de transformação

 Velocidades específicas de transformação (GADEN)

Devido a concentração microbiana aumentar durante um cultivo descontínuo é
importante especificar as velocidades com respeito ao valor de X em um
determinado instante.

1 dX
 Crescimento do microrganismo X  .
X dt
1  dS 
 Consumo de substrato S   
X  dt 
1 dP
 Formação de produto P 
X dt
Unidade: t-1
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação

 Fatores de conversão
(num determinado t de fermentação)

 Substrato à célula
g células produzidas X  X0 dX dt 
YX / S     X
g substrato consumido S 0  S  dS dt  S

 Produto à célula
g células produzidas X  X 0 dX dt  X
YX / P    
g produto formado P  P0 dP dt  P
 Substrato à produto
g produto formado P  P0 dP dt 
YP / S     P
g substrato consumido S 0  S  dS dt  S
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação
 Coeficiente de manutenção
 Importante lembrar que o substrato consumido tem vários “destinos”

rS  (rS ) X + (rS )m + (rS )P

rS X  velocidade de consumo de substrato devido ao crescimento

rS m  velocidade de consumo de substrato devida a manutenção
rS P  velocidade de consumo de substrato devido a formação de produto

Manutenção
 Trabalho osmótico visando manter os gradientes de concentração de
substâncias entre o interior da célula e seu meio ambiente;
 Renovação de componentes celulares que requeiram energia;
 Mobilidade celular.
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação
 Coeficiente de manutenção

 Pirt – Consumo específico para manutenção

 rs  m  m.X
rX r
rS  + P + m.X
rS  (rS ) X + (rS )m + (rS )P YX S " YP S '
X P
S  + +m
YX S " YP S '

YX S "  fator de conversão destinado apenas ao crescimento

YP S '  fator de conversão destinado apenas a formação de produto
m = coeficiente de manutenção (kg substrato/kg célula.h)
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação
 Coeficiente de manutenção
 Coeficientes de manutenção de alguns microrganismos

Espécie m Condições da cultura Fonte de energia

(kg substrato/kg células.h)
Lactobacillus casei 0,135 Cultura anaeróbica Glicose

Aerobacter 0,054 Cultura aeróbica Glicose

aerogenes
0,076 Cultura aeróbica Glicerol

0,058 Cultura aeróbica Citrato

Azotobacter 0,15 Cultura descontínua, pressão parcial de Glicose

vinelandii O2 de 0,02 atm
1,5 Cultura descontínua, pressão parcial de Glicose
O2 de 0,2 atm
Saccharomyces 0,036 Cultura descontínua anaeróbica Glicose
cerevisiae
0,360 Cultura descontínua anaeróbica 1,0M Glicose
NaCl
Penicillium 0,022 Cultura aeróbica Glicose
chrysogenum

Fonte: Fonseca e Teixeira, 2007

 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação

 Cálculos das velocidades

 Traçados das curvas a partir de pontos experimentais

 Manualmente; Programas; Modelos
 Experiência para conhecer os perfis característicos das curvas
 Levar em consideração que nem sempre os instantes em que P e X são
máximos coincidem
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação

 Exercício: Baseado nos resultados experimentais obtidos em uma fermentação

alcoólica descontínua mostrado na Figura a seguir, calcule:
a) Velocidades instantâneas de crescimento celular, consumo de substrato e
formação de produto
b) Velocidades específicas de crescimento celular, consumo de substrato e
formação de produto
c) Fatores de conversão de substrato à célula, substrato à produto, produto à
célula
No tempo de fermentação de 5 horas.
Desconsiderando o consumo de substrato utilizado para manutenção celular.
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação

 Exercício 100 40
S P

P (g/L)
a) rX , rS , rP 80
20

b)  X , S ,  P
60

S (g/L)
c) yX S, yP S, yX P X
0
4
40

X (g/L)
3
20

2
0
0
2 4 6 8 10
Tempo (h)
Resultados obtidos em uma fermentação alcoólica.
Fonte: Borzani, 2001.
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação

 Resolução:
100 A 40
a) Velocidade instantâneas S P
I. Consumo de substrato

P (g/L)
80 D 20
dS 100  70 30 g / L 
rS    tg    9,1g / L.h
dt 6,8  3,5 3,3h B
60 

S (g/L)
0
C F X 4
II. Produção de etanol 40

X (g/L)
dP 20  0,0 20 g / L
rP   tg    3,84 g / L.h 3
dt 7,9  2,7 5,2h
20
E 
2
III.Crescimento da levedura 0
dX 4,0  2,2 1,8 g / L 0
rX   tg    0,47 g / L.h 2 4 6 8 10
dt 6,0  2,2 3,8h
Tempo (h)
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação

 Resolução:
100 40
b) Velocidade específicas S P
I. Consumo de substrato

P (g/L)
80
20
1  dS  rS 9,1g / L.h
S      2,6h 1
X  dt  X 3,5 g / L 60

S (g/L)
0
X 4
II. Produção de etanol 40

X (g/L)
1 dP rP 3,84 g / L.h
P     1,1h 1 3
X dt X 3,5 g / L 20

2
III.Crescimento da levedura 0
1 dX rX 0,47 g / L.h 0
X  .    0,13h 1 2 4 6 8 10
X dt X 3,5 g / L Tempo (h)
 Cinética microbiana
Parâmetros de transformação

 Resolução:
c) Fatores de conversão
I. Substrato à célula  X 0,13
yX    0,05
 S 2,6
S

II. Substrato à produto  P 1,1

yP S    0,42
 S 2,6

 X 0,13
III. Produto à célula
yX    0,12
P
P
1,1
 Cinética microbiana
 Fases Curva de crescimento microbiano
1. Lag
X=X0=constante Xm
Síntese das enzimas
Xd
f(CI, IMO, fisiologia, MI) A
2. Transição
Início da reprodução microbiana
3. Log
x = m=constante
XC
4. Linear
rx = rk =constante
x ↓←↑X Xi
X0
5. Desaceleração 0
1 2 3 4 5 6 7
Esgotamento de S e/ou acúmulo P inibidores Xm
x, rx↓ 0 – tf
6. Estacionária Log X XC
X = Xm =constante B

7. Declínio
Xi
Lise celular, autólise ou rompimento
X0
MO – enzimas intracelulares
0 ti tC td tf
 Cinética microbiana
Classificação dos processos fermentativos

 Gaden ( = (t))

Formação de produto está associada ao crescimento

Formação de produto parcialmente associada ao crescimento

Formação de produto não está associada ao crescimento

 Cinética microbiana
Classificação dos processos fermentativos

Formação de produto está associada ao crescimento

 Perfis semelhantes
 Formação do produto – reações do catabolismo
 Produção de vitaminas, aminoácidos e etanol

s  p x

Consumo de
açúcar
Velocidade específica

Produção de
etanol

Crescimento
Tempo
 Cinética microbiana
Classificação dos processos fermentativos

 Formação de produto parcialmente associada ao crescimento

 Duas fases distintas
 Formação do produto não está ligada diretamente ao caminho metabólico de
produção de energia
 Produção de ácido cítrico e ácido lático

1ªFase 2ªFase
s  x≠p s  x  p
Produção de
ácido
Velocidade específica

Consumo de
açúcar
Crescimento

Tempo
 Cinética microbiana
Classificação dos processos fermentativos

Formação de produto não está associada ao crescimento

 Formação do produto ocorre quando as demais velocidades sofrem uma redução
significativa
 Metabolismo secundário
 Produção de antibióticos

x ≠ p
Produção de
Consumo de açúcar antibiótico
Velocidade específica

Consumo de
oxigênio

Crescimento

Tempo
 Cinética microbiana
Classificação dos processos fermentativos

Cinética de formação de produto

 Correlação empírica (Luedeking e Piret, 1959)
 Formação de ácido lático por Lactobacillus delbrueckii

rP   .rX +  . X
 P   . X + 
rX   X . X
rP   P . X

α e β – ctes (T, pH, MOs, meio)

 Cinética microbiana
Classificação dos processos fermentativos

Cinética de formação de produto

 P   . X + 

 Primário - β=0 – Associado ao crescimento

 Ácido glucônico

 Secundário – α=0 – Sua síntese inicia-se depois do crescimento cessado

 Antibiótico, proteínas recombinantes

 Intermediário – Ambos os parâmetros são positivos

 Ácido lático, ácido cítrico
 Cinética microbiana
Modelos de crescimento e morte celular

 Modelos de crescimento e morte celular

 Na ausência de inibição pelo substrato

 Com inibição pelo substrato

 Com inibição pelo produto ou compostos tóxicos

 Morte celular
 Cinética microbiana
Modelos na ausência de inibição

 Na ausência de inibição
 Monod – Propôs um modelo para descrever o efeito do substrato
limitante em função de μX

 m .S
X 
KS + S m

m  Máxima velocidade específica de crescimento

μX (h-1)
K S  Constante de saturação ou de Monod m/2
S  Concentração do substrato limitante

KS
S (mg/L)
 Cinética microbiana
Modelos na ausência de inibição

 Crescimento em um único substrato limitante sem levar em

conta o fenômeno de inibição
S
-
 Equação de Teissier  X   m .(1  e KS
)

Sn
 Moser  X  m .
KS + S n
S
 Contois e Fujimoto  X  m .
K S .X + S
 Cinética microbiana
Modelos com inibição
 Com inibição pelo substrato
 Crescimento num único substrato limitante levando em conta o fenômeno de inibição
 Andrews

S K I ,S
 X  m . .
K S + S K I ,S + S m

μX (h-1)
K I , S  constante de inibição pelo substrato m/2

K S K S .K I ,S K I , S
S (mg/L)
 Cinética microbiana
Modelos com inibição
 Com inibição pelo substrato
 Crescimento com múltiplo substrato limitante
 Dunn ET et al. (uso preferencial de S1)

 Megee et al. (uso simultâneo de S1 e S2)

 Cinética microbiana
Modelos com inibição
 Com inibição pelo produto ou por compostos tóxicos

 Jerusalimsky e Neronova

S K I ,P
 X  m . .
K S + S K I ,P + P

K I , P  constante de inibição pelo produto ou composto tóxico

 Ex.: Inibição do crescimento de Saccharomyces cerevisiae em glicose pelo etanol

 Cinética microbiana
Modelos morte celular
 Morte celular

rd  K d . X

K d  velocidade específica de morte (kg de células mortas/kg células vivas)

rd  velocidade volumétrica de morte celular (kg de células mortas(kg células vivas)-1 h 1 )
X  concentração de células viáveis (kg. m -3 )

 Kd – MOs, meio, T
 Na fase exponencial – geralmente desprezada
 Biorreator com recirculação de biomassa – quantificação é necessária
 Cinética microbiana
Efeito das condições ambientais
 Efeito das condições ambientais na cinética MOs

 Temperatura
 pH
 Pressão osmótica
 Cinética microbiana
Efeito das condições ambientais
 Efeito da temperatura
 Parâmetros da cinética de crescimento - max e KS
 Fase 1: ↑ T→↑velocidade da reação
 Fase 2: T mais elevadas → desativação térmica das proteínas→velocidade da reação
 Hinshelwood (1946) – Lei de Arrhenius
1,2

 max (T )  A1.e  E 1 RT
 Ad .e  Ed RT 1,0

μmax (h-1)
0,8

0,6
A1 e Ad  constantes num meio com uma determinada composição
E1  Energia de ativação de crescimento celular 0,4

Ed  Energia de ativação de morte celular térmica 20 25 30 35 40 45

T (oC)

Efeito da T em μmax de E. Coli

Fonte: Fonseca & Teixeira, 2007.
 Cinética microbiana
Efeito das condições ambientais
 Efeito da temperatura
 Cinética microbiana
Efeito das condições ambientais
 Efeito do pH
 Existe uma gama de uma ou duas unidades de pH – pouca variação de μmax
 Alguns valores típicos de pH ótimo de crescimento
 Células bacterinas- 7
 Fungos filamentosos – 4-5
 Muitos MOs tem mecanismos de manter o pH intracelular constante quando ocorre flutuação
deste no meio

2
μmax (h-1)

1
Efeito do pH em μmax de E. Coli cultivada a 37oC
Fonte: Fonseca & Teixeira, 2007.

4 5 6 7 8 9 10

pH
 Cinética microbiana
Efeito das condições ambientais
 Efeito da pressão osmótica
 SUGESTÃO DE LEITURA
 Livro Fundamentos (Volume 1)
 Capítulo 1 (seção 1.5)
 Capítulo 2 (seção 2.8.3)

 Livro Engenharia Bioquímica (Volume 2)

 Capítulo 6

ATIVIDADE INTEGRADORA
 Artigos sobre cinética microbiana - Seminários
 Lista de exercícios
 TÓPICOS BÁSICOS A SEREM ABORDADOS
 Importância e aplicação do bioproduto
 Etapas de produção
 Métodos de obtenção dos valores experimentais
 Curvas de ajustes (X, P, S)
 Parâmetros cinéticos avaliados
 Identificação das fases da curva de crescimento celular
 Classificação do processo fermentativo
 Modelos cinéticos
 Efeito das condições ambientais
VERIFICAÇÃO DE APRENDIZAGEM