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Estudo da Atividade de Complexos de Cobre com Ligantes Peptídicos

na Oxidação de Proteínas
Forte, G.O.; Cerchiaro, G.

Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Laboratório de Bioquímica

Espécies reativas de oxigênio têm um papel importante na oxidação de proteínas dentro das células. Existem especulações de que estas
espécies chamadas de EROs (espécies reativas de oxigênio) causam danos oxidativo em proteínas , principalmente os radicais hidroxila
e superoxido, onde, o cobre, que é um metal de transição presente no organismo humano, é fundamental para catalisar a formação
destas espécies.

Palavras Chave - 1. Bioquímica, 2. Complexos de cobre, I. Universidade Federal do ABC. Centro de Ciências Naturais e Humana. , II.
Estudo da Atividade de Complexos de Cobre com Ligantes Peptídicos na Oxidação de Proteínas

molecular em condições fisiológicas, catalisada por íons de

I. INTRODUÇÃO metais de transição [13, 14], gerando intermediários oxidantes.
1) O cobre e sua participação nos danos redox Há evidencias claras da participação de íons de Cu2+ neste

O cobre é um dos mais abundantes metais de transição

em seres humanos, junto com o ferro e o zinco, é um
elemento que em meio biológico suas principais características
química são os dois estados de oxidação relevantes +1 e +2
[1]. Como metal de transição que contêm elétrons
desaparelhados, o cobre tem a tendência de iniciar reações
radicalares [2-5].
O cobre é um metal fundamental para processos
bioquímicos em seres vivos. Porém, se não estiver em
concentração ideal no organismo, pode causar danos.
Alterações na homeostase deste metal pode aumentar o
estresse oxidativo, diminuindo a atividade da SOD1
(superoxido dismutase) e do citocromo c oxidase causando
aumento de produção de EROs mitocondrial [6, 7]. Os dois
estados redox do cobre representam um excelente catalisador
do ciclo redox na presença de oxigênio [8] gerando
parcialmente as EROs que podem agir como oxidantes de
resíduos de aminoácidos [9].
2) Química dos danos nas proteínas [10, 11]
O ataque de radicais hidroxila (OH•) em proteínas pode gerar
uma multiplicidade de produtos finais, como uma grande
variedade de proteínas carboniladas. Radicais alcoolxil
posteriormente formados podem causar β-fragmentação da
cadeia carbônica, liberando grupos carbonílas das proteínas.
Peróxidos podem se formar sobre a cadeia principal dos
peptídeos, e nas cadeias-laterais de resíduos de aminoácidos.
Uma vez que muitas proteínas vinculam íons metálicos,
(principalmente ferro e cobre), subseqüentemente à exposição
de RO• e RO2• ao H2O2 gera OH•, que danifica seletivamente
os resíduos de aminoácido no local da ligação.
3) O cobre e a glicoxidação de proteínas
Sabe-se que na presença de íons cobre os monossacarídeos
agem como pró - oxidantes potentes através das espécies
reativas de oxigênio [12]. A glicose, como outros α-
hidroxialdeídos, pode se enolizar e reduzir o oxigênio
processo de glicoxidação de proteínas in vitro [15], como o
fato do aumento da taxa de oxidação dos açucares na presença
do metal, e o conseqüente aumento da oxidação de proteínas.
Este projeto de pesquisa está focado em verificar o
potencial de oxidação do cobre complexado com peptídeos de
baixa massa molecular (G3- Triglicina, G4- Tetraglicina,
GGH- Glicina, Glicina, Histidina), na oxidação de proteínas
como a albumina, na ausência e na presença de
monosacarídeos, o que estimularia a glicoxidação.
II. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
1) Analise de formação de EROs por Cobre complexado
com peptídeos
Foram realizados ensaios de amostras separadas de G3, G4,
e GGH da Sigma, complexados com Cu2+ (solução de sulfato
de cobre), da Fluka, 12,5 μM; bicarbonato de sódio (25mM) -
preparado a partir de NaHCO3 da USB-, peróxido de
hidrogênio (3mM) -preparado a partir de solução de 9,5M da
Merck-, tampão fosfato (pH=7,4; 25mM) preparado com
Na2HPO4 e NaH2PO4 da USB e sonda DHR em concentração
de 80 μM da Sigma para identificar formação de espécies
reativas de oxigênio.
As analises foram realizada no Espectrômetro UV-1800 da
Shimadzu utilizando a sonda DHR (dihidrorodamina 123),
composto que serve para detectar alguns RS (OH• e espécies
derivadas da peroxidase) a qual é altamente fluorescente
(emite em 500 nm) quando oxidada por estas espécies [16].
2) Eletroforese e Western Bloting, Analise
imunoquímica de oxidação de aminoácidos da BSA em
solução de D-Glucose + GGHCu2+ / G4Cu2+.
Os ensaios foram preparados com as seguintes
concentrações: BSA (100μM), Peptídeos (G4 ou GGH; 125
μM), Cu2+(100 μM), D-Glucose (25 mM), HCO3- (25 mM),
H2O2 (10 mM) em tampão fosfato, encubados por 6 h em

banho à 37ºC. Os géis utilizados na eletroforese foram de 12%
acrilamida/bisacrilamida. A derivatização das amostras e a
detecção de proteínas carboniladas foram feitas segundo
procedimentos do kit “OxyBlot Protein Oxidation Detection
Kit (Chemicon)”.
III. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A. Analise de formação de EROs por Cobre complexado
com peptídeos
Como já é sabido, o cobre pode gerar EROs em presença de
peróxido de hidrogênio devido ao seu potencial de redução e
essas EROs são fortes oxidantes protéicos [9, 10].
De acordo com a analise dos dados obtidos no espectrômetro,
foi possível constatar que em curto período de tempo, o cobre
complexado com GGH produz menor quantidade de EROs,
enquanto o cobre complexado com G4 produziu maior
quantidade de EROs dentre as demais amostras, removendo os
valores anômalos (gráfico), assim, foi possível focar nos Figura I: ensaio de carbonilação de BSA as analises com
pontos extremos das amostras, para a analise imunoquímica.
Gráfico 1: Media e Desvio no gráfico: [Rodamina] x
Amostras(todos os ensaios continham em sua composição:
peptídeos(G3, G4, GGH) (12,5 μM), Cu2+(10 μM), HCO3- (25
mM), H2O2 (3mM), DHR (80 μM), a amostra de CuSO4 não
possui os peptídeos e o controle não tem os peptídeos e o
Cu2+, todas as soluções estavam em tampão fosfato (pH=7,4 e
25 mM),para cinética em 15 minutos , em espectrômetro
configurado para λ=500 nm.
Dados estatísticos :ANOVA **α=0,001 com p < α; e #α=0,05
com p < α
obs.: o peroxido e a sonda sempre são adicionados por ultimo.
B. Eletroforese e Western Bloting, Analise
imunoquímica de oxidação de aminoácidos da BSA em
solução de D-Glucose + GGHCu2+ / G4Cu2+.
Na Analise imunoquimica da BSA em meio patológico de
peróxido de hidrogênio D-Glucose com GGHCu2+/G4Cu2+, o
complexo GGHCu2+ mostrou-se mais eficiente na formação de
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EROs para a oxidação da proteína, se contrapondo aos
resultados obtidos no estudo da formação de EROs através da
oxidação da sonda DHR, o que leva a acreditar que co o
excesso de formação de EROs pelo complexo G4Cu2+, acaba
por inativar o mesmo, assim causando menor dano na
proteína.
BSA BSA- 1 1- 2 2- 3 3- 4 4-
índices “-“ são controle negativo de anti-Dinitrofenilhidrazona
para cada amostra para comprovar funcionamento da
derivatização com dinitrofenilhidrazina, analise corrida em gel
12% SDS-Page com corrente de 25 A e voltagem livre, onde:
BSA (100 μM)em tampão Pi (pH=7,4 e 25 mM) (controle),
1: BSA (100 μM) em tampão Pi (pH=7,4 e 25 mM) com HCO3-
(25 mM) e H2O2 (10 mM) tratada com glicose (25 mM) e
GGH (125 μM), Cu2+ (100 μM);
1 - : controle negativo, com inativador da derivatização.
2: BSA (100 μM) em tampão Pi (pH=7,4 e 25mM) com HCO3-
(25 mM) e H2O2 (10 mM) tratada com GGH (125 μM), Cu2+
(100 μM)
2 - : controle negativo, com inativador da derivatização.
3: BSA (100 μM) em tampão Pi (pH=7,4 e 25mM) com HCO3-
(25 mM) e H2O2 (10 mM) tratada com glicose (25 mM) e G4
(125 μM), Cu2+ (100 μM);
3 - : controle negativo, com inativador da derivatização.
4- BSA (100 μM) em tampão Pi (pH=7,4 e 25 mM) com HCO3-
(25 mM) e H2O2 (10 mM) tratada com G4 (125 μM), Cu2+ (100
μM);
4 - : controle negativo, com inativador da derivatização.
IV. CONCLUSÃO
Com estes ensaios foi possível constatar a funcionalidade
dos complexos em questão para gerar EROs e assim oxidar
proteínas, e a partir desses dados será possível fazer testes em
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extrato celular para verificar seu efeito em células.

REFERENCIAS
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