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Profª Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato

Sumário

 Conceito de esterilização
 Consequências da presença de contaminantes
 Aplicação dos processos de esterilização
 Modos de ação dos agentes esterilizantes
 Métodos de esterilização
◦ Métodos físicos
◦ Métodos químicos
 Esterilização de equipamentos
 Esterilização de meio
 Esterilização de ar
É um processo físico ou químico que destrói ou inativa
todas as formas de vida presentes em um
determinado material, especialmente microrganismos
incluindo bactérias, fungos e vírus
Esterilização Desinfecção Pasteurização

Remoção de Remoção ou Tratamento


todas as formas destruição dos térmico para
de vida de um organismos vivos redução
objeto ou capazes de causar drástica no
material danos ou infecções nº de MOs

Vegetativa e Vegetativa
esporulada
Métodos Métodos
Físicos Químicos

Calor úmido
Líquidos ou gases
Calor seco
Filtração por membranas
Hipoclorito
Fenóis

Radiação ultravioleta Formaldeídos

Radiação com partículas Óxido de etileno


ionizantes Ozônio
Ultra-som Dióxido de enxofre
 Consequências da presença de um contaminante no processo

 Compromete seriamente o resultado


• Produção de penicilina – Produção de penicilinase por contaminantes
• Fermentação acetonabutanólica – Destruição por vírus bacteriófagos
 Afeta negativamente o processo
• Consomem os nutrientes competindo com o MO de interesse
• Produção de enzimas, vitaminas
 Pouco ou nada compromete o processo
• Tratamento de resíduos
• Produção de vinagre – Produção de inibidores de crescimento
 Eliminação de contaminantes depende de cada caso
 Em alguns casos a eliminação de contaminantes pode inviabilizar
economicamente o processo
• Produção de etanol a partir de caldo de cana-de-açúcar
Em um processo fermentativo são três os pontos de esterilização necessários

 Meio
 Equipamento
 Ar
 Aplicação dos processos de esterilização
Biorreatores e tubulações • Calor úmido
Bombas, filtros, centrífugas,
misturadores, separadores, colunas • Calor úmido
cromatográficas, homogeneizadores
• Calor úmido (autoclaves)
Material de laboratório • Calor seco (fornos)
• Radiação ultravioleta
• Calor úmido
Meios de cultivo • Filtração em membranas
• Cartuchos esterilizantes
Ar • Cartuchos esterilizantes

• Radiação gama
Embalagens • Calor úmido
• Lavagem com produtos químicos
 Modo de ação dos agentes esterilizantes

Agentes
esterilizantes

Célula microbiana

Formação de Alteração de
substâncias letais moléculas essenciais
para manutenção e
sobrevivência celular

Morte do
microrganismo
 Modo de ação dos agentes esterilizantes

Alvos possíveis de lesão celular

• Enzimas
• responsáveis pelos processos metabólicos
• Membrana citoplasmática
• que mantém a integridade do conteúdo celular, controlando o
transporte de substâncias entre a célula e seu meio externo,
além de ser também o local de algumas reações enzimáticas
• Parede celular
• que proporciona rigidez e resistência mecânica aos
microrganismos e participa de alguns processos fisiológicos
• Dano genético
• responsável pela codificação de alguma enzima essencial
Métodos físicos

Métodos químicos
 Métodos físicos
 Calor úmido
 Calor seco
 Irradiação UV
 Radiação ionizante
 Calor úmido
 É um dos métodos mais efetivos para destruição dos MOs
 Vapor de água saturado
 Associa a temperatura elevada ao alto grau de umidade
 Mata os MOs, principalmente pela desnaturação irreversível
de suas proteínas
 Destruindo elementos essenciais para sobrevivência e
multiplicação celular (enzimas e membranas celulares)
 Carameliza carboidratos produzindo produtos tóxicos
Equipamento – autoclaves (vapor sob pressão)
Aplicação
◦ Tubulações
◦ Reatores vazios
◦ Reatores com meio de cultura
 Calor seco
 Destrói os MOs através da oxidação de seus constituintes
químicos
 Mais lenta e menos eficaz que o calor úmido
 Nível de hidratação das células tende a diminuir lentamente,
conferindo uma certa proteção às proteínas
 Podendo também ocorrer a coagulação de proteínas
Equipamento – estufas, fornos (T>150ºC)
Aplicação
◦ Vidrarias
◦ Metais e sólidos
 Irradiação por luz ultravioleta (UV)
 É absorvida por muitas substâncias celulares, mas
significativamente pelos ácidos nucléicos, onde geralmente ocorre
as lesões
 Seu efeito letal depende do grau de radiação aplicada
 A região do espectro de UV com ação esterilizante é de 220–300
nm (região abiótica)
 Fatores que influenciam na sensibilidade microbiana a UV
• pH, estado fisiológico da célula (fase log de crescimento) e constituição
genética
Equipamento - câmara de irradiação ultravioleta
Aplicação
◦ Vidrarias
◦ Utensílios metálicos
◦ Embalagens
 Radiação ionizante
 São radiações eletromagnéticas (, , , raios X, raios catódicos e
prótons, nêutrons e elétrons de alta energia)
 Causam grande variedade de efeitos físicos e bioquímicos em
MOs
 Ataca a molécula de DNA levando a perda de viabilidade celular
 Podendo causar mutações
Equipamento - câmara de irradiação
Aplicação
◦ Vidrarias
◦ Metais
◦ Materiais sólidos (pós, solo, alimentos, sementes, embalagens...)
 Métodos químicos
 Agentes líquidos – Glutaraldeído
 Agentes gasosos – Óxido de etileno
 Glutaraldeído
 Age na superfície das células
 Promove interações glutaraldeído-proteínas gerando diversos
produtos
 Interferindo no transporte de aminoácidos de baixo peso
molecular
 Podendo ocorrer a aglutinação celular

Equipamento - próprio equipamento


◦ Ciclo de desinfecção/esterilização química
Aplicação
◦ Equipamentos
 Óxido de etileno
 Reage com a parte sulfídrica da proteína, do sítio ativo no
núcleo do MOs, impedindo assim sua reprodução
 Utilizada em produtos que não podem ser expostos ao calor ou
a agentes esterilizantes líquidos

Equipamento – Autoclaves de esterilização por vapor


Aplicação
◦ Itens hospitalares
◦ Artigos plásticos de laboratório...
 Esterilização de equipamentos
 O agente de uso mais freqüente é o calor úmido, fornecido por
vapor de água saturado
◦ Facilidade de obtenção, de manuseio, sua eficácia e custo
relativamente baixo
 O calor é obtido em caldeiras e distribuído por dutos de aço
galvanizado ou inoxidável, isolados termicamente
 Pelas altas temperaturas e pressões na caldeira o vapor é
considerado estéril

◦ Esterilização de reatores vazios


◦ Esterilização de reatores com meio de cultura
◦ Esterilização em autoclaves
 Esterilização de reatores vazios

Ar

Ar
Vapor Vapor esterilizado Meio de
cultura
esterilizado

121°C, 1 atm Estabilização P e T


 Injeção de vapor no interior do reator promovendo expulsão de
todo o ar presente
 Fecha-se o reator e injeta-se vapor até a T e P adequada (121°C,
1atm)
 Terminada a esterilização injeta-se ar esterilizado para evitar
que o resfriamento (condensação do vapor) gere vácuo
 Após resfriamento e estabilização na pressão o meio de cultura
esterilizado externamente é carregado
 Esterilização de reatores com meio de cultura

Ar Ar Água fria
Vapor na na
serpentina serpentina Ar
Vapor no Vapor no
meio meio

100°C

96 a 97°C 100°C 121°C, 1 atm Resfriamento


 Circula-se vapor pela serpentina ou camisa até que a T do meio
de cultura atinja a faixa de 96 a 97°C
 Injeta-se vapor diretamente no meio de cultura até atingir 100°C
 Fecha-se o reator, a injeção continua até que a T atinja 121°C e a
P 1 atm (mantidas através da serpentina ou camisa)
 Resfriamento feito pela circulação de água fria na serpentina ou
camisa
 Quando a T atingir 100°C, deve-se injetar ar no tanque para
evitar formação de vácuo pela condensação do vapor
 Esterilização de reatores com meio de cultura

◦ Tempo de esterilização  Condição do reator e do processo


 Biorreator onde se usa sempre o mesmo MO
 20 – 40 min
 Biorreator multipropósito (bactérias ou fungos formadores de
esporos)
 Assepsia química + 60 min
 Modelos de biorreatores com serpentina e jaqueta para
o sistema de aquecimento/resfriamento

Serpentina interna

Serpentina interna

Jaqueta

Serpentina interna
 Esterilização em autoclaves
◦ Para biorreatores de pequeno porte (até 30L)
◦ Vidrarias
◦ Meio de cultura...
◦ Modelos verticais e horizontais
◦ Geração de vapor: elétrica, a gás ou externa (caldeira)
 Esterilização em autoclaves (Modo de operação)
Válvula de escape Câmara de vapor Válvula de Manômetro Válvula de controle
segurança

Atingir Vapor Porta


Câmara
T= 1210C de vapor
P=1 atm

Ar

Placa perfurada Tela de


sedimentos

Camisa de vapor Termômetro

Regulador de pressão para


fornecimento de vapor

Linha de resíduos Fornecimento de vapor


 Esterilização de meios de cultura por calor úmido
 Em escala industrial
◦ Processo descontínuo ou batelada
 O meio é colocado no fermentador e, a seguir aquecido com vapor
 Esterilizam-se simultaneamente o meio e o fermentador
◦ Processo contínuo
 O meio de cultura é esterilizado antes de entrar no fermentador
 Meio de cultura e o fermentador são esterilizados separadamente
◦ Processo descontínuo Tempo de esterilização
 Aquecimento 
 Esterilização Te
T esterilização

 Resfriamento

Resfriamento
Esterilização

Aquecimento
Tm
A destruição dos MOs não se T mínima letal
dá somente na fase de Temperatura

esterilização. Durante o
aquecimento e resfriamento, Tf
T final do meio esterilizado = T de fermentação
enquanto a T for superior a T
mínima letal (80 a 100°C),
Ti T inicial
também ocorre destruição dos Algumas horas
MOs.

Tempo
 Vantagem

• Esterilização do meio de cultura e do fermentador simultaneamente, diminuindo os


riscos de contaminação nas operações de transferência do meio para a dorna

 Desvantagens

• Manutenção do meio em temperaturas relativamente altas (acima de 100°C) por


períodos longos (horas) favorece o desenvolvimento de reações químicas no meio
com possíveis alterações indesejadas em sua composição
Ex.: Caramelização da sacarose
• Elevados consumos de vapor (A) e de água (R): consequentes da eficiência baixa
do sistema de troca de calor
• Problemas de corrosão: ocasionados pelo contato prolongado do fermentador com
o meio aquecido
• Tempo ‘não produtivo’ muito elevado: no período de esterilização, o fermentador é
utilizado como um tanque de esterilização, sem produção
• Processo contínuo
Atinge a T de esterilização
Vapor Termômetro e
manômetro
Tubo de retenção
Termicamente isolado
dimensionado de modo que o
tempo de retenção seja igual ao
tempo de esterilização
Válvula de
redução de
pressão
V
Fermentador
Termômetro e
manômetro

Trocador Trocador Pode ser efetuada


de calor 1 de calor 2 por vapor indireto –
trocador de calor
Meio Água
Bomba
T é reduzida até a T de
fermentação
Tempo de
esterilização

Esterilização
Te
T esterilização

Resfriamento
Aquecimento
Tm
T mínima letal
Temperatura

A destruição dos MOs Tf


T final do meio esterilizado = T de fermentação
durante o aquecimento e
resfriamento pode ser Ti T inicial
Alguns minutos
desprezada.

Tempo
 Vantagens

• Menor destruição de nutrientes do meio de cultura: por trabalhar com T mais


elevadas e por ser um processo mais rápido tanto no aquecimento como no
resfriamento, o tempo de permanência do meio é relativamente pequeno (10 a 15
min)
• Maior rendimento do que as realizadas com meio esterilizado por processo
descontínuo
• Evita contaminação metálica do meio de cultura com a parede do tubo: tubo de
espera com dimensões pequenas (ligas especiais)
• Dispensa a utilização de motores de potência elevada para acionamento dos
agitadores, como no processo descontínuo
• Economia de vapor, e de água de resfriamento, em relação ao processo
descontínuo
• Cinética de destruição térmica de microrganismos

• Destruição por calor úmido depende

• Microrganismo
• Gênero, espécie, linhagem, existência de esporos, idade da cultura
• Meio de cultivo
• Composição, pH, presença de sólidos em suspensão
• Temperatura

dN Modelo de Rahn
 k  N
dt

N = nº de MO vivos após um t de aquecimento do sistema a T constante


k = Constante de velocidade de destruição térmica do MO
• Cinética de destruição térmica de microrganismos

• Utilizando o mesmo meio na mesma temperatura (>Tm)


• N0 = nº de MOs vivos no instante t=0
dN dN
dt
 k  N  N  k   dt ln N  ln N 0  k  t

• Usando valores experimentais de N e t  calcula-se k k

12
t N ln N ln N = -0,0341t+ 12,163
(minutos) R² = 0,9998Ln
8
25 8,5 . 104 11,35041
ln N

Série1
50 3,5 . 104 10,4631 4
Linear (Série1)
100 6,0 . 103 8,699515
200 2,0 . 102 5,298317
0
0 100 200 300
250 40 3,688879 Tempo (min)
• Cálculo do tempo de esterilização
1 N0
ln N  ln N 0  k  t t ln
k N
Problemas Soluções
Os meios não possuem uma única Escolha de um MO altamente resistente ao calor
espécie de MO Ex.: Bacillus stearothermophilus
k depende também do meio e da Experimentos preliminares para determinação
temperatura de k
Aproximação – k≈ 1 min-1 (a 121°C)
Células estarem em forma de -
aglomerados ou protegidas por
partículas sólidas em suspensão
Como a esterilização tem como Probabilidade de falha da esterilização (P=N)
objetivo destruir todos os MOs P=Ef/Et
vivos – N=0
• Exercício
Um dado volume de meio a esterilizar contém 2,5.1010
microrganismos vivos. O valor da constante de velocidade de
destruição térmica do microrganismo é de 3,4 min-1. Calcule os
tempos de esterilização para que as probabilidades de falha sejam
de 10%, 1% e 0,1%.

Resolução:
1 2,5.1010
Para P = 0,1(10%) t ln  7,7 min
3,4 0,1
1 2,5.1010
Para P = 0,01(1%) t ln  8,4 min
3,4 0,01

1 2,5.1010
Para P = 0,001(0,1%) t ln  9,1 min
3,4 0,001
• Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo
Tempo de
esterilização
N2  N3
• N1 – Nº inicial de células vivas 1 1
• P – Probabilidade de falha Te
• Tm – Temperatura mínima letal N1

Resfriamento
Esterilização
P1
• Te – Temperatura de esterilização 1
• k = f(T)

Aquecimento
Tm
• As curvas de aquecimento e
Temperatura

resfriamento do meio

Tf

Ti

t1 t2 t3 t4 Tempo
• Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo
Tempo de esterilização
t2
N1 
N 2 t1
•Aquecimento ln  k A .dt N2 N3
N Te
•Esterilização ln 2  ke .

Resfriamento
N3 Esterilização
t N1 P1
N3 4
P t3
•Resfriamento ln  k R .dt

Aquecimento
Tm
Temperatura

t t
N1 2 4

ln   k A .dt ke .   k R .dt Tf


P t1 t3

Ti
Tempo de esterilização

t1 t2 t3 t4 Tempo
• Cálculo do tempo de esterilização por processo contínuo
Tempo de
esterilização
N2 N3

• Aquecimento e 1 1
Te
resfriamento são Esterilização
muito rápidos N1 P1

Resfriamento
Aquecimento
1
Tm
t t Temperatura
N1 2 4

ln   k A .dt ke .   k R .dt


P t1 t3 Tf

N1
ln  k e . Ti
P

t1t2 t3 t4
Tempo de esterilização Tempo
• Exercício (esterilização descontínua)
Um meio com 100 m3 de volume a esterilizar tem uma concentração
de microrganismos vivos igual a 7,2.109 células/litro. A temperatura
de esterilização é 120oC, a temperatura mínima letal do
microrganismo 80oC e a probabilidade de falha é 0,1%. A variação
da constante de velocidade de destruição térmica do microrganismo
(min-1) com a temperatura (oC) é dada pela equação abaixo. Como
também as curvas de aquecimento e resfriamento do meio. Calcule
o tempo de esterilização deste mosto.

k = 6, 04·10-11 ·e0,200T
• Resolução:
• Dados
• V=100m3=105L
• C=7,2.109 Células/L
• Te=120oC
• Tm=80oC
• P = 0,1% = 0,001
k = 6, 04·10-11 ·e0,200T
Curvas de aquecimento e resfriamento
• Resolução:
• Dados
• V=100m3=105L
N1=7,2.1014Células
• C=7,2.109 Células/L
• Te=120oC
• Tm=80oC
• P = 0,1% = 0,001
k = 6, 04·10-11 ·e0,200T
Curvas de aquecimento e resfriamento
q =?
Tempo de esterilização t t
N1 2 4

ln   k A .dt ke .   k R .dt


P t1 t3
• Resolução:
t2 t4
N1
ln   k A.dt ke .   k R .dt
P t1 t3

• Cálculo de ke

k = 6, 04·10-11 ·e0,200T ke  6,04  10 11  e 0, 200.120  1,6min 1


t t
N1 2 4

• Resolução: ln   k A.dt ke .   k R .dt


P t1 t3

• Cálculo de kA e kR
• A partir das curvas (A e R) e da equação de Bigelow – Tabela (t, T e k)

k = 6, 04·10-11 ·e0,200T Resfriamento


Aquecimento t (min) T (oC) k (min-1)
t (min) T (oC) k (min-1) 0 120 1,6
24 80 0,0005 2 114 0,48
30 87 0,0022 4 109 0,18
40 97 0,016 6 105 0,080
50 105 0,080 8 101 0,036
60 112 0,32 10 97 0,016
70 116 0,72 15 88 0,0026
80 120 1,6 20 80 0,0005
t t
N1 2 4

• Resolução: ln   k A.dt ke .   k R .dt


P t1 t3

• Cálculo de kA e kR
• Tabelas A e R - curvas (t x k) – obtém-se as equações – integra-se
80

k
24
A .dt  19,40

20

k
0
R .dt  3,23

t t
N1 2 4

ln   k A .dt ke .   k R .dt


P t1 t3

7,2  1014
ln  19,40  1,6  3,23
0,001
  12 min
t t
• Resolução: N1 2 4

ln   k A.dt ke .   k R .dt


P t1 t3
• Cálculo de kA e kR
• Usando a regra de Simpson

tn

t k (t )dt  3 k (t0 )  4k (t1 )  2k (t2 )  4k (t3 )  ...  2k (tn2 )  4k (tn1 )  k (tn )


h
0

t n  t0
h
n
n= número de partes em que o intervalo foi dividido – deve ser um
número par
h= comprimento de cada intervalo
• Exercício (esterilização contínua)
Com os mesmo dados do exercício anterior, mas com a
temperatura de esterilização igual a 130oC. Qual o tempo de
esterilização?

Resolução:
t t
N1 2 4

ln   k A.dt ke .   k R .dt


P t1 t3

k = 6, 04·10-11 ·e0,200T = 6, 04·10-11 ·e0,200.130 =11,8min-1


41,12 =11,8q
q = 3, 5min
• Dimensionamento do tubo de espera

Calcular D (diâmetro interno do tubo de espera) e L


(comprimento do tubo de espera)

É preciso conhecer os valores de V, te, , µ, , e Re e calcular o valor


de υ
V = volume de meio necessário para encher um fermentador
te = tempo de carga do fermentador
 = massa específica do meio à T de esterilização
µ = viscosidade do meio à T de esterilização
 = tempo de esterilização
υ = velocidade de meio no tubo de espera
Re = nº de Reynolds no tubo de espera
• Dimensionamento do tubo de espera

Cálculo de D
𝑉 𝜋(𝐷 2)2 .𝐿 𝜋𝐷2
4𝐹
𝐹= = = .𝑣 𝐷. 𝑣 =
𝐷𝜋
𝑡𝑒 𝑡𝑒 4

𝐷. 𝑣. 𝜌 𝜇. 𝑅𝑒
𝑅𝑒 = 𝐷. 𝑣 =
𝜇 𝜌
𝑉𝑐𝑖𝑙𝑖𝑛𝑑𝑟𝑜 =𝜋𝑟 2 𝐿
4𝐹. 𝜌
𝐷=
𝜇. 𝑅𝑒 . 𝜋
Cálculo de L

4𝐹
𝐷. 𝑣 = 𝐿 = 𝑣. 𝜃
𝐷𝜋
Esterilização
Ar
Esterilização - Ar

• Aerossóis microbianos
 Solo: ventos
 Água: gotas d’água que se desprendem da superfície
 Irrigação com efluentes de esgoto
 Colheitas
 Abatedouros
 Criação de animais
 Depósitos de resíduos
Esterilização - Ar

• Métodos para esterilização de ar

Aquecimento Radiação Filtração


Esterilização – Ar
Aquecimento

• Esterilização por aquecimento

O processo consiste em forçar a passagem do ar através de resistores


elétricos, onde o ar é aquecido, e mantê-lo pelo tempo necessário a altas
temperaturas.

• Pouco utilizada
• Exige temperaturas elevadas
• Grandes tempos de esterilização
• Compressores e resfriadores
• Utilizada para pequenas instalações (laboratório e escala piloto)
• Esterilização de ar na saída de fermentações com patógenos
Esterilização – Ar
Aquecimento

Equipamento para esterilização de ar por aquecimento através de


resistores elétricos
Esterilização – Ar
Radiação

• Esterilização por radiação ultravioleta

Baixo poder de Longos períodos de


penetração exposição

Inviabilidade do processo

As radiações ultravioletas são utilizadas no interior de salas ou


câmaras para esterilização do ar circundante e de mesas, uma
vez que o ar introduzido nestes locais é previamente
esterilizado por filtração.
Esterilização – Ar
Filtração

• Esterilização por filtração


• Mais adequada
• Obtenção de altas vazões
• Baixo custo
• Disponibilidade de filtros bastante confiáveis
• Utilizada em praticamente todas as instalações industriais

• Materiais filtrantes
• Carvão
• Algodão
• Papel
• Materiais fibrosos: lã de vidro
• Materiais sinterizados: vidro, metais e materiais cerâmicos
• Materiais poliméricos: membranas de náilon, teflon
• Membranas seletivas (esterilizar o ar e provocar o enriquecimento
com oxigênio) – Futuramente
Esterilização – Ar
Filtração
• Filtros de materiais fibrosos (lã de vidro)

• Pouca aplicação industrial


• Operação de filtração em
profundidade, pois as partículas são
retidas ao longo de toda altura da
camada filtrante Lã de vidro
• Retenção dos microrganismos por
impacto direto (retenção mecânica), ...
• A passagem do ar através da
camada filtrante deve ser a uma
temperatura superior a ambiente
para manter a camada aquecida e
evitar a condensação de umidade
Esterilização – Ar
Filtração
• Filtros de membranas
• Filtros de membranas
microporosas, elaborados com
material polimérico
• Poros de dimensões menores do que
os microrganismos a serem retidos
(0,2 m, 0,22 m ou 0,45 m)
• Retenção dos microrganismos por
impacto direto na superfície do
elemento filtrante
• Filtros hidrofóbicos: sem água na Retenção na superfície
superfície do filtro diminui o
crescimento microbiano, diminuindo a
possibilidade de enviar ar
contaminado para o biorreator
Esterilização – Ar
Filtração
• Filtros HEPA
(High Efficiency Particulate Air)

• Câmaras de fluxo laminar


• Áreas limpas
• Placas de acetato de celulose
• Permite a retenção de pelo menos 99,97% das
células e esporos microbianos ou outras partículas
presentes no ar
• Remove partículas com diâmetro médio de 0,3 m a
0,5 m
• São montados com vários elementos filtrantes separados
por folhas de alumínio, obtendo-se grande área para a
passagem do ar e a utilização de ventiladores ao invés
de compressores de ar, devido a baixa perda de pressão
através do leito filtrante
 Livro Engenharia Bioquímica (Volume 2)
◦ Capítulos 3, 4 e 5