"PROTEÍNA SLURP-1 PARA USO NO TRATAMENTO DE DOENÇAS

OCULARES”
[01] A presente invenção refere-se a uma proteína compreendendo a SEQ
ID NO:1 e a uma composição compreendendo a mesma para uso na indução
ou aceleração da cicatrização no olho de um indivíduo e/ou na prevenção de
infecção no olho de um indivíduo.
Estado da técnica
[02] As lesões oculares, em especial as corneanas e conjuntivais, são umas
das condições mais diagnosticadas em pacientes que consultam seu médico, e
uma das principais causas de perda de visão. Essas lesões podem ser de
várias origens, mas se devem principalmente a alergia, infecções (bacterianas,
virais e fúngicas), síndrome do olho seco, cirurgias e outros traumatismos.
Essas lesões são nocivas e muito dolorosas. Os sintomas dessas lesões
podem incluir secura, queimação e uma irritação áspera-arenosa no olho. Os
sintomas também podem ser descritos como coceira, arranhões, pontadas ou
cansaço nos olhos. Outros sintomas incluem dor ocular, vermelhidão, sensação
de desconforto e pressão por trás do olho. O dano à superfície do olho
aumenta o desconforto e a sensibilidade à luz forte.
[03] As lesões na superfície ocular precisam ser tratadas e cicatrizadas
muito rapidamente para evitar o agravamento da situação e complicações
como ulceração, que podem levar à perda de acuidade visual e cegueira nos
casos mais graves. Para o tratamento de lesões devido à síndrome do olho
seco, existem diversas soluções lubrificantes e hidrogéis hidratantes.
Entretanto, esses produtos somente aliviam os sintomas, mas não aceleram o
processo de cura das lesões.
[04] Para lesões mais profundas, há algumas soluções de vitamina A e
composições que acentuam a secreção de mucina, que podem ajudar na
cicatrização, porém, possuem eficácia limitada.
[05] Embora haja alguns compostos químicos e moléculas biológicas que
demonstraram estar envolvidas na cicatrização de lesões em outros tecidos, a
escolha para a aplicação específica ao olho ainda é muito restrita e não há
moléculas eficazes disponíveis atualmente.
[06] O componente humano B (daqui em diante chamado de SLURP-1) é
um membro da superfamília Ly-6/uPAR, conforme demonstrado por
comparação de sequência de aminoácidos. Esta superfamília contém uma
sequência consenso C-terminal CCXXXXCN e diferentes números de
repetições de domínio Ly-6/uPAR. A sequência inteira contém múltiplos
[1-3]
resíduos de cisteína (de oito a dez) , levando a ligações dissulfeto
específicas da proteína.
[07] A superfamília Ly-6/uPAR pode ser dividida em duas subfamílias,
dependendo da presença de sequências de sinal de ancoragem por GPI [4].
[08] A SLURP-1 pertence à primeira subfamília da superfamília Ly-6/uPAR
e não possui nenhuma sequência de sinal de ancoragem por GPI. A SLURP-2
[4,5]
também é um membro da mesma subfamília . Os pacientes com o Mal de
Meleda (MdM) muitas vezes são associados a uma mutação na SLURP-1 e o
gene MdM está localizado em um grupamento de genes Ly-6 no cromossomo
8q24.3[6-9]. A segunda subfamília compreende proteínas com um sinal de
ancoragem por GPI e inclui várias proteínas: o gene E induzido por ácido
retinóico (RIG-E), o antígeno E48 (Ly-6D humana), Ly6H, antígeno de células-
tronco da próstata (PSCA), CD59 ou protectina, Lynx1 e uPAR (receptor da
uroquinase) [10-15].
[09] A SLURP-1 é descrita na patente WO 94/14959. Em suma, a proteína
foi descoberta e purificada pela primeira vez a partir de um concentrado de
urina dialisado após tratamento com um agente adsorvente e um processo de
purificação específico. Ela é uma proteína com 81 aminoácidos (SEQ ID NO:1)
em sua forma madura (103 aminoácidos – SEQ ID NO:2 - com o peptídeo sinal
N-terminal) que tem um peso molecular em torno de 8.9 kD. Sua sequência
está localizada no braço longo do cromossomo humano 8 como muitos dos
membros da superfamília Ly6/uPAR, confirmando uma potencial co-evolução
após eventos de duplicação cromossômica. [4]
[010] A SLURP-1 existe em duas formas diferentes, dependendo da
presença de um grupo sulfato na tirosina na posição 39: o tipo 1 é sulfatado,
enquanto o tipo 2 não. A SLURP-1 é detectada em diversos órgãos e fluidos,
como no sangue e na urina. Ela é produzida principalmente pelos ceratinócitos
e células epiteliais, tendo, portanto, uma distribuição principal no tecido epitelial
[19-24]
. Ademais, a análise filogenética demonstrou estreita relação entre a
SLURP-1 e os membros da superfamília Ly-6/uPAR, mas também com as
neurotoxinas de serpente[4]. As neurotoxinas de serpente apresentam um efeito
inibidor sobre os receptores de acetilcolina, inibindo, portanto, a troca iônica
entre as células e o meio extracelular e, subsequentemente, impedindo a
[16,17]
sinalização celular . A homologia de sequência importante entre as
neurotoxinas de serpente e a SLURP-1 é enfatizada pela similaridade da
estrutura tridimensional: a SLURP-1 tende a ter a aparência de “três dedos",
[18,19]
uma característica específica das proteínas de serpente . A semelhança de
ambas as proteínas e a atividade inibitória das neurotoxinas de serpente
demonstrou que a SLURP-1 poderia ser usada para ligar-se e interagir com
canais iônicos, como os receptores de acetilcolina nicotínicos.
[011] A ativação de nAChRs em células não-neuronais poderia modificar a
expressão gênica das proteínas envolvidas em processos como a regulação do
ciclo celular, apoptose, interação célula-célula e célula-substrato. O principal
receptor homomérico estudado é composto de subunidades 7; a ativação
desse receptor especifico é transduzida por diferentes sinais iniciais, levando,
porém, a um ponto final comum. Os sinais transduzidos envolvem
simultaneamente eventos iônicos e sinalização da proteína quinase.
Chernyavsky et al concluíram que essa ativação dupla (eventos iônicos e
sinalização da proteína quinase) poderia levar à expressão gênica e a
alterações simultâneas na morfologia celular (e na locomoção subsequente dos
[20]
ceratinócitos) . A sinalização simultânea e complementar foi demonstrada
claramente pela inibição da sinalização iônica ou da proteína que levou à
inibição parcial enquanto se inibe ambos os mecanismos que levaram à
inibição completa dos seus efeitos.
[012] A interação entre a SLURP-1 e os receptores nicotínicos foi confirmada
em diferentes publicações e na presença de acetilcolina, uma atividade
agonista (contrária às neurotoxinas de serpente) foi descoberta nos
[21]
ceratinócitos humanos enquanto se utilizava a SLURP-1 . Esta interação
regula as funções celulares através das vias colinérgicas e provavelmente leva
[22, 23]
à adesão, motilidade e cicatrização das células epiteliais ; entretanto,
resultados discordantes foram obtidos por uma equipe, levando-nos a concluir
que a SLURP-1 estava desacelerando o processo de cicatrização enquanto a
[26]
SLURP-2 estava acelerando-a. Esses resultados ainda seriam comparados
com um terceiro experimento do mesmo grupo, afirmando que a combinação
de SLURP-1 e SLURP-2 leva um efeito positivo aditivo no processo de
cicatrização da pele se comparado a qualquer uma das atividades de inibição
da SLURP-1 ou aceleração da SLURP-2 por conta própria.
[013] São necessárias pesquisas adicionais para averiguar se a SLURP-1 ou
a SLURP-2 são úteis à cicatrização de lesões em geral.
[014] Ademais, há uma grande necessidade sentida na área da oftalmologia
no sentido de desenvolver medicamentos e composições relacionadas para
promover a cicatrização após doenças oculares com alta eficiência, sem efeitos
colaterais e recuperação total da transparência da córnea.
[015] A presente invenção tem por objetivo proporcionar moléculas
biológicas e/ou composições para uso no tratamento de doenças oculares, em
particular para induzir ou acelerar a cicatrização, reduzir a inflamação e
prevenir infecção no olho de um indivíduo.
[016] O objetivo declarado acima é alcançado pela presente invenção, na
medida em que se refere a uma proteína conforme definida na reivindicação 1.
[017] Salvo menção em contrário, todos os termos técnicos e científicos
usados neste documento têm o mesmo significo de conhecimento geral por
parte dos versados na técnica a que pertence esta invenção. Embora muitos
métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento
possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e
materiais preferidos são descritos a seguir. Salvo indicação em contrário, as
técnicas aqui descritas para uso com a invenção são metodologias
convencionais bem-conhecidas pelos indivíduos com conhecimento geral na
técnica.
Breve descrição dos desenhos
[018] A Figura 1 mostra uma comparação de sequência entre a sequência de
aminoácidos da sequência completa, SEQ ID NO: 2, e a proteína SLURP-1
madura, SEQ ID NO: 1, (respectivamente, aminoácidos 1-103 e aminoácidos
23-103)
[019] A Figura 2 mostra imagens da coloração com fluoresceína de lesões
epiteliais da córnea nos pontos de tempo indicados após a desepitelização total
induzida por álcool nos grupos controle e tratado com SLURP-1. Os grupos
controle incluem um grupo que não recebeu nenhum tratamento (controle) e
um grupo que foi tratado com injeção subconjuntival do veículo (PBS) (veículo
SCJ). As porcentagens em negrito indicam as médias de grupo da superfície
da lesão corneana, e as porcentagens em colchetes indicam o valor da córnea
representativa para o grupo considerado.
[020] A Figura 3A é um gráfico que ilustra o curso de tempo da cicatrização
da lesão corneana após a desepitelização total nos grupos controle e tratado
com SLURP-1. Médias de velocidade de cicatrização calculadas ± SEM.
[021] A Figura 3B mostra um gráfico da velocidade de cicatrização no dia
dois após a desepitelização total nos grupos controle e tratados com SLURP-1
(administração subconjuntival com 50 ng e SLURP e instilação).
[022] A Figura 3C mostra um gráfico da velocidade de cicatrização no dia
três após a desepitelização total nos grupos controle e tratados com SLURP-1
(administração subconjuntival com 50 ng e SLURP e instilação).
[023] A Figura 4 mostra imagens da coloração com fluoresceína de lesões
epiteliais da córnea nos pontos de tempo indicados após a desepitelização
calibrada induzida por álcool nos grupos tratado com SLURP-1 e PBS. As
porcentagens em negrito indicam a média de grupo da superfície da lesão
corneana, e as porcentagens em colchetes indicam o valor da córnea
representativa para o grupo considerado.
[024] A Figura 5A é um gráfico que ilustra o curso de tempo da área de lesão
medida a partir do dia 0 ao dia 2 após a desepitelização total nos grupos
controle e tratado com SLURP-1.
[025] A Figura 5B é um gráfico da velocidade de cicatrização calculada entre
TOh e T47h após a desepitelização calibrada nos grupos controle e tratado
com SLURP-1.
[026] A Figura 5C é um gráfico do grau de cicatrização de lesão no T47h
após a desepitelização calibrada. O grau de cicatrização de lesão foi calculado
pela razão: área da lesão com fluoresceína em T47h / área da lesão com
fluoresceína na linha de base, para cada córnea, para cada grupo, e expresso
em porcentagem.
[027] A Figura 6 mostra fotografias de experimentos de cicatrização de
lesões realizados pelo tratamento da linhagem celular epitelial corneana
humana hTCEpi com SLURP-1.
Descrição Detalhada da Invenção
[028] De acordo com a presente invenção, uma proteína compreendendo a
SEQ ID NO:1 é usada na indução ou aceleração da cicatrização no olho de um
indivíduo e/ou na prevenção de infecção no olho de um indivíduo.
[029] De preferência, a doença ocular é selecionada dentre o grupo que
consiste de ceratinopatia diabética, ceratite, conjuntivite, ceratoconjuntivite,
uveíte, trauma corneano, abrasão corneana, queimadoras corneanas, úlcera
crônica corneana, distrofias corneanas, defeito epitelial corneano persistente
(PED), defeito epitelial corneano após cirurgias a laser, defeito epitelial
corneano pós-PRK, defeito epitelial corneano pós-transplante transcorneano.
[030] A SEQ ID NO: 1 corresponde à forma madura de 81 aminoácidos da
SLURP-1.
[031] Em uma concretização alternativa, de acordo com a presente invenção,
uma composição compreendendo uma proteína compreendendo a SEQ ID NO:
1 é usada para induzir ou acelerar a cicatrização, e/ou prevenir infecção no
olho de um indivíduo.
[032] A composição compreende, de preferência, pelo menos um polímero
biocompatível.
[033] Mais preferivelmente, o polímero biocompatível é selecionado dentre o
grupo que consiste de ácido hialurônico, polímeros de açúcares, géis de
lecitina, derivados de polialanina, plurônicos, poli (etileno) glicol, poloxâmeros,
quitosana, xiloglucano, colágeno, fibrina, poliortoésteres e misturas dos
mesmos.
[034] Ainda mais preferivelmente, o polímero biocompatível é ácido
hialurônico.
[035] Como alternativa, o polímero biocompatível é, de preferência, um
polímero de açúcar, ainda mais preferivelmente, dextrano (um polímero de
glicose).
[036] De preferência, o dextrano é um polímero de sulfato de carboximetil
dextrano, mais preferivelmente, um agente ReGeneraTing (TGTA®), ainda
mais preferivelmente, OTR4120 (fórmula I) que é comercializado sob o nome
de Cacicol 20®.
[037] A Fórmula I representa uma subunidade análoga de sulfato de
heparano com uma cadeia principal baseada em subunidade de glicose.
[038] A composição pode ser sólida, semi-sólida, em forma de gel ou líquida;
além do mais, ela pode ser uma solução, uma suspensão, uma emulsão ou um
gel de termocura.
[039] Em uma concretização alternativa, a composição compreende pelo
menos um veículo de nanopartículas.
[040] O veículo de nanopartículas é, de preferência, selecionado dentre o
grupo consistindo de poli--caprolactona, policianocrilato e quitosana.
[041] Em uma concretização alternativa, a composição é na forma de uma
composição de polímero viscoso injetável. Em particular, os polímeros da
composição são poli-ortoésteres.
[042] A composição é preferivelmente administrada por tratamento tópico ou
injeção subconjuntival.
[043] Mais preferivelmente, a quantidade de proteína compreendendo a SEQ
ID NO: 1 é de 5 ng a 50 g por unidade de administração, mais preferivelmente
de 10 ng a 10 g por unidade de administração.
[044] Em uma concretização preferida, a composição é administrada por
injeção subconjuntival e a quantidade de proteína compreendendo a SEQ ID
NO: 1 é de 20 ng a 90 ng por unidade de administração.
Exemplos
Exemplo 1: cicatrização da lesão corneana após administração tópica ou
subconjuntival.
[045] As Figuras 2 e 3 relatam os dados de um primeiro experimento no qual
a atividade de cicatrização da lesão ocular/cicatrização da SLURP-1 foi
comparada usando duas vias de administração em um modelo de
desepitelização em ratos. A primeira via de administração é uma via comum
para produtos oculares usados para manutenção de umidade da córnea e,
especificamente, para sua facilidade de uso: instilação (aplicação tópica). Essa
via foi usada com uma frequência de administração de seis tempos/dia nos
dias 0 e 3 após uma desepitelização cirúrgica completa. Seguindo o mesmo
tratamento cirúrgico, um segundo conjunto de animais foi tratado por uma via
de administração diferente: a via subconjuntival. Este último tipo de
administração foi praticado somente uma vez por dia nos dias 0 e 3.
[046] Ambas as vias de administração têm um aspecto em comum, a saber,
as quantidades aplicadas de SLURP-1: o grupo recebendo instilações foi
tratado com uma solução correspondendo à maior dose usada no grupo tratado
pela via subconjuntival. Poderia ser facilmente concebível que os produtos
administrados por meio da via subconjuntival estivessem disponíveis por um
tempo maior durante o tratamento, uma vez que poderiam ser liberados
lentamente pelo tanque conjuntival no qual eles estão armazenados;
inversamente, o tratamento administrado topicamente seria rapidamente
eliminado da superfície do olho. Seguindo esta hipótese, o regime de dose no
tratamento subconjuntival estava em uma faixa a partir da dose usada
topicamente (5 μg) e diminuindo gradualmente a 50 ng.
[047] Como mostra a Figura 3A, ambas as vias de administração eram
capazes de acelerar o processo de cicatrização da lesão.
[048] No dia 2 após a desepitelização total, a velocidade de cicatrização
após uma injeção subconjuntival de 50 ng de SLURP-1 foi significativamente
maior quando comparado a uma injeção subconjuntival de OBS (P<0,05)
(Figura 3B).
[049] A descoberta inesperada referia-se à via de administração
subconjuntival na qual o efeito de cicatrização foi mais pronunciado na menor
dose (50 ng) quando comparado à dose usada na administração tópica, que,
em termos de quantidade, é muito superior.
[050] A quantidade total administrada foi calculada em ambas as vias do
regime de administração, fornecendo resultados de eficácia similares (isto é, 1
μg/mL para via subconjuntival e 100 μg/mL para via tópica). No tratamento
tópico, 6 administrações de gotas de 50 L foram realizadas por dia em dois
dias separados temporalmente com uma solução de 100 μg/mL. Então, a
quantidade final usada nesse grupo de tratamento foi de 6*2*5 μg = 60 μg. No
tratamento subconjuntival, uma solução de 1 μg/mL foi injetada duas vezes
(volume de 50 μL), assim, a quantidade geral fornecida por essa via foi de
2*0,05 μg = 0,1 μg. Ao comparar ambas as quantidades administradas levando
a uma eficácia clínica similar, observa-se uma razão de 600 entre as
quantidades subconjuntivais e tópicas.
[051] Isto claramente está a favor de uma eficácia fortemente aumentada do
produto por essa via de administração menos comum específica para esse
produto de modo a tratar a cicatrização de lesão ocular e outras condições
clínicas declaradas. Mais particularmente, o experimento envolveu resseção
mecânica de todo o epitélio corneano realizada sob um microscópio cirúrgico
usando uma microesponja embebida em etanol a 70% e um bisturi a 15 o. A
córnea foi então enxaguada com NaCl a 0,9% e o efeito do tratamento sobre a
reepitelização corneana foi avaliado usando fluoresceína tópica a 0,5%, em 5
pontos no tempo após a desepitelização (D1, D2, D3, D6 e D7
correspondendo, respectivamente, a T24h, T48h, T72h, T144h e T168h).
[052] Seis grupos de 5 animais receberam o seguinte tratamento:
[053] Grupo 1: 50 μL do veículo,injeção subconjuntival em D0 e D3
[054] Grupo 2: 1 g/mL (50 L) de SLURP-1, injeção subconjuntival (50 ng
por administração), em D0 e D3
[055] Grupo 3: 10 g/mL (50 L) de SLURP-1, injeção subconjuntival (500 ng
por administração), em D0 e D3
[056] Grupo 4: 100 g/mL (50 L) de SLURP-1, injeção subconjuntival (5 g
por administração), em D0 e D3
[057] Grupo 5: 100 g/mL (50 L) de SLURP-1, 6 instilações tópicas (5 g
por administração), em D0 e D3
[058] Grupo 6: Sem tratamento
[059] Em cada ponto de tempo (D1, D2, D3, D6 e D7), fotografias de rosto
inteiro foram obtidas usando uma luz de biomicroscópio azul cobalto e a
marcação com verde fluorescente da córnea foi usada para determinar a forma
e a área da úlcera remanescente (Figura 2). O curso de tempo da velocidade
de cicatrização é apresentada no gráfico para cada grupo de modo a comparar
os grupos “controle” (veículo e/ou controle sem qualquer tratamento) versus
grupos tratados com SLURP-1 (Figura 3A). O acompanhamento da
cicatrização da lesão de cada córnea foi realizado através de medidas
assistidas por computador da área da lesão (A t): razão da área corada com
fluoresceína para a área total da córnea. Para cada ponto de tempo, a
velocidade de cicatrização: (At0-At)/At0 foi calculada. Os resultados são
apresentados como média ± SEM. Um teste ANOVA seguido pelo teste de
comparação múltipla de Dunnett ou o teste de comparação paramétrico de
Mann Whitney foi realizado usando o programa GraphPad Prism (GraphPad
Software, San Diego, EUA).
[060] O modelo induziu uma insuficiência límbica, levando à
neovascularização corneana e desacelerando o processo de cicatrização. As
córneas que apresentaram uma forte úlcera central foram excluídas do estudo.
[061] Como mostra a Figura 3B, no dia 2 após a desepitelização total, a
velocidade de cicatrização após uma injeção subconjuntival de 50 ng de
SLURP-1 é significativamente maior se comparado a uma injeção
subconjuntival de PBS (p<0,05 Dunnett) e controles (p<0,01 Dunnett). A
velocidade de cicatrização após a instilação de SLURP-1 também é
consideravelmente maior do que os controles (p<0,05, Dunnett), mas não é
significativamente diferente do que após a injeção PBS.
[062] Como mostra a Figura 3C, no dia 3 após a desepitelização total, as
taxas de cicatrização do grupo tratado com 50 ng de SLURP-1 em SCJ e do
grupo de instilação são significativamente maiores do que as do grupo controle
(p<0,05, Dunnett), mas não são significativamente diferentes da velocidade de
cicatrização com PBS.
[063] Esta observação sugere que o próprio procedimento SCJ (ou PBS)
induz uma resposta que promove a cicatrização corneana.
[064] Com respeito à neovascularização, neovasos estavam visíveis em
cada grupo logo após o começo do processo de reepitelização. O
acompanhamento qualitativo da neovascularização corneana não demonstrou
qualquer diferença entre os grupos tratados com SLURP-1 e controle. Esta é
uma observação muito importante que demonstra que as propriedades de
cicatrização da SLURP-1 não estão associadas a efeitos pró-angiogênicos e
não prejudicam a restauração da transparência corneana.
[065] Isso significa que a SLURP-1 apresentou um efeito corneano
significativo após a administração subconjuntival e a instilação, na ausência de
efeitos colaterais, e em particular, na ausência de neovascularização corneana
que está associada à deficiência límbica, demonstrando que o efeito de
cicatrização não está ligado ao processo de transdiferenciação corneana.
Exemplo 2: cicatrização de lesão corneana após administrações tópicas ou
subconjuntivais em um modelo de desepitelização corneana calibrado
[066] Seguindo os resultados preliminares obtidos no primeiro modelo de
desepitelização corneana que envolveu não somente um processo de cura mas
também uma insuficiência límbica, um modelo calibrado de desepitelização
induzido por álcool foi escolhido como um segundo modelo de estudo de modo
a se focar nas propriedades de cicatrização corneana da SLURP-1. O objetivo
desse estudo era confirmar os resultados preliminares demonstrando um
aprimoramento da reepitelização pela proteína testada se comparado aos
controles, e avaliar uma possível dose-resposta induzida pela proteína.
[067] O modelo envolveu uma lesão calibrada criada usando uma trefina
causando uma incisão circular de 4 mm de diâmetro. A cicatrização de tal lesão
minúscula é muito rápida, mesmo na ausência de qualquer tratamento (às
vezes por volta de 2 dias). Por conseguinte, só foram realizadas
administrações uma vez, no dia da incisão, e a eficácia foi avaliada durante as
primeiras 48h por um exame duas vezes por dia.
[068] O volume injetado foi ajustado a partir do primeiro experimento; as
doses eram equivalentes com duas vezes o volume de administração e metade
das soluções concentradas. Esta dosagem diferente foi escolhida para
aumentar o tempo de retenção no tanque criado pela injeção subconjuntival,
levando a uma presença prolongada da SLURP-1 na superfície corneana para
compensar a administração única realizada neste modelo padronizado.
[069] Neste segundo modelo experimental, os efeitos da SLURP-1 foram
confirmados; a saber, a via subconjuntival com baixas quantidades injetadas
era de 6 a 60 vezes mais eficiente em acelerar a cicatrização da lesão ocular
quando comparado à via tópica.
[070] Mais particularmente, as lesões epiteliais corneanas foram obtidas
como descrito por Hattori et al [25]. Em suma, após a anestesia sistêmica e
tópica, utilizou-se uma trefina para fazer uma incisão circular de 4 mm de
diâmetro que estava centralizada na córnea. Então, o papel-filtro circular de 4
mm de diâmetro, que foi embebido com etanol a 70%, foi colocado na área
incisada por 5 segundos. Após uma lavagem suave com 5mL de solução
salina, removeu-se o epitélio corneano desprendido.
[071] O tratamento foi administrado somente no olho direito por meio de 1
injeção subconjuntival única ou 6 instilações em D0 (tempo da desepitelização
corneana). Cinco grupos de 4 a 6 animais receberam o seguinte tratamento:
[072] Grupo 1: 0,5 g/mL (100 L) de SLURP-1, injeção subconjuntival (50
ng por administração), em D0
[073] Grupo 2: 5 g/mL (100 L) de SLURP-1, injeção subconjuntival (500 ng
por administração), em D0
[074] Grupo 3: 50 g/mL (100 L) de SLURP-1, injeção subconjuntival (5 g
por administração), em D0
[075] Grupo 4: 100 g/mL (50 L) SLURP-1 (5 μg por administração) , 6
instilações em D0
[076] Grupo 5: Injeção subconjuntival do veículo (100 L) em D0
[077] As córneas direitas foram examinadas com um biomicroscópio. Cada
córnea direita recebeu uma gota de fluoresceína a 0,5% (Novartis pharma
S.A.S) e foi examinada usando uma luz azul cobalto. Fotografias digitais foram
obtidas através do microscópio binocular. Durante o acompanhamento da
cicatrização nos modelos de desepitelização corneana calibrada, as córneas
foram examinadas no dia 0, no dia 1 de manhã (T23h), no dia 1 de noite
(T28h), no dia 2 de manhã (T47h) e no dia 2 de noite (T56h) (Figura 4).
[078] As fotografias digitais foram analisadas com um software de imagens
(Adobe Photoshop). Para cada olho e cada ponto de tempo, a área da úlcera
remanescente foi comparada com a área total da córnea. O curso de tempo da
velocidade de cicatrização é apresentada no gráfico para cada grupo de modo
a comparar os grupos controle (veículo e/ou controle sem qualquer tratamento)
versus tratado com SLURP-1. Os resultados são apresentados como média ±
SEM. Um teste ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett
ou o teste de comparação paramétrico de Mann Whitney foi realizado usando o
programa GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, EUA). Os cursos
de tempo do fechamento da lesão corneana nos grupos controle e tratado com
SLURP-1 são apresentados na Figura 5A. Ao comparar a velocidade de
cicatrização calculada entre T0h e T47h, a injeção SCJ de 500 ng e 5 g de
SLURP-1 aumentou significativamente a velocidade de cicatrização se
comparado aos grupos de administração subconjuntival de PBS ou instilação
(Figura 5B). Houve um efeito dose-resposta, uma vez que nenhum efeito
significativo foi observado no grupo de injeção SCJ de 50 ng. Além do mais, em
T47h, o número de córneas totalmente cicatrizadas era maior nos grupos
tratados com injeção subconjuntival de SLURP-1 ou em 500 ng ou 5 g (Figura
5C), com uma diferença percebida entre os 500 ng (4 de 5 córneas) e 5 g (5
das 5 córneas) se comparado ao grupo controle (3 de 6 córneas).
Exemplo 3: Ensaio de fechamento da lesão com SLURP-1 na linha celular
epitelial corneana humana hTCEpi.
[079] Um ensaio de fechamento de lesão para monitorar a migração celular é
o Ensaio de Migração Celular Oris – Revestido com Colágeno I da Platypus
Technologies. A densidade da semeadura celular foi determinada visualmente
usando um microscópio invertido. 100 microlitros da densidade de semeadura
celular ideal foram pipetados em poços de teste e incubados em uma câmara
umidificada (37°C, 5% CO2) por 1 a 4 horas para permitir a fixação celular.
Utilizou-se citocalasina D como controle positivo. Os experimentos foram
realizados em triplicada com quantidades crescentes de SLURP-1. As
quantidades testadas foram de g/mL (controle negativo), 1 g/mL, 5 g/mL, 10
g/mL, 15 g/mL, 25 g/mL e 50 g/mL. Após 24h, as áreas feridas na placa
foram cicatrizadas em diferentes graus. As células tratadas com 10 g/mL de
SLURP-1 apresentam cicatrização de lesão ideal, como pode ser visto na
Figura 6.
[080] A partir de uma análise dos dados acima, as vantagens que a presente
invenção permite alcançar são aparentes.
[081] Em particular, uma associação efetiva entre uma concentração
específica de SLURP-1 e uma via de administração específica fornece
resultados ideais em termos de velocidade de cicatrização acelerada e área de
lesão reduzida mais rapidamente, em particular protegendo a superfície ocular
de infecções.
[082] Ademais, as propriedades de cicatrização da SLURP-1 não estão
associadas a efeitos pró-angiogênicos e não prejudicam a recuperação da
transparência corneana.
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20 :p. 103- 113.
 REIVINDICAÇÕES
1. Proteína, CARACTERIZADA por compreender a SEQ ID NO:1 para uso na
indução ou aceleração da cicatrização no olho de um indivíduo.
2. Proteína, CARACTERIZADA por compreender a SEQ ID NO:1 para uso na
prevenção de infecção no olho de um indivíduo.
3. Composição, CARACTERIZADA por compreender uma proteína
compreendendo a SEQ ID NO: 1 e pelo menos um polímero biocompatível
para uso na indução ou aceleração da cicatrização no olho de um indivíduo, ou
para uso na prevenção de infecção no olho de um indivíduo.
4. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA
pelo fato de que o polímero biocompatível é selecionado dentre o grupo que
consiste de ácido hialurônico, polímeros de açúcares, géis de lecitina,
derivados de polialanina, plurônicos, poli (etileno) glicol, poloxâmeros,
quitosana, xiloglucano, colágeno, fibrina, poliortoésteres e misturas dos
mesmos.
5. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA
pelo fato de que o polímero biocompatível é ácido hialurônico e/ou um polímero
de açúcar.
6. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA
pelo fato de que o polímero de açúcar é um dextrano.
7. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA
pelo fato de que o dextrano é um polímero de sulfato de carboximetil dextrano.
8. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA
pelo fato de que polímero de sulfato de carboximetil dextrano é
9. Composição, CARACTERIZADA por compreender uma proteína
compreendendo a SEQ ID NO: 1 e pelo menos um veículo de nanopartículas
para uso na indução ou aceleração da cicatrização no olho de um indivíduo, ou
para uso na prevenção de infecção no olho de um indivíduo.
10. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 9,
CARACTERIZADA pelo fato de que o veículo de nanopartículas é selecionado
dentre o grupo que consiste de poli--caprolactona, policianocrilato e quitosana.
11. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a
10, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é administrada por
tratamento tópico ou injeção subconjuntival.
12. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 11,
CARACTERIZADA pelo fato de que a quantidade de proteína compreendendo
a SEQ ID NO:1 é de 5 ng a 50 g por unidade de administração.
13. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 12,
CARACTERIZADA pelo fato de que a quantidade de proteína compreendendo
a SEQ ID NO:1 é de 10 ng a 10 g por unidade de administração.
14. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 13,
CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é administrada por injeção
subconjuntival e a quantidade de proteína compreendendo a SEQ ID NO: 1 é
de 20 ng a 90 ng por unidade de administração.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo
fato de que a quantidade de proteína compreendendo a SEQ ID NO:1 é de 40
ng a 60 ng por unidade de administração.
 RESUMO
"PROTEÍNA SLURP-1 PARA USO NO TRATAMENTO DE DOENÇAS
OCULARES”
A presente invenção refere-se a uma proteína compreendendo a SEQ ID NO:1
(forma madura da SLURP-1) e a uma composição compreendendo a mesma
para uso na indução ou aceleração da cicatrização, e/ou na prevenção de
infecção no olho de um indivíduo.
TRADUÇÃO DAS LEGENDAS
FIG. 1
multiple sequence alignment = alinhamento de múltiplas sequências
Full = Completa
Mature = Madura

FIG. 2
SLURP-1 treated groups = grupos tratados com SLURP-1
Control groups = Grupos controle
Instillation = Instilação
SCJ vehicle = Veículo SCJ
Control = Controle

FIG. 3a
Control = Controle
Instillation = Instilação
Healing rate = Velocidade de cicatrização
Time after total desepitelização (hours) = Tempo após a desepitelização total
(horas)

FIG. 3b, 3c
Healing rate = Velocidade de cicatrização
Control = Controle
Instillation = Instilação

FIG. 4
SLURP-1 treated groups = grupos tratados com SLURP-1
Control group = Grupo controle
Instillation = Instilação
SCJ vehicle = Veículo SCJ
Control = Controle

FIG. 5a
Instillation = Instilação
Wound area = Área da lesão
time (hours) = tempo (horas)

FIG. 5b, 5c
From T0h to T47h = De T0h a T47h
Healing rate = Velocidade de cicatrização
Instillation = Instilação

FIG. 6
100% open wound, 0% wound closure = lesão 100% aberta, 0% de fechamento
da lesão

Control (No treatment) = Controle (Sem tratamento)