INTRODUÇÃO

A cinética enzimática é basicamente a área que estuda a velocidade de uma

reacção química que ocorre na presença de uma enzima. É na cinética enzimática que se
estuda a influência de modificações de parâmetros experimentais, como concentração
de substrato, pH, temperatura e concentração de inibidores e ativadores, sobre a
velocidade das reações.
Com relação à concentração do substrato [S], no início da reação, ela é muito
maior do que a concentração de enzima [E] e pode ser considerada uma constante. A
velocidade inicial (V0) da reação é medida e sendo [S] considerada constante, no início
da reação, V0 aumenta linearmente com as variações da [S]. Conforme a reação
prossegue e [S] aumenta, V0 deixa de variar linearmente e começa sofrer aumentos
graduais. Porém, quando [S] alcança valores mais elevados, V 0 sofre aumentos
significantes e atinge-se então a velocidade máxima (Vmáx) da reação (Ver Figura 1).

Figura 1. Efeito da concentração do substrato na velocidade inicial da reação

Leonor Michaeles e Maud Menten propuseram a separação da reação enzimática

em duas etapas:
1ª etapa:
 2ª etapa:

Segundo Michaelis e Menten, primeiramente a enzima (E) se liga ao substrato

(S) para a formação do complexo enzima-substrato (ES) e depois esse substrato se
dissocia para a liberação do produto (P) da reação e da enzima livre (E).
A primeira etapa é reversível e mais rápida que a segunda etapa, sendo então a
segunda a limitante da velocidade da reação global do reagente em produto. Assim,
pode-se dizer que a velocidade da reação global está diretamente ligada concentração de
ES presente na segunda etapa.
Durante toda a reação é possível encontrar a enzima tanto na forma livre (E)
quanto na forma de complexo com o substrato (ES). A velocidade máxima (V máx) então
é alcançada quando praticamente toda a enzima está na forma de complexo (ES), sendo
insignificante a quantidade de enzima livre (E).
Algebricamente, a curva da Figura 1 pode ser expressa pela Equação de Michaelis
e Menten:

onde V0 é a velocidade inicial, Vmáx é a velocidade máxima, [S] é a concentração do

substrato e Km é a constante de Michaelis-Menten.
A constante de Michaelis-Menten (Km) é uma constante dinâmica. Ela indica a
afinade da enzima pelo substrato, sendo inversamente proporcional a essa afinidade, e
corresponde à concentração de substrato [S] para a qual a velocidade inicial (V 0) é
metade da velocidade máxima (Vmáx):
 Invertendo a Equação de Michaelis e Menten é obtida a chamada Equação de
Lineweaver-Burk:

Através da Equação de Lineweaver-Burk pode-se construir o gráfico de uma

função linear de 1/V0 contra 1/[S] (Ver Figura 2) onde a inclinação da reta é igual a
Km/Vmáx, o intercepto no eixo 1/V0 corresponde a 1/Vmáx e o intercepto no eixo 1/[S]
corresponde a -1/Km. Esse gráfico permite uma determinação mais precisa de Vmáx do
que um gráfico de V0 contra [S].

Figura 2. Gráfico de Lineweaver-

Burk ou duplo- recíproco

A Sacarose

A sacarose é um dissacarídeo
constituído por dois monossacarídeos,
glicose e frutose, unidos
covalentemente entre si por uma
ligação O - glicosídica, a qual é
formada quando um grupo hidroxila de uma molécula de açúcar reage com o átomo de
carbono anomérico da outra molécula de açúcar. Esta reação representa a formação de
um acetal a partir de um hemiacetal e de um álcool. As ligações glicosídicas são
facilmente hidrolisadas por ácido, mas resistem à clivagem por base. Assim os
dissacarídeos podem ser hidrolisados para liberar seus componentes monossacarídeos
livres por aquecimento com ácido diluído. Ligações N-glicosil reúnem o átomo de
carbono anomérico de um açúcar a um átomo de nitrogênio em uma glicoproteína e em
nucleotídeos. A sacarose não contém átomos de carbono anoméricos livres; os átomos
de carbono anoméricos de ambos os monossacarídeos estão envolvidos na ligação
glicosídica. Ela é, portanto, um açúcar não-redutor sendo chamada glicosídeo. [1]
 Levedura Saccharomyces cerevisiae

As leveduras são fungos que se apresentam, usual e predominantemente, sob

forma unicelular. Como células simples, as leveduras crescem e reproduzem-se mais
rapidamente do que os bolores. Também são mais eficientes na realização de alterações
químicas, por causa da sua maior relação área/volume. Elas não constituem um grupo
definidos de microorganismos, embora apresentem uniformidade morfológica, ou
melhor, são diferenciados  de acordo com características morfológicas e mais de acordo
com as características fisiológicas. [2]

A levedura Saccharomyces cerevisiae é um modelo microbiológico unicelular

eucariótico muito utilizado em pesquisa das ciências Biológicas e Biomédicas, por
apresentar características celulares muito semelhantes às de células humanas, além de
permitir a realização de experimentos bastante controlados com um grande número
amostral. [3]

Somogyi-Nelson

O método de Smogvi-Nelson quantifica a presença de açúcares redutores,

produtos que surgem da ação das glicosidases. Entretanto, ele requer grandes volumes
de reagente e amostra. O açúcar aquecido com uma solução alcalina de tartarato de
cobre leva à obtenção de óxido cuproso que, reagindo com molibdato de arsênio,
possibilita a produção de um composto de coloração azul passível de ser quantificada
por colometria; a adição de sulfato de sódio à mistura minimiza a entrada de oxigênio
na solução, responsável pela reoxidação do óxido cuproso. A intensidade da cor
originada é proporcional a quantidade de açúcares redutores existentes na amostra. Este
teor pode ser calculado a partir da espectrofotometria a 540 nm, juntamente com a
utilização de uma curva padrão construída a partir de uma solução de glicose
(100mg/mL).

MATERIAIS E MÉTODOS

Inicialmente foram numerados 11 tubos de ensaios com rótulos de 1 a 10, sendo o

último representado com a letra B. Em seguida pipetou-se em cada um dos tubos, 4mL
de solução de sacarose nas diferentes concentrações (tubo 1 = 1g/L; tubo 2 = 2g/L; tubo
3 = 3g/L; tubo 4 = 4g/L; tubo 5 = 5g/L; tubo 6 = 6g/L; tubo 7 = 7g/L; tubo 8 = 8g/L;
tubo 9 = 9g/L; tubo 10 = 10g/L; tubo 11 = 10g/L. Posteriormente incubou-se os 11
tubos de ensaio a 40°C por 5 minutos e logo após adicionou-se 1,0mL de solução
enzimática (extrato bruto diluído1:30) nos tubos de 1 a 10, e no tubo B adicionou-se 1,0
mL de água destilada, em intervalos de 30 segundos. Os tubos foram mantidos a 40ºC
por exatamente 10 minutos. Após esperado os 10 minutos, transferiu-se 0,5mL de cada
tubo, em intervalos de 30 segundos, para o banho em ebulição, onde ocorreu inibição da
atividade enzimática e deu início à determinação de açúcares redutores. Por fim,
determinou-se a concentração de açúcares redutores pelo método de Somogyi-Nelson
em cada frasco, medindo-se os valores das absorbâncias a 540nm em um
espectrofotômetro.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir dos valores para cada absorbância obtida foi possível estimar os valores
para a concentração dos açúcares redutores (Tabela 2) tendo como padrão a curva de
calibração (Tabela 1).

Tabela 1. Determinação de açúcares redutores (método de Somogyi-Nelson) em

soluções de glicose.
Concentração de glicose (g/L) Absorbância média a 540 nm
2,0 1,04
1,8 0,92
1,5 0,70
1,2 0,66
1,0 0,51
0,8 0,32
0,5 0,28
0,2 0,16

Tabela 2. Concentração da glicose para cada absorbância a 540 nm.

Concentração de glicose
Experimento ABS
(g/L)
1 0,02 0,019
2 0,40 0,231
3 0,70 0,284
4 0,90 0,357
5 1,03 0,414
 6 1,05 0,537
7 1,10 0,601
8 1,70 0,802
9 1,77 0,904
10 2,00 1,028

Transformou-se a concentração do açúcar redutor de g/L para μmol dividindo pelo

valor da Massa Molar da glicose:

MM glicose = 180,16 g/mol

Com isso foi possível calcular os valores para a atividade enzimática, e com isso a
velocidade em μmol/min.mL de acordo com a fórmula abaixo:

[ a çú car redutor ]
v=
tempo(min)x Volume( mL)

Construiu-se um gráfico de Lineweaver-Burk (V x [S]) e em seguida realizou-se a

sua linearização (1/V x 1/[S]) para uma melhor obtenção dos valores de Km e de Vmáx.

Tabela 3. Efeito da concentração de substrato na atividade da invertase.

Conc.
Concentração
Experiment Açucares V (μmol 1/[S] 1/V
de sacarose
o redutore /min.mL) (1/mol) (min.mL/μmol)
[S] (mol)
s (μmol)
1 0,0029 0,02x10-6 0,06x10-6 342,24 16,0x106
2 0,0058 0,40x10-6 1,25x10-6 171,12 8,00x105
3 0,0088 0,70x10-6 2.18x10-6 114,08 4,58x105
4 0,0117 0,90x10-6 2,81x10-6 85,56 3,55x105
5 0,0146 1,03x10-6 3,21x10-6 68,45 3,11x105
6 0,0175 1,05x10-6 3,28x10-6 57,04 3,04x105
7 0,0205 1,10x10-6 3,43x10-6 48,89 2,91x105
8 0,0234 1,70x10-6 5,31x10-6 42,78 1,88x105
9 0,0263 1,77x10-6 5,53x10-6 38,03 1,80x105
10 0,0292 2,00x10-6 6,00x10-6 34,22 1,60x105
 Figura 1. Gráfico de Lineweaver-Burk ou do duplo recíproco.

A partir da análise deste gráfico, foi possível calcular o valor de Km e Vmáx.

Através da equação de Michaelis-Menten:
Vm á x [ S]
V=
Km+[S]

Após feita a linearização:

1 Km 1
= +
V Vm á x [S] Vm á x

A partir do coeficiente linear da reta, obtido através do prolongamento da reta,

obtêm-se o valor de Vmáx.

Vmáx = 4,87 x 10-5

Km
Logo, o coeficiente angular da reta é igual a .
Vm á x
 Km
= 4335.572 Km = 2,1 x 10-1
Vm á x

Portanto os valores de Km e Vmáx para a atividade da enzima Saccharomyces

cerevisiae foram, respectivamente, 2,1 x 10-1 e 4,87 x 10-5.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica,

4ª ed. São Paulo: Sarvier, 2006.

2. VAN NOORT, R. Introdução aos materiais dentários. 2. ed. Porto Alegre: Artmed.
2004.

3. LEVEDURAS. Disponível em:

<http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_grad2004/microor
ganismos/leveduras.htm>.Acesso em 06 de Dezembro de 2010.