Indução alfa e beta adrenérgica da expressão da proteína desacopladora termogenina em adipócitos marrons diferenciados

em Cultura

A fim de analisar o controle da expressão do gene que codifica para a proteína desacopladora termogenina específica para tecido
adiposo marrom (UCP), células de gordura marrom isoladas como precursores indiferenciados a partir de tecido adiposo marrom
interescapular de ratos jovens foram cultivadas em cultura. Nestas células, foi possível pela adição de norepinephrine (NE) induzir
especificamente a expressão do gene da UCP. O efeito do NE foi devido a ativação de transcrição. A capacidade de expressar o gene
UCP foi máxima nas células ao redor confluência; culturas de células mais jovens ou mais velhos que estas mostraram uma resposta
menor. A resposta a NE mostrou-se ótima em torno de 0,1µM e foi linear com o tempo durante o período de 4 h estudado. A
presença de insulina ou hormônios da tireóide facilitou a resposta NE. Análise farmacológica da resposta adrenérgica indicou que a
expressão do gene UCP poderia ser induzido tanto via receptores ᵦ (provavelmente β3 ) quanto α1-receptores; estes efeitos foram
sinérgicos. Concluiu-se que é possível levar essas células precursoras à avançar para um tal estado de diferenciação que possam
demonstrar a característica seletiva das células de gordura marrom, ou seja, a capacidade de expressar UCP. A expressão do gene é
regulada através da interação da UCP com mecanismos adrenérgicos.

Mitocôndrias do tecido adiposo marrom possuem uma única proteína, a proteína desacopladora termogenina (UCP). A UCP está
localizado na membrana mitocondrial interna. Sua principal função é dissipar o gradiente de prótons gerado pela atividade
respiratória e, portanto, dissociar respiração mitocondrial da fosforilação oxidativa, dando origem à dissipação de energia na forma
de calor. A quantidade de UCP é geralmente considerada ser limitada pela termogênese sem tremores induzida por dieta e frio, o
que faz com que a regulação da síntese da UCP uma questão de grande interesse fisiológico. Para avaliações gerais ver Refs. 1 e 2.
A partir de experimentação in vivo sabe-se que a expressão do gene da UCP é fisiologicamente estimulada pela exposição ao frio de
animais (3-ll). Como o aumento induzido pelo frio na UCP mRNA é mimetizado por injeções de norepinefrina em animais intactos
(3, 5, 6), é geralmente aceito que a indução fisiológica da expressão do gene da UCP é mediada através da liberação de
norepinefrina dos nervos simpáticos e é provavelmente um efeito direto sobre as células. Embora a caracterização farmacológica da
resposta tenha sido tentada (5, i '), os resultados têm sido, em parte contraditórias, e essas experiências compartilham a limitação
inerente de todos em estudos in vivo de que efeitos secundários podem estar envolvidos, tornando conclusões ambíguas . Para
entender o processo de diferenciação da célula de gordura marrom, e a regulação da expressão gênica da UCP, os resultados do
trabalho com células de gordura marrom diferenciadas in vitro são, portanto, essenciais. Há vários anos sistemas de cultura de
células de gordura marrom estão disponíveis (12-16). Estas culturas de células demonstraram avançar em diferenciação, pelo menos,
na medida em que as culturas de células de gordura branca; ou seja, elas demonstraram características esperadas de adipócitos
maduros, ou seja, a expressão de certas enzimas lipolíticas e lipogênicas (15, 17) e um aumento induzido adrenergicamente no
AMPc e estimulação da lipólise (18, 19).

No entanto, até muito recentemente, este tem sido o limite. Não houve demonstração de que as chamadas culturas de células de
gordura marrom tiveram a capacidade de expressar o gene da UCP, ou seja, a única diferença qualitativamente discriminadora entre
as células de gordura branca e marrom. Assim, as experiências mais difíceis, aquelas preocupadas com a conclusão do processo de
diferenciação, e com a regulação da expressão da proteína desacopladora em si, não poderia ser realizada com estas culturas de
células. Assim, num estudo recente, no qual as células precursoras de gordura marrom foram isolados a partir de animais
hipotireoideanos, pudemos observar pela primeira vez, a presença de UCP ARNm em culturas de células (20). Embora promissor,
foi, no entanto, fisiologicamente insatisfatório e limitante para a interpretação que esse fenômeno só pode ser observado em tais
células anormais. Apresentamos aqui a primeira evidência de que é possível em células de gordura marrom isolados de ratos
normais induzir a expressão do gene UCP pela adição NE. A partir de um estudo detalhado deste fenômeno, podemos concluir que a
capacidade de expressar de forma ideal o gene UCP é um evento transitório no ciclo de vida dessas células de gordura marrom em
cultura. A expressão pode ser induzida por noradrenalina, com potencialização por insulina e hormônios da tireóide. A norepinefrina
age tanto via receptores α1 e β adrenérgicos, com indicações de que esses receptores podem interagir sinergicamente.

MATERIAIS E MÉTODOS

Células isoladas e culturas de células precursoras de gordura marrom foram isolados a partir de tecido adiposo marrom cervicar,
axilar e interescapular de ratos machos com 4 semanas de idade, como descrito no Rehnmark et al. (20) (idêntico ao descrito no
procedimento utilizado para células de rato por Néchad et al. (12), exceto para o choque hipoosmótico). A quantidade de células
correspondentes às células isoladas a partir de um animal foi inoculado por cultura em balão (Bibby, Estocolmo, Suécia, 25
centímetros), contendo 5 ml de meio de cultura consistindo em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de
soro de bezerro recém-nascido, 4 nM insulina, 10 mM de Hepes e 50 IU de penicilina, 50 µg de estreptomicina, e 25 µg de
ascorbato de sódio por mililitro. As células foram cultivadas a 37 "C numa atmosfera de 8% de CO2, no ar (conforme recomendado
por meio de Eagle modificado por Dulbecco pelos fornecedores) com 80% de umidade. O meio foi mudado nos dias 1 e 3 após o
plaqueamento. Salvo disposição em contrário, as culturas foram analisadas no dia 6 após o plaqueamento (ou seja, em torno de
confluência). As células foram expostas a norepinefrina (solução aquosa recentemente feito para cada experimento) e / ou outros
agentes por 4 h (se não for indicado de outra forma) e colhidas. Colheita de células, Isolamento de RNA e Análise - As células
foram lavadas uma vez em 4 ml de solução salina tamponada com fosfato e em seguida dissolvido em 1 ml de tampão de extração
de guanidina HCl quente (4). O RNA total foi isolado como descrito previamente (4, 5) e a concentração de RNA foi determinada
com um espectrofotómetro (DU-50, Beckman Instruments) a 260 nm; as relações 260/280 foram rotineiramente cerca de 1,8. A
intacto do RNA isolado foi geralmente verificado por separação sobre um mini-gel de agarose a 1,25% contendo 0,01% de brometo
de etídio, e o RNA foi visualizado sob luz UV. Para a análise de slot-blot, alíquotas de ARN total (4 µg) foram aplicadas a
membranas de nylon Zetaprobe (Bio-Rad) em um aparelho de slot-blot (Schleicher e Schuell SRC 072 / S Minifold II); uma amostra
de UCP ARNm-positivo ( RNA de gordura marrom isolado a partir de ratos expostos a 4 "C durante 24 h) e uma amostra negativa
UCP ARNm (ARN cerebral isolada dos mesmos ratinhos) foram incluídos em todas os blots como controles de hibridação.

As análises de Northern blot foram realizadas tal como descrito previamente (4) em um gel de agarose a 1,25% contendo 3% de
formaldeído em tampão fosfato de sódio 10 mM (pH 6,5), após o que o RNA foi transferido para membranas de nylon Zeta Probe.
A hibridação dos blots foi realizada como descrito previamente (4) com um clone de ADNc radioativo nick-translation
correspondente à proteína desacopladora do rato. Em algumas experiências a hibridação com uma sonda de cDNA da actina @ foi
realizado, adicionalmente, nas mesmas manchas. Os dados foram avaliados pela digitalização dos autoradiogramas com um
densitômetro a laser (UltraScan XL, Pharmacia LKB Biotechnology Inc., ou Molecular Dynamics 300A computação densitômetro).
Verificou-se que boa linearidade entre a quantidade de sondas e os resultados da varredura a laser foram obtidos, desde que foram
usados filmes com intensidades de exposição relativamente baixos. Os resultados foram expressos como uma percentagem de
intensidade, em comparação com a observada após a adição de norepinefrina. Nos slot blots, em alguns casos, o controle RNA
negativo (cérebro) deu um sinal muito fraco (<5% do sinal induzido pelo NE). Nestes casos, esta foi subtraída dos outros valores.

Materiais -A fonte dos materiais usados para o isolamento de células, da cultura, colheita e foi o mesmo descrito anteriormente (12).
O kit nick-tradução foi da Bethesda Research Laboratories. Filmes de raios-X foram Kodak X-Omat AR. (-)-Arterenol bitartarato
(noradrenalina), cloridrato de DL-propanolol, (-)-isoproterenol hidro-cloreto de (isoprenalina), cloridrato de L-fenilefrina,
forscolina, ox-ymetazoline, Tn, T,, e 8-bromoadenosine- 3 ', foram todos obtidos monofosfato-Phate 5'-cíclicos a partir de Sigma.
Actinomicina D (Cosmegen) foi obtido a partir de Merck. Prazosin e cirazoline foram generosas doações da Pfizer e Synthelabo
Recherches (Lers, Paris, França), respectivamente. BRL-37344 e CGP-12177 foram generosas doações de Beecham Laboratories,
Reino Unido e Ciba-Geigy, respectivamente.

RESULTADOS

A expressão do gene UCP em culturas de células de gordura marrom

Na Northern blot mostrada na fig. 1, demonstra-se que a partir da estimulação por norepinefrina (NE) é possível obter uma
expressão forte do gene da UCP em células de gordura marrom que se desenvolveram em cultura a partir de células precursoras não
diferenciadas.

Neste experimento, como em todos os outros experimentos relatados neste trabalho, uma alta reprodutibilidade quantitativa foi
observada entre frascos duplicados na mesma série experimental. Devido à presença de duas bandas correspondentes a duas
espécies de ARNm de UCP, o sinal UCP aqui aparece difusa (as duas bandas são mais claramente distinguíveis na fig. 6). Estas
duas bandas, a maior em 16 S (1,6 quilobases) e a menor em 18 S (1,9 quilobases), também são encontradas na gordura marrom de
rato in vivo (4), e sua presença aqui indica que os processos de transcrição e pós-transcrição (splicing) ocorrerem de forma
competente nas células cultivadas. Em contraste com os elevados níveis de UCP de ARNm encontrados nas células NE-estimuladas,
os níveis de mRNA de UCP foram sempre muito baixos, se for detectável, em células a que não foi adicionado NE (ver também as
Figs. 2-6).

Para eliminar a possibilidade de que o aumento induzido pelo NE no nível UCP ARNm era devido à estabilização da já existente
UCP ARNm, o efeito da inibição da transcrição foi examinado.

A inibição da síntese de ARN por tratamento prévio das culturas de células de gordura marrom com actinomicina D por 1 h antes da
estimulação NE aboliu completamente o aumento NE-estimulado na expressão do mRNA da UCP (Fig. 1, pista ACT + NE). Assim,
o efeito da NE foi um efeito direto sobre a taxa de transcrição do gene da UCP. Isto está de acordo com as conclusões de
experimentos in vivo (5, 6). In vivo, a estimulação da expressão do gene está associada com a desestabilização da UCP ARNm (6).

Como mostrado pela rehibridização de Northern blot com uma sonda de actina cDNA (Fig. 1) nem NE ou actinomicina afetou os
níveis de actina ARNm (ver também a fig. 4B).

Expressão relacionada com a diferenciação do gene UCP em células de gordura marrom

Durante o desenvolvimento fetal em vivo, o aparecimento da UCP ARNm e proteína em gordura marrom é um evento relativamente
tardio, que ocorre em torno do nascimento em ratos e camundongos (11, 21, 22) e pós-natal inteiramente em hamsters (23, 24). Nós,
portanto, investigadas se a capacidade de expressar o gene UCP em culturas desenvolvidas a partir de células indiferenciadas foi um
evento relativamente tarde, necessitando de uma fase de maturação posconfluente, ou se poderia ser já observado na confluência
quando outros marcadores de diferenciação, tais como o gene da lipoproteína lipase (17) são expressos.

Células precursoras e gordura marrom foram cultivadas em cultura, por conseguinte, para 4, 6, e 10 dias. Estes dias correspondem
às fases preconfluente (fase de crescimento), confluente, e posconfluente com o procedimento de cultura utilizado aqui (12, 20). No
respectivo dia, o nível de expressão do gene da UCP foi investigada tanto em culturas não tratadas e em culturas tratadas com
0,1µM NE durante 4 h antes da colheita.
Nas culturas não tratadas, não havia nenhuma quantidade detectável de UCP mRNA, e não foram encontradas diferenças a este
respeito entre as três fases (dias) investigados (Fig. 2). Em todas as fases, no entanto, o tratamento NE induziu um aumento nos
níveis de ARNm da UCP. Como pode ser visto na fig. 2, a intensidade deste efeito variou muito, dependendo da fase de análise. A
resposta foi maior em torno da confluência (dia 6). Nas células preconfluentes (dia 4), o efeito de NE era muito fraco em
comparação com a observada em torno de confluência. Em células posconfluentes (dia 10) a capacidade de resposta a NE tinha
diminuído significativamente e foi apenas cerca de 40% da expressão encontrado em células tratadas com NE no dia 6. Estes
resultados, bem como todos os outros resultados do presente estudo são analisados por µg de ARN e, assim, são independentes do
rendimento de RNA a partir de cada frasco. Ao usar uma dose 100 vezes maior de NE (10 µM) em duas séries experimentais
independentes testamos se as mudanças na expressão gênica UCP poderia refletir as mudanças na sensibilidade das células à NE. Os
resultados qualitativamente semelhantes aos mostrados na figura. 2 foram obtidas, com uma resposta máxima no dia 6 (não
mostrado), e não havia qualquer razão para supor que uma sensibilidade alterada NE poderia explicar a curva do tempo mostrada na
FIG. 2. Foi, portanto, concluído que a capacidade de expressar o gene da UCP não foi um acontecimento tardio diferenciação dessas
células, mas que isso aconteceu e foi máxima em torno de confluência; cultura com posconfluencia prolongada pelo contrário
conduziu a uma diminuição da capacidade de expressar o gene da UCP. Com base nestes resultados, as culturas de 6 dias de idade
foram usados para posterior análise do efeito de NE sobre a expressão do gene da UCP.

Com as técnicas de microscopia de elétrons, nós temos observado anteriormente, a presença de alguns adipócitos maduros na fração
do estroma vascular isolada a partir de tecido adiposo castanho de cultura (13). A partir dos resultados apresentados aqui (a virtual
ausência de expressão de gene induzida no dia 4, em contraste com o grande aumento no dia 6), pode ser excluída a possibilidade de
que a grande expressão do gene UCP induzida por NE observada em células confluentes pode ter ocorrido nestes poucas células
maduras; ao invés, esta resposta indica a progressão do processo de diferenciação verdadeiro.

Efeito de insulina e hormônios da tireóide

Nas figuras anteriores mostra-se que a NE, por si só, nestas células cultivadas, é capaz de induzir a expressão do gene da UCP. In
vivo o sinal para a expressão do gene da UCP é mediado através da inervação simpática do tecido (9), e as presentes experiências
apoiariam a noção de que a liberação de NE estes nervos é um sinal suficiente para a expressão do gene da UCP in vivo. No entanto,
in vivo o sinal para a expressão do gene da UCP é processado em um ambiente hormonal e, em adição a NE, a insulina (25) e
hormônios da tireóide (9, 56) tem sido implicados no controle da expressão do gene da UCP.

O possível envolvimento desses hormônios no efeito do NE sobre a expressão do gene UCP foi, portanto, investigado em culturas
de células de gordura marrom. Como hormônios da tireóide estão presentes no soro de vitelo recém-nascido adicionado ao meio de
cultura, e como este meio é suplementado com insulina, a experiência foi realizada descartando o meio e substituindo-o por meio de
Eagle modificado por Dulbecco, pouco antes da adição de NE.

Isto resultou em um decréscimo na capacidade de NE para estimular a expressão do gene da UCP nas células adiposas marrons (Fig.
3). Quando também insulina, T3, ou T4, foram adicionados em conjunto com NE, o aumento no UCP ARNm então observado
aproximou-se daquele visto na presença de meio de cultura completo. Além disso, estes hormônios são aparentemente capazes, por
si só (na ausência de NE) de aumentar a expressão do gene da UCP em uma pequena extensão. Os resultados de três séries
experimentais independentes confirmam estas conclusões, embora o efeito quantitativo de omissão soro variou entre séries
provavelmente devido às diferentes eficiências na remoção do meio original.

Tempo Curso de Expressão UCP mRNA induzida por NE

Os níveis de mRNA UCP foram seguidos em culturas de células de gordura marrom tratados com NE em intervalos curtos de tempo
até 4 h após a adição NE. Depois de 15 minutos de exposição a NE um sinal do ARNm UCP claramente detectável podia ser
observado (Fig. 4A), e o ARNm UCP continuou a aumentar durante todo o experimento. É notável que não havia nenhuma
indicação de qualquer desvio da linearidade durante estes 4 h; o processo de transcrição prosseguiu com uma estabilidade notável. A
partir da retidão da linha, é claro que não houve atraso no tempo de transcrição , e nenhum passo de ativação deve ser invocado.
Embora seja claramente possível aumentar ainda mais os níveis de mRNA celulares por exposição prolongada ao NE, um período
de estimulação de 4 h foi rotineiramente escolhido para as experiências relatadas no presente trabalho.

Durante o mesmo período, o nível de ARNm de actina não mudou significativamente, o que confirma a especificidade do efeito do
NE na expressão do gene da UCP (Fig. 4B).

Sensibilidade adrenérgica da expressão do gene da UCP

Para investigar se a expressão do gene UCP tem um maior limiar de idade para a estimulação do que o processo termogênico agudo
foi estudado a sensibilidade do processo de indução do gene à NE.

A curva de dose-resposta para o efeito da NE em culturas de células de gordura marrom (Fig. 5) mostrou que 0,1 µM de NE foi a
concentração ótima para a estimulação da transcrição do gene da UCP. Em concentrações inferiores ou acima de 0,1µM de NE a
expressão do mRNA da UCP foi reduzida (Fig. 5).

A termogênese NE-estimulada (respiração) também é maximamente estimulada com 0,1µM de NE (26). Assim, a sensibilidade do
processo de expressão do gene à NE é semelhante ao da resposta termogênica aguda. No entanto, em experimentos respiratórios tem
sido observada diminuição acentuada na resposta com maiores concentrações de NE. À medida que o processo de expressão do
gene é notavelmente linear com o tempo (Fig. 4A), não há razão para supor que esta diferença no padrão de resposta deve-se à
análise da expressão do gene que está sendo executada 4 h após a adição de NE, enquanto que as experiências respiratórias são
normalmente analisadas dentro dos primeiros minutos após adição NE. Assim, não há explicação simples para esse fenômeno que o
controle NE da expressão gênica de UCP não siga a cinética de saturação de Michaelis-Menten esperada.

Deve-se salientar que estas cinéticas de não saturação fazem uma caracterização farmacológica detalhada da resposta NE mais
complicada. Por exemplo, pode prever-se que a adição de antagonistas de NE em certos intervalos (supraoptimal) de concentração
poderia inesperadamente ter um efeito positivo sobre a expressão do gene da UCP.

Caracterização Farmacológica dos adrenoceptores mediando o efeito NE

A observação aqui de um efeito de NE na expressão do gene da UCP em células de gordura marrom cultivadas oferece uma
excelente possibilidade para investigar diretamente a nível celular os pormenores da regulação adrenérgica da expressão do gene
UCP. Isto é de especial importância, porque há evidência para a presença de nada menos que cinco tipos de receptores adrenérgicos
nessas células (α1,α2,β1,β2 e β3), e cada um deles poderia ser (e tem sido) implicado no controle adrenérgico da expressão do gene
UCP e implicaria diferentes mecanismos de controle intracelular. Nós portanto apresentamos aqui a primeira análise detalhada da
participação destes receptores celulares na expressão do gene da UCP.

Em vista da seletividade receptor- subtipo limitada dos agentes adrenérgicos disponíveis, considerou-se essencial testar tanto a
capacidade dos antagonistas de inibir o efeito de NE na expressão do gene da UCP, e a capacidade dos agonistas ou segundos
mensageiros para imitar este efeito.

Efeito dos antagonistas subtipo-seletivo- O efeito da adição dos antagonistas subtipo-seletivos propanolol (β) e / ou a prazosina (α1),
em conjunto com a NE, às culturas de célula de gordura marrom na Tabela I, A. O aumento NE-induzido na UCP ARNm foi inibido
48% por 10µM de prazosina. Propranol na mesma concentração diminuiu os efeitos da NE por 83%. Que o restante, em ambos os
casos foi devido à ação da via não inibida, é demonstrado pelo efeito da adição de ambos os antagonistas simultaneamente; toda a
expressão do gene poderia, então, ser inibida. Assim, a resposta observada para NE foi o resultado de ativação de ambas as vias.
Pode-se mencionar que, quando a expressão do gene foi induzida por 1µM de NE em vez de 0,1µM, os antagonistas (adicionados
nas mesmas concentrações, como acima) não foram capazes de inibir o efeito de NE (não mostrado). Na ocasião uma estimulação
foi observada de acordo com as previsões feitas a partir da curva dose-resposta para a NE mostrados na fig. 5.

Efeito de β3 Agonistas - Tem sido salientado que β -receptor mediando lipólise (e termogênese) no tecido adiposo marrom (27)
(bem como no tecido adiposo branco (28) e, em certos outros tecidos) não preenche os critérios para ser classificado como β1 ou β2
conforme a critérios originalmente criados por Lands et al. (29). A caracterização farmacológica da resposta fisiológica
preferencialmente indica que o receptor mediando esta resposta pertence a um terceiro tipo de β-receptor, que pode ser referido
como β3 receptores (28, 30). Uma série de β3 agonistas tem sido desenvolvida, por exemplo, a série BRL (27).

O efeito do β3 - agonista BRL-37344 sobre a expressão do gene da UCP, em comparação com NE, é mostrado na Tabela I, B. BRL-
37344 foi capaz de induzir a expressão do gene da UCP, mas pareceria que (pelo menos nesta concentração), não foi capaz de
aumentar a quantidade UCP mRNA nas células de gordura marrom, tanto quanto NE fez. Uma vez que observou-se que NE em
concentrações acima da conc. ótima é auto-inibidora (Fig. 5), e uma vez que o valor de EC50 para BRL-37344 para a estimulação
da lipólise em adipócitos marrons maduros isolados é menor do que para NE (27), a resposta mais baixa pode ser explicada nestes
termos. O efeito BRL não poderia ser contratacado pelos antagonistas do subtipo seletivo prazosina e propanolol em concentrações
onde eles inibem a estimulação NE (Tabela I, A). Isto bate com a baixa afinidade de BRL-37344 por α1-receptores (locais de
ligação de prazosina) (31) e sua elevada eficácia para a estimulação de β3 receptores (em comparação com aquele, por exemplo, de
NE). Embora a capacidade de BRL 37344 de induzir a expressão do gene UCP está de acordo com uma capacidade de β3 receptores
para mediar o sinal para a expressão do gene, essa observação não pode ser considerada evidência conclusiva desde que BRL-37344
é capaz de actuar como um agonista também em β1-receptores (27 ) No entanto, o agente adrenérgico CGP-12177 (em geral, aceite
como um β1 - antagonista (48).) foi recentemente mostrado ser um agonista para a termogênese em células de gordura marrom (32)
Em contraste com os agonistas-BRL, o CGP - 12177 pode ser considerada um β3-agonista qualitativamente seletiva (isto é, que tem
um efeito estimulador em apenas β3 receptores). Temos, pois, também investigamos o efeito do CGP-12177 sobre a expressão do
gene da UCP. Como pode ser visto na Tabela I, B, de forma semelhante a BRL-37344, CGP-12177 foi capaz de aumentar a
quantidade de UCP ARNm nas células de gordura marrom. Portanto, esta é uma indicação muito clara de que a expressão do gene
UCP pode ser mediada via receptores β3. O efeito de CGP-12177 pode ser inibido pelo propanolol; que o propranolol foi capaz de
inibir a expressão de genes induzidos por CGP, mas não a induzida por BRL-37344, está de acordo com indicações de que a
afinidade aparente de CGP-12177 para os receptores β3 não é tão elevada como a de BRL-37344 , com base na capacidade destes
agentes para induzir a termogênese (32). Pode-se assim concluir que os chamados β3-agonistas foram capazes de induzir a
expressão do gene da UCP em células de gordura marrom cultivadas. Esta é a primeira demonstração de que estes agentes têm um
efeito direto sobre a expressão do gene nas células de gordura marrom propriamente ditos, e está de acordo com interpretações de
experimentos realizados in vivo (7).

Efeitos da estimulação seletiva α e β-adrenérgicos – Condições experimentais já haviam sido estabelecidos para permitir seletiva
estimulação α1e β-adrenérgicos da respiração nas células de gordura marrom maduras isoladas (33). Nós, portanto, aplicamos essas
condições às nossas culturas de células de gordura marrom e investigamos se era possível distinguir vias independestes α e β
adrenérgicos para a estimulação adrenérgica da expressão do gene UCP.
Culturas de gordura marrom, portanto, receberam ou NE ou combinações de antagonistas\agonista em concentrações em que em
células de gordura marrom maduras isoladas mostrou produzir uma estimulação do consumo de oxigênio β-adrenérgico seletivo (1
µM isoprenalina + 5µM prazosin) ou α-adrenérgico (10µM fenilefrina + 5µM propranolol) (33 ).

Como mostrado na Tabela I, C, a estimulação B-adrenérgica seletiva (isoprenalina + prazosina) foi aparentemente tão eficaz como
NE (aqui adicionados em 1µM) para estimular a síntese de ARNm UCP. Embora a presente experiência indica, portanto, que
seletiva β-estimulação é equipotente ao NE, esta interpretação possa ser muito simples devido à estreita faixa ideal de NE
encontrada na curva dose-resposta (fig. 5). Assim, em uma experiência independente na qual 0,1µM NE foi comparada com 0,1µM
isoprenalina (+ 5µM prazosina), a resposta a NE era 135% da observada com isoprenalina (não mostrado).

A estimulação seletiva do receptor α1-adrenérgico (fenilefrina + propranolol) foi, em si, também capaz de aumentar a expressão do
gene da UCP, embora em menor extensão que a estimulação β seletiva (cerca de 30% do efeito NE). A fim de determinar se esta
resposta foi devido a um puro efeito α1, ou se uma estimulação da via β no entanto ocorreu, a prazosina antagonista α1 seletiva foi
adicionada em conjunto com fenilefrina e propanolol às culturas de células de gordura marrom em duas séries de experiências
independentes. Verificou-se que 5 µM prazosina 5 FM foi capaz de inibir cerca de 80% do aumento da expressão do gene da UCP
induzida pela estimulação α seletiva de estimulação (não apresentado). Por conseguinte, concluiu-se que esta estimulação foi de fato
seletivo e foi mediado via receptores α1 adrenérgicos. Em boa concordância com isto, a adição do agonista α1 seletivo cirazoline
(35) em 1µM, foi em si mesmo capaz de aumentar os níveis de mRNA de UCP do controle do nível de 2% a 10% do nível
observado após estimulação NE (não mostrado) . A combinação de α e β estimulação (isoprenalina + fenilefrina sem antagonistas)
aumentou a expressão do gene da UCP para a mesma extensão que NE.

Foi, portanto, concluído destas experiências que uma estimulação α ou β seletiva pode independentemente induzir a expressão do
gene UCP, embora não no mesmo grau.

Expressão do gene induzida por cAMP - Para investigar a mediação intracelular da via β-adrenérgica foram utilizados dois meios
alternativos para aumentar o nível de cAMP na célula. Testamos o efeito da forscolina, um adenilato-ciclase ativador, que foi
anteriormente mostrado estimular a termogênese rapidamente em células de gordura marrom maduros (34) e que é, portanto, capaz
de aumentar o cAMP nestas células de uma forma adequada. Também testamos 8-Br-cAMP, que tem sido encontrado em estudos
respiratórios ter uma capacidade inicialmente lenta mas acelerada para estimular a termogênese (34) (o início lento é,
provavelmente, devido à lenta permeação, mas não é um problema nas presentes experiências, onde uma incubação de 4h é usada).
Forskolin (5µM), por si só aumentou a expressão do gene UCP em 65% em comparação com o efeito do NE. Da mesma forma, 8-
Br-cAMP (1 mM) aumentou a expressão de mRNA UCP em 53% em comparação com a expressão induzida por NE (Tabela I, C).
A partir destas observações, é evidente que o efeito da estimulação β-adrenérgico sobre a expressão do gene da UCP é mediada
através de um aumento na CAMP citosólica. No entanto, nenhuma conclusão pode ser tirada sobre a capacidade quantitativa de
CAMP para induzir a expressão do gene UCP desde que a curva dose-resposta para NE pode novamente implicar que estreitas
faixas de concentração ideais também podem existir para forskolin e 8-Br-CAMP.

Modulação α-adrenérgica da expressão genética induzida por cAMP- A fim de investigar se as vias α e β - adrenergicamente
mediadas interagem, estudamos a habilidade de estimulação α-adrenérgica aumentar a expressão do gene UCP induzida pelo
CAMP.

A oximetazolina um agonista α selectivo (36) poderia aumentar significativamente a expressão do mRNA da UCP (Tabela I, D) (7%
do efeito NE). Este efeito não foi bloqueado por 5 µM propranolol pM (não mostrado). Na mesma experiência, 1 mM de 8-Br-
cAMP aumentou a expressão de mRNA de UCP em 45% para a expressão induzida por NE e combinada a presença de
oximetazolina e 8-Br-cAMP levou a um aumento maior na expressão de mRNA de UCP; o aumento foi então de 66% da expressão
induzida por NE e claramente diferente do efeito de 8-Br-cAMP sozinho.

Para verificar que uma α estimulação e 8-Br-CAMP induziram a expressão da mesma espécie de mRNA, as amostras de RNA de
uma das experiências também foram analisados por manchas de Northern (Fig. 6). Avaliação densitométrica destes resultados indica
que, em relação ao NE, os níveis de mRNA de UCP foram de 3% no controle, 15% nas células estimuladas com oximetazolina,
63% nas células estimuladas por CAMP, e de 90% nas células onde foram feitas estimulação combinada.

Por conseguinte, concluiu-se que uma estimulação α seletiva, que, em si mesma, pode ter apenas um pequeno efeito sobre a
expressão do gene da UCP, pode ser capaz de aumentar a expressão do gene da UCP induzida por um aumento nos níveis de AMPc
citosólicas.

DISCUSSÃO

Foi anteriormente tentada por vários grupos (incluindo o nosso) demonstrar a expressão do gene da UCP em diferentes sistemas de
cultura de células de gordura marrom isoladas a partir de animais normais, mas nenhuma indicação quanto à presença de UCP ou
UCP mRNA em tais células foram até agora foram publicadas . Além disso, embora haja indícios de efeitos crônicos de agentes
adrenérgicos sobre os níveis de UCP em células maduras sobreviventes mantidas sob condições de cultura (16,37), não houve
indicações positivas de que esses efeitos foram em decorrência de eventos nucleares. Mostramos aqui que as células de gordura
marrom, isoladas como precursores do tipo fibroblastos de animais normais, e proliferadas e diferenciados em cultura, podem
avançar para o estágio de diferenciação que, quando adequadamente estimulados, eles demonstram uma expressão visível do gene
para a termogenina uma proteína desacopladora específica da gordura marrom (UCP). Esta é a primeira demonstração de que essas
culturas, geralmente referidas como culturas de células de gordura marrons, são de fato isso (uma vez que são capazes de expressar
o único gene para o qual uma localização única para gordura marrom foi pedida).

Várias razões experimentais para a efetivação do presente sistema pode ser discutido. Nós aqui usamos um clone UCP cDNA
derivado de tecido rato contra células de gordura marrom de rato em cultura; em tentativas anteriores, a identidade de espécies entre
o clone cDNA e o tecido alvo nem sempre foi alcançada. O presente meio de cultura contém ascorbato que demonstramos ter um
papel benéfico na mitocondriogenese (38). Nós, no entanto, apontaríamos especialmente para a necessidade de otimizar o sistema,
tanto para a concentração ótima NE e para o dia ótimo sensível. Ele pode ser entendido a partir das Figs. 2 e 5 que não ótimas
combinações destes fatores pode facilmente resultar em níveis de expressão de genes que são 10-100 vezes mais baixo do que
aqueles que mostramos aqui. Assim, em condições ligeiramente diferentes, a competência destas células para expressar UCP pode
não ser observável.

Nível da expressão de UCP In Vitro

É possível a partir das experiências mostradas aqui avaliar se a intensidade da expressão do gene da UCP observado em células em
cultura é equivalente ao que pode ser observado in situ.

O nível específico da UCP ARNm observada pode ser comparado aos encontrados nos controles UCP-mRNA-positivos executados
em todos os blots (Fig. 1). Estes controlos consistem de RNA total isolado a partir de ratos expostos ao frio 24 h. Nas presentes
experiências, o conteúdo específico da UCP ARNm do ARN de células de cultura foi de 30-50% do RNA isolado a partir de
gordura marrom in vivo. Níveis comparáveis de expressão do gene são assim obtidos, e devido à cinética das respostas, pode ser
fundamentado que a competência das células em cultura pode chegar a das células in situ.

Relação da expressão do gene de UCP para o grau de diferenciação

Mesmo em células não estimuladas existe uma baixa expressão do gene da UCP (mais claramente mostrado na. Fig. 6). Esta é uma
observação importante, pois demonstra que um estado completamente diferenciado é, na realidade alcançado nestas células, apesar
de nunca ter sido exposto ao NE. Assim, o processo de diferenciação pode avançar nessas células para o estado concluído, mas o
processo de recrutamento requer estimulação NE. Esta conclusão está em excelente acordo com as conclusões, por exemplo, de
estudos em que o processo de diferenciação foi seguido em pedaços de tecido adiposo marrom explantado para dentro da câmara
anterior do olho. Nestas experiências, a inervação simpática foi permitida a desenvolver ou foi prevenida, e, embora o processo de
diferenciação começou mais rapidamente com a estimulação simpática, as células diferenciaram-se ainda na ausência de inervação
(39).

Nos presentes experimentos a extensão da expressão induzida por NE UCP mRNA foi claramente dependente do estado de
diferenciação de células e acompanhou de perto o padrão de diferenciação morfológica das células de gordura marrom em cultura.
Assim, antes da confluência, as células eram praticamente incapazes de responder à estimulação NE para expressão do gene da
UCP. Em torno da confluência, quando gotículas de gordura multiloculares e o arredondamento das células é evidente, a
estimulação por norepinefrina da transcrição de genes UCP foi mais proeminente. No entanto, após 4 dias adicionais em cultura, a
expressão induzida por NE tinha diminuído. Este padrão tem semelhanças com o padrão de diferenciação e desdiferenciação
implicados por Néchad (13) a partir de observações sobre a ultraestrutura mitocondrial em culturas de células de gordura marrom.
Não é possível um paralelismo entre este padrão e o comportamento do tecido in vivo. Na situação in vivo, o tecido é geralmente
descrito como "desdiferenciado" e torna-se "branco semelhante à gordura", quando não é cronicamente estimulado (por exemplo,
durante o desenvolvimento pós-natal, na maioria dos mamíferos (40)). É uma possibilidade interessante que no sistema in vitro
descrito aqui nós podemos criar um padrão de desenvolvimento semelhante ao observado in vivo.

Controle hormonal da Expressão Gênica de UCP

O presente sistema fornece a primeira possibilidade para investigar diretamente o controle da expressão do gene da UCP, em células
com um pré-história conhecida e controlável. Aqui nós investigamos principalmente os efeitos de agentes adrenérgicos sobre a
expressão gênica da UCP, mas também observamos efeitos dos hormônios da tireóide e insulina. Os resultados com estes últimos
hormonas pode ser mais facilmente entendida como indicando que estas hormonas têm de estar presentes para que o sinal de NE ser
processado.

Insulina - Descobrimos que a insulina foi capaz de aumentar o efeito de NE na expressão do gene da UCP. Como insulina conduz
aparentemente a um abaixamento do nível de CAMP em células de gordura marrom maduros (41), e como CAMP promove a
expressão do gene da UCP (Tabela I, D), uma explicação de que o efeito da insulina deveria ser mediado através da via de cAMP
parece improvável. É mais provável que o efeito da insulina é indireto, facilitando o efeito de NE. Assim, a insulina estimula a
captação de glicose nas células adiposas marrons (42, 43), e um fluxo adequado de glicose pode ser essencial para a expressão de
genes induzidos por NE.

Thyroid Hormones - Embora as presentes experiências indicam claramente que a presença de hormonas da tiróide é essencial para a
mediação do efeito de NE na expressão do gene da UCP não é possível distinguir se este efeito é mediado diretamente ao nível do
gene tal como foi recentemente sugerido (9) , através dos receptores nucleares para os hormônios da tireóide (44), ou se é um efeito
indireto associado à mediação transmembrana do sinal NE como anteriormente discutido (45). Que só um curto período de tempo de
privação de hormônio da tireóide é suficiente para influenciar a expressão de genes UCP induzidos por NE é surpreendente, mas
tenderiam a favorecer um efeito direto sobre o gene. O fato de que T3 é competente na promoção da expressão gênica de UCP
induzida por NE não iria dar apoio à sugestão de que a conversão intracelular de T4 a T3 é essencial para o efeito da hormona da
tiróide (46).

 Evidência da estimulação β-adrenérgica da Expressão gênica de UCP - Que a via β-adrenérgica é capaz de induzir diretamente a
expressão do gene UCP nas células cultivadas é claramente mostrado por vários dos experimentos demonstrados aqui. Assim, o
propranolol marcadamente um β-antagonista clássico (mas não completamente) inibe a expressão de genes induzidos por NE, e
estimulação β seletiva aumenta a expressão do gene (Tabela I). Além disso, o fato de o segundo mensageiro intracelular esperado
para β estimulação (aumento de cAMP) é capaz de induzir a expressão do gene da UCP (Tabela I) apoia a noção de que a via β está
envolvida.

Que a via β-adrenérgica é capaz de induzir a expressão do gene da UCP está em bom acordo com o que seria antecipado de estudos
in vivo (47), bem como com as indicações do nível de proteína a partir de estudos in vitro com células sobreviventes maduros ( 16,
37).

Aqui, também mostramos que os chamadas β3-agonistas (por exemplo, BRL-37344) foram capazes de induzir a expressão do gene
da UCP nas células cultivadas. O fato de que CGP-12177 tem a mesma capacidade é uma forte indicação de que é possível ativar a
expressão do gene UCP via β3-receptores.

Resta saber se o efeito do NE sobre a expressão gênica da UCP também é mediada via β3-receptores. Ambos os β1-receptores
(49,50) e, provavelmente, também β2 receptores (51) também são encontrados em células de gordura marrom maduras. No entanto,
afigura-se (com base, por exemplo, na baixa sensibilidade de propranolol) que a lipólise estimulada por NE e termogênese são
acoplados através de β3 receptores (30). Que também a expressão do gene UCP está exclusivamente acoplado via β3 receptores é de
fato a mais provável sugestão a partir dos resultados aqui apresentados, embora isso não seja explicitamente demonstrado.

Evidência para expressão de gene UCP estimulado α1- adrenergicamente - A questão do possível envolvimento de α1-receptores na
expressão do gene UCP é mais controverso. Há vários indícios de estudos in vivo que α1-receptores podem estar envolvidos na
expressão do gene UCP (5, 52), mas foi discutido que tais indicações podem, em parte, resultar das ações de α1-agonistas em outros
tipos de células que adipócitos no tecido (52, 53). Com o atual sistema, é possível estimular diretamente os adipócitos marrons
seletivamente.

No presente estudo, várias linhas de evidência sugerindo o envolvimento α na regulação da expressão do gene UCP pode ser
encontrado. Primeiro, foi possível com a prazosina um antagonista α1seletivo inibir significativamente a expressão de genes
induzidos por NE (Tabela I, A). Em segundo lugar, um estímulo α, que em estudos de respiração tem sido demonstrado ser seletivo
(33) e que, nas experiências aqui foi totalmente inibido por prazosina, foi, por si só capaz de induzir alguma expressão do gene UCP
(Tabela I, C). Nós também descobrimos um efeito de α agonistas específicos aceitos, tais como oximetazolina (que tem uma elevada
afinidade para sítios de ligação de prazosina em células de gordura marrom (31)) e cirazoline.

Assim a estimulação αl-adrenérgica pode conduzir a expressão do gene da UCP. Contudo , esta via só é capaz de induzir um nivel
de expressão do gene que é quase uma ordem de magnitude mais baixa do que a observada com uma estimulação NE completo.

Evidência do sinergismo do efeito α\β – Mais análises de dados dá alguma evidência de que o efeito da α estimulação na expressão
do gene da UCP pode ser manifestada como um efeito sinérgico. Tabela I, B mostra que a capacidade do bloqueio αl-adrenérgico
para diminuir a expressão do gene UCP induzida por NE é muito maior do que o esperado com base na capacidade de estimulação
α1seletiva para induzir a expressão; ou seja, ambos os componentes interagem para se obter expressão máxima. Isto está em boa
concordância com implicações de experiências realizadas in vivo (5, 52).

Uma outra questão é se o efeito sinérgico é "pré-cAMP" ou "pós-cAMP", ou seja, se a α1 estimulação promove a produção de
cAMP através desta expressão gênica ou se outros segundos mensageiros interagem com cAMP para aumentar a expressão do gene
UCP. Certos experimentos in vivo indicaram um sinergismo pré-CAMP entre estimulação α e β adrenérgica (54, 55). No entanto,
nas presentes resultados o sinergismo parece ser um fenómeno pós-CAMP porque a α estimulação pode aumentar o efeito de 8-Br-
cAMP (Tabela I, D, Fig. 6.). Uma conclusão similar foi recentemente alcançado sobre regulação das atividades da tirosina 5'-
deiodinase em células de gordura marrom maduras (57).

Conclusões

Mostra-se aqui que as células de gordura marrom, isoladas como células precursoras a partir de ratinhos normais e diferenciadas in
vitro, podem expressar o gene de UCP, levando a um aumento dos níveis de mRNA da UCP. Dois caminhos estão, portanto, agora
abertos para investigação detalhada. Um deles é o controle intracelular da expressão do gene, ou seja, uma compreensão das etapas
principais de interação com o receptor adrenérgico para expressão do gene. Só com um sistema in vitro, tais como este, com uma
cinética de resposta rápida, é possível através da manipulação dos segundos mensageiros intracelulares identificar os passos
principais para o núcleo. A segunda diz respeito ao papel funcional do mRNA UCP sintetizada. As questões iniciais serão se este
mRNA nestas células é utilizado para a síntese de proteína desacopladora em si, se a proteína é incorporada na mitocôndria, e se a
proteína nas mitocôndrias atinge um estado funcional.
FIG. 1. Indução da expressão do gene UCP por norepineph-rine em culturas de células de gordura marrom. Células precursoras de
gordura marrom foram isolados, dividido em seis frascos e crescidas em cultura. No dia 6, quatro frascos foram expostos a
norepinefrina 0,1 FM durante 3 h (NE). Para dois destes frascos, actinomicina D (10 rig / mL) foi adicionado 1 h antes da adição de
norepinefrina (ACT). Duas garrafas serviram como controle (0). O RNA total foi isolado a partir de cada frasco e analisado pelo
processo de hibridação Northern descrito em "Materiais e Métodos". De 10 pg de RNA total foram executados em cada pista. 4 fig
de RNA isolado a partir de tecido adiposo castanho de um ratinho expostos a frio (UCP +) e 10 pg de RNA a partir de ARN de
cérebro de rato (UCP-) foram executados em duas faixas adicionais. Os filtros foram hibridizados com a primeira sonda de ADNc
de UCP (as setas indicam a posição das duas espécies de mRNA UCP; 1,6 e 1,9 quilobases). Depois disso, uma nova hibridação foi
realizada com uma sonda de cDNA da actina (2,15 quilobases).

FIG. 2. Indução dependente da diferenciação da expressão do gene UCP por norepinefrina. Células precursoras de gordura marrom
foram isolados, dividido em 12 balões, e cultivada em cultura durante 4, 6, ou 10 dias. No respectivo dia, 12:01 norepinefrina (NE
+) foi adicionada a dois frascos de 4 horas antes de as células foram colhidas para o isolamento do ARN. Duas garrafas serviram
como controle (sem NE). 4 @ g de RNA total a partir de cada balão foi e analisado por hibridação com a sonda de ADNc de UCP
apagou-ranhura. Os autorradiogramas foram avaliadas por varrimento laser. A média dos níveis de mRNA da UCP observados no
dia 6 nas culturas tratadas com NE foi definida como 100% e os níveis de mRNA de UCP nas outras culturas foram expressos
relativamente a este valor. Barras, meios (com os valores individuais) de frascos em duplicado (em que não é visto, a variação foi
menor do que o tamanho do símbolo).

FIG. 3. Efeito da insulina e hormônios da tireóide sobre a expressão gênica da UCP em células de gordura marrom. Células
precursoras de gordura marrom foram cultivadas durante 6 dias em cultura. No dia 6, o meio foi descartado de certos frascos e
substituído por meio de Eagle modificado por Dulbecco com Hepes 10 mM ("sem soro") e estes balões foram pré-incubados durante
1 h. As adições foram feitas depois de todos os recipientes, excepto os controlos, tal como indicado: 0,1 WM a norepinefrina (NE),
4 nM de insulina (INS), um equipamento / ml T,, e 30 de sonda / ml T,. 4 h mais tarde, o ARN total foi isolado e analvzed para UCP
ARNm bv slot-blot hvbridization como descrito sob Fii. 2. Médio dos "níveis de mRNA UCP medidos nos frascos contendo soro
tratados com NE foi definida como 100%, e os outros valores foram expressos relativamente a este. Os valores apresentados são
médias e os valores individuais dos frascos em duplicado em uma das experiências.

FIG. 4. Curso de tempo do aumento induzido por noradrenalina na expressão do gene UCP. Células precursoras de gordura marrom
foram cultivadas em cultura durante 6 dias e foram então expostas a 12:01 norepinefrina (NE) para os tempos indicados. Os níveis
de ARNm de UCP (A) e de p-actina de ARNm (B) foram analisadas tal como na fig. 2. Os pontos representam a média e os valores
individuais a partir de uma experiência realizada com frascos duplicados. Os níveis médios de mRNA UCP ou actina observadas em
4 h foram criados para loo%, e os outros valores foram relacionados a isto

FIG 5. Curva de dose-resposta de cinco. Pelo efeito de norepineph-rine na expressão do gene da UCP. Células precursoras de
gordura marrom cultivadas em cultura durante 6 dias foram expostas às concentrações indicadas de norepinefrina por 4 h, o RNA
total isolado, slot-apagados, e analisadas pela sonda de cDNA da UCP. Os pontos representam as médias + D.P. de dois
experimentos independentes (cada uma realizada em duplicado). Em cada experimento, a expressão significa a 10m7 M
norepinefrina foi definido como 100% e os valores expressos relativamente a este valores

FIG. 6. Transferência de Northern de ARN isolado a partir de culturas de células de gordura castanha depois de tratamento como na
Tabela ID. Células precursoras de adipócitos foram isolados a partir do depósito de gordura marrom interescapular e cultivadas
durante 6 dias em cultura. 4 horas antes da colheita de 1 pM de norepinefrina (NE), 13:00 oximetazolina (OXY), e / ou 1 mM de 8-
Br-cAMP (CA) foram adicionados aos frascos, como indicado. Um frasco serviu como controle (0). O ARN foi isolado e analisado
por hibridação de Northern com a sonda de PCD como na fig. 1. As setas indicam as posições das duas espécies de mRNA UCP.

TABELA I Caracterização Farmacológica da expressão do gene da UCP induzida adrenergically

Células precursoras de gordura marrom foram cultivadas em cultura durante 6 dias e expostas aos agentes indicados para 4 horas
antes da colheita. Valores foram adicionados NE, 12:01 norepinefrina (em A e B) ou 1:00 (em C e D); PRA, 10:00 prazosin; PRO,
propranolol 22:00; BRL, 12:01 BRL-37344; CGP, 12:01 CGP-12177; OXY, 13:00 oximetazolina; CAMP, 1 mM 8-Br-CAMP; e
17:00 forskolin. A e p estímulos seletivos em C foram obtidos com 22:00 fenilefrina + 5:00 propranolol e 01:00 isoprenalina + 5
prazosin FM, respectivamente; Estimulação fi OL + foi obtido pela adição de fenilefrina e de isoprenalina, sem os antagonistas. Em
cada série, a média dos níveis de mRNA da UCP nas culturas tratadas com NE foi definida como 100%, e os outros valores
expressos relativamente a este. Em A e C, os valores são médias de f S.E. de dois e três experimentos, respectivamente, cada um
realizado em duplicado; B e D mostram meios e valores individuais a partir de um experimento com frascos duplicados.