ADEQUAÇÃO DE METODOLOGIA PARA ANÁLISE CITOGENÉTICA DE

MAMONA

VIEIRA, Caroline Barbosa¹, CORRÊA, Lauís Brizolara²; VILANOVA, Laura

Borba2; ROCHA, Carla Lima³; SILVA, Sérgio Delmar dos Anjos e 4; ROCHA,
Beatriz Helena Gomes5.
¹Graduada em Ciências Biológicas
²Graduando em Ciências Biológicas UFPel
³Mestranda em Fisiologia Vegetal-UFPel
4
Pesquisador Dr. Embrapa Clima Temperado-CPACT
5
Professora Drª Departamento de Zoologia e Genética, Instituto de Biologia
Universidade Federal de Pelotas, Campus Universitário-Caixa Postal 354-CEP96010-900.
caroline_barbosa@ibest.com.br,

1. INTRODUÇÃO

A mamona (Ricinus communis L.), da família Euphorbiaceae, tem aumento

crescente no seu cultivo graças às descobertas de suas propriedades. Atualmente,
está sendo usada como biodísel e nematicida e sua torta como adubo, além de seus
derivados produzirem ceras, cosméticos, lubrificantes, nylon, etc. Assim, o objetivo
deste trabalho foi desenvolver técnica citogenética para avaliar a divisão celular e a
variação fenotipica dos cromossomos e seu comportamento intraespecifico.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Sementes de mamona Al-guarani 2002 e IAC-guarani foram colocadas em

gerbox em germinador sob temperatura de 25ºC [2]. As raízes foram coletadas às
nove horas e testados diferentes fixadores: Carnoy I 3:1 (álcool etílico: ácido
acético), fixador Carnoy II 6:3:1 (álcool etílico absoluto: clorofórmio: ácido acético),
fixador 2:1:1 (álcool etílico absoluto: clorofórmio: ácido propiônico), fixador de
Newcomer 6:3:1:1:1 (álcool etílico ou álcool isopropano: ácido propiônico ou ácido
acético: acetona: éter de petróleo: dioxane), além do fixador Carnoy com 1% ácido
crômico de acordo com Shimoya [6], durante duas a 24 horas, e após armazenadas
em freezer no próprio fixador.
Posteriormente, as raízes foram lavadas duas vezes com água destilada
para remoção do fixador, hidrolisadas com HCl 1N em banho-maria à 35ºC sendo
uma por 5 minutos e outra por 10 minutos, e com HCl 5N à temperatura ambiente
por 5, 10, 15 e 20 minutos, e após lavadas novamente, três vezes, em água
destilada. Além disso, foi testada também a metodologia descrita por Shimoya [6],
onde as raízes após terem sido lavadas/hidrolisadas/lavadas, novamente retornaram
ao fixador por mais 10 minutos para uma melhor absorção do mesmo.
Após os diferentes processos de fixação e hidrólise as lâminas foram
preparadas e coradas com os métodos de: a)coloração seguida de esmagamento,
b)esmagamento seguido de coloração e c)esmagamento com corante (Tabela 1):

a) Coloração seguida de esmagamento: as pontas de raízes foram colocadas em

recipiente com corante, durante o tempo específico de cada protocolo de
coloração, transferidas para lâmina e esmagadas sob lamínula;
b) Esmagamento seguido de coloração: as pontas de raízes foram colocadas sobre
lâmina e esmagadas com ácido acético 45% sob lamínula, retirada a lamínula em
nitrogênio líquido e corada segundo o protocolo específico de coloração;
c) Esmagamento com o corante: as pontas de raízes foram colocadas em lâmina e
esmagadas com o corante sob lamínula e após lutadas.

Tabela 1. Métodos de coloração usados na preparação de lâminas em análise citogenética de

Ricinus communis L.
Coloração e Esmagamento e Esmagamento com
esmagamento coloração o corante
-Hematoxilina acética 1% -Hematoxilina acética 1% -Orceína acética 2%
(Guerra & Souza, 2002) (Guerra & Souza, 2002) (Darlington & La Cour,
1976)
-Orceína acética 2% -Giemsa 1% (Worton & Duff, -Orceína lácto-acética 1%
(Guerra & Souza, 2002) 1979; Benn & Perle, 1992 –
modificados)
-Feulgen (Felgen & -Giemsa 2% (Worton & Duff,
Rosenbeck, 1924) 1979; Benn & Perle, 1992 –
modificados)

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os fixadores usados não apresentaram diferença qualitativa na análise das

lâminas. Entretanto, o tempo de exposição ao fixador (24 horas em temperatura
ambiente), o aumento no número de dias em que as raízes ficaram armazenadas
em freezer e a menor espessura das mesmas reduziu a presença de pontos
refringentes (Figura 1a). Resultados semelhantes foram encontrados por Vieira et al.
[8] em células meristemáticas radiculares de girassol.
Quanto à hidrólise, os melhores resultados foram obtidos com HCL 5N por
15 minutos e HCl 1N por 10 minutos.
Não houve diferença nas lâminas preparadas pelo método de Shimoya [6] e
o método convencional, ou seja, o retorno das raízes ao fixador não promoveu uma
melhoria na qualidade.
Pelo método de coloração seguido de esmagamento com orceína acética
2%, de acordo com Guerra & Souza [5], as lâminas não apresentaram resultados
satisfatórios, uma vez que as raízes não são eficientemente hidrolisadas, isto é, as
etapas de hidrólise e de coloração são concomitantes, diferentemente das outras
metodologias testadas.
Para a coloração com Giemsa, técnica de esmagamento seguido de
coloração, foi obtido melhor resultado com a concentração de 1%, durante dez
minutos (Figura 1b). Os resultados estão de acordo com os de Guerra & Souza [5]
que elegem este como o melhor corante para citogenética. Com a concentração de
2%, o citoplasma ficou excessivamente corado (Figura 1c), semelhante às
observações realizadas em girassol [8], diferindo, entretanto, dos trabalhos de
Aarestrup & Carvalho [1] e Melo et al. [7] que usaram Giemsa 2% para a coloração
de células de pimentão e Lycopersicon, respectivamente.
As lâminas coradas com hematoxilina 1%, tanto para coloração seguida de
esmagamento (Figura 1d) como de esmagamento seguido de coloração (Figura 1e),
coraram excessivamente o citoplasma, não havendo contraste e impossibilitando a
distinção clara do núcleo. Entretanto, Guerra & Souza [5] recomendam esta solução
corante para espécies que possuem cromossomos pequenos, como os da mamona,
afirmando ser este corante o que produz melhores resultados juntamente com o de
Giemsa.
 Nas lâminas confeccionadas com hematoxilina, fixadas com Carnoy
contendo 1% ácido crômico (Figura 1f), não houve diferença qualitativa entre elas e
as fixadas com outros fixadores, diferindo dos resultados de Shimoya [6], que diz
que os fixadores que possuem este ácido causam a contração do protoplasma,
neutralizando assim a ação do ácido acético e melhorando a visualização das
células.
As lâminas preparadas pelo método de esmagamento com o corante
orceína acética 2% e orceína acética lática 1% apresentaram boa visualização,
apesar do citoplasma também ter sido corado (Figuras 1g e 1h), não impedindo o
contraste entre citoplasma - núcleo, confirmando os resultados de Guerra & Souza
[5]. Vieira et al. [8] verificou também que orceína acética 2% foi um dos melhores
corantes para células de girassol.
Na técnica de Feulgen, as raízes foram esmagadas com os carmins acético,
propiônico e alcoólico, e com ácido acético. Com todos os carmins não houve bom
contraste (Figuras 1i, 1j e 1k), e nas lâminas esmagadas com ácido acético este
retirou o corante de Shiff (Figura 1k), contrariando Guerra & Souza [5], que dizem
ser esta técnica a mais utilizada em citogenética vegetal, porém confirmando os
resultados de Bobrowski [3], que obteve melhores resultados usando Giemsa 3%
que Shiff esmagado com carmim em pontas de turião de aspargo.

Figura 1- Lâminas de mamona: a- pontos refringentes em células coradas com orceína acética; b-
Giemsa 1%; c- Giemsa 2%; d- esmagamento seguido de coloração com hematoxilina; e-
esmagamento seguido de coloração com hematoxilina; f- raiz fixada com ácido crômico, corada com
hematoxilina; g- orceína acética; h- orceína lacto-acética; i- Felgen esmagado com Carmim alcoólico;
j- Felgen esmagado com Carmim propiônico; k- Felgen esmagado com Carmim acético; l- Felgen
esmagado com ácido acético 45%.

4. CONCLUSÃO

Para análise citogenética de mamona as melhores técnicas são as que

utilizam hidrólise com HCl 5N por 15 minutos à temperatura ambiente ou HCl 1N
durante 10 minutos em banho-maria à 35ºC, coradas com Giemsa 1% durante 10
minutos. Porém, para simples análise de divisão celular são recomendados orceína

b
acética 2% e orceína lácto-acética 1%, após 24 horas, por serem técnicas mais
rápidas.

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] AARESTRUP, J.R.; CARVALHO,C.R. de, Análise de imagem de cromossomos

mitóticos de pimentão, Genetics and Molecular Biology., v.22, n3. Supplement, p.
112, 1999.
[2] BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Divisão de Laboratório
Vegetal. Regras para Análise de Sementes. Brasília, 1993. 365 páginas.
[3] BOBROWSKI , V. L., ECKERT, M. I., VIÉGAS, J. AUGUSTIN, E., PETERS, J.A.
A technique to obtain metaphasic chromosomes in asparagus (Asparagus officinalis
L.) sperar cells. Genetics and Molecular Biology. v.19, n2: p.323-325,1996.
[4] FREGONEZI, F. N. ;LIMA, I. G. P. ; RUAS, C. F.; VANZELA , A..L. L. ; RUAS, P.
M.; MATZENBACHER, N. I. Análise Cariotípica em duas espécies do gênero
Mikania (Asteraceae). In: Genetics and Molecular Biology, v.22, n3. Supplement,
p. 101-100, 1999.
[5] GUERRA, M.; SOUSA, M. J. de. Como observar cromossomos – Um guia de
técnicas em citogenética vegetal, animal e humana. Editora FUPEC. Ribeirão Preto.
2002. 131 páginas.
[6] SHIMOYA C. Manual de Técnicas Citológica Vegetal. Escola Superior de
Agricultura do Estado de Minas Gerais, Viçosa, Minas Gerais 1964.
[7] MELO. M. B. S. de Cavalheira, G. M. C., GUERRA M. ANDRADE V. C. de
Análise Citogenética das nove espécies do gênero Lycorsiconn. In: Genetics
and Molecular Biology., v.22, n3. Supplement, p.122, 1999.
[8] VIEIRA, C.B.; VARGAS, D.P.; BOBROWSKI, V.L.; ROCHA, B.H.G. Otimização
de procedimentos citológicos para análise de células meristemáticas radiculares de
girassol. II Congresso de Biociências. 2004