Desafio sobre metodologias biotecnológicas na resolução de problemas

Aluna: Andrielle Araújo Oliveira

O problema a ser solucionado: "Presença de metal pesado no rio São Francisco pode
contaminar peixes". A ideia é modificar geneticamente bactérias para que possam
extrair metais pesados do meio ambiente do rio e incorporá-los em compostos que
possam ser prontamente recuperados no meio ambiente. Suponhamos que tal
mecanismo seja possível pela expressão de uma enzima de determinada espécie
bacteriana, que é capaz de metabolizar metais pesados. Tendo isso em vista, o gene que
codifica para essa enzima deve ser transferido para bactérias locais, ou bactérias com
capacidade serem inseridas naquele ecossistema sem causar danos, e sobreviver bem ali.

Então considerando o gene para tal enzima, segue um protocolo básico de clonagem
desse gene em bactérias:

Primeiro, o DNA genômico da bactéria metabolizadora de metais pesados deve ser

isolado. Também deve ser isolado o vetor de escolha, que nesse caso será um plasmídeo
bacteriano a partir de células E. coli. Tal plasmídeo possui algumas características muito
úteis: o gene ampR, que torna as células de E. coli resistentes à ampicilina; e o gene
lacZ, que codifica para a enzima beta-galactosidase capaz de hidrolisar lactose e
também X-gal. A hidrólise de X-gal forma um produto de cor azul. O plásmídeo possui
apenas uma cópia do sítio de restrição que fica dentro do gene lacZ.

A mesma enzima de restrição é então usada para cortar o DNA do plasmídeo e o DNA
da bactéria que metaboliza metais pesados. Os fragmentos obtidos são misturados,
permitindo o pareamento de bases entre suas extremidades coesivas complementares.
Em seguida, DNA-ligase é acrescentada para ligar covalentemente os esqueletos de
açúcar-fosfato dos fragmentos que tenham se pareado. Como resultado da mistura, nem
todos os plasmídeos são recombinantes, e nem todos os recombinantes carregam o gene
de interesse. Assim, a mistura de DNA é adicionada a bactérias com mutação no gene
lacZ no próprio cromossomo, tornando-as incapazes de hidrolisar lactose (ou X-gal). As
bactérias com tal mutação captam os plasmídeos da mistura por transformação. Sendo
cultivadas em meio contendo ampicilina, sabemos que as bactérias que crescerem
contêm o plasmídeo com gene ampR. Mas nem todos os plasmídeos contêm fragmentos
de DNA da bactéria que metaboliza metais pesados. A etapa seguinte consiste em
cultivar as bactérias resistentes à ampicilina em meio contendo X-gal. As bactérias
transformadas com plasmídeos não recombinantes terão o gene lacZ normal,
expressando beta-galactosidase que irá quebrar X-gal, e as colônias dessas bactérias
serão de cor azul (contêm o plasmídeo, mas este não é recombinante). As colônias
brancas contêm plasmídeos recombinantes, lembrando que nem todos contêm o gene de
interesse, mas outros fragmentos de DNA da bactéria que metaboliza metais pesados.
Para selecionar as bactérias que possuem o gene para a enzima que metaboliza metais
pesados, há várias técnicas de análise da expressão gênica, como: Northern blotting (que
tem o RNA mensageiro como base de análise), detecção de proteínas (como Western
blotting), ou ainda RT-PCR (reação da transcriptase reversa, seguida de reação em
cadeia da polimerase, que é capaz de reconhecer e quantificar o RNA mensageiro de
uma única célula).

Depois de isolar as bactérias recombinantes com o gene de interesse, elas devem ser
testadas para sua capacidade de metabolizar os metais pesados, e para sua segurança
ambiental. Se o projeto obtiver sucesso nos resultados, essas bactérias podem ser
colocadas no ecossistema do Rio São Francisco para reduzir a quantidade de metais
pesados, preservando assim os peixes e os animais humanos e não humanos que irão se
alimentar deles.

Padrão de resposta esperado:

Para qualquer um dos problemas citados no desafio, é necessário escolher um fragmento de DNA que já
tenha sido caracterizado e que tenha sua função reconhecida. No caso do vazamento de óleo no Golfo do
México, o gene que fosse inserido no plasmídeo da bactéria, poderia, por exemplo, sintetizar uma enzima
que degradasse o óleo. Após a inserção do gene no plasmídeo, este seria introduzido na bactéria. A
bactéria se replicaria por repetidas divisões celulares, produzindo bactérias recombinantes capazes de
sintetizar a enzima. A forma de atuação poderia ser através da digestão do óleo pelas bactérias, ou elas
poderiam ser colocadas no local do vazamento e, simplesmente, eliminariam a enzima no local.
Hipoteticamente, essa bactéria recombinante poderia ser criada em um biorreator, produzindo
quantidades suficientes de enzimas que seriam purificadas e lançadas nas áreas contaminadas com óleo,
sendo este totalmente degradado. É importante ainda fazer uma avaliação dos riscos ambientais da
utilização da bactéria ou da enzima no local. Seria necessário a utilização de metodologias confiáveis
para não causar desequilíbrios ainda maiores.