UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PROGRAMA DE PESQUISA EM NEUROCIÊNCIA
BÁSICA E CLÍNICA

Efeito da terapia com células

mesenquimais em tubo de
policaprolactona na regeneração de
nervo mediano de camundongos.

Ana Maria Blanco Martinez

I Simpósio de Reabilitação Locomotora:
da bancada ao leito
25-26 de Novembro, UFRJ
 OS NERVOS PERIFÉRICOS SÃO RESPONSÁVEIS PELA CONEXÃO
ENTRE O CORPO, ENCÉFALO E MEDULA ESPINAL

SEM OS NERVOS PERIFÉRICOS NÃO HÁ MOVIMENTO,

NÃO HÁ SENSIBILIDADE...

OS NERVOS PERIFÉRICOS SÃO FREQUENTEMENTE ACOMETIDOS POR

DIVERSAS PATOLOGIAS.
APESAR DISSO, ESSAS PATOLOGIAS NÃO SÃO
AMPLAMENTE CONHECIDAS OU ENTENDIDAS POR PACIENTES,
PROFISSIONAIS DA ÁREA DE SAÚDE OU NEUROCIENTISTAS !!
9 NERVO PERIFÉRICO- estrutura e função

Adaptado a partir de Krstić, 1988.

• Lesão

• Degeneração Walleriana
z Injúria – influxo de cálcio - proteases – desintegração do citoesqueleto.

z Células de Schwann detectam e fagocitam restos axonais e mielínicos,

desdiferenciam, formam agregados tubulares e, uma vez que contactam o
axônio, começam o processo de remielinização.
9Lesões do plexo braquial são muito comuns, correspondendo a mais de
73,5% das lesões nervosas, acarretando transtornos diversos.

Retirado de Gordon et al., 2003.

Será que a recuperação funcional sempre acontece???

Adaptado a partir de NETTER, Frank H. Atlas de
anatomia humana, segunda edição, Porto Alegre,
Artmed, 2000.
 • ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS

- Neurorrafia

- Aloenxerto

- Autoenxerto

- Tubulização

- Terapia Celular
 • ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS

- Neurorrafia

- Aloenxerto

- Autoenxerto

- Tubulização

- Terapia Celular
 • ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS

- Neurorrafia

- Aloenxerto

- Autoenxerto

- Tubulização

- Terapia Celular
 INTRODUÇÃO

• ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS

- Neurorrafia

- Aloenxerto

- Autoenxerto

- Tubulização

- Terapia Celular
9 Tubo de Policaprolactona (PCL)
- Sintético

-Biodegradável

-Bom substrato para adesão, sobrevivência,

diferenciação e migração de células de Schwann

9Células - Tronco mesenquimais

- Multipotentes

- Extraídas do estroma da medula óssea

9Tubo de Policaprolactona (PCL)
- Sintético

-Biodegradável

-Bom substrato para adesão, sobrevivência,

diferenciação e migração de células de Schwann

9 Células - Tronco mesenquimais

- Multipotentes

- Extraídas do estroma da medula óssea

9 Células Mesenquimais
- Se diferenciam em:
ƒ Osso
ƒ Cartilagem
ƒ Músculo
ƒ Tecido adiposo
™ Linhagem neural
• Células Mesenquimais

- Se diferenciam em:

ƒ Osso
ƒ Cartilagem
ƒ Músculo
ƒ Tecido adiposo
™ Linhagem neural
- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de

tumorigênese;

- Transplante autólogo
• Células Mesenquimais

- Se diferenciam em:

ƒ Osso
ƒ Cartilagem
ƒ Músculo
ƒ Tecido adiposo
™ Linhagem neural
- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de

tumorigênese;

- Transplante autólogo
• Células Mesenquimais

- Se diferenciam em:

ƒ Osso
ƒ Cartilagem
ƒ Músculo
ƒ Tecido adiposo
™ Linhagem neural
- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de

tumorigênese;

- Transplante autólogo
• Células Mesenquimais

- Se diferenciam em:

ƒ Osso
ƒ Cartilagem
ƒ Músculo
ƒ Tecido adiposo
™ Linhagem neural
- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de

tumorigênese;

- Transplante autólogo
• Células Mesenquimais

- Se diferenciam em:

ƒ Osso
ƒ Cartilagem
ƒ Músculo
ƒ Tecido adiposo
™ Linhagem neural
- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de

tumorigênese

- Transplante autólogo
• Células Mesenquimais

- Se diferenciam em:

ƒ Osso
ƒ Cartilagem
ƒ Músculo
ƒ Tecido adiposo
™ Linhagem neural
- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de

tumorigênese;

- Transplante autólogo.
Objetivo

- Analisar a regeneração do nervo

mediano de camundongo após secção e
tubulização com o biopolímero PCL
contendo ou não células-tronco
mesenquimais.
 Cultura de células-tronco mesenquimais
Cultura Primária
Black6/c57 GFP+
Extração das células (5 x 107 células)
(fêmur e tíbia)

Remoção
das células
não aderidas

Confluência
Terceira passagem

Tripsinização

Enxerto das MSCs

(1 x 105 cél/2µL)
Caracterização morfológica das células
mesenquimais
 Procedimento cirúrgico
9 30 camundongos black6/c57.

9 Os animais foram anestesiados, tiveram o nervo mediano

exposto e transeccionado ao nível da porção média do
bíceps braquial.

Retirado de Ronchi et al., 2008. Barra de escala= 300 µm.

 Tubulização
9 Imagem do tubo de PCL, após tubulização no nervo mediano (A).
Ilustração da tubulização e dos segmentos proximal (1), médio (2) e distal
(3) analisados após oito semanas de procedimento (B).
• Barra de escala 1mm.
9 Grupos

-Tratado lesão e tubulização com células-tronco

mesenquimais em DMEM (n=10)

-Controle lesão e tubulização com DMEM (n=10)

-Normal sem lesão nem tratamento (n=10)

• Após 8 semanas perfundidos

segmentos 1, 2 e 3 coletados
 Análise funcional
9 Aparato do teste funcional (grasping test), o qual consiste de uma grade
com quatro pontos de apoio sobre uma balança digital. Um peso é deixado
sobre a grade e a função tara da balança o anula, permitindo a leitura da
força de tração que o animal desempenha ao agarrá-la.
 Análise funcional – Grasping test
9 Análise funcional semanal dos grupos controle e tratado, através do
grasping test.
• N=9, **P<0,01.
 Análise do peso do músculo flexor dos
dedos
9 Análise do peso do músculo flexor dos dedos dos grupos normal,
controle e tratado, após oito semanas de pós-operatório.
• N=10, P=0,08.
 Medida do conteúdo de creatina
fosfocinase total do músculo flexor dos
dedos
9 Análise dos níveis de creatina fosfocinase no músculo flexor dos
dedos nos grupos normal, controle e tratado após oito semanas de
pós-operatório.
• N=9, P<0,05.
 Microscopia eletrônica de varredura
9 Eletromicrografias de varredura evidenciando o tubo de PCL intacto,
numa perspectiva transversal (A, A’ e A’’), mostrando as características da
parede do tubo, e suas superfícies externa (B, B’ e B’’) e interna (C, C’ e
C’’) em três aumentos diferentes.
Parede do tubo Superfície externa Superfície interna
 Análise temporal do
grau de degradação
do tubo de PCL

9 Eletromicrografias de varredura
evidenciando cortes transversais do
segmentos1 (A-E’) e 2 (F).
 Microscopia de luz
9 Micrografias de luz evidenciando cortes transversais semi-finos corados
com azul de toluidina de nervo do grupo normal (A e B) correspondentes
aos segmentos 2 e 3 do tubo dos grupos controle (C e D) e tratado (E e F).
• Barra de escala 20 μm.
 Microscopia de luz
9 Micrografias de luz de cortes tranversais semi-finos corados com azul
de toluidina dos nervos dos grupos controle e tratado, nos segmentos 2 (A
e C) e 3 (B e D) do tubo.

Barra de escala 10 μm.

 Quantificação dos vasos sanguíneos
9 Quantificação de vasos sanguíneos no nervo dos grupos controle e
tratado no segmento 2 do tubo.
• N=10, P<0,05.
Microscopia eletrônica de transmissão

9 Micrografias eletrônicas de
transmissão de cortes tranversais
ultra-finos (70nm) dos nervos dos
grupos controle (A) e tratado (B),
no segmento 2 do tubo.
 Visualização de células GFP+ e
imuno-marcação para células de Schwann
9 Micrografias de fluorescência de corte transversal de nervo mediano
9 Conclusões

9 O tubo de policaprolactona mostrou-se um bom

substrato para crescimento linear e organizado do nervo
em regeneração.

9 As células-tronco mesenquimais implantadas no tubo de

policaprolactona foram capazes de melhorar a função
preênsil, prevenir uma diminuição da atividade do
músculo flexor dos dedos e aumentar o número de
vasos sanguíneos e de fibras mielínicas em
camundongos após lesão traumática de nervo mediano.

9 Em alguns casos, essas células se transdiferenciaram

em células de Schwann.
Obrigada!