UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
FITOPATOLOGIA
Av. Dom Manoel de Medeiros, s/ n – Dois Irmãos 52171-900 Recife, PE
Fone/Fax: (81) 3320.6205 / E-mail: coordenacao@pgf.ufrpe.br

Relatório Final

IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE Colletotrichum

ASSOCIADAS À ANTRACNOSE DAS ANONÁCEAS NO

ESTADO DE PERNAMBUCO

Willie Anderson dos Santos Vieira

Recife, PE
Julho, 2017
 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOPATOLOGIA
DEPARTAMENTO DE AGRONOMIA

IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE Colletotrichum

ASSOCIADAS À ANTRACNOSE DAS ANONÁCEAS NO

ESTADO DE PERNAMBUCO

Relatório final apresentado à Fundação de

Amparo à Ciência e Tecnologia de
Pernambuco (FACEPE) referente às
atividades do projeto de Bolsa de Fixação de
Pesquisador (BFP) nº BFP-0040-5.01/16
relacionado ao bolsista Willie Anderson dos
Santos Vieira.

Recife, PE
Julho, 2017
 INTRODUÇÃO GERAL

As anonáceas, nome genérico utilizado para se referir às plantas da Família

Annonaceae, apresentam distribuição pantropical, apesar de ser mais encontrada
em clima tropical, por vezes subtropical, e raramente em condições temperadas
(SILVA & SILVA, 1997). Devido ao alto valor no mercado nacional e internacional, o
plantio de anonáceas tem aumentando significativamente, tanto no Brasil como em
outros países, pertencendo a um grupo de produtos com potencial de crescimento
de consumo, ainda barrado pela pouca oferta (MELLO et al., 2003).
A pinha (A. squamosa L.) e a graviola (A. muricata L.) são as espécies mais
cultivadas no Brasil, por serem frutos muito saborosos e comercialmente aceitáveis
(MANICA et al., 2003). O mercado da pinha é abastecido principalmente pelos
Estados da Bahia, maior produtor, e São Paulo. Do total plantado no Brasil (10500
hectares), o Nordeste representa 70%, sendo que cerca de 7100 hectares ficam na
Bahia (SEAGRI, 2007). Quanto ao Estado de Pernambuco, este encontra-se como o
terceiro maior produtor da fruta (LEMOS, 2014).
Quanto a produção de graviola, a Bahia é o maior produtor mundial de
graviola, com produção de 9000 toneladas/ano, e onde se encontra 85% da área
cultivada no Brasil (SEAGRI, 2011). Também podem ser citadas áreas de plantio
nos Estados de Alagoas, Pará, Paraíba e Minas Gerais (LIMA, 2004), e
Pernambuco, o segundo maior produtor da fruta na região Nordeste. Entretanto,
apesar da exploração crescente desta cultura, informações e trabalhos disponíveis
sobre produtividade e área cultivada ainda são bastante escassos.
Vários fatores interferem na produtividade da cultura, entre eles a
temperatura, precipitação, umidade relativa, luminosidade e manejo cultural,
exercendo importante influência na produção, longevidade do pomar, incidência de
pragas e doenças na cultura (LIMA; BORGES, 2002).
Dentre as doenças das anonáceas, a antracnose representa um dos
principais entraves ao desenvolvimento da cultura (LOPEZ, 2005). Os sintomas da
doença manifestam-se nas folhas como manchas de coloração pardo-escuras ou
pretas, com o centro mais claro, de contorno irregular, distribuído pelo limbo foliar.
As folhas ficam deformadas e, em ataques mais severos, ocorre a desfolha. As
lesões, inicialmente, são pequenas, mas com o passar do tempo, podem atingir mais
de um centímetro em diâmetro. Nos ramos, são encontradas lesões alongadas e
deprimidas que podem provocar a morte dos ponteiros. Nas flores, aparecem
manchas circulares, de coloração castanho-escura, que provocam quedas
expressivas na produção (JUNQUEIRA, 2001). Os frutos podem ser atacados em
qualquer estádio de desenvolvimento. Nos frutos mais jovens, causa escurecimento
de toda a superfície, queda e mumificação, enquanto que nos mais desenvolvidos
ocorre podridão escura de rápida evolução, inutilizando-os para o consumo ou para
a comercialização (FREIRE; CARDOSO, 1997).
Quanto ao agente etiológico, as espécies C. theobromicola, C. tropicale, C.
siamense e C. karstii foram relatadas como espécies associadas à antracnose da
gravioleira na Colômbia (ALVAREZ et al. 2014). Recentemente, no Brasil, as
espécies C. gloeosporioides, C. boninense, C. fragariae e “C. magna” foram
relatadas como as espécies associadas à antracnose das anonáceas (KAMEI et al.
2014). No entanto, a identificação desta espécies foi baseada somente em
sequencias da região ITS, marcador molecular com baixa informatividade
filogenética para identificação precisa e confiável das espécies de Colletotrichum.
Desta forma, permanece a necessidade de estudos utilizando marcadores
moleculares de alta informatividade filogenética para um precisa identificação das
espécies de Colletotrichum associadas à antracnose das anonáceas no Brasil,
especialmente no estado de Pernambuco, onde nenhum estudo foi desenvolvido
para investigação etiologia da doença em questão.
Com base nos pontos supracitados e diante da importância da antracnose
para a cultura das anonáceas, o presente trabalho teve como objetivo principal
identificar a diversidade de Colletotrichum spp. associadas à antracnose das
anonáceas no Estado de Pernambuco.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta e obtenção dos isolados

A coletas foram realizadas em diferentes áreas de plantio doméstico e

comercial de pinha e graviola no estado de Pernambuco. As áreas de coleta
estavam situadas nas cidades de Recife, Goiana, Bezerros, Buíque e Petrolina
(Figura 1).
 Folhas, ramos e frutos com sintomas típicos de antracnose foram coletados,
encaminhados para o laboratório e lavados em água corrente. Para obtenção dos
isolados foi utilizada a técnica de isolamento indireto em meio de cultura batata
dextrose ágar (BDA) suplementado com o antibiótico sulfato de estreptomicina.
Foram obtidas culturas puras a partir das colônias identificadas como sendo
do gênero Colletotrichum. Posteriormente, foi obtida cultura monospórica dos
isolados, os quais foram preservados em papel de filtro e armazenados em tubos de
1,5 µl contendo sílica gel, e mantidos sob refrigeração.

Extração de DNA, PCR e sequenciamento

Os isolados serão cultivados em meio de cultura batata-dextrose (BD) por

sete dias, e o micélio será separado do meio líquido através de filtração. O DNA
genômico será extraído com o kit AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep
(Axygen®), conforme protocolo descrito pelo fabricante, e a qualidade e a quantidade
de DNA foram estimadas visualmente em gel de agarose 0,8%.
Para caracterização da diversidade genética, todos os isolados foram
submetidos à amplificação da região parcial do gene gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase (GAPDH). As amplificações em PCR foram realizadas em um volume
final de 25 µl, utilizando o 2X PCR Master Mix (Promega GoTaq® Master Mix,
Wisconsin, USA) conforme recomendações do fabricante. A região GAPDH
utilizando os primers GAP-95 e GAP-1174 (Vieira et al. 2017, aceito para
publicação). Foram utilizados os seguintes parâmetros para a PCR: desnaturação
inicial a 95 ºC durante 3 minutos, seguida de 35 ciclos de 95 ºC por 30 segundos, 58

ºC por 45 segundos, e 72 ºC por 1 minuto, seguido de extensão final a 72 ºC por 10

minutos. Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose 2%. Os
produtos de PCR foram enviados para o colaborador do projeto Prof. Dr. Vinson P.
Doyle (Department of Plant Pathology and Crop Physiology, Louisiana State
University - LSU, Baton Rouge, Louisiana, Estados Unidos) para realização dos
sequenciamentos. As amostras foram purificadas e sequenciadas nos dois sentidos
com os mesmos primers utilizados na amplificação. Os sequenciamentos foram
realizados pela empresa Beckman Coulter Genomics (Danvers, Massachusetts,
USA).
Montagem de contigs e análise da diversidade genética de Colletotrichum spp.

A montagem dos consensos a partir dos eletroferogramas resultantes dos

sequenciamentos foi realizada com o programa Geneious 8.1 (Kearse et al. 2012).
Sequencias foram inspecionadas visualmente para detecção de erros de
sequenciamento.
Os alinhamentos múltiplos das sequências de cada região sequenciada foram
individualmente realizados com o programa MAFFT (KATOH; TOH, 2013).
Alinhamentos foram ajustados manualmente para permitir o alinhamento máximo e
similaridade máxima entre as sequências. Regiões ambiguamente alinhadas foram
excluídas das análises.
Os alinhamentos foram individualmente submetidos a análise de máxima
verossimilhança para detecção do número de. Análises foram realizadas no software
RAxML- HPC2 (Stamatakis 2014) implementada no servidor CIPRES Science
Gateway portal (https://www.phylo.org/portal2/home.action). Para identificação
prévia das espécie e do complexo de espécies aos quais os isolados pertencem,
isolados representativos de cada haplótipos foram comparados com sequências
disponíveis no repositório NCBI através do BLAST.

RESULTADOS

Coleta e obtenção dos isolados

Um total de 97 isolados de Colletotrichum foi obtido a partir de folhas de

pinheira e gravioleira. Em todas as áreas amostradas, plantas apresentavam folhas
com sintomas típicos de antracnose (Figura 1). Os sintomas mostravam-se mais
severos em folhas de pinheira do que em gravioleira.
Isolados não puderam ser obtidos de folhas de pinheira durante os meses de
outubro a janeiro devido à ausência de chuvas. Como a maioria dos plantios de
pinha não dispõem de sistema de irrigação (plantio extrativista), ocorre queda total
das folhas das plantas nos meses mais quentes e secos devido à escassez de água.
 Figura 1 – Sintomas de antracnose em folhas de pinheira (A) e gravioleira (B)

Análise da diversidade genética de Colletotrichum spp.

Sequências da região GAPDH dos 97 isolados de Colletotrichum

apresentaram comprimento variando de 900 a 950 pares de bases. De acordo com a
análise de máxima verossimilhança, os isolados de Colletotrichum obtidos de
anonáceas foram divididos em 10 diferentes haplótipos (figura 2).
De acordo com a busca BLAST no repositório NCBI, sequencias da região
GAPDH de 92 isolados (haplótipos H1—H2, H5—H10) apresentaram alta
similaridade com sequ}ências de espécies do complexo C. gloeosporioides. Um
isolado (haplótipo H4) apresentou 100% de similaridade com isolados da espécie C.
karstii, a qual pertence ao complexo de espécies C. boninense. Por fim, quatro
isolados (haplótipo H3) apresentaram 100% de identidade com isolados da espécie
C. cliviae, a qual não está inserida em nenhum complexo de espécies.
Dos 10 haplótipos, oito foram inseridos dentro do complexo C.
gloeosporioides. Uma vez que o GAPDH apresenta uma alta informatividade
filogenética, possivelmente cada haplótipo representa uma espécie diferente, o que
apenas pode ser confirmado através da filogenia multilocus.
Figura 2 – Árvore de máxima verossimilhança resultade do alimnhamento de
sequencias da região GAPDH, representando a diversidade terminal de 97 isolados
de Colletotrichum associados à antracnose das anonáces no estado de
Pernamabuco.
Considerações finais

Após as coletas e isolamentos, observou-se que antracnose está amplamente

disseminada nos plantios de pinha e graviola. Sintomas foram observados tanto em
plantios comerciais como em plantios extrativistas.
As análises filogenéticas evidenciaram uma alta diversidade genética dentre
os isolados de Colletotrichum, o que é uma evidência de que mais de uma espécie
está associada à doença no estado de Pernambuco. Embora o a região GAPDH
apresente elevada informatividade filogenética, é necessária a amplificação e
sequenciamento de outras regiões do genoma para que se faça uma identificação
precisa das espécies associadas à antracnose das anonáceas no estado de
Pernambuco.
Uma vez que seja precisamente identificada as espécies ocorrentes no
estado de Pernambuco, será possível testar quais as espécies mais virulentas paras
as duas culturas em estudo, bem como observar a distribuição destas espécies nas
diferentes áreas. Desta forma, futuramente, poderão ser definidas as melhores
estratégias para um manejo eficiente da doença, uma vez que se sabe que espécies
diferentes reagem de formas diferente de acordo com o método de controle
empregado.
 ATIVIDADES COMPLEMENTARES DO BOLSISTA

Além das atividades referentes ao projeto associada a Bolsa de Fixação de

Pesquisador – BFP (Identificação de espécies de Colletotrichum associadas à
antracnose das anonáceas no estado de Pernambuco), o bolsista desenvolveu
outras atividades acadêmicas e está vinculado a outros projetos durante os meses
de vigência da bolsa.

CO-ORIENTAÇÕES EM ANDAMENTO

Angélica dos Santos Nunes. Tese de Doutorado. Projeto: Taxonomia e sistemática

de espécies de Colletotrichum associadas à antracnose do mamão (Carica
papaya)no Brasil.

Francisco Jorge Carlos de Souza Júnior. Dissertação de Mestrado. Projeto:

Identificação de espécies de Colletotrichum associadas à antracnose da pata de
vaca (Bauhinia variegata) no Brasil.

Gerusa Rodrigues dos Santos Cavalcante: Tese de Doutorado. Projeto: Espécies de

Colletotrichum associadas à antracnose do feijão fava (Phaseolus lunatus) no
Nordeste do Brasil.

PROJETOS

Espécies de Colletotrichum associadas à antracnose do pinhão manso (Jatropha

curcas) no Brasil.

Identificação de espécies de Colletotrichum associadas à antracnose de

anacardiácias do gênero Spondias spp. no nordeste do Brasil

Reavaliação dos métodos de análises filogenéticas e informatividade filogenética de

marcadores moleculares utilizados na sistemática molecular do gênero
Lasiodiplodia.
PARTICIPAÇÃO EM BANCA

Banca de qualificação de Projeto de Mestrado.

Discente: Selma dos Passos Braga
Orientador: Prof. Dr. Evandro Leite de Souza
Universidade Federal da Paraíba, Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Nutrição

PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS

49º Congresso Brasileiro de Fitopatologia (2017)

IV Encontro Pernambucano de Micologia - IV EPEM (2017)

TRABALHOS APRESENTADOS EM EVENTOS CIENTÍFICOS

VIEIRA, W.A.S., LIMA, W.G., NASCIMENTO, E.S., MICHEREFF, S.J., DOYLE, V.P.,
CÂMARA, M.P.S. Sensibilidade in vitro e in vivo de C. musae ao tiofanato metílico.
49º Congresso Brasileiro de Fitopatologia (2017)

VIEIRA, W.A.S., VELOSO, J.S., LIMA, W.G., CÂMARA, M.P.S. Informatividade

filogenética de marcadores moleculares utilizados na taxonomia de espécies do
complexo Colletotrichum acutatum. IV Encontro Pernambucano de Micologia (IV
EPEM). 2016

TRABALHOS PUBLICADOS EM ANAIS DE EVENTOS CIENTÍFICOS

VIEIRA, W.A.S., LIMA, W.G., NASCIMENTO, E.S., MICHEREFF, S.J., DOYLE, V.P.,
CÂMARA, M.P.S. Sensibilidade in vitro e in vivo de C. musae ao tiofanato metílico.
49º Congresso Brasileiro de Fitopatologia (2017).

APRESENTAÇÃO DE PALESTRAS

Analisando a qualidade de dados na sistemática do gênero Colletotrichum: um

estudo de caso com espécies associadas a banana. 49º Congresso Brasileiro
de Fitopatologia (2017).
PREMIAÇÕES

Melhor trabalho na modalidade pôster do eixo temático Diversidade de Fungos.

VIEIRA, W.A.S., VELOSO, J.S., LIMA, W.G., CÂMARA, M.P.S. Informatividade
filogenética de marcadores moleculares utilizados na taxonomia de espécies do
complexo Colletotrichum acutatum. IV Encontro Pernambucano de Micologia (IV
EPEM). 2016

ARTIGOS PUBLICADOS

VIEIRA, W.A.S., LIMA, W.G., NASCIMENTO, E.S., MICHEREFF, S.J., REIS, A.,
DOYLE, V.P., CÂMARA, M.P.S. Thiophanate-Methyl Resistance and Fitness
Components of Colletotrichum musae Isolates from Banana in Brazil. Plant Disease.
DOI: https://doi.org/10.1094/PDIS-11-16-1594-RE. 2016

ARTIGOS ACEITOS PARA PUBLICAÇÃO

VIEIRA, W.A.S., LIMA, W.G., NASCIMENTO, E.S., MICHEREFF, S.J., CÂMARA,

M.P.S., DOYLE, V.P. The impact of phenotypic and molecular data on the inference
of Colleotrichum diversity associated with Musa. Aceito para publicação em
Mycologia. (mycologia-D-17-00044)

ARTIGOS SUBMETIDOS

CAVALCANTE, G.R.S., VIEIRA, W.A.S., MICHEREFF, S.J., BARGUIL, B.M.,

DOYLE, V.P., CÂMARA, M.P.S. First report of Anthracnose caused by
Colletotrichum sichuanensis on Phaseolus lunatus in Brazil. Nota de primeiro relato
de fitopatógenos, submetida na Plant Disease.

PARECERISTA DE PERIÓDICOS CIENTÍFICOS

Plant Disease.
Antonie van Leeuwenhoek (Journal of Mycrobiology).
REFERÊNCIAS

CAI, L.;, HYDE, K.D.; TAYLOR, P.W.J.; WEIR, B.; WALLER, J.; ABANG, M.M.;
ZHANG, J.Z.; YANG, Y.L.; PHOULIVONG, S.; LIU, Z.Y., PRIHASTUTI, H.; SHIVAS,
R.G.; MCKENZIE, E.H.C.; JOHNSTON, P.R.; A polyphasic approach for studying
Colletotrichum. Fungal Diversity, Kunming, v. 39, p. 183–124, 2009.

FREIRE, F. C. O.; CARDOSO, J. E. Doenças das anonáceas. In: SÃO JOSÉ, A. R.;
VILAS BOAS, I.; MORAIS, O. M.; REBOUÇAS, T. N. H. (eds.). Anonáceas:
produção e mercado (pinha, graviola, atemóia e cherimóia). Vitória da conquista:
Universidade Estadual do Sudeste da Bahia, p. 196-213, 1997.

KAMEI, S. H. et al . Identificação e caracterização de espécies de Colletotrichum

associadas à antracnose de anonáceas no estado de Alagoas. Rev. Bras. Frutic.,
Jaboticabal , v. 36, n. spe1, p. 209-216, 2014 .

KATOH, K.; TOH, H. MAFFT multiple sequence alignment software version 7:

improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution,
Oxford, v. 30, p. 772-780, 2013.

Kearse M, Moir R, Wilson A, Stones-Havas S, Cheung M, Sturrock S, Buxton S,

Cooper A, Markowitz S, Duran C, Thierer T, Ashton B, Meintjes P, Drummond A.
2012. Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for
the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics 28(12): 1647–1649.

LEMOS, E. E. P. A produção de anonáceas no Brasil. Revista Brasileira de

Fruticultura, Jaboticabal, 36(spe1), 77-85, 2014.

LIMA, M. A. C. O cultivo da gravioleira. Revista Brasileira de Fruticultura 26: 385–

566, 2004.

MANICA, I.; ICUMA, I. M.; JUNQUEIRA, K. P.; OLIVEIRA, M. A. S.; CUNHA, M. M.;
OLIVEIRA JÚNIOR, M. E.; JUNQUEIRA, N. T. V.; ALVES, R. T. Frutas Anonáceas
(ata ou pinha, atemólia, cherimólia e graviola). Tecnologia de produção, pós-
colheita, mercado. Cinco Continentes Editora, 596 p., 2003.
MELLO, N. T. C.; NOGUEIRA, E. A.; MAIA, M. L. Atemóia: perspectivas para a
produção paulista. Informações Econômicas 38: 7-13, 2003.

MILLS, P.R.; HODSON, A.; BROWN, A.E. Molecular differentiation of Colletotrichum

gloeosporioides isolates infecting tropical fruit. In: Bailey, J.A. & Jeger, M.J.
Eds.) Colletotrichum: Biology, pathology and control. Wallingford. CAB
International. 1992. pp. 269-288.

POSADA, D. jModelTest: phylogenetic model averaging. Molecular Biology and

Evolution, Oxford, v. 25, p. 1253–1256, 2008.

PRIHASTUTI, H.; CAI, L.; CHEN, H.; HYDE, K.D. Characterization of Colletotrichum
species associated with coffee berries in Chiang Mai, Thailand. Fungal Diversity,
Kunming, v. 39: p. 89-109, 2009.

RONQUIST, F.; TESLENKO, M.; VAN DER MARK, P.; AYRES, D.L.; DARLING, A.;
HÖHNA, S.; LARGET, B.; LIU, L.; SUCHARD, M. A.; HUELSENBECK, J.P. MrBayes
v. 3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large
model space. Systematic Biology, Oxford, v. 61, p. 539–542, 2012.

SEAGRI (Secretaria da Agricultura, Irrigaçao e Reforma Agrária). Bahia lidera a

produção mundial de graviola. 2010. Acesso em 15 de outubro de 2011. Disponível
em:
http://www.seagri.ba.gov.br/noticias.asp?qact=view&exibir=clipping&notid=21733

SILVA, A. Q.; SILVA, H. Nutrição e adubação em anonáceas. In: SÃO JOSÉ, A. R.;
VILAS BOAS, I.; MORAIS, O. M.; REBOUÇAS, T. N. H. (eds.). Anonáceas:
produção e mercado (pinha, graviola, atemóia e cherimóia). Vitória da conquista:
Universidade Estadual do Sudeste da Bahia, p. 118-137, 1997.

Stamatakis A. (2014) RAxML version 8: A tool for Phylogenetic Analysis and Post-
Analysis of Large Phylogenies. Bioinformatics, 30(9):1312-1313.