Fundação Oswaldo Cruz

Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas

Centro de Referência Nacional para Leishmaniose Tegumentar- CRNLeish

Curso de atualização em Leishmanioses- FIOCRUZ/FUNASA

Diagnóstico molecular das

Leishmanioses
Texto de apoio

Aline Fagundes da Silva

Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas- IPEC/FIOCRUZ

Serviço de Parasitologia
Centro de Referência Nacional para Leishmaniose Tegumentar- CRNLeish
 Fundamentos da Técnica
O diagnóstico molecular das leishmanioses baseia-se em exames de detecção do
DNA parasitário em diferentes amostras clínicas.
De forma didática, podemos dividir os exames de DNA em dois tipos:
a) de caracterização e identificação, que permitem o estudo de semelhanças
e diferenças entre diferentes organismos e entre diferentes indivíduos de
uma mesma espécie. Estes exames permitem a classificação de
organismos em diferentes espécies e grupos (ex: estudos de diferentes
espécies e cepas de Leishmania), bem como a identificação de um único
indivíduo em uma espécie (ex: exames de investigação de paternidade). O
fundamento desses exames baseia-se no fato de que todos os organismos
vivos apresentam DNA e que cada indivíduo de uma determinada espécie
apresenta uma identidade genética, que lhe é conferida pelo seu padrão de
DNA. No caso da Leishmania e outros parasitas unicelulares, cada cepa
de parasita (grupo de promastigotas isolados a partir da lesão de um
paciente, ou de um flebotomíneo) apresenta uma identidade genética
única.
b) De detecção, ou seja, a evidenciação de um DNA em uma amostra
suspeita. Em nosso caso, para a evidenciação do DNA de Leishmania em
lesões clínicas sugestivas e em outros materiais de estudo.

O DNA (ácido desoxirribonucléico) (figura 1) é a molécula que contem todas as

informações genéticas de um indivíduo. Ela, portanto lhe confere sua identidade (quem
somos??) e nos explica sua filogenia, sua árvore genealógica (de onde viemos??). Está
presente em quase todas as células humanas (as hemácias, no entanto, não contém DNA)
enrolado em forma espiral dupla dentro do núcleo da célula. As leishmanias e outros
parasitas apresentam outra organela celular, chamada cinetoplasto, que contém DNA,
sendo esses parasitas classificados na família Kinetoplastidae (em latim- cinetoplastídeos
em português).

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 Figura 1: esquema representando a molécula de DNA. A molécula encontra-se enrolada em
fita dupla no núcleo das células. A fita dupla é composta por duas partes (vermelha e cinza). Os
pequenos pedaços ligando as duas fitas são as pontes de hidrogênio unindo os nucleotídeos (A-T e C-G)

O diagnóstico molecular através da detecção de DNA em amostras só foi possível a

partir de duas descobertas: 1- a de que o DNA se reproduz automaticamente no núcleo
celular, e que só após a reprodução do DNA é que a célula inteira se reproduz. Sendo uma
fita dupla, cada molécula de DNA origina duas novas fitas em sua reprodução; e 2- a de que
essa reprodução poderia ser realizada em tubo de ensaio, no laboratório, com adição dos
ingredientes corretos em máquina especialmente formulada para isso, o termociclador
(termo, de temperatura, ciclador, de ciclos), ou seja: máquina que produz ciclos de
temperaturas automaticamente (figura 2). Essas duas descobertas possibilitaram a utilização
da reprodução do DNA em laboratório para exames diagnósticos: a Reação em cadeia da
Polimerase (ou polymerase chain reaction- PCR em inglês)
A PCR faz com o DNA o mesmo que o cultivo de microorganismos faz com o
material de biópsia. Explicando, quando colocamos um fragmento de biópsia em um meio
de cultura, estamos dando as condições necessárias (nutrientes, temperatura, etc) para que
as poucas amastigotas presentes naquele fragmento se transformem em promastigotas e se
reproduzem, aumentando e muito seu número (amplificando_ de poucos a muitos
parasitas). Da mesma forma, quando colocamos poucas moléculas de DNA no
termociclador, damos àquelas moléculas condições de se “reproduzirem”, multiplicando e
muito seu número. Assim, aqueles poucos fragmentos que não poderiam ser visualizados,
transformam-se em numerosas moléculas que podem ser visíveis à luz ultravioleta.
Enquanto a cultura só pode ser realizada com parasitas vivos, a partir de materiais
clínicos recém coletados (normalmente biópsias), a PCR pode ser realizada com diferentes
materiais, vivos ou fixados: biópsias, sangue periférico, blocos de parafina, etc. A PCR

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também apresenta sensibilidade muito superior a da cultura, chegando em muitos casos a
100 %, enquanto a cultura chega em média a 60 % , sendo ambos 100 % específicas para o
nosso caso em particular.
A especificidade da PCR se deve a determinados componentes da reação, os
iniciadores. Para entendermos esse mecanismo, vamos examinar um pouco a técnica da
reação em si (ver figura 3)
A multiplicação natural do DNA é feita por uma enzima, chamada polimerase , que,
a partir de uma fita do DNA, adiciona novos pedaços, chamados nucleotídeos, a um
pequeno pedaço iniciador. Para a PCR colocamos no tubo de ensaio a fita original (da
biópsia, por exemplo), a enzima, esses nucleotídeos e os nossos iniciadores, tudo comprado
no comércio.

Figura 2: a máquina de PCR (termociclador).

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 Reação em cadeia da polimerase (PCR

30-40 ciclos de 3 passos

Desnaturação (abertura
da fita)
1 min, 94 oC

Passo 2: religação da
fitas
45 segundos, 54oC

iniciadores

nucleotídeos Enzima polimerase

Etapa 3: alongamento
das fitas (extensão)

2 min, 72 oC

Figura 3: O esquema da PCR, como acontece no interior do tubo de ensaio. O processo de reprodução
natural é similar, mas bem mais complexo.

A reação consiste em várias etapas: no primeiro momento, colocamos os reativos e

o DNA de nossa amostra (por exemplo, DNA extraído de uma biópsia humana) em um
tubo de ensaio e colocamos o tubo na máquina de PCR. A máquina então é ligada e.
automaticamente, aquece o tubo e os reagentes a 94 oC por um minuto. Esse aquecimento
faz com que o DNA de fita dupla se desenrole e as fitas se separem.

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 A seguir, a máquina abaixa a temperatura para cerca de 50 oC, por mais ou menos
45 segundos. Nessa temperatura as fitas do DNA presentes no tubo procuram se juntar
novamente. A diferença é que agora entram em ação os iniciadores, que vão também se
juntar às fitas já existentes. A ligação de uma fita velha com um fragmento iniciador gera
fitas mistas, com uma cadeia maior do que a outra. Novamente, a máquina eleva a
temperatura, dessa vez até 72 oC por dois minutos. Nesse momento, começa a agir a
polimerase sobre os fragmentos iniciadores, aumentando os mesmos até que as fitas mistas
tenham dois pedaços de tamanhos iguais.
Esse ciclo de temperaturas (94-50-72) vai se repetindo cerca de 30-35 vezes. No
entanto, ele pode sofrer pequenas variações, de acordo com o DNA a ser amplificado. Não
é necessário decorarmos diferentes “receitas de bolo”, e sim entendermos o que acontece
em cada etapa do processo, que é o mesmo para cada PCR realizado: desnaturação,
religação, alongamento.
A enzima e os nucleotídeos são semelhantes para qualquer PCR realizado. No
entanto, os iniciadores são específicos para o DNA que queremos amplificar. Por exemplo,
se queremos amplificar o DNA de Leishmania presente em biópsias de lesões cutâneas,
utilizamos um iniciador que só reconhece DNA de Leishmania e, portanto orienta a enzima
para que só este DNA seja amplificado. É por isso que a especificidade da PCR é garantida
pelo iniciador utilizado. Existem diferentes tipos de iniciadores, para cada DNA a ser
amplificado. Em nosso laboratório, utilizamos um iniciador que amplifica qualquer DNA
de Leishmania presente no material de estudo. Isso permite que identifiquemos a presença
de qualquer parasita deste gênero na amostra. A partir daí, realizamos outras técnicas que
permitem a identificação da espécie a que pertence aquele DNA amplificado.
Após cerca de duas horas, retiramos o tubo da máquina. O que teremos a olho nu?
Um tubo de plástico com algumas “gotinhas d’água” (figura 4). Na verdade, teremos uma
“sopa” de moléculas de DNA multiplicadas extraordinariamente. Como para cada fita velha
de DNA são originadas duas novas fitas e assim sucessivamente, se iniciarmos o PCR com
uma única cópia de DNA, teremos, ao final de 35 ciclos de amplificação, cerca de 34
bilhões de cópias da mesma molécula de DNA!!!! (como mostra a figura 5.).

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Figura 4: quando tiramos o PCR da máquina, só conseguimos ver um tubo com algumas “gotinhas
d’água”

DNA a ser Amplificação

amplificado exponencial

Figura 5: esquema mostrando o processo de amplificação exponencial, na qual em cada ciclo gera-se o
dobro das fitas do ciclo anterior.

Como o DNA é invisível a olho nu, deveremos então processar o material

amplificado para que possamos visualizar o resultado da PCR. Esse processamento consiste
em aplicarmos um pouco do líquido com o material amplificado numa camada de gelatina
(chamada gel de agarose), a qual é submetida à corrente elétrica em um equipamento
chamado cuba de eletroforese. Essa cuba é uma caixa plástica cheia de líquido, com um
pólo positivo e outro negativo. Quando colocamos o DNA na gelatina, a gelatina na caixa e
ligamos a corrente, ela circula pela caixa e arrasta o DNA, que está em pedaços, do pólo
negativo para o positivo. Os pedaços maiores ficam mais distantes do local de partida e os

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 maiores mais perto. A figura 6 mostra um esquema de cuba de eletroforese com o gel já
aplicado

Vista lateral Amostra

aplicada no
orifício do gel Caixa plástica

Direção da corrente
elétrica e do arraste do
DNA
Pólo negativo Pólo positivo

Figura 6: esquema da cuba de eletroforese. A “caixa plástica” (cuba) está cheia de solução condutora
(amarelo). Os pólos negativo e positivo estão representados em preto. O gel de agarose (gelatina) é
vermelho, com um orifício para colocarmos algumas gotas do material amplificado. A seta mostra a
direção da corrente elétrica, que vai arrastar o DNA, separando os pedaços maiores dos menores.

A separação do DNA no gel, chamada de ELETROFORESE, leva cerca de duas

horas. Após esse tempo, retiramos o gel da cuba e o levamos a uma lâmpada especial, que
emite luz ultravioleta. O DNA pode ser visualizado nessa luz na forma de pequenas
manchas, chamadas bandas, no gel. Mas, como interpretamos os resultados, para
decidirmos quem é a amostra positiva ou negativa no PCR?
Num mesmo gel de eletroforese, aplicamos o nosso material de paciente, e, em
outro furinho separado, temos que aplicar também uma mistura de DNAs de tamanhos
conhecidos, chamada de marcador. O marcador é para sabermos, por comparação, o
tamanho do DNA que está em nossa amostra. Aplicamos também um DNA de Leishmania,
extraído de formas promastigotas de cultura, pra compararmos com o produto obtido de
nossa amostra. A amostra positiva apresentará no gel uma banda de mesmo tamanho do
DNA de cultura que eu apliquei e que tenho certeza de sua origem. A figura 7 mostra um

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gel de exemplo do que podemos visualizar. O gel então é fotografado e temos um registro
permanente de nossa reação.

Verificação dos produtos de PCR no

gel

Produtos amplificados
Marcador

Figura 7: fotografia de um gel de agarose após exposição à luz ultravioleta. O DNA aparece como
bandas brancas sobre o fundo de gelatina preto. Os números de 1 a 5 são diferentes DNAs aplicados,
um em cada furinho do gel. 2 é meu DNA de cultura de Leishmania. 1, e 5 são amostras contendo
outros DNAs que não são de Leishmania., amplificados em outro PCR. 3 e 4 são amostras suspeitas. 3 é
negativo (não apresenta banda) e 4 é positivo, com uma banda do mesmo tamanho do meu DNA
controle (2)

De acordo com meu iniciador utilizado, consigo identificar no PCR o gênero ou a

espécie do parasito detectado. Em nosso protocolo, utilizamos um iniciador que detecta
qualquer espécie de Leishmania presente na amostra. Diz-se então que é um iniciador
gênero - específico. Para a identificação da espécie, o gel com os produtos amplificados é
submetido a um tratamento, o DNA presente no gel é transferido para um papel especial e o
papel é submetido a uma impregnação com elementos radioativos e submetido ao raio X.
Após esse tratamento, podemos identificar qual dos dois subgêneros de Leishmania está
presente na amostra: Viannia ou Leishmania, bem como identificar a L. chagasi.

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 Vantagens, desvantagens e utilizações

Podemos listar várias vantagens e desvantagens da utilização da PCR em nossa

prática clínica e laboratorial. O que devemos, de fato, entender é em que momentos e
situações a PCR pode e deve ser usada, bem como seu potencial e limitações.
A PCR é atualmente a forma de diagnóstico parasitológico mais sensível.
Considera-se diagnóstico parasitológico pelo fato dela permitir a visualização de material
genético do parasita e não a resposta imunológica do paciente e outras alterações indiretas
causadas pela infecção. Como já foi dito, ela pode ser realizada em diferentes materiais
clínicos, vivos ou fixados, permitindo estudos retrospectivos da infecção. Pode também ser
extremamente útil em estudos epidemiológicos.
O fato de ser uma técnica automatizada permite uma melhor padronização. No
entanto, se não necessitamos do olho treinado do técnico, como na Imunofluorescência,
para interpretarmos os resultados, precisamos de muito treinamento, cuidado e ambientes
especiais para o processamento das amostras. Isso porque qualquer contato entre as
amostras pode carregar DNA de umas às outras e induzir resultados falso-positivos.
Os DNAs já amplificados também não podem nunca ser misturados às amostras
clínicas, pois nos amplificados temos bilhões de cópias de DNA, que podem “contaminar”
aquelas amostras com poucas cópias que temos, pois os fragmentos de DNA são muito
leves e podem ser transportados por nossas mãos.
Ao contrário da cultura, a PCR não trabalha com parasitas vivos, o que implica em
maior segurança pessoal do técnico. O produto amplificado pela PCR também pode ser
congelado e ser utilizado de base para o desenvolvimento de outras técnicas moleculares.
O custo elevado da montagem de um ambiente para a PCR, mais do que o custo de
cada exame individualmente (embora este também seja bastante alto) dificulta o
estabelecimento desta técnica em laboratórios de rede. Além do custo, outro fator limitante
é a necessidade de treinamento especial dos funcionários. Portanto, a utilização desta
ferramenta ocorre primariamente nos Centros de referência e em laboratórios de pesquisa.
No entanto, à medida que a tecnologia evolui, espera-se uma queda no custo das técnicas já
existentes, o que deve baixar o custo da PCR.

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 A PCR comporta-se, sob um aspecto, de forma complementar ao teste de
Montenegro: ambos podem ser positivos em casos de infecção subclínica. Assim o fato de
um indivíduo ser positivo à PCR para Leishmania não significa que ele teve ou terá
leishmaniose doença, mas indica um contato prévio com o parasita. Considera-se que para
que o DNA de Leishmania esteja presente no organismo hospedeiro, tem que haver pelo
menos um parasita vivo, liberando este mesmo DNA no sangue ou na biópsia, pois o DNA
fora da célula é rapidamente degradado. Por segurança, recomendamos coletar material
para PCR antes da realização do teste de Montenegro.
Como já foi dito, podemos aplicar a PCR no diagnóstico clínico e em estudos
epidemiológicos com pacientes, animais reservatórios e vetores. No entanto, quando é mais
vantajoso aplicar a PCR? Consideramos, para o diagnóstico clínico, em pacientes
Montenegro positivos com lesões típicas ou atípicas que se tenham demonstrado negativas
nos testes parasitológicos (se o paciente já é positivo no parasitológico, a PCR não será tão
útil). A seguir, relatamos alguns exemplos da aplicação da PCR na resolução de problemas
na pesquisa e no serviço frente às leishmanioses.
Em estudos de avaliação de uma vacina canina, Borja-Cabrera e colaboradores
(Borja-Cabrera et al., 2002) realizaram a PCR após o protocolo de vacinação nos cães
vacinados e controles (que receberam apenas placebo) e evidenciaram DNA de Leishmania
apenas nos cães controle, mostrando com isso a proteção obtida com a vacina. A PCR foi o
único exame que diferenciou exatamente os dois grupos, já que alguns cães controles foram
positivos à sorologia e IDRM, mas nenhum cão vacinado foi positivo à PCR.
Outro estudo (Costa et al., 2002), dessa vez para investigar a presença de parasitas
na corrente sanguínea de indivíduos assintomáticos, contactantes de pacientes de
leishmaniose visceral mostrou que 8 em 108 pessoas examinadas (7,4%). Os oito
indivíduos PCR - positivos eram também positivos ao teste de Montenegro e negativos à
sorologia. O autor questiona se essas pessoas PCR positivas podem ser fonte de infecção
para flebotomíneos, o que pode influir no ciclo de transmissão da doença nessa área.
Casos de leishmanioses com sintomatologia atípica vem ocorrendo mais
freqüentemente, por conta, por exemplo, da infecção pelo vírus da imunodeficiência
adquirida humana (HIV). Nessas situações várias complicações clinicas podem ocorrer, e
necessita-se de técnicas sensíveis e rápidas para a resolução dos problemas diagnósticos

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encontrados. Em Minas Gerais, Silva e colaboradores (Silva et al., 2002) encontraram uma
criança de 1 ano e 7 meses, HIV positiva, com sintomatologia sugestiva de leishmaniose
visceral e com sorologia positiva (1:320). No entanto, o parasita causador, identificado por
técnicas moleculares (PCR e hibridização) foi a Leishmania braziliensis, que normalmente
não produz doença visceral.
Em avaliação de pacientes no Rio de Janeiro, (Coutinho et al., 2002) foi encontrado
DNA de Leishmania em ¼ dos pacientes na fase ativa da doença, em pacientes curados e
em 1/3 dos indivíduos sadios, Montenegro positivos, testados. Nessa situação, a presença
do DNA parasitário não foi, no entanto, associada a recidivas ou a resistência ao
tratamento, tendo esse autor encontrado em sua população sinais de proteção e resistência à
reinfecção por Leishmania, em decorrência da resposta imune bem modulada apresentada
por estes pacientes e ex-pacientes.
Por outro lado, a presença de DNA do parasita em sangue doado em bancos de
sangue (Otero et al., 2000) nos mostra a necessidade de investigar mais criteriosamente o
sangue utilizado em transfusões, pelo menos nas áreas com grau de endemicidade
importante, ou caso o indivíduo tenha história clínico-epidemiológica sugestiva de contato
com L. chagasi.
Em estudo de infecção de animais reservatórios e vetores, a PCR pode ser utilizada
na identificação de reservatórios domésticos e silvestre, como nos mostra Telleria e
colaboradores (Telleria et al., 1999), que conseguiram identificar vários roedores e outros
animais como reservatórios de Leishmania amazonensis em um foco na Bolívia. Para esses
estudos, quanto mais sensível a técnica empregada, melhores os resultados obtidos. O
mesmo pode-se dizer para estudos de identificação de infecção natural em flebotomíneos. É
conhecido de todos a dificuldade de encontrarmos um flebotomíneo naturalmente
infectado, utilizando nossas ferramentas mais tradicionais (dissecção e visualização do tubo
digestivo do flebótomo em busca de promastigotas). No entanto, a elevada sensibilidade da
PCR aumentou a capacidade de detecção de infecção natural e possibilitou estudos como o
de da Silva e colaboradores (da Silva and Grunewald, 1999), no Rio Grande do Sul, que
identificaram 3 exemplares (2 Lutzomyia pessoai e 1 Lu. missionensis) com infecção por
Leishmania (Viannia). Este estudo corrobora outro, realizado em populações humanas no

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mesmo estado (Fagundes et al, no prelo), que encontraram pela primeira vez, através da
PCR, a infecção por Leishmania (viannia) em populações humanas no Rio Grande do Sul.

Referências Bibliográficas

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