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RIBEIRÃO PRETO - SP
2015
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA
RIBEIRÃO PRETO - SP
2015
Autorizo a divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou
eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada à fonte.
Ao Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento, pelo apoio, paciência, incentivo e confiança
depositada.
Ao Prof. Dr. Marco Antonio Del Lama, pelo exemplo de seriedade e dedicação à pesquisa
científica.
Aos meus pais e irmãos (Pedro, Maria, Dedé, Márcio, Marcelo e Pedro Filho) pela
compreensão, confiança, e principalmente, pelo exemplo de amor e cumplicidade.
Aos especialistas de Laboratório Dr. Sidnei Mateus, Izabel Turatti e Isabel Cristina pelo
auxílio técnico à realização do trabalho.
Ao Dr. Sidnei Mateus (Dneis), pela amizade, incentivo, pelo exemplo de honestidade,
cafezinhos e discussões.
Ao Dr. Túlio Nunes, pela amizade, apoio, incentivo, e acima de tudo pelo exemplo de
seriedade e competência.
Aos amigos irmãos Dani Carol, Márcia Xavier, Nathy, Rafa, Fabrício, Raone, Ju Cordeiro, Ju
Duarte, Nanda e Marília, pela compreensão, confiança, parceria e pela amizade verdadeira.
“Remember to look up at the stars and not down at your feet.
Try to make sense of what you see and wonder about what makes the universe exist.
Be curious. And however difficult life may seem, there is always something you can do and succeed at.
Stephen Hawking
RESUMO
Animal societies exhibit remarkable variation in their breeding strategies. Groups may contain
one or a few individuals that maintain a monopoly over reproductive output, or be formed by
individuals that have an equal share in the reproductive process. Ultimately, an individual
may maximize its fitness by either reproducing itself or contributing to the success of its close
relatives. Social structure may be maintained by the discrimination of relatives through the
differential treatment of conspecifics. In social insects, relatives may be recognized by their
odor, with chemical signaling being fundamentally important for the resolution of conflicts.
Queens indicate their social status through chemical signals and the response of workers to
these signals may include the suppression of ovarian activity. In primitively social insects,
dominant individuals may communicate their status and inhibit reproduction in subordinates
by aggressive behavior alone, although they may also be docile, but still maintain their
reproductive monopoly, indicating that chemical signaling may act synergistically with
dominance behavior. The present study investigated the mechanisms determining social
regulation of Euglossa melanotricha, a primitively social bee. This investigation was based on
the analysis of behavioral interactions, experimental tests, the analysis of the chemical
composition of the cuticle of the females, and the relatedness between the females and their
offspring in 42 Euglossa melanotricha families. The results indicated that the dominant
females maintain a reproductive monopoly through coercion and oophagy, although the
differences in the chemical profiles of the cuticle of the dominant and subordinate females
suggests that chemical signaling may also be involved in the communication of reproductive
dominance. However, this factor was not dependent of the fertility associated with the mating
condition and ovarian activity. The results of the genetic analysis indicated o unique mating
system for the species, with the relatedness among females indicating three distinct types of
group: families of sisters, mother-daughters, and families of unrelated females. Reproductive
asymmetry varied according to relatedness, aggression, and oophagy. The participation of the
subordinates in total production was lower in the related females (sisters and mother-
daughters) than in the unrelated families. However, the production of the subordinates in the
related families was biased towards males. These findings support the predictions of
concession models, in which sharing of reproduction results from the incentives of the
dominant females and the tolerance of the subordinate in exchange for cooperation. This
study provides evidence of a rare positive correlation between reproductive asymmetry and
relatedness, as predicted by concession models, and indicates the existence of a social
hierarchy maintained by a “social contract” in relation to reproductive effort in Euglossa
melanotrica. The data also indicate that the organization of small societies, such as those
found in Euglossa, may be modulated by complex traits, as in advanced insect societies.
Figura 4. Representação esquemática das interações não agressivas nos ninhos de Euglossa
melanotricha: (D) Aproximar e acompanhar sem contato físico, (E) Aproximar com contato físico
das antenas. Fêmea dominante e Fêmea subordinada .....................................................................37
Figura 6. Gaiola com alimentador, utilizada para abrigar as fêmeas dominantes removidas dos
ninhos de Euglossa melanotricha. Em destaque uma das fêmeas..........................................................39
Figura 7. Média do tamanho corporal (Média ± desvio padrão) das fêmeas dominantes invasoras,
subordinadas invasoras e dominantes residentes em ninhos de Euglossa melanotricha .......................48
Figura 8. Atividade ovariana em fêmeas de Euglossa melanotricha: (A) Fêmea dominante, (B)
subordinada e (C) invasora que assumiu a dominância reprodutiva ......................................................48
Figura 9. Comparação das proporções (%; média ± desvio padrão) de n-alcanos, alcenos e alcanos
ramificados entre dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha .........................55
Figura 10. Cromatogramas dos perfis cuticulares de fêmeas de Euglossa melanotricha. Uma
fêmea de cada grupo foi escolhida aleatoriamente. Os principais componentes encontrados nesta
amostra foram: (a) Tricosano; (b) (Z) 5-Pentacoseno; (c) n-Pentacosano; (d) 5-Metilpentacosano
(e) n-Hexacosano; (f) (Z) 9- Heptacoseno; (g) n- Heptacosano; (h) 13-, 11-, 9- Metilheptacosano;
(i) 9- Nonacoseno; (j) n-Nonacosano; (k) Hentriacontano.....................................................................57
Figura 11. Resultado da analise canônica mostrando as posições relativas dos grupos de fêmeas
por status social (fêmeas dominantes, n = 30; subordinadas, n = 30; fundadoras, n=12) em
Euglossa melanotricha. Elipses correspondem a 95% do intervalo de confiança .................................58
Figura 12. Comparação das proporções (% relativa, média ± desvio padrão) dos compostos C23 =
n-tricosano, ZC25 = 5-pentacoseno, C25 = n-pentacosano, MeC25 = 5-metilpentacosano, C26 = n-
hexacosano, ZC27 = 9-heptacoseno, C27 = n-heptacosano, MeC27= 13-, 11-, 9-Metilheptacosano, 9-
Nonacoseno, n-nonacosano e n-hentriacontano entre fêmeas dominantes (n=30) e subordinadas
(n=30) de colônias de Euglossa melanotricha. *p < 0,05 e ns = não significativo foram
determinados pelo teste t para amostras independentes por grupo.........................................................58
Figura 13. Proporção relativa (média ± desvio padrão) of n-alcanos, alcenos, e alcanos
ramificados entre fêmeas dominantes (invasoras e residentes) e subordinadas de Euglossa
melanotricha ..........................................................................................................................................62
Figure 14. Análise discriminante do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas dominantes
invasoras (n = 5), dominantes residentes (n = 30) e subordinadas (n = 30) em 10 ninhos de
Euglossa melanotricha...........................................................................................................................62
Figura 15. Genealogia de himenópteros sociais com uma rainha fecundada por um macho
(sistema monogínico/monoândrico). Os números ilustram o parentesco de uma operária com sua
irmã (r = 0,75), seu irmão (r = 0,25), seu próprio filho (r = 0,5), e do seu filho com outra operária
(r = 0, 375). Os indivíduos estão representados por meio de símbolos indicando o sexo (Hamilton
1972, Bourke & Franks 1995, Heinze et al 2004)..................................................................................90
Figura 16. Filogenia dos gêneros de Hymenoptera eussocial (formigas, abelhas e vespas) sugerida
a partir da análise da frequência de acasalamento. Os clados que exibem alta poliandria (> 2
acasalamentos) têm ramos sólidos vermelhos, enquanto os clados com baixa ou poliandria
facultativa (>1, mas < 2 acasalamentos) têm ramos pontilhados vermelhos; ao passo que, os clados
que exibem monoandria têm ramos sólidos pretos (Hughes et al 2008)................................................93
Figura 17. Correlação entre a proporção de machos produzidos pelas fêmeas subordinadas e o
parentesco (r) entre as fêmeas adultas nas famílias de reativações de Euglossa melanotricha (n =
30) ........................................................................................................................................................116
Figura 19. a) Correlação entre assimetria reprodutiva (B) e o parentesco (r) das fêmeas adultas nas
famílias de reativações de Euglossa melanotricha (n = 30). b) Correlação entre a assimetria
reprodutiva (B) e a frequência de policiamento dos ovos feito pelas fêmeas dominantes. c)
Correlação entre assimetria reprodutiva (B) e a frequência de interações agressivas realizadas pelas
fêmeas dominantes. Cada símbolo representa uma família .................................................................118
LISTA DE TABELAS
Tabela 3. Reutilizações de ninhos por pares de fêmeas, incluindo o número de posturas, o número
de ovos comidos pelas dominantes, e as interferências não agressivas (AN) e agressivas (A)
observadas durante as atividades de construção das células (CC), aprovisonamento (AP),
oviposição (OV), operculação (OP), reabertura da célula (RC) e outras atividades como limpeza
das células, selamento de arestas e da entrada do ninho ........................................................................49
Tabela 4. Resultados dos experimentos de remoção: efeito da presença das fêmeas dominantes de
Euglossa melanotricha com as interações que ocorreram após sua reintrodução nos ninhos (em 30
reutilizações de 10 ninhos).....................................................................................................................51
Tabela 6. Porcentagens médias (± desvio padrão) dos 11 picos selecionados pela análise
discriminante entre fêmeas dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha ..........56
Tabela 7. Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares dos
grupos de fêmeas dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha .........................57
Tabela 9. Análise discriminante dos compostos químicos cuticulares encontrados nos grupos de
fêmeas dominante invasora, dominante residente e subordinada de Euglossa melanotricha ................61
Tabela 10. Associação prevista entre as variáveis de acordo com os diferentes modelos de
assimetria reprodutiva ............................................................................................................................95
Tabela 11. Número de amostras analisadas nas famílias de fundações e reativações de ninhos de
Euglossa melanotricha.........................................................................................................................102
Tabela 12. Microssatélites utilizados, sequências e temperaturas de hidridação (TH) dos primers e
suas referências. F: forward; R: reverse...............................................................................................104
Tabela 13. Diversidade alélica para as famílias de Euglossa melanotricha, com o número de
machos e fêmeas genotipados por loco ................................................................................................110
Tabela 14. Parentesco entre as fêmeas de Euglossa melanotricha nas relações entre mãe e filhas e
entre irmãs completas nas famílias de fundações (n = 12; NF1-NF12) .................................................111
Tabela 15. Estimativas de parentesco (r) entre categorias de fêmeas reprodutivas em cada família
de reativação de Euglossa melanotricha (n = 30; N1FR1-N14FR3).......................................................112
Tabela 16. Número total da prole e a proporção de machos produzidos por cada fêmea reprodutiva
nas famílias de Euglossa melanotricha, agrupadas de acordo com o parentesco ................................115
Tabela 17. Número de oviposições feitas pelas subordinadas e a frequência de ovos comidos pelas
dominantes em cada família de Euglossa melanotricha agrupadas de acordo com o parentesco........119
Tabela 18. Associação observada e prevista entre as variáveis de acordo com os diferentes
modelos de assimetria reprodutiva.......................................................................................................128
SUMÁRIO
A
s investigações sobre o comportamento social em Hymenoptera têm
cooperativas no cuidado com a prole são manifestadas (Wilson 1971). A razão para este
enfoque é óbvia, pois as associações mais complexas encontradas nos himenópteros sociais
Uma das predições do modelo afirma que em ninhos com apenas uma rainha que tenha
acasalado apenas uma vez (monoginia/monoandria), as operárias podem alocar seus esforços
entre dois tipos reprodutivos: fêmeas ou irmãs completas com as quais terão 75% de genes
compartilhados, e machos ou irmãos com os quais terão 25% dos genes em comum. Essa
igualitário de 1:1, como previsto pela teoria da alocação sexual em populações panmíticas
(Fisher 1930), pode gerar conflitos de interesse no momento da determinação do sexo da prole
(Trivers & Hare 1976). Em outras palavras, a estrutura social pode ser mantida pela
parentesco e o ganho genético individual seja ele pela reprodução direta ou indiretamente
através da ajuda a parentes (Alexander et al 1991, Keller & Nonacs 1993, West-Eberhard
2003, Seppä et al 2012). Contudo, apesar das idéias de Hamilton terem sido largamente
Cap. I – Introdução Geral | 15
1964a,b), se atos altruístas são dirigidos diretamente a “parentes” que tenham sido
reconhecidos como tal, ainda é um assunto controverso (Sherman et al 1997). Há, portanto,
reconhecimento parental (Fletcher & Michener 1987), incluindo seres humanos (Weisfeld et
al 2003).
químicos podem compor uma assinatura individual que contribui para o reconhecimento de
companheiras de ninho (Nunes et al 2008, revisado por Blomquist & Bagnères 2010, Emery
social ou reprodutivo, fertilidade, e alocação de tarefas (Nunes et al 2009, 2010, 2014, Smith
em insetos sociais (revisado em Ratnieks et al 2006), mas pouco se sabe sobre a evolução e
(Ratnieks et al 2006, Zanette et al 2012). Uma importante questão sobre essas interações é
como as variações nas estratégias individuais podem contribuir para manter o sistema social
estável.
Cap. I – Introdução Geral | 16
altamente direcional das interações de dominância sugere que o reconhecimento ocorre e pode
ter uma base olfativa (revisado por Blomquist & Bagnères 2010). West-Eberhard (1977)
sugeriu que a regulação reprodutiva se baseia tanto no controle físico quanto na sinalização
química, e isso tem sido demonstrado em testes experimentais realizados com vespas do
gênero Polistes e Ropalidia e em formigas Ponerinae (Downing & Jeanne 1985, Premnath et
dentro dos grupos sociais podem variar. Os grupos podem ter um ou poucos indivíduos que
assumem a dominância reprodutiva (alta assimetria), ou podem ser formados por indivíduos
que compartilham de forma igualitária a reprodução (baixa assimetria) (Emlen & Wrege
1992).
ou “reproductive skew” têm sido amplamente discutidos. Essa percepção levou a formulação
de modelos teóricos que prevêem como a assimetria reprodutiva pode ser afetada por fatores
genéticos, ecológicos e comportamentais (Reeve & Ratnieks 1993, Reeve & Keller 1995,
Reeve 1998, Reeve et al 1998, Johnstone 2000, Reeve & Keller 2001, Bolton et al 2006,
Reeve & Shen 2006, Lucas et al 2011, Seppä et al 2012, Reeve & Shen 2013).
por Reeve & Ratnieks (1993), prevê que uma fêmea dominante tem controle total sobre a
para outra fêmea, a fim de incentivá-la a permanecer no grupo. A concessão está relacionada
Cap. I – Introdução Geral | 17
as relações parentais entre as fêmeas reprodutivas, de modo que, quanto maior o parentesco,
colônia (Reeve 1991). Esse contrato social conhecido como modelo de concessão foi proposto
com base nas associações de fêmeas do gênero Polistes (Reeve & Ratnieks 1993), uma vespa
primitivamente social.
Outro modelo conhecido como cabo-de-guerra ou ‘tug-of-war’ tem sido aplicado para
& Velthuis 1999, Reeve et al 2000, Hannonen et al 2002, Seppä et al 2012, Sumner et al
2002, Paxton et al 2002, Field & Cant 2009, Shen et al 2011). O modelo prevê que fêmeas
dominantes e subordinadas têm controle limitado sobre a reprodução e devem alocar mais
esforços para aumentar as suas próprias cotas e contribuir para produção total do grupo. A
mais basal, monofilético e distinto dos Apinae corbiculados (Apini + Meliponini + Bombini)
por serem as únicas que não formam grandes ninhos e diferenciação morfofisiológica entre
castas (Roig-Alsina & Michener 1993). As abelhas euglossine possuem atualmente cinco
gêneros e mais de 200 espécies, sendo Euglossa, Eulaema e Eufriesea constituídos por
norte do México até o Paraguai, norte da Argentina e Jamaica (Michener 2000, Nemésio &
Ramussen 2011). As abelhas desse gênero apresentam pequeno ou médio porte (8-19 mm),
Cap. I – Introdução Geral | 18
possuem poucos pelos, tegumento metálico brilhante e coloração que varia do verde ao azul,
1987, Michener 2000, Cameron 2004), comunal (Garófalo et al 1998, Soucy et al 2003, Otero
et al 2008) ao primitivamente social, além das espécies com multifêmeas nos ninhos que
2008, Augusto & Garófalo 2009, 2010, Andrade-Silva & Nascimento 2012). Em espécies
com multifêmeas nos ninhos, os estudos têm mostrado monopólio reprodutivo por uma única
fêmea que inclui interações agressivas e oofagia de ovos (Garófalo 1985, Ramirez-Arriaga et
al 1996, Augusto & Garófalo 2009, 2010, Andrade-Silva & Nascimento 2012).
Dada a diversidade de sistemas sociais das abelhas euglossine que varia do solitário ao
primitivamente social com multi-fêmeas nos ninhos, entender como os conflitos de interesse
surgem e como evoluem em populações desse táxon são de particular interesse para
Além desses aspectos, estudos prévios têm especulado que o comportamento solitário
das abelhas euglossine seria uma reversão evolutiva, com algumas espécies de Euglossa
retendo alguns traços eussociais (Cameron 2004, Cardinal et al 2010), enquanto outros
corbiculados (Zucchi et al 1969, Chavarría & Carpenter 1994, Noll 2002, Canevazzi & Noll
2014). Portanto, o estudo da biologia comportamental das abelhas euglossine pode iluminar as
social em espécies com nível rudimentar de socialidade (Paxton et al 2002, Langer et al 2004)
e são ausentes estudos com abelhas euglossine. Os estudos atualmente disponíveis com
dados empíricos e análise do parentesco das famílias desse táxon são necessários para se
1.1 Objetivos
destes através da análise das relações sócio-etológicas mediadas por sinalização química e
Nosso modelo de estudo foi a espécie Euglossa melanotricha, por diferentes motivos. O
primeiro foi a possibilidade de estudar uma população encontrada em área urbana, com
Caatinga (Nemésio & Faria Jr. 2004, Andrade-Silva et al 2012). O último se refere a questões
b. A sinalização química representa uma das formas de resolução dos conflitos sobre a
reprodução?
parentesco?
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Este estudo foi dividido em etapas que consistiram em sessões de observação, sessões
do comportamento das fêmeas nos ninhos para identificação do status social ocupado por cada
uma delas, e registro das interações comportamentais. Em seguida, foram feitas as sessões
experimentais com manipulação das fêmeas adultas e, finalmente, foram feitas as análises da
composição do perfil químico cuticular das fêmeas, e do parentesco genético das fêmeas
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CAPÍTULO II:
Regulação reprodutiva em Euglossa
melanotricha: Contexto social, fertilidade e
sinalização química
(Manuscrito submetido a Animal Behavior em Jan/2015: ANBEH-D-15-00021-Anexo XLIV).
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 26
2.1 Introdução
reconhecimento eficientes com base em sinais químicos (revisado por D'Ettorre & Lenoir
2010).
companheiras de ninho (revisado por Blomquist & Bagnères 2010, van Zweden & D’Ettorre
2012).
formarem uma barreira contra micro-organismos (Jackson & Blomquist 1976, Lockey 1988,
Gibbs 2002). São compostos hidrofóbicos de cadeia longa que podem ter origem endógena,
ou serem adquiridos a partir do meio externo (Wigglesworth 1964, Carlin 1983, revisado por
corpos de gordura, uma importante fonte de ácidos graxos, que podem servir como
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 27
precursores para a biossíntese de hidrocarbonetos (ver Diehl 1975, Howard & Blomquist
2005, Juarez & Fernandez 2007). Eles ainda podem ser produzidos por glândulas
1999).
(Lp) (Chino et al 1985). Esta proteína está envolvida no transporte seletivo de feromônios
hidrocarbonetos com 20 a 40 átomos de carbono (Akino 2006). Além dos compostos lineares,
são descritos compostos ramificados com um a três radicais metil ou etil (Howard 1993). São
encontrados também, compostos insaturados com uma ou duas ligações duplas (Howard &
Blomquist 2005, Akino 2006, revisado por Blomquist & Bagnères 2010). Nestes grupos de
(revisado por Blomquist & Bagnères 2010, D'Ettorre & Lenoir 2010, Smith et al 2012).
feromônios e a resposta das operárias a esses sinais incluem o início da trofalaxia, a inibição
rainha transmitido pelo seu perfil de hidrocarbonetos cuticulares pode estar estreitamente
associado com a ativação dos ovários ou somente ao seu status social definido a partir da
sociais, as formigas têm sido o melhor grupo estudado. Neste grupo, foram descritas
em 21 espécies representadas por 16 gêneros (revisado por Blomquist & Bagnères 2010).
condição reprodutiva é corroborada por vários estudos que mostram que as mudanças
intensas depois que as colônias se tornam órfãs ou quando a hierarquia de dominância reprodutiva
é estabelecida pela primeira vez (Monnin & Peeters 1999, revisado por Ratnieks et al 2006). As
reprodutiva (Monnin & Peeters 1999, Cuvillier-Hot et al 2004). Esta redução parece coincidir
Esse comportamento foi amplamente estudado em formigas, e neste grupo não ocorre
dominância, sem que ocorra sinalização química (Blomquist & Bagnères 2010). A maioria
das descrições foi feita em estudos com espécies primitivamente sociais, proporcionando a
base para a identificação de uma rainha saudável e reprodutiva (Martin & Drijfhout 2009,
reprodutivas sinalizam de forma confiável tanto seu status de acasalamento como sua
fertilidade, e a resposta dos outros membros do grupo deve ser proporcional ao potencial
mesmos compostos presentes na sua cutícula. Esses ovos são distribuídos pelas operárias ao
longo do ninho indicando dessa forma a presença de uma rainha fértil dentro da colônia o que
operárias têm sido demonstrados em algumas espécies de formigas, abelhas e vespas (Slessor
et al 2005, Holman et al 2010, Nunes et al 2014, van Zweden et al 2014, van Oystaeyen et al
2014) e em espécies de cupins (Matsuuraa et al 2010). Na formiga Lasius niger, por exemplo,
et al 2009). Operárias expostas a esse composto apresentaram uma grande resposta elétrica
fêmeas sem distinção morfológica entre rainhas e operárias, em que todas as fêmeas são
potencialmente capazes de reproduzir e produzir machos e fêmeas (Peeters 1993). Neste grupo de
van Honk 1990, Augusto & Garófalo 2010). Contudo, a natureza altamente direcional das
interações de dominância sugere que o reconhecimento ocorre e pode ter uma base olfativa
(revisado por Blomquist & Bagnères 2010). West-Eberhard (1977) sugeriu que a regulação
reprodutiva se baseia tanto no controle físico quanto na sinalização química, e isso tem sido
formigas do gênero Formica (Downing & Jeanne 1985, Premnath et al 1996, Hannonen et al
Apesar da existência de uma extensa base de dados para as abelhas das tribos Bombini
(Ayasse et al 1999), Apini (Wossler & Crewe 1999) e Meliponini (Nunes et al 2014), não há
Neste estudo, foram investigados os mecanismos que regulam a estrutura social em famílias
famílias. Uma das previsões do estudo é que a regulação reprodutiva envolve sinais químicos
subordinados afetam o comportamento desses indivíduos, mas não inibe seu desenvolvimento
e reintrodução e dos registros das invasões nos ninhos, se o status de indivíduos dominantes
mm), tegumento metálico brilhante e de cor azul, comumente encontrada em áreas com
distribuída nas regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste (Moure et al 2007, Nemésio
2009), sendo uma das mais abundantes em áreas de Cerrado e Caatinga (Andrade-Silva et al
2012).
A fundação dos ninhos é solitária e as fêmeas das sucessivas gerações podem reutilizar
os ninhos, resultando em ninhos com multi-fêmeas. Ninhos reutilizados são ocupados por 2-5
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 31
fêmeas. Todas as fêmeas podem potencialmente acasalar e colocar ovos, embora somente
processo de reutilização de ninho (R) é iniciado quando pelo menos duas fêmeas da mesma ou
de diferentes gerações reutilizam os ninhos ou quando novas associações são formadas por
forrageamento, coleta de resina até à postura final das fêmeas) varia de 18 a 79 dias (46,4 ±
de nidificação e permanecem nos ninhos a maior parte do tempo. Este período de inatividade
dura de 15-63 dias (34,11 ± 11,7 dias) (Andrade & Silva 2012).
entre fêmeas fundadoras e sua prole, entre recém emergidas ou entre fêmeas residentes e
invasoras.
(10º30’00’’S e 40º19’00’’W), Chapada Diamantina, Bahia, Brasil (Fig. 1). O tipo climático
da região é tropical subúmido seco com precipitação variando de 302 a 1935 mm anuais, e
(PERH 2010).
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 32
C
B
caixas de madeira (12 x 10 x 8 cm) cobertas com tampa de vidro. Os ninhos foram mantidos
sobre uma bancada e estiveram conectados ao meio externo através de um tubo plástico, de
modo que as abelhas podiam sair livremente para forragear (Fig. 2A, B, C, D e E). O
combinação de imagens de vídeo capturadas usando mini-câmeras (Citrox 5001 de cor digital
de dia/noite) e imagens focais com melhor resolução foram feitas com câmera digital -
imagens foram processadas e editadas (USB Camera Viewer 1.25) (Figura 2G). As análises
dos vídeos foram feitas diariamente e cópias foram armazenadas em DVD e HD externo. Para
facilitar a análise foram criadas sessões de 3 horas para leitura e registro dos dados, sem
intervalo, entre 6-9 h, 9-12 h, 12-15 h, 15-18 h, 18-21 h, 21-24 h, 24-3h, 3-6h. Duas análises
foram feitas por sessão, a primeira utilizando o método de todas as ocorrências para
métodos seguiram o mesmo esquema: três vezes por semana durante os meses de
Janeiro/2013 a Abril/2013.
processo de reutilização dos ninhos. A identificação das fêmeas foi feita com base em
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 34
marca indicando seu status ou condição reprodutiva. As marcações foram feitas no tórax das
fêmeas com pontos de caneta permanente colorida não-tóxica, sem cheiro e de secagem
Durante o estudo, foram observadas 12 invasões nos ninhos por fêmeas ‘alienígenas’.
(1) Dominância: dez pares de fêmeas com estrutura reprodutiva estável (ou seja,
fêmeas que permaneceram como dominante e subordinada por várias semanas) foram
filmadas por 24 h continuamente (240 dias; 5760 horas; LD 3:3 h). As observações foram
dominante ataca outra fêmea mordiscando a extremidade abdominal; Figura 3a), empurrar (a
dominante ataca outra fêmea dando cabeçadas no abdômen; Figura 3b), ameaçar com
sobrevôos (a dominante persegue a outra fêmea sem contato físico com sobrevôos de ameaça;
Foram então calculadas as taxas das interações de dominância para cada abelha, após
correção para a proporção de tempo gasto por abelhas em seus ninhos, no dia em questão. Os
proporção de tempo gasto por essa abelha no seu ninho, no dia em questão.
(3) Outras atividades: a proporção de tempo que uma abelha esteve envolvida em
atividades fora ou dentro do ninho durante o período de monitoramento. Tais atividades foram
classificadas como:
b) Repouso: a fêmea permanece a maior parte do tempo dentro dos ninhos, sem
no substrato, sem realizar qualquer atividade aparente, que não seja para se
c) Auto limpeza: a abelha se limpa passando as pernas pelo corpo, antenas, uma
a serem limpas. Nas regiões sensoriais a auto limpeza é entendida como uma
(colar da célula) após a última deposição de alimento larval. Essas fêmeas então
B
A
D E
Figura 4. Representação esquemática das interações não agressivas nos ninhos de Euglossa
melanotricha: (D) Aproximar e acompanhar sem contato físico, (E) Aproximar com contato físico das
antenas. Fêmea dominante e Fêmea subordinada.
determinação da maternidade do ovo, cada ninho foi esquematizado com registro da ordem e
posição das células que tiveram os ovos substituídos (Figura 5). Os eventos são facilmente
média: 158,35 ± 45,65 segundos, n = 70), seguido por rotação ou movimentos ascendentes e
7
ON 8
OS
3
4 5
OS
6 OS OS
OS
2
OS
9
1
OS 10
OS
OS 1 cm
2.2.4 Experimentos
outubro/2013. Cada repetição foi feita durante um novo processo de reutilização de um ninho,
logo após a emergência ou associação das fêmeas (Tabela 1). O número de fêmeas associadas
em cada reutilização de ninho variou entre dois e cinco. Contudo, apenas um par de fêmeas
foi monitorado em cada repetição. As fêmeas que emergiram após a identificação do par
realizadas em três dias, entre 6 h e 18 h. No primeiro dia, foram observados os ninhos como
parte do tempo no ninho, comeram e substituíram os ovos postos por outras fêmeas pelos
seus. Por outro lado, as fêmeas subordinadas foram aquelas que realizaram atividades
Em cada ninho, uma dominante foi removida no segundo dia de manhã, entre 0500 h e
0600 h. As dominantes removidas foram mantidas em gaiolas individuais feitas com ‘bobs’
plásticos para cabelo, tamanho 3 (2,8 x 6,3 cm) (Figura 6). Cada gaiola foi coberta com tule e
suas extremidades fechadas com papelão. Um microtubo do tipo Eppenforf (2 ml) foi
pendurado dentro de cada gaiola com solução de mel a 40% para alimentação das fêmeas
(Figura 6). As dominantes foram mantidas nas gaiolas em intervalos que variaram de 12 a 72
Figura 6. Gaiola com alimentador, utilizada para abrigar as fêmeas dominantes removidas dos ninhos
de Euglossa melanotricha. Em destaque uma das fêmeas.
efeito da remoção das fêmeas dominantes sobre a atividade reprodutiva das subordinadas e
análise do (2) efeito da remoção com posterior reintrodução sobre a capacidade das
1), foram conduzidas as sessões experimentais nas quais as subordinadas foram removidas de
tempo (Tabela 1). Como descrito anteriormente para os experimentos de remoção das
foram removidas permanentemente em cada uma das repetições para avaliar o efeito da
presença das subordinadas na produtividade das dominantes. Para avaliar o efeito da ausência
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 40
Ao final dos testes experimentais, as fêmeas foram retiradas dos ninhos usando pinças
fêmeas foram sacrificadas por resfriamento, congeladas a -10º C, e armazenadas para análise
Número de fêmeas
Experimentos Repetições Ninho/Reuso Tempo fora do ninho (h)
Dominantes Subordinadas
1 N1R1 1 1 12h
2 N2R1 1 1 12h
1 3 N31 1 1 12h
4 N4R1 1 1 12h
5 N5R1 1 1 12h
1 N6R1 1 1 24h
2 N7R1 1 1 24h
2 3 N8R1 1 1 24h
4 N9R1 1 1 24h
5 N10R1 1 1 24h
1 N1R2 1 1 36h
2 N2R1 1 1 36h
3 3 N3R2 1 1 36h
4 N4R2 1 1 36h
5 N5R2 1 1 36h
1 N6R2 1 1 48h
2 N7R2 1 1 48h
4 3 N8R2 1 1 48h
4 N9R2 1 1 48h
5 N10R2 1 1 48h
1 N1R3 1 1 60h
2 N2R3 1 1 60h
5 3 N3R3 1 1 60h
4 N4R3 1 1 60h
5 N5R3 1 1 60h
1 N6R3 1 1 72h
2 N7R3 1 1 72h
6 3 N8R3 1 1 72h
4 N9R3 1 1 72h
5 N10R3 1 1 72h
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 41
material foi fotografado em microscopia de contraste de fase (400x). O conteúdo dos ovários
foi quantificado por contagem do número de oócitos que eram maiores do que 70% do
(não incluindo a câmara adjacente aos trofócitos). A espermateca foi removida e colocada
numa lâmina de uma solução 1: 1 de glicerina e álcool (70%) para a análise dos conteúdos.
A razão sexual da prole foi calculada a partir da divisão do número de fêmeas pelo
total de indivíduos (machos + fêmeas) (Silveira Neto et al 1976). Para verificar a existência de
conflitos potenciais, a razão sexual foi determinada pela proporção de machos que emergiram
posição de subordinadas. Para testar se a relação entre o tamanho da fêmea confere vantagem em
termos de ocupação, foram tomadas as medidas das fêmeas invasoras e residentes. Cada abelha
foi colocada em um aparato de metal preenchido por material esponjoso com cavidades de
diferentes tamanhos. Dentro dessa cavidade, uma placa de vidro foi colocada sobre o indivíduo, a
fim de que sua cabeça e tórax fossem mantidos em posição adequada para as medições. As
imagens foram capturadas com uma câmera fotográfica acoplada a um estereomicroscópio (Leica
MZ16), com auxílio de câmera digital, e as medidas realizadas nas fotografias, usando o software
Leica Soft IM50. Para as análises realizadas neste trabalho, foi considerada apenas a distância
intertegular, medida padrão utilizada em Bombus (Goulson et al 2002, Couvillon & Dornhaus
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 42
2010) e nas espécies solitárias (Cane 1987). A confirmação taxonômica das fêmeas foi feita pelo
feita a partir da análise dos indivíduos provenientes de 14 ninhos. Foram então amostradas as
fêmeas fundadoras foram inseridas na análise como grupo controle, uma vez que o perfil cuticular
sob refrigeração (-10ºC), foram submetidas a extração dos compostos cuticulares feito por
meio de banho em solvente hexano a 500 µl por 2 minutos. Os extratos foram analisados no
equipado com coluna Rtx-5MS e hélio como gás carreador à 1 ml/min, utilizando o método
ionização eletrônica de 70V (EI). O volume de injeção foi de 1,5µl em uma temperatura
inicial de 50ºC, mantida por 1 minuto, seguida de um acréscimo de 10ºC/min até 300ºC, e
O perfil químico individual das fêmeas foi analisado com o auxílio do programa
apresentados em diferentes posições. Cada pico contém todas as informações obtidas pelo
espectrômetro de massa. A quantificação foi realizada com base nas áreas de pico obtidas
Fluka®) foi submetida à cromatografia sob as mesmas condições as quais foram submetidas
todas as amostras das fêmeas. A partir dos tempos de retenção dos alcanos da amostra padrão
e dos tempos de retenção dos compostos das amostras, foi empregada a seguinte fórmula:
Para a identificação da insaturação dos alcenos encontrada nos perfis químicos das
invasora) (Carlson et al 1989). Os extratos de cada grupo foram secos sob fluxo de nitrogênio
Aldrich®) e 100 µl de solução de iodo (iodo à 6%, em éter etílico). Os frascos foram mantidos
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 44
A fase orgânica foi extraída e à esta fração foi adicionado sulfato de sódio em quantidades
suficientes para a completa extração da água restante. A solução foi seca, e 50 µl de hexano
compostos foram comparados com os índices encontrados por Adams (1995) e pelas bibliotecas
digitais FFNSC Library (Flavor and Fragrance Natural and Synthetic Compounds) e NIST-08.
lineares generalizados mistos, GLMMs (Bolker et al 2009). Inicialmente o GLMM foi testado
durante período observado foi influenciado pelo status reprodutivo, tamanho do corpo e / ou
desenvolvimento ovariano. Em seguida, foi testado se o canibalismo dos ovos também foi
regulado pela dominância ou tamanho corporal. Cada tratamento foi especificado como um
efeito fixo, e a identidade do ninho (procedência) como um efeito aleatório (Neter et al 1996).
comparadas entre os grupos de fêmeas. Para esta análise, os valores da área de cada pico
(expressos em % relativa de cada composto) foram analisados pela ANOVA e pelo teste F. O
teste F foi utilizado para verificar a significância estatística da diferença entre as médias.
Os dados dos perfis químicos obtidos pelo GC-MS foram então comparados entre os
componentes (PCA) foi usada para se definir os principais picos de compostos a serem
perfil químico cuticular dos indivíduos dos grupos experimentais formados. Substâncias
ausentes na maior parte dos indivíduos de um grupo foram excluídas das análises estatísticas.
Os compostos apontados pela análise dos componentes principais como responsáveis por
menos de 5% de contribuição para os dois primeiros fatores dessa análise, não foram
Para se evitar erros na composição dos dados amostrais (Aitchison 1986), a área de cada pico
Z = ln [ Ap / g (Ap) ],
grupos, dois a dois, para compreensão das distâncias entre as nuvens de pontos a serem
Para análise individual dos compostos que mais contribuíram para discriminar entre
discriminante (n=11) foram comparados entre os dois grupos de fêmeas e então sua
significância foi testada através do teste t para amostras independentes por grupo. Todas as
2.3 Resultados
Durante os 240 dias de monitoramento nos ninhos, foram registrados 3965 eventos
agonísticos (média ± desvio padrão = 33,04 ± 30,57, n = 14 ninhos), o que permitiu determinar a
classificação hierárquica das abelhas com sucesso. A natureza da dominância foi significativamente
unidirecional em todos os ninhos (Tabela 2). Em outras palavras, interações foram sempre
direcionadas as subordinadas pelas fêmeas dominantes. Do número total de eventos, 2541 (64%)
foram classificados como não agressivos e 1424 (36%) como agressivos ou de dominância (Tabela 3).
O resultado das análises de GLMM indicou que atos agressivos foram mediados pelo status
reprodutivo das fêmeas nos ninhos (F1,59 = 237,66, p <0,0001; Tabela 2), ao invés do tamanho
corporal (F1,59 = 0,94, p = 0,34) ou do desenvolvimento ovariano (F1,59 = 0,15, p = 0,69). Contudo,
resultados mostraram que invasoras (DI) significativamente maiores que as dominantes residentes
(DR) tiveram sucesso na substituição da dominância (DI: média ± desvio padrão = 4,11 ± 0,06 mm
vs DR = 3,33 ± 0,17; t = 16,85 p <0,001; Tabela 2, Figura 7), enquanto invasoras (SI) que não
atividades subordinadas (SI: 3,52 ± 0,15 vs DR: 3,56 ± 0,17; t = 1,35, p = 0,19) (Tabela 2, Figura 7).
(média ± desvio padrão = 3,77 ± 0,33 mm) em comparação com as dominantes residentes
(DR: 3,12 ± 0,26 mm; DI vs DR: t = 5,47, p <0.0001; Tabela 2, Figura 8). Contudo, o
desenvolvimento ovariano não foi diferente entre dominantes e subordinadas residentes (SR)
(SR: 3,32 ± 0.25 mm vs DR: 3,34 ± 0,27 mm; t = 1.57, p = 0.12; Tabela 2, Figura 8). As
GLMM também confirmou que o canibalismo do ovo pode ser previsto pelo status
reprodutivo das fêmeas (F1,165 = 6,62, p <0,05), ao invés do tamanho do corpo (F1,59 = 0,27, p
Tabela 2. Número de atos agressivos e ovos policiados (comidos) durante os processos de reutilização
de ninhos, incluindo o status social das fêmeas e seus respectivos tamanhos corporais (distância
intertegular) e desenvolvimento ovariano (comprimento dos oócitos basais).
4.8
Dominante invasora (DI)
4.6
4.4
Distância Intertegular (mm)
4.2
4.0
Dominante residente (DR)
3.8
Subordinada invasora (SI)
3.6
3.4
3.2
Figura 7. Média do tamanho corporal (média ± desvio padrão) das fêmeas dominantes invasoras,
subordinadas invasoras e dominantes residentes em ninhos de Euglossa melanotricha.
A B C
2 mm 2 mm 2 mm
Figura 8. Atividade ovariana em fêmeas de Euglossa melanotricha: (A) Fêmea dominante, (B)
subordinada e (C) invasora que assumiu a dominância reprodutiva.
= 2%; Tabela 3) permitindo a finalização da operculação das células por essas fêmeas.
agressivos ocorreram em 21% dos casos; 292/1424), comeram e substituíram 73% (185, n=
252; Tabela 3) dos ovos das subordinadas pelos seus. A duração do canibalismo do ovo
Tabela 3. Reutilizações de ninhos por pares de fêmeas (dominante e subordinada), incluindo o número
de posturas, o número de ovos comidos pelas dominantes, e as interferências não agressivas (AN) e
agressivas (A) observadas durante as atividades de construção das células (CC), aprovisonamento
(AP), oviposição (OV), operculação (OP), reabertura da célula (RC) e outras atividades como limpeza
das células, selamento de arestas e da entrada do ninho
limpeza de células e/ou selamento de arestas (27/1424 = 2%) (Tabela 3), sendo mais
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 50
empurrar em 24% (182 de 745), ameaçar com sobrevôos de ameaça em 19% (138 de 745), e
As fêmeas dominantes mantidas até 36 h fora dos ninhos foram capazes de reconhecer
as células que continham ovos das subordinadas em todos os testes experimentais (15 fêmeas
em 10 ninhos). Nestes casos, ao serem recolocadas nos ninhos, às fêmeas dominantes ficaram
agitadas e inspecionaram as células por um tempo que variou entre 300 e 960 segundos
(média ± desvio padrão: 760 ± 109,3 segundos, n=8). Após a inspeção, as dominantes
pelo seu. No entanto, as fêmeas dominantes reintroduzidas por períodos acima de 36 h não
ingeriram os ovos das subordinadas, e ainda, foram substituídas por seus antigos pares de
das células, mas a produtividade média foi significativamente menor (4,8 ± 1,19 células
Tabela 4. Resultados dos experimentos de remoção: efeito da presença das fêmeas dominantes de
Euglossa melanotricha com as interações que ocorreram após sua reintrodução nos ninhos (em 30
reutilizações de 10 ninhos).
2.3.4 Discriminação do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas por status social
0,00001; Alcenos F2,104 = 83,9; p < 0,00001; Alcanos ramificados (metilados e dimetilados) F
2,104 = 30,9; p < 0,00001 (Figura 9). A proporção de n-alcanos foi maior entre fundadoras,
alcenos e alcanos ramificados foi maior nas subordinadas quando comparadas as dominantes
devido a ausência destes compostos no perfil químico das fundadoras. As fêmeas fundadoras
desses, os dimetilados do pentacosano, presentes somente neste grupo. Dada a descrição geral
dos resultados, dos 63 picos identificados pela análise individual, como determinado pela CG-
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 55
MS, 11 foram selecionados pela análise discriminante (Tabela 6). Cada um desses picos
representa mais do que 3% da área total do cromatograma em pelo menos um dos grupos
grupos de fêmeas. O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 50,3%
grupos analisados (Modelo global: Wilks’s λ =0,0297; F15,36 = 42,17; p < 0,00001) (Tabela 6).
45
Alcanos Alcenos Alcanos ramificados
40
35
Proporção dos compostos (Média ± DP)
30
25
20
15
10
-5
Dominantes Subordinadas Fundadoras
Figura 9. Comparação das proporções (%; média ± desvio padrão) de n-alcanos, alcenos e alcanos
ramificados entre dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha.
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 56
A discriminação dos grupos por status social foi significativa (Figura 10; p < 0,00001;
Tabela 7). A classificação da matriz apontou um total de 92,3 % da correta alocação dos
indivíduos dentro do grupo previsto, enquanto o esperado para uma distribuição ao acaso é de
25%.
Tabela 6. Porcentagens médias (± desvio padrão) dos 11 picos selecionados pela análise discriminante
entre fêmeas dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha.
Código
do pico Dominantes Subordinadas Fundadoras
KI Compostos
(ref. (N=30) (N=30) (N=12)
Fig.2)
10
a 2300 Tricosano C23 6,03 ± 2,26 3,79 ± 2,00 7,66 ± 2,04
7
b 2485 5-Pentacoseno C25 10,00 ± 3,61 5,46 ± 1,91 7,59 ± 3,40
4
c 2500 Pentacosano C25 9,66 ± 4,67 0,67 ± 0,54 12,19 ± 3,08
2
d 2541 5-Metil C25 0,05 ± 0,05 1,33 ± 0,67 0,04 ± 0,05
1
e 2600 Hexacosano C26 0,45 ± 0,47 4,26 ± 2,79 2,27 ± 1,87
6
f 2670 9- Heptacoseno C27 3,07 ± 0,99 5,25 ± 2,02 2,76 ± 1,68
3
g 2700 Heptacosano C27 2,99 ± 1,65 0,79 ± 0,35 0,92 ± 0,49
11
h 2727 13-; 11-; 9-Metil C27 0,62 ± 1,32 0,88 ± 0,66 0,06 ± 0,02
9
i 2876 9-Nonacoseno C29 3,29 ± 1,84 0,24 ± 0,04 3,39 ± 1,05
5
j 2900 Nonacosano C29 3,31 ± 1,65 1,96 ± 1,88 0,97 ± 1,08
8
k 3100 Hentriacontano C31 0,53 ± 0,35 1,32 ± 1,78 0,47 ± 0,36
1-13
Os números sobrescritos nos códigos dos picos correspondem ao ranking dos hidrocarbonetos encontrados nas
fêmeas pela análise discriminante steptwise. Os picos destacados em negrito foram aqueles que contribuíram
significativamente para discriminar entre fêmeas dominantes e subordinadas.
sempre > 2,68, p sempre < 0,04) discriminado por 9 dos 11 compostos selecionados pela
análise discriminante para os três grupos de fêmeas (Tabela 7, Figura 12). Tais compostos
Tabela 7. Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares dos
grupos de fêmeas dominantes, subordinadas e fundadoras de Euglossa melanotricha.
(x100,000,000)
1.7
1.6
Fundadora
1.5
1.4 c
1.3
a
1.2 b
fg j
1.1 h k
d e i
co
i
p 1.0
o
d
ed 0.9 Subordinada
a f
d
is b
n 0.8
et c
In 0.7 a
g h i j
0.6 de k
0.5 Dominante
c f
0.4 a b
0.3
g j
0.2 i
de h k
0.1
21.0 22.0 23.0 24.0 25.0 26.0 27.0 28.0 29.0 30.0 31.0 32.0 33.0
Tempo de Retenção
Figura 10. Cromatogramas dos perfis cuticulares de fêmeas de Euglossa melanotricha. Uma fêmea de
cada grupo foi escolhida aleatoriamente. Os principais componentes encontrados nesta amostra foram:
(a) Tricosano; (b) (Z) 5-Pentacoseno; (c) n-Pentacosano; (d) 5-Metilpentacosano (e) n-Hexacosano; (f)
(Z) 9- Heptacoseno; (g) n- Heptacosano; (h) 13-, 11-, 9- Metilheptacosano; (i) 9- Nonacoseno; (j) n-
Nonacosano; (k) Hentriacontano. O tempo de retenção é dado em minutos.
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 58
12
Dominantes
10 Subordinadas
Fundadoras
4
Root 2
-2
-4
-6
-6 -4 -2 0 2 4 6
Root 1
Figura 11. Resultado da analise canônica mostrando as posições relativas dos grupos de fêmeas por
status social (fêmeas dominantes, n = 30; subordinadas, n = 30; fundadoras, n=12) em Euglossa
melanotricha. Elipses correspondem a 95% do intervalo de confiança.
012
*
* Dominante Subordinada
010
Proporção relativa dos compostos
08
06 *
04 * *
*
* ns
02
ns
00
C23
ZC25
C25
MeC25
C26
ZC27
C27
MeC27
ZC29
C29
C31
Figura 12. Comparação das proporções (% relativa, média ± desvio padrão) dos compostos C23 = n-
tricosano, ZC25 = 5-pentacoseno, C25 = n-pentacosano, MeC25 = 5-metilpentacosano, C26 = n-
hexacosano, ZC27 = 9-heptacoseno, C27 = n-heptacosano, MeC27= 13-, 11-, 9-Metilheptacosano, 9-
Nonacoseno, n-nonacosano e n-hentriacontano entre fêmeas dominantes (n=30) e subordinadas (n=30)
de colônias de Euglossa melanotricha. *p < 0,05 e ns = não significativo foram determinados pelo
teste t para amostras independentes por grupo.
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 59
Dado o registro de comutação das fêmeas entre ninhos (12 invasões em 30 processos
químicos das invasoras que assumiram a dominância com os perfis das dominantes residentes
A análise do perfil cuticular das fêmeas invasoras e residentes também revelou 63 picos já
subordinadas. Assim como, foram encontrados hidrocarbonetos com cadeia entre n-C20 a n-C38, e
os alcanos lineares foram mais abundantes, seguidos pelos alcenos, e alcanos ramificados (Tabela
8). A proporção dos compostos químicos cuticulares não variou entre fêmeas dominantes
residentes e dominantes invasoras (n-alcanos: F1,104 = 4,02; p = 0,12; alcenos: F1,104 = 6,07; p =
0,15; alcanos ramificados: F1,104 = 3,91; p = 4,55), mas variou significativamente entre
alcenos: F1,104 = 84,2; p < 0,00001; alcanos ramificados: F1,104 = 25,4; p < 0,00001; Figura 13).
< 0,00001; Tabela 9, Figura 14). Os principais compostos que discriminaram os dois grupos
matriz apontou um total de 83,4 % da correta alocação dos indivíduos dentro do grupo
Tabela 8. Proporção relativa de hidrocarbonetos cuticulares (média ± desvio padrão) das fêmeas
dominantes (residentes e invasoras) e subordinadas de Euglossa melanotricha. Letras em negrito
representam os 11 picos selecionados pela análise estatística.
Tabela 8. Proporção relativa dos hidrocarbonetos cuticulares (média ± desvio padrão) das fêmeas
dominantes (residentes e invasoras) e das subordinadas (residentes e invasoras) de Euglossa
melanotricha. Os compostos em negrito representam os 11 picos selecionados pela análise
estatística.
Tabela 9. Análise discriminante dos compostos químicos cuticulares encontrados nos grupos de
fêmeas dominante invasora, dominante residente e subordinada de Euglossa melanotricha.
35
30
Proporção de compostos (Média ± DP)
25
20
15
10
-5
Dominante Invasora + Residente Subordinada
Figura 13. Proporção relativa (média ± desvio padrão) of n-alcanos, alcenos, e alcanos ramificados
entre fêmeas dominantes invasoras + dominantes residentes e subordinadas de Euglossa melanotricha.
5
Inv asora
4 Dominante residente
Subordinada
3
1
Root 2
-1
-2
-3
-4
-15 -10 -5 0 5 10 15
Root 1
Figure 14. Análise discriminante do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas dominantes
invasoras (n = 5), dominantes residentes (n = 30) e subordinadas (n = 30) em 10 ninhos de Euglossa
melanotricha.
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 63
2.4 Discussão
melanotricha monopolizam a reprodução por coerção e canibalismo dos ovos (cerca de 70%
dos ovos das subordinadas foram policiados pelas dominantes; Tabela 3). A ocorrência de
coerção e policiamento dos ovos pelas dominantes é esperada, dado que em Euglossa
melanotricha os ninhos são pequenos, com duas ou três fêmeas associadas (Foster et al 2001).
sociedades simples quando todas as fêmeas são capazes de produzir machos e fêmeas
selecionadas a reconhecer e remover os ovos das subordinadas, dado que elas são mais
relacionadas com sua própria prole (r = 0.5) do que com a prole das suas irmãs completas (r =
através da agressão e canibalismo dos ovos. Particularmente interessante, é que esses traços
embora não afetem a ativação dos ovários nas subordinadas. Em colônias de vespas
reprodução das operárias é suprimida fisiologicamente (Reeve & Gamboa 1983, 1987).
Estudos com abelhas têm demonstrado que a substituição das dominantes por
cordata, Garófalo 1985; Euglossa fimbriata Augusto & Garófalo 2009; Evylaeus calceatus,
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 64
bicolor, Schwarz & O’Keefe 1991), ou quando há registro de substituição da dominante por
relação entre o status reprodutivo assumido nos ninhos, tamanho do corpo e desenvolvimento
subordinadas. Uma das explicações para esse fato é que invasoras maiores podem usurpar e
manter a residência nos ninhos por intimidação física (Smith & Weller 1989, Richards &
sinalização (Smith & Weller 1989) que a caracteriza como invasora ou usurpadora potencial
porcentagem que variou entre 60% a 94% das tentativas de invasão (Smith & Weller 1989,
Kaitala et al 1990).
residentes podem estar associadas à estratégia de ganho da dominante no cuidado da sua prole
devido aos riscos de morte das subordinadas durante o forrageamento (Ward & Kukuk 1998,
Field et al 1999), ou ainda, as fêmeas invasoras não apresentariam sinalização química como
interações não agressivas foram mais comuns do que as agressivas ou de dominância (Tabela
reprodutiva (West-Eberhard 1969, 1982a, b, 1986, Strassmann 1981, Dew 1983, Reeve &
Gamboa 1983, 1987, Hughes & Strassmann 1988, Reeve 1991, Röseler 1991, Augusto &
Garófalo, 2009, 2010). Uma explicação para esse comportamento pode ser a presença de
outra forma mais sutil ou química de controle reprodutivo das subordinadas, além da
depois do estabelecimento dos ninhos tornam-se cada vez mais raras, devido aos sinais
Não está claro, qual destas duas transições evolutivas, a inibição física ou à regulação
química do controle reprodutivo das operárias evoluiu primeiro (Kardile & Gadagkar 2003).
O que se sabe é que com a evolução dos feromônios, as rainhas já não apresentam altos níveis
até 36 h fora dos ninhos foram capazes de reconhecer as células com ovos das subordinadas,
e, como consequência, comer e substituir os ovos dessas fêmeas pelos seus. Isto indica que as
fêmeas são capazes de recuperar a dominância reprodutiva. Uma explicação para este
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 66
resultado é que células com ovos das subordinadas não teriam as pistas químicas deixadas
de rainhas tem sido demonstrada como explicação para ausência de policiamento do ovo da
rainha por operarias que policiam ovos de outras operárias (Ayasse et al 1999, Endler et al
e do abdômen das rainhas, e mostraram que de fato a rainha deixa pistas químicas nas células
fêmeas dominantes foram mantidas por mais de 36 h fora dos ninhos. É provável que este
resultado não tenha relação com a capacidade de discriminação das células neste intervalo de
tempo, mas sim com o fato das dominantes terem sido substituídas pelas subordinadas mais
desaparecimento) por subordinadas mais velhas foram observados em estudos feitos com
Euglossa cordata (Garófalo 1985), Eg. fimbriata (Augusto & Garófalo 2009), Eg. melanotricha
lineatulus (Eickwort 1986), Halictus rubicundus e Exoneura bicolor (Shwarz & O’keefe 2001).
fundar seus próprios ninhos. Os resultados indicaram também que a remoção das
2.4.3 Análise do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das fêmeas de acordo com o status
Fundadoras solitárias têm uma frequência de atividade de forrageamento quase três vezes
maior que subordinadas, porque elas coletam recurso para nidificação, enquanto as
células (Andrade-Silva & Nascimento 2012). Assim, como os alcanos são estruturalmente os
(Blomquist & Dillwith 1985, Gibbs 2002), espera-se que fêmeas fundadoras expostas a
maiores pressões ambientais tenham uma quantidade maior de n-alcanos sobre a cutícula. Tais
A maior parte dos compostos encontrados na análise do perfil cuticular das fêmeas de
Euglossa melanotricha também foi descrito em espécies de vespas (Polistes fuscatus: Espelie
al 2004, revisando por Monnin 2006, Green & Field 2011; Polistes gallicus: Dapporto et al
2007; Polistes satan: Tannure-Nascimento et al 2007, 2008; Vespa crabro: Butts et al 1995) e
Sramkova et al 2008, Rottler et al 2013). Para todas estas espécies, os compostos foram
A explicação para a proporção de alcanos em fundadoras, não pode ser aplicada para
analise comparativa entre fêmeas dominantes e subordinadas, porque as dominantes são mais
velhas e a concentração desses compostos pode estar relacionada tanto a idade quanto as
Bagnères 2010).
associados com a sinalização reprodutiva ou de dominância (Figura 10). A análise geral dos
grupos de compostos mostrou que a proporção entre alcanos e alcenos foi o fator principal
para discriminação entre dominantes e subordinadas (Tabela 5, Figura 11), semelhante ao que
foi encontrado em outros trabalhos com abelhas, formigas e vespas (revisado por Monnin
2006, revisado por Blomquist & Bagnères 2010, Green & Field 2011, Evison et al 2012).
contribuíram significativamente para variação (p < 0,04, Tabelas 5 e 6; Figura 12). Este
químicos forem honestos para sinalização do status social, semelhante ao que ocorre em
& Hölldobler 1990, Visscher & Dukas 1995, Ortius & Heinze 1999, revisado por Blomquist
perfil químico das fêmeas dominantes do que nas subordinadas (Tabela 5, Figura 12). Na
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 69
formiga Aphaenogaster cockerelli este alcano também foi o mais abundante no perfil químico
pentacosano demonstrou que em colônias órfãs quando operárias poedeiras foram tratadas
com doses extras desse composto em suas cutículas, suas companheiras de ninhos policiaram
intrusas (Smith et al 2009, 2011). Este resultado aponta que alterações na concentração do n-
companheiras de ninho.
dessas fêmeas do que nas fêmeas subordinadas (Tabela 5, Figura 12). Estes resultados
corroboram com estudos feitos com abelhas, formigas e vespas, os quais apontam essas
substâncias como sinais químicos individuais que carregam informações a respeito da casta,
fertilidade e dominância (D'Ettorre et al 2004, revisado por Howard & Blomquist 2005,
Nunes et al 2010, revisado por Blomquist & Bagnères 2010, Foitzik et al 2011)
operárias ou subordinadas na vespa Polistes dominulus (Sledge et al 2001, Green & Field
2011). Além disso, nas formigas ponerine Harpegnathos saltator, Streblognathus peetersi e
2011).
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 70
bioensaios para manipular o perfil cuticular das fêmeas. Fêmeas não reprodutivas receberam
doses do composto 9-nonacoseno C29 em suas cutículas e foram tratadas como reprodutivas
intrusas por suas companheiras de ninho. As reações agressivas contra as fêmeas manipuladas
antenação rápida, compunham a maioria das respostas ao 9-nonacoseno C29 (Smith 2012).
fêmeas manipuladas com o 9-nonacoseno C29 envolveram respostas submissas das fêmeas não
Ainda com relação aos hidrocarbonetos que contribuíram para diferir os perfis
sinais de fertilidade são supostamente para ajudar na resolução de conflitos dentro da colônia
2001).
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 71
estabelecimento de uma nova alfa ou gamergate. A condição de poedeira da nova alfa foi
primavera e o verão, quando a rainha põe muitos ovos, mas não difere no final do inverno,
período em que rainha mesmo inseminada, ainda não iniciou a postura dos ovos (Bonavita-
Cougourdan & Clément 1994, Biseau et al 2004). Isto mostra que os hidrocarbonetos
desta espécie são potencialmente capazes de reproduzir por partenogênese telítoca (produção
de fêmeas a partir de ovos não fertilizados), mas apenas uma normalmente a faz, e ela
quando grupos de operárias foram isoladas por 27 dias da fêmea poedeira, elas iniciaram a
postura dos ovos, mas continuaram a ter o perfil de hidrocarbonetos cuticulares típico de
fêmeas não poedeiras. No entanto, quando os grupos foram isolados por 47 dias, as fêmeas
ovariano do que com a classificação de hierarquia (Heinze et al 2002, revisado por Monnin
2006, Izzo et al 2010, Blomquist & Bagnères 2010). Contudo, estudos com Polistes
dominulus têm demonstrado que a relação entre o tamanho dos corpora allata (e, portanto, dos
cuticulares é complexo e varia dependendo do ambiente social (Tibbetts & Izzo 2009,
ninho (cerca de 20%, Andrade-Silva & Nascimento 2012). Desta forma, se a sinalização
química estiver relacionada ao status social das fêmeas, esta não será fator dependente da
fertilidade. Possivelmente, nesta espécie, a sinalização reprodutiva não está associada somente
(Peeters et al 1999, revisado por Blomquist & Bagnères 2010) e dessa forma, as interações até
‘pyriproxyfen’ (uma substância análoga ao hormônio juvenil) na gamergate não afetou sua
agressividade, mas diminuiu sua produção de ovos e acionou sua imobilização por operárias de
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 73
hierarquia inferior com consequente substituição por outra fêmea na escala hierárquica
mostram que a relação entre fertilidade, níveis hormonais e perfis de hidrocarbonetos cuticulares é
realmente complexa. O efeito hormonal pode variar de acordo com a condição social ou a
fisiologia do indivíduo, e pode haver atrasos entre mudanças nos títulos hormonais,
apenas indica que um indivíduo reproduz ou não, ele anuncia a sua capacidade e nível de
atividade reprodutiva. Com efeito, o perfil químico pode variar gradualmente a partir do perfil
sempre ideal, uma vez que não varia no mesmo ritmo. Isso não quer dizer que a correlação
seja fraca, ou que os hidrocarbonetos cuticulares não sejam uma reflexão honesta da
fertilidade. Ambos os fatores podem ser regidos pelos mesmos mecanismos subjacentes, mas
Em outros grupos animais, como nas aves, por exemplo, Gonzalez et al 2002
condição de ser dominante, funcionando assim como um ‘sinal avaliador’ de resistência pelas
companheiras a possíveis combates com intrusas. Agressão física é, portanto, essencial para o
sistema, pois é um ‘controle de qualidade’, que garante que a rainha torne evidente sua
fundadoras associadas não apresentam diferenças químicas entre seus perfis cuticulares
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 74
(Sledge et al 2001). Estes estudos sugerem ainda que devido a ausência de discriminação, a
competição entre as fêmeas é maior, e por esse motivo são mais frequentes interações
hierárquicas entre as fêmeas, surgindo três grupos distintos, as fundadoras ‘alfa’, fundadoras
dos ‘corpora allata’ e variações entre seus perfis cuticulares (Turillazzi et al 1982, Sledge et al
2004).
‘corpora allata’ (Dapporto et al 2007) e as diferenças de perfis entre os ovos e a cutícula das
fêmeas, enquanto as variações nos perfis foram inversamente relacionadas com diferenças de
subordinadas mesmo quando estas são removidas do ninho antes da postura das subordinadas,
dominulus podem colocar ovos a uma frequência correspondente a fertilidade inicial da fêmea
Cap. II – Regulação reprodutiva em “Euglossa melanotricha”: contexto social, fertilidade e sinalização química | 75
alfa, mas notavelmente seus perfis cuticulares não correspondem ao perfil das alfas. Os
autores mostraram então que a posição relativa dos indivíduos na hierarquia de dominância
sinalizador de fertilidade.
independente do sinal de fertilidade, perfil também encontrado em seus ovos. Este resultado
de fertilidade, e que este permite o domínio da produção de ovos por fêmeas dominantes
Keller & Nonacs (1993) afirmaram que a ausência da supressão ovariana entre as
das fêmeas dominantes. Assim, tanto o controle físico, quanto a sinalização química são
confiáveis indicadores da capacidade reprodutiva das fêmeas (vertebrados: Hrdy & Hrdy 1976
ambientais alteram a composição do perfil a curto prazo, a exemplo do que ocorre com as
fêmeas durante as interações sociais, mas não contribuem para a manutenção da diversidade
entre colônias, sendo este fenômeno uma resultante dos componentes genéticos que mantêm a
Os resultados das analises dos perfis cuticulares das fêmeas invasoras, dominantes
Estes resultados mostram que o efeito do ambiente social no perfil cuticular é particularmente
evolução dos sinais químicos de dominância em insetos sociais (Ayasse et al 2001, revisado
por Blomquist & Bagnères 2010). Assim como ocorre em abelhas do gênero Bombus, as
em Cameron 2004, Dressler 1982). Contudo, recentes estudos filogenéticos indicaram que a
eussocialidade evoluiu uma única vez em ancestrais comuns dos Apinae corbiculados, e foi
subsequentemente perdido nas abelhas euglossine (Cardinal & Danforth 2011, Canevazzi &
Noll 2014). Os resultados do presente estudo fornecem novos “insights”, e indicam que
Nos Hymenoptera sociais, a forte correlação entre perfil químico cuticular e o status
reprodutivo das fêmeas têm sido demonstrado (revisado em Liebig 2010). Contudo, neste
estudo foi demonstrado que esta relação em Euglossa melanotricha parece ser parcialmente
cuticulares são refletidos pelo status social, mas não resulta em supressão da atividade
dominância reprodutiva como foi demonstrado nos experimentos de remoção das fêmeas.
Esses aspectos sugerem que a organização de sociedades pequenas tais como em Euglossa
pode ser modulada por traços complexos como ocorre em insetos com socialidade avançada.
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CAPÍTULO III
Regulação reprodutiva e o parentesco em
Euglossa melanotricha: evidência para
seleção parental
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 89
3.1 Introdução
executa apresenta elevado parentesco com os indivíduos que recebem. Em outras palavras, a
são então capazes de avaliar os custos e benefícios da ajuda social e devem agir de modo a
maximizar seu ganho genético ou aptidão inclusiva. O parentesco (r) entre os indivíduos é
origem e evolução do comportamento social, bem como sua relação com o sistema
foram feitas em estudos com insetos cuja determinação do sexo é haplodiploide e o sistema de
Grafen 1990, Boomsma & Grafen 1991, Mueller 1991, Sundström 1994, Hughes et al 2008,
não fertilizados se desenvolvem em machos haplóides (Cook & Crozier 1995). Assumindo
(monoginia/monoandria), as fêmeas serão, em média, mais relacionadas com suas irmãs (r = 0,75)
do que com a sua própria prole (r = 0,5) (Figura 14). Além disso, o parentesco entre uma operária
e seu irmão é de apenas 0,25, ou seja, menor do que com suas irmãs. As operárias então serão
mais relacionadas com seus próprios filhos (r = 0,5), e com os filhos de outras operárias, seus
sobrinhos (r = 0,375), do que com seus irmãos (Figura 15). Essa assimetria de parentesco pode
resultar em conflitos sobre a alocação sexual (Ratnieks & Reeve 1992). Um desses conflitos é
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 90
sobre a produção de machos. As operárias podem aumentar a sua aptidão inclusiva cuidando dos
seus próprios filhos ou dos filhos das suas irmãs (Bourke 1988, Hamilton 1972), enquanto a
Figura 15. Genealogia de himenópteros sociais com uma rainha fecundada por um macho (sistema
monogínico/monoândrico). Os números ilustram o parentesco de uma operária com sua irmã (r =
0,75), seu irmão (r = 0,25), seu próprio filho (r = 0,5), e do seu filho com outra operária (r = 0,375).
Os indivíduos estão representados por meio de símbolos indicando o sexo (modificado de Heinze et al
2004).
relacionada com suas filhas e filhos e, portanto, é selecionada para produzir uma proporção
sexual de 1:1, as operárias irão se beneficiar da ajuda ‘altruísta’ somente se investirem mais
na produção de fêmeas, neste caso suas irmãs, do que em machos (Trivers & Hare 1976,
Heinze 2004). Elas podem então tentar aumentar a sua aptidão inclusiva através da
manipulação da proporção sexual em favor das fêmeas. Assim, o conflito potencial existe
todas as linhagens estudadas (Hughes et al 2008, Figura 16). Além disso, estes estudos
sugerem que a totipotência reprodutiva das operárias está associada com a monoandria, de
maneira que a seleção direcional para a perda da totipotência reprodutiva das operárias pode
ter sido reforçada pelo sistema haplodiplóide (Bourke & Franks 1995, Hughes et al 2008).
reprodutiva. Assim, poliandria parece ter evoluído depois que a evolução social alcançou um ponto
em que a reversão da eussocialidade se tornou improvável. Tais estudos indicam que o elevado
as predições da teoria da aptidão inclusiva (Hughes et al 2008, Boomsma 2009; Figura 16).
Sociedades animais são notáveis pela enorme variação que exibem em suas estratégias
sociais e reprodutivas. No nível mais básico, as estratégias que os indivíduos adotam dentro
das colônias podem variar. Alguns indivíduos deixam o ninho, ao passo que outros ali
outros renunciam ou retardam a sua reprodução (Sumner et al 2002, Buston 2004, Heg et al
2006 ); ou ainda, alguns ajudam, enquanto outros não (Field et al 2006, Cant 2012).
dos grupos sociais podem variar. Os grupos podem ter um ou poucos indivíduos que assumem
a dominância reprodutiva (alta assimetria), ou podem ser formados por indivíduos que
compartilham de forma igualitária a reprodução (baixa assimetria) (Emlen & Wrege 1992).
principalmente na aptidão indireta adquirida através da ajuda a parentes, uma vez que as
Polistes dominulus, uma vespa primitivamente social, Queller et al (2000) demonstraram que
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 92
sistema social é funcionalmente diferente de outros insetos sociais, mas semelhante a algumas
um território, razão pela qual a aptidão indireta não explica totalmente a vida em grupo
regulação social que envolve uma ou poucas fêmeas no monopólio reprodutivo do ninho,
embora todas ou a maioria delas sejam totipotentes, razão pela qual as subordinadas podem
parentesco para as fêmeas devem ser semelhantes aos de se tornar uma rainha
sistema social (Ratnieks & Reeve 1992, Buston 2003, Ratnieks et al 2006, Wong et al 2007).
A teoria da assimetria reprodutiva fornece uma explicação convincente de como e por que
os conflitos reprodutivos são resolvidos, sendo inclusive sugerida como uma teoria geral da
evolução social (Keller & Reeve 1994, Sherman et al 1995, Johnstone 2000, Seppä et al 2012).
guerra ou ‘tug-of-war’, usualmente têm sido sugeridos para explicar a assimetria reprodutiva
em vespas, abelhas e formigas (Field et al 1998, Hogendoorn & Velthuis 1999, Reeve et al
2000, Field & Cant 2009, Lucas et al 2011, Shen et al 2011, Seppä et al 2012).
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 93
Euglossa
Figura 16. Filogenia dos gêneros de Hymenoptera eusocial (formigas, abelhas e vespas) sugerida a
partir da análise da frequência de acasalamento. Os clados que exibem alta poliandria (> 2
acasalamentos) têm ramos sólidos vermelhos, enquanto os clados com baixa ou poliandria facultativa
(>1, mas < 2 acasalamentos) têm ramos pontilhados vermelhos; ao passo que, os clados que exibem
monoandria têm ramos sólidos pretos (Modificado de Hughes et al 2008).
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 94
dominante que tem controle completo sobre a reprodução (Vehrencamp 1983, Reeve &
Ratnieks 1993). Esta fêmea tem a opção de conceder parte da reprodução a outra fêmea em
subordinada pode então decidir entre aceitar a oferta da dominante e permanecer no grupo ou
sair e fundar seu próprio ninho. Este processo de decisão sequencial do modelo de concessão
tem sido largamente reconhecido e foi claramente descrito como mecanismo para resolução
de conflitos dentro da teoria dos jogos em biologia reprodutiva (Maynard Smith 1982, Reeve
produtividade solitária das subordinadas que ficam para ajudar. A subordinada garante maior
sucesso da reprodução solitária das subordinadas são elevadas, a dominante tem que conceder
limitado sobre a reprodução e devem alocar mais esforços para aumentar as suas próprias
cotas e contribuir para produção total do grupo. A principal previsão do modelo é que a
competição pela reprodução ocorre ao custo da produtividade total do grupo (Reeve & Shen
2013).
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 95
benefícios do grupo social contra o sucesso da nidificação solitária (Tabela 10) (Field et al
Tabela 10. Associação prevista entre as variáveis de acordo com os diferentes modelos de assimetria
reprodutiva
Modelo de
Associação entre as variáveis Modelo de Concessão
Cabo-de-guerra
Assimetria reprodutiva vs parentesco (r) entre fêmeas adultas + Nenhum ou -
Assimetria reprodutiva vs agressão + Nenhum ou -
Assimetria reprodutiva vs policiamento do ovo + Nenhum ou -
Assimetria reprodutiva vs o sucesso da nidificação solitária (Subordinada) - Nenhum
Assimetria reprodutiva vs os benefícios da nidificação em grupo + Nenhum
Parentesco vs produtividade total do grupo Nenhum +
+ = correlação positiva; - = correlação negativa; vs = versus Fonte: Field et al 1998, Reeve & Shen 2013
e, com isso, inferir relações de parentesco (Yagi & Hasegawa 2012). Os microssatélites foram
introduzidos em analises de parentesco por Queller (1992) e são considerados ideais para esse
tipo de análise devido ao seu alto grau de polimorfismo, o que resulta em uma grande
quantidade de alelos por loco, diminuindo as chances de dois indivíduos não relacionados
compartilharem esses alelos (Webster & Reichart 2005). Além disso, por serem marcadores
al 2004, Bolton et al 2006, Field & Cant 2009), bem como no sucesso reprodutivo de cada
foram desenhados especificamente para Eulaema nigrita e outros treze para Euglossa
cordata.
cordata (Souza et al 2007) foram polimórficos para Eg. imperialis, Eg. viridissima, Eg.
hemichlora e Eg. “2dentada”. Nas três últimas espécies, os loci microssatélites foram
et al 2009). Os resultados desse estudo mostraram que os ninhos dessas espécies foram
gênero, sete dos oito loci amplificaram em El. cingulata, El. bombiformis, El. chocoana, El.
de Euglossini. Assim, primers desenhados para Euglossa cordata e Eg. annectans (Souza et al
2007, Paxton et al 2009) podem ser utilizados para as análises parentais em Eg. melanotricha.
Marcadores microssatélites tem sido empregados para testar as predições dos modelos
Seppä et al 2002; P. aurifer , Liebert et al 2005a); P. dominulus, Liebert & Starks 2006),
dos estudos com formigas da família Fomicidae (Leptothorax rugatulus, Rüppell et al 2002 e
entre dominante e subordinada, a relação entre tamanho corporal das fêmeas e a contribuição
dela, depende de fatores tais como, os mecanismos de determinação do sexo (por exemplo,
reprodutivas e seu parentesco, e a relativa contribuição de cada fêmea para produção da prole
(monogínico/monoândrico) (Field & Foster 1999, Langer et al 2004, Field & Cant 2009).
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 98
fundação de ninho é solitária, com famílias formadas por fêmeas que nidificam de forma
independente nas fundações e famílias formadas por associações de fêmeas nas reutilizações
2012), o que significa que todas as fêmeas são potencialmente capazes de reproduzir, evitando
assim o problema de ter que distinguir entre a assimetria para a prole reprodutiva e não
reprodutiva (Reeve & Ratnieks 1993). Terceiro, uma elevada proporção de famílias (cerca de
80%, Andrade-Silva & Nascimento 2012) contém pelo menos duas fêmeas reprodutivas,
sendo o tipo de modelo onde testes de assimetrias reprodutivas com outros táxons têm sido
gerações e a comutação de fêmeas entre os ninhos, o parentesco (r) entre famílias é variável.
viridissima e Euglossa“2dentada” mostraram que os ninhos foram fundados por uma fêmea
fecundada por um único macho (Zimmermann et al 2009). Assim, se essa condição for
monoândrico e monogínico.
Neste estudo, foram investigados se os mecanismos que regulam a estrutura social nas
desses mecanismos, o parentesco genético entre as fêmeas adultas nas famílias de Euglossa
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 99
melanotricha foi determinado; e variáveis preditas pelos modelos de assimetria que envolve
correlacionadas com o parentesco (r). A previsão do estudo é que famílias pequenas fundadas
por uma única fêmea que tenha acasalado apenas uma vez (monoginia/monoandria), mas que
são mantidas por sucessivas gerações pela associação entre fêmeas totipotentes, apresentem
3.2 Objetivos
melanotricha são determinantes para organização social da espécie. Uma das formas de testar
estas predições constitui um dos objetivos específicos deste estudo que foi testar se há
associadas.
o parentesco?
fundadora e sua prole), e as famílias dos processos de reutilização de ninhos (FR = fêmeas
ninho (R) é iniciado quando pelo menos duas fêmeas da mesma ou de diferentes gerações
reutilizam os ninhos, ou ainda, quando novas associações são formadas por fêmeas invasoras
realizados no capítulo 2 desta tese, foram analisados o parentesco genético das famílias das
de ninhos (n= 30 famílias). Em cada família, os pares de fêmeas adultas foram coletados após
o período de nidificação - fase de inatividade dessas fêmeas nos ninhos (ver descrição em
Materiais e Métodos no capítulo 2 desta tese) e a prole dessas fêmeas (machos e fêmeas)
foram coletadas ao emergir. Em casos raros, amostras de imaturos foram analisadas quando
e fêmeas recém emergidos, imaturos e fêmeas adultas. Ao todo foram coletados 425
residentes) que foram submetidas ao banho em hexano para análise do perfil químico foram
submetidas a três repetidas lavagens em álcool absoluto para remoção do hexano. As pernas
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 101
medianas do lado direito dessas fêmeas e de toda a prole coletada, incluindo machos e fêmeas
a 4ºC. O restante do material corporal foi armazenado em frascos com álcool absoluto nas
das interações de dominância e canibalismo dos ovos (Tabela 2; Capítulo 2 desta tese), foram
das interações e canibalismo dos ovos foram somadas, e as proporções calculadas para cada
par de fêmeas.
O DNA total foi extraído a partir da maceração das pernas do lado direito dos
cada tubo. A mistura foi incubada por 30 minutos a 56o C, vortexada por dez segundos,
fervida por cinco minutos e novamente vortexada, de acordo com o protocolo de Walsh et al
(1991). Os tubos foram centrifugados por três minutos a 14000 rpm. A fração sobrenadante
foi retirada para a utilização na reação de PCR e transferida para tubos autoclavados. Os tubos
Tabela 11. Número de amostras analisadas nas famílias de fundações (F) e reativações de ninhos (FR)
de Euglossa melanotricha.
Indivíduos
Ninhos
Recém-emergidos e imaturos
Famílias Fêmeas adultas
Machos Fêmeas Total
N1F 3 4 1 8
N2F 3 5 1 9
N3F 4 5 1 10
N4F 2 4 1 7
Fundações N5F 5 6 1 12
N6F 3 4 1 8
N7F 4 6 1 11
N8F 4 5 1 10
N9F 3 5 1 9
N10F 4 5 1 10
N11F 3 3 1 7
N12F 2 3 1 6
N1FR1 5 7 2 14
N1FR2 4 3 2 9
N2FR1 4 5 2 11
N2FR2 4 4 2 10
N2FR3 4 3 2 9
N3FR1 3 4 2 9
N4FR1 4 5 2 11
N5FR1 5 3 2 10
N6FR1 3 2 2 7
N6FR2 4 4 2 10
Reutilizações N6FR3 3 3 2 8
N6FR4 5 6 2 13
N7FR1 4 3 2 9
N7FR2 3 4 2 9
N7FR3 5 7 2 14
N8FR1 3 5 2 10
N8FR2 3 4 2 9
N9FR1 3 5 2 10
N9FR2 4 4 2 10
N10FR1 5 8 2 15
N10FR2 4 8 2 14
N10FR3 6 6 2 14
Continuação...
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 103
Tabela 11. Número de amostras analisadas nas famílias de fundações (F) e reativações de
ninhos (FR) de Euglossa melanotricha.
Indivíduos
Machos Fêmeas
Total
N10FR4 4 5 2 11
N11FR2 4 4 2 10
N11FR3 5 4 2 11
Reativações N12FR2 3 4 2 9
N12FR3 4 4 2 10
N13FR2 4 5 2 11
N14FR2 3 4 2 9
N14FR3 4 6 2 12
Total Geral 159 194 72 425
sete originalmente descritos para Euglossa cordata (Egc 17, Egc 18, Egc 24, Egc 26, Egc 35,
Egc 37, Egc 51; Souza et al 2007), e quatro desenhados para Euglossa annectans (Ann 03,
Ann 04, Ann 24 e Ann 37; Paxton et al 2009). As reações de PCR foram realizadas com
125µM de cada dNTP, 1,75mM de MgCl2, 1µL de tampão Invitrogen 10X, 1U de Platinum
Taq DNA polimerase (Invitrogen), 0,53µM de cada primer, 1µL de DNA extraído e água para
temperatura de hibridização específica para cada loco por Souza et al (2007) e Paxton et al
(2009) (Tabela 12), e um minuto a 72°C (extensão). A reação foi finalizada com um passo de
extensão a 70°C por 30 minutos. Após as amplificações, os produtos da PCR foram diluídos
Tabela 12. Microssatélites utilizados, sequências e temperaturas de hidridação (TH) dos primers e
suas referências. F: forward; R: reverse.
F: AGAGGAGGGTCCAGGAAAGA
Egc 17 54 Souza et al 2007
R: ACCAGGCGTTCTCATCAAGT
F: TGATACAGGTCGGCGTAAAA
Egc 18 58 Souza et al 2007
R: GGTAACTCCGTCGCGAACTA
F: AGGAGAACCGAACAGCGATA
Egc 24 56 Souza et al 2007
R: CCGAGCTTTTTCTTCCCTCT
F: GCCGAACAAACATCTCGTCT
Egc 26 56 Souza et al 2007
R: CGGAACTTTGATATCGTCGAG
F: GATCACGAAACGGTGTAAAGTC
Egc 35 54 Souza et al 2007
R: CTTTCTTCGGATTCGGACTG
F: ATCCTCCTCTTCGTGGTCCT
Egc 37 56 Souza et al 2007
R: GGCAAAACTTCCGCTTGATA
F: GGAATGGGATTCATTCAGCA
Egc 51 54 Souza et al 2007
R: CGAAAGGTCGACAAACCAAT
F: GATCAGGAATCCCCAAAACG
Ann03 60 Paxton et al 2009
R: CATAATCGTGCAACGTTCCTT
F: CGCGCCCATTCTATTTACAG
Ann04 54 Paxton et al 2009
R: GCGCTATCTCCGAATCATTG
F: GTCGGACATTAGGGTGATGG
Ann24 56 Paxton et al 2009
R: TCCGTTTGAATCTGTGGTCTC
F: CGTTCGAAGGAGAGAACGAC
Ann37 56 Paxton et al 2009
R: CGGGATACAGGAAAGGAGAG
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 105
amplificação bem sucedida dos machos amostrados e a ausência de machos diplóides tornou
Para testar se ocorreram desequilíbrios de ligação entre pares de loci analisados nas
famílias de Euglossa melanotricha, foi utilizado o programa Genepop (Raymond & Rousset
vez que o programa não permite uma análise conjunta de dados haplóides e diplóides. Para
este teste, foi aplicado ao valor crítico P, a correção de Benjamini & Yekutieli (2001).
Segundo Narum (2006), este teste pondera melhor os erros do tipo I (rejeitar a hipótese nula
sendo ela verdadeira - aceitar uma diferença que não existe) e do tipo II (não rejeitar a
hipótese nula sendo ela falsa - não reconhecer uma diferença quando ela existe); quando
comparado com a correção de Bonferroni, cujo valor crítico se aproxima rapidamente de zero,
A análise da diversidade alélica foi feita por loco através de um pacote padrão de
análises descritivas usando o programa ‘Microsatellite Analyzer (MSA) 4.05’ (Dieringer &
Schlotterer 2003). Este programa fornece a opção da análise conjunta de dados haplóides e
diplóides. Todos os machos foram incluídos na análise, e para evitar pseudoreplicação, uma
fêmea de cada família, ou seja, fêmeas teoricamente não relacionadas foram inseridas, exceto
nas famílias com mais de uma fêmea não relacionada, especialmente nos casos de invasões,
Inicialmente, um teste de atribuição das fêmeas reprodutivas como mães da sua prole
foi feito através da inspeção visual da segregação mendeliana dos genótipos nas famílias de
fundações (n= 12); todas as filhas atribuídas a uma mãe tinham que carregar um único alelo
materno em cada loco, e todos os filhos um dos dois alelos da mãe em cada loco. Sob
monoandria, toda a prole de fêmeas de uma mesma mãe deve ter o mesmo alelo paterno em
cada loco. A atribuição a partir da inspeção visual foi facilitada pelo sistema haplodiplóide de
determinação sexual, dado que a partir do alelo comum as filhas ou “irmãs completas” foi
Para dar suporte a determinação do pedigree baseado na inspeção visual dos genótipos
foi utilizado o programa Kinship 1.3.1 (Goodnight & Queller 1999), (http://www.gsoftnet.
hipótese nula de que eram meio-irmãs (r = 0,25, como esperado para mais de um
acasalamento da mãe) em favor da hipótese alternativa de que elas eram irmãs completas (r =
0,75, como esperado para um único acasalamento). As comparações foram feitas aos pares
com 1.000 simulações entre elas. Com a função de parentesco do Kinship 1.3.1 foi feito o
cálculo de parentesco (r) entre todas as fêmeas para gerar o valor médio de parentesco entre
estimado a partir dos dados genotípicos usando o programa Relatedness 5.0.8 (Goodnight &
foram estimados pelo método Jackknifing sobre loci (para o parentesco dentro das famílias).
A razão sexual da prole foi calculada pela divisão do número de fêmeas pelo total de
conflitos potenciais, a razão sexual foi determinada pela proporção de machos que emergiram
O grau de assimetria reprodutiva foi calculado com base no índice B de Nonacs (2000)
usando o programa ‘Skew Calculator 2003’ (Nonacs 2003). Este índice corrige variações em
grupos de diferentes tamanhos e ajusta o intervalo de tempo das interações, de modo que a
desaparecimento de um indivíduo. Este índice indica valor zero para distribuição randômica
negativos baixa assimetria com relação ao que se espera ao acaso (Nonacs 2000). A avaliação
da assimetria reprodutiva foi sobre a produção total da prole devido ao pequeno tamanho das
Euglossa melanotricha a partir da análise das seguintes variáveis associadas com assimetria:
foi de 5% e as análises foram feitas no programa Statistica 6.0. Para alguns dados, os valores
3.4 Resultados
Para análise da variação alélica dos loci, toda a prole de machos das famílias de
Euglossa melanotricha (n = 159) foi genotipada. Esses dados foram agrupados com os
genótipos de um conjunto de fêmeas não relacionadas. Tal conjunto foi formado por uma
fêmea de cada família de fundações (n=12 fêmeas) e de reativações sem invasões (n=18
fêmeas); e por duas fêmeas de cada família das reativações com invasões (n = 24 fêmeas),
número de alelos únicos por loco e pela elevada heterozigosidade esperada (He) (Tabela 13).
genotipagem ou erro de detecção (dp) foi muito baixa. Além disso, os loci não estavam em
desequilíbrio de ligação (p > 0,01 para todas as 54 comparações entre pares ou ‘pairwise’,
aplicando a correção de Benjamini & Yekutieli, 2001), e não exibiram desvio significativo de
Em cada uma das famílias de fundações analisadas (n = 12), uma única fêmea adulta
fecundada por um único macho foi claramente identificada como mãe de toda a prole, tanto
pela inspeção visual quanto pela análise do parentesco (r) (Anexos de I a XXII; Tabela 14).
parentesco entre os pares de fêmeas adultas (Tabela 14). A análise não foi feita a partir do
parentesco de cada fêmea adulta com sua prole porque em 12 famílias de reativações (40%, n
= 30), uma das fêmeas produziu somente machos dificultando a análise do parentesco a partir
Tabela 13. Diversidade alélica para as famílias de Euglossa melanotricha, com o número de machos e
fêmeas genotipados por loco.
Nº de indivíduos
genotipados Heterozigosidade Tamanho médio Alelos Variação da
Loci
esperada (He) dos alelos (pb) observados frequência alélica
Machos Fêmeas
Nas famílias de reativações, com exceção dos casos em que ocorrem invasões
(N9/FR2, N10/FR1, N10/FR2, N10/FR3, N10/FR4, N11/FR2, N11/FR3, N12/FR2, N12/FR3, N13/FR2,
N14/FR2, N14/FR3), todas as fêmeas adultas de uma mesma família tinham genótipos
possível atribuir em 19 famílias (63%, n = 30), o genótipo dos pais a partir da comparação dos
genótipos de irmãs completas produzidas por cada fêmea adulta (Ver Anexos I-XLII).
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 111
Tabela 14. Parentesco entre as fêmeas de Euglossa melanotricha nas relações entre mãe e filhas e
entre irmãs completas nas famílias de fundações (n = 12 ninhos)
Parentesco genético entre mãe e filhas Parentesco genético entre irmãs completas
Prole
Comparações
Prole de Nível de Média de r Nível de Média de r de
'pairwise'
fêmeas significância ± DP significância ± DP machos
entre filhas
3.4.3 Proporção sexual da prole e o parentesco entre as fêmeas adultas nas famílias de
Euglossa melanotricha
sendo os grupos formados pelos pares de fêmeas adultas e sua prole (Tabela 16).
34 fêmeas para 25 machos (78%, n = 70 indivíduos), ou 1,36: 1 numa razão de 0,44 machos,
2
o que não diferiu de 1:1 ( (1) = 0,02, p > 0,05). E a proporção da prole que emergiu dos ovos
das subordinadas foi de 2 fêmeas para 9 machos (22%, n = 70 indivíduos), ou 0,22: 1, numa
2
razão de 0,78 machos, o que diferiu de 1:1 ( (1)= 0,21, p < 0,05; Tabela 16, Figura 18).
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 112
Tabela 15. Estimativas de parentesco (r) entre categorias de fêmeas adultas em cada família de
reativação de Euglossa melanotricha (n = 30 famílias).
Com exceção das famílias com invasões, todas as fêmeas em uma família tiveram genótipos consistentes com o parentesco
mãe-filha ou irmãs-completas. Os genótipos da prole de fêmeas e machos foram usados para gerar o sumário do
parentesco par a par por família. Contudo, somente o resultado entre os pares de fêmeas reprodutivas foi considerado
nesta análise.
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 113
Nas famílias do grupo 2 (mãe e filha), a proporção da prole para dominantes foi de 36
fêmeas para 19 machos (72%, n = 76 indivíduos), ou 1,89: 1 numa razão de 0,65 para fêmeas,
2
o que diferiu de 1:1 ( (1) = 0,85, p < 0,05), enquanto para as subordinadas a proporção foi de
5 fêmeas para 16 machos (28%, n = 76 indivíduos), ou 0,31: 1, numa razão de 0,72 machos, o
2
que também diferiu de 1:1 ( (1)= 0,38, p < 0,05; Tabela 16, Figura 18).
invasoras dominantes foi de 32 fêmeas para 23 machos (53%, n = 112 indivíduos), ou 1,39: 1
numa razão de 0,42 machos, o que não diferiu de 1:1 (χ2(1) = 0,71, p >0,05). Enquanto a
proporção da prole atribuída as dominantes residentes foi de 30 fêmeas para 27 machos (47%,
n = 112 indivíduos), ou 1,11: 1, numa razão de 0,53 machos, não diferindo também de 1:1 (χ2
diferentes grupos parentais mostrou correlação positiva entre a razão para produção de
machos e o parentesco (r) das fêmeas adultas (Spearman: r = 0, 417, p = 0, 021; Figura 17). A
razão sexo assimétrica para machos atribuídos as fêmeas subordinadas aumenta com o
Adicionalmente, quando a análise foi feita por família considerando a produção total
das fêmeas adultas (dominantes e subordinadas), a proporção sexual não diferiu de 1:1. Nas
famílias do grupo 1 (irmãs), a proporção foi de 34 machos para 36 fêmeas, numa razão de
0,51 fêmeas, ou 1:1 (χ2(1) = 0,13, p > 0,05); nas famílias do grupo 2 (mãe-filha), a proporção
foi de 34 machos para 42 fêmeas, numa razão de 0,55 fêmeas, também não diferindo de 1:1
(χ2(1) = 0,02 p > 0,05); e da mesma maneira, nas famílias do grupo 3 (não aparentadas) a
proporção foi de 50 machos para 62 fêmeas, numa razão de 0,55 fêmeas, não diferindo de 1:1
variável. Os valores medidos pelo índice de assimetria B (Nonacs 2003) variaram entre –
0,062 e 0,400 (média = 0,051, p = 0,002, n = 30; Anexo XLIII). A assimetria reprodutiva
foi de 0,15 ± 0,02 e no grupo mãe-filha foi 0,07 ± 0,03, enquanto em residente-invasora foi de
0,04 ± 0,02 (irmãs vs residente-invasora, teste t = 8,27, p < 0,001; mãe-filha vs residente-
A média de parentesco entre fêmeas adultas foi de r ± desvio padrão = 0,79 ± 0,02
para as famílias de irmãs; 0,54 ± 0,02 para famílias de mãe-filha; e de -0,10 ± 0,01 para as
parentesco (r) (Spearman: r = 0,7193, p < 0,0001; Figura 19a). A correlação também foi positiva
quando foram relacionados os índices de assimetria reprodutiva (B) das fêmeas adultas pela
frequência de ovos policiados pelas fêmeas dominantes (Tabela 17) (Spearman: r = 0,8432, p <
0,0001; Figura 19b). Outra variável testada foi a proporção de interações agressivas exibida pelas
fêmeas dominantes. O número total de interações agressivas foi de 1424 (36%, n = 3965), com
uma média ± desvio padrão de 47,5 ± 13,04 interações por família (Tabela 2; Capítulo 2). O
resultado mostrou que a assimetria reprodutiva (B) foi positivamente correlacionada com a
Tabela 16. Número total da prole e a proporção de machos produzidos por cada fêmea reprodutiva nas
famílias de reutilização de ninhos de Euglossa melanotricha, agrupadas de acordo com o parentesco.
Grupo 1: Irmãs
Dominante Subordinada
Ninhos/Família
Proporção sexual Proporção sexual
Machos Fêmeas Machos Fêmeas
(machos) (machos)
1.2
1.0
0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Parentesco (r) entre fêmeas adultas
Figura 17. Correlação entre a proporção de machos produzidos pelas fêmeas subordinadas e o
parentesco (r) entre as fêmeas adultas nas famílias de reativações de Euglossa melanotricha (n = 30).
r = 0,79 r = 0,54
Dominante
Dominant Subordinada
Subordinate Dominante Subordinada
Dominant Subordinate
22% 28%
Não relacionadas
r = -0,10
Dominante
Dominant Invasora
Invader
47%
53%
36%
47%
64% Fêmeas 53%
Machos
A variação no parentesco não afetou a produtividade total das famílias: fêmeas adultas
aparentadas (irmãs: 7,7 ± 0,68 indivíduos produzidos, n = 9 famílias, mãe-filha: 8,44 ± 0,60
indivíduos produzidos, n = 9; Tabela 16) não foram significativamente mais produtivas (irmãs
vs não aparentadas: teste t = - 1,73, p = 0,53; mãe-filha vs não aparentadas: teste t = -1,03, p =
0,27) do que duas fêmeas não aparentadas (residente-invasora: 9,33 ± 0,67 indivíduos
produzidos, n = 12). A produtividade total então não foi correlacionada com a assimetria
0.3
Assimetria reprodutiva (B)
0.2
0.1
0.0
-0.1
-0.2
b) 0.5
0.4
Assimetria reprodutiva (B)
0.3
0.2
0.1
-0.1
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
c) 0.5
0.4
Assimetria reprodutiva (B)
0.3
0.2
0.1
0.0
-0.1
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Figura 19. a) Correlação entre assimetria reprodutiva (B) e o parentesco (r) das fêmeas adultas nas
famílias de reativações de Euglossa melanotricha (n = 30). b) Correlação entre a assimetria
reprodutiva (B) e a frequência de policiamento dos ovos feito pelas fêmeas dominantes. c) Correlação
entre assimetria reprodutiva (B) e a frequência de interações agressivas realizadas pelas fêmeas
dominantes. Cada símbolo representa uma família.
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 119
Tabela 17. Número de oviposições feitas pelas subordinadas e a frequência de ovos comidos pelas
dominantes em cada família de Euglossa melanotricha agrupadas de acordo com o parentesco.
3.5 Discussão
na análise, sendo possível determinar com precisão a produção total das famílias e a razão
sexual da prole. Além disso, foi possível corrigir erros de aferição das observações
usurpação de ninhos por fêmeas invasoras (Queller et al 2000, Zanette & Field 2008) .
registro de imagens (vídeo transmissão), combinadas com o parentesco, foram fundamentais para
o conhecimento das variáveis que influenciaram na estrutura social, bem como nas respostas a
estas variáveis. Sumner et al (2007) em estudos com a vespa Polistes canadensis também
pedigree. Estes autores usaram equipamentos de rádio transmissão nas fêmeas para combinar
semelhante foi demonstrado em estudos sobre as estimativas de acasalamento nas espécies Euglossa
pode ser comum ao gênero e possivelmente para as abelhas euglossine (Tribo Euglossini.
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 121
estudo. Assim, embora a relação filogenética exata para abelhas corbiculadas ainda seja
confirma a previsão de que acasalamento único foi a condição ancestral em todos os táxons
seu incentivo para cooperar (Cole 1983, Boomsma 2007). Isto é sugerido porque os
indivíduos não reprodutivos podem ganhar maior aptidão inclusiva ajudando a parentes
genética das famílias de vários modos. Essa condição, conforme previsto pela teoria da
seleção parental, contribui para elevar o parentesco nas famílias, o que é particularmente
interessante quando se tem mais de uma fêmea adulta numa relação de dominância e
subordinação.
melanotricha
subordinadas mostrou que apenas no grupo mãe-filha a produção das dominantes foi em favor
de fêmeas (1,89: 1), numa razão de 0,65; enquanto no grupo de irmãs e fêmeas não
aparentadas a proporção não diferiu de 1:1 (Tabela 16). Essa assimetria da razão sexual nas
famílias do grupo mãe-filha pode está relacionada com a frequência de parasitas de ninho.
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 122
Nas famílias desse grupo, 15 células foram parasitadas por Anthrax oedipus (Diptera,
nos grupo irmãs e mãe-filha a proporção sexual numérica diferiu de 1:1, numa razão de 0,78
machos no grupo de irmãs; 0,72 machos no grupo mãe-filha, ao passo que no grupo de
fêmeas não aparentadas a razão foi de 0,53 machos, não diferindo de 1:1. Esse resultado está
considerando que as subordinadas são mais relacionadas com seus filhos (r = 0,5) do que com
os filhos de suas irmãs, seus sobrinhos (r = 0, 375) e com os filhos da sua mãe, seus irmãos (r
sexual nas famílias do grupo de fêmeas não relacionadas. Nestas condições, na ausência do
elevado parentesco (r) que constitui a garantia do ganho genético indireto, as subordinadas
podem ter incentivos extras sobre a reprodução para permanecerem no ninho, além do
Em todo caso, quando a análise foi feita a partir da produção total das famílias, a razão
foi de 0,55 fêmeas, não diferindo de 1:1. Segundo Trivers & Hare (1976), a previsão para
espécies com único acasalamento onde as subordinadas não se reproduzem, mas são capazes
assimetria sexual em favor de três fêmeas para cada macho produzido (3:1).
Alternativamente, assim como ocorre nas famílias de Euglossa melanotricha, se o controle for
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 123
exclusivamente da rainha ou dominante, a razão sexual esperada é de 0,5, assim como para a
A ocorrência de Anthax oedipus, uma espécie de mosca parasitóide de larva, têm sido bem
documentada, principalmente em ninhos das abelhas do gênero Centris (Aguiar & Garófalo
2006), Tetrapedia (Gazola & Garófalo 2009) e Euglossa (Augusto & Garófalo, 2004, 2010,
Andrade-Silva & Nascimento 2012). A fêmea deposita seus ovos na célula ainda na fase de
de parasitismo sobre a razão sexual da prole do hospedeiro ainda são escassos, contudo, estudos
com a abelha Calliopsis pugionis mostrou que a razão sexual de colônias parasitadas foi
A espécie de vespa parasita Aximopsis masneri foi recentemente descrita por Gates
(2009) associada a ninhos de Euglossa variabilis e Euglossa cybelia . A fêmea deposita seus
ovos em células recém operculadas fazendo um pequeno furo lateral. Em média, 30 ovos são
depositados por célula. Apesar da ausência de relatos na literatura sobre a preferência sexo-
ninhos (Augusto & Garófalo, 2004, 2010). Contudo, neste estudo, a combinação dos dados
entre 22% (16, n = 70 indivíduos) nas famílias de irmãs, 28% (21, n = 76) nas famílias de
mãe-filha, e 53% (55, n = 112) nas famílias de fêmeas não aparentadas (Tabela 16, Figura
Tais resultados estão de acordo com as predições dos modelos de concessão, dado que
embora a dominante tenha controle sobre a reprodução, concessões podem ser feitas a outra
fêmea em troca da sua cooperação (Vehrencamp 1983, Reeve 1991). Essas concessões variam
de acordo com o parentesco (r), de maneira que as fêmeas concedem menos as subordinadas
aparentadas do que as não aparentadas (Figura 18). Assim, o elevado parentesco reduz o
ganho genético indireto ao cooperar com parentes (Monnin & Peeters 1997). De maneira
inversa, concessões maiores sobre a reprodução direta devem ser dadas a subordinadas não
aparentadas como incentivo para permanecerem, além do incentivo ao ganho direto pela
Até o momento, poucos estudos com insetos sociais demonstraram correlação positiva
entre assimetria reprodutiva e parentesco. Os estudos foram feitos com as vespas Polistes
formigas Leptothorax rugatulus (Rüppell et al 2002) e Formica fusca (Hannonen & Sundström
vespa Polistes bellicosus (Field et al 1998), onde o parentesco foi correlacionado com a proporção
de guerra (tug-of-war). O estudo com Exoneura nigrescens foi o primeiro a ter sucesso em
Outros estudos não encontraram relação entre parentesco e assimetria reprodutiva. Por
exemplo, nas formigas: Myrmica tahoensis: Evans 1996; Pachycondyla inversa: Heinze et al
2002; Polistes aurifer: Liebert et al 2005; Polistes dominulus: Liebert & Starks 2006, Polistes
estes resultados devem ser discutidos com cautela. A maioria desses estudos demonstrou
pouca variação do parentesco e/ou assimetria, razão pela qual é possível inferir que a ausência
de correlação com parentesco pode ter sido associada ao baixo poder estatístico dos testes.
foram testadas. Os resultados mostraram significativa correlação positiva entre essas variáveis
Reeve (1991) e Reeve & Ratnieks (1993) sugeriram que quando a partilha sobre a
para ‘testar’ a dominante e tentar ganhar mais usurpando a sua posição. Assim é esperado que
o conflito seja resolvido a partir de mecanismos tais como o canibalismo do ovo e interações
aumento dos custos da reprodução de outras fêmeas, aumentando, por exemplo, a pressão
sobre a realização de outras tarefas, como o forrageamento, ou ainda, constituir uma ameaça
constante de despejo quando as fêmeas tentam produzir (Cant & Young 2013).
dominante reprodutiva (Nakata & Tsuji 1996, Monnin et al 2002). Nestes casos, tanto o
parentesco quanto a coerção podem resolver o conflito entre fêmeas totipotentes. Contudo,
embora esses fatores possam ajudar a resolver o conflito, o efeito é limitado porque mesmo
com altas taxas de parentesco, algumas operárias participam da produção do ninho. A prova
de que a relação de parentesco pode aumentar a produção das operárias foi demonstrado em
Bombus terrestris e B. occidentalis, em que operárias invasoras com fêmeas não aparentadas
formigas órfãs de Dinoponera quadríceps, por exemplo, testes com base no modelo de
aptidão inclusiva previam que cerca de cinco operárias participassem de uma hierarquia de
dominância se elas fossem sobrinhas (r = 0,375), mas apenas quatro deviam fazê-lo se fossem
Resolução de conflitos mais eficaz ocorre se os indivíduos podem ser coagidos para
não procriar. Tal coerção pode assumir várias formas. Em D. quadríceps , as operárias podem
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 127
não ser impedidas de participar de uma hierarquia de dominância, mas, se uma operária beta
desafia a alfa e tenta assumir a sua posição na colônia, essa substituição é impedida com
punição (Nakata & Tsuji 1996). A alfa sinaliza com pistas químicas e induz as operárias de
desafiadora.
& Reeve 1992). As operárias dessa espécie têm um par de apêndices torácicos ou gemas que
de algum modo são necessários para o acasalamento. No entanto, a menos que seja necessário
famílias, mãe-filha = 8,44± 0,60, n= 9, e não aparentadas: 9,33 ± 0,67, n = 12. Assim, esta
porque as fêmeas não alocam energia para competição reprodutiva. Sendo o controle feito por
uma única fêmea, a produção é independente do parentesco entre as fêmeas adultas (Reeve &
Shen 2013).
predições dos modelos de concessão (Tabela 18), em que uma dominante tem controle sobre a
Tabela 18. Associação observada e prevista entre as variáveis de acordo com os diferentes modelos de
assimetria reprodutiva
competição como prevista pelo modelo de cabo de guerra. Este modelo prevê que as
podem levar a uma diminuição na assimetria reprodutiva. Neste modelo, a luta é assumida
como sendo o meio pelo qual as subordinadas obtêm a sua reprodução: aquelas que não lutam
comportamental dos insetos e sua capacidade de modular seu nível de esforço reprodutivo de
acordo com atributos sociais, tais como a relação dos outros membros do grupo.
espécie de abelha euglossine. E ainda, fornece evidências a rara situação de correlação positiva
entre assimetria reprodutiva e parentesco previsto pelos modelos de concessão. Tais modelos têm
formado a base para a grande parte dos trabalhos teóricos, contudo, poucos testes empíricos
apoiam suas predições (Field & Cant 2009, Seppä et al 2012, Reeve & Shen 2013). Os resultados
indicam uma hierarquia social em Euglossa melanotricha mantida pelo chamado ‘contrato social’
com relação ao esforço reprodutivo (Figura 18). Mais estudos com outras espécies do gênero
Euglossa são necessários para determinar se tais contratos são típicos neste gênero.
Cap. III – Regulação reprodutiva e o parentesco em “Euglossa melanotricha”: evidência para seleção parental | 129
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ANEXOS
Anexos | 136
Anexo I.
Ninho 1/Família 1 (NF1) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha,
mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria)
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 217 221 179 197 208 211 161 167 161 163 171 177 223 229 166 168 124 122 157 165 161 171
♀ 223 221 193 197 206 211 157 167 159 163 169 177 221 229 174 168 126 122 167 165 175 171
♀ 223 221 179 197 208 211 161 167 161 163 171 177 223 229 174 168 126 122 167 165 175 171
♂ 217 193 206 157 161 169 223 174 124 157 161
♂ 217 193 206 157 159 169 221 166 124 157 161
♂ 217 179 208 161 161 171 223 166 124 157 161
♀ 217 221 193 197 208 211 157 167 161 163 171 177 221 229 166 168 126 122 157 165 161 171
♀ Mãe 217 223 179 193 206 208 157 161 159 161 169 171 221 223 166 174 124 126 157 167 161 175
♂ Pai 221 197 211 167 163 177 229 168 122 165 171
Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.
Anexos | 137
Anexo II.
Ninho 2/Família 2 (NF2) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha,
mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 219 223 179 193 204 208 167 157 161 159 169 167 226 223 172 166 126 124 197 155 169 175
♀ 226 223 197 193 211 208 159 157 161 159 169 167 226 223 174 166 126 124 195 155 169 175
♀ 226 223 179 193 204 208 167 157 161 159 177 167 226 223 174 166 126 124 197 155 177 175
♂ 219 179 211 167 161 177 221 172 122 197 177
♂ 226 197 211 159 167 169 221 172 126 197 169
♂ 226 179 211 159 167 177 221 174 126 197 169
♀ 219 223 179 193 204 208 167 157 161 159 177 167 221 223 174 166 126 124 195 155 177 175
♀ 226 223 197 193 211 208 159 157 161 159 169 167 221 223 174 166 126 124 197 155 177 175
♀ Mãe 219 226 179 197 204 211 159 167 161 167 169 177 221 226 172 174 122 126 195 197 169 177
♂ Pai 223 193 208 157 159 167 223 166 124 155 175
Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.
Anexos | 138
Anexo III.
Ninho 3/Família 3 (NF3) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha,
mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 217 226 193 165 202 195 155 161 161 167 169 179 221 226 166 174 126 122 195 165 161 179
♀ 211 226 193 165 202 195 159 161 161 167 167 179 221 226 166 174 126 122 195 165 161 179
♂ 211 193 206 155 171 169 221 176 126 191 175
♂ 211 193 206 155 171 167 221 166 124 195 161
♀ 211 226 193 165 206 195 159 161 171 167 167 179 221 226 166 174 126 122 195 165 161 179
♀ 217 226 167 165 206 195 159 161 171 167 167 179 221 226 166 174 124 122 191 165 175 179
♂ 217 193 202 155 171 169 221 176 126 191 175
♀ 211 226 167 165 202 195 159 161 171 167 167 179 221 226 176 174 126 122 191 165 175 179
♂ 211 193 206 155 161 169 221 176 126 195 175
♀ Mãe 211 217 167 193 202 206 155 159 161 171 167 169 221 229 166 176 124 126 191 195 161 175
♂ Pai 226 165 195 161 167 179 226 174 122 165 179
Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.
Anexos | 139
Anexo IV.
Ninho 4/Família 4 (NF4) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha,
mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 223 217 167 165 206 195 157 153 157 169 153 157 223 226 166 174 126 126 167 165 165 161
♀ 219 217 167 165 208 195 151 153 157 169 153 157 223 226 172 174 126 126 167 165 171 161
♀ 223 217 167 165 206 195 151 153 157 169 161 157 221 226 166 174 126 126 179 165 165 161
♂ 219 167 206 151 163 153 221 166 122 179 165
♀ 219 217 197 165 208 195 151 153 157 169 153 157 223 226 166 174 126 126 179 165 171 161
♂ 219 197 208 151 157 161 221 166 122 179 165
♀ Mãe 219 223 167 197 206 208 151 157 157 163 153 161 221 223 166 172 122 126 167 179 165 171
♂ Pai 217 165 195 153 169 157 226 174 126 165 161
Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.
Anexos | 140
Anexo V.
Ninho 5/Família 5 (NF5) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha,
mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 211 223 191 177 195 208 155 159 169 163 157 161 226 229 168 176 124 122 193 191 161 175
♀ 211 223 191 177 195 208 155 159 169 163 157 161 226 229 168 176 124 122 193 191 161 175
♀ 211 223 191 177 195 208 155 159 174 163 163 161 223 229 168 176 124 122 195 191 161 175
♂ 217 195 211 163 174 157 226 174 126 193 171
♂ 217 195 211 163 174 157 223 174 126 195 171
♀ 211 223 191 177 211 208 163 159 169 163 163 161 226 229 174 176 126 122 193 191 171 175
♂ 217 195 195 155 169 163 226 168 124 195 161
♂ 211 195 195 155 169 157 226 168 124 193 161
♀ 217 223 191 177 211 208 155 159 169 163 157 161 226 229 174 176 126 122 193 191 161 175
♀ 217 223 191 177 211 208 163 159 174 163 163 161 223 229 174 176 124 122 193 191 161 175
♂ 211 191 211 163 174 163 226 174 126 195 161
♀ Mãe 211 217 191 195 195 211 155 163 169 174 157 163 223 226 168 174 124 126 193 195 161 171
♂ Pai 223 177 208 159 163 161 229 176 122 191 175
Anexo VI.
Ninho 6/Família 6 (NF6) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha,
mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 226 219 177 167 193 195 161 163 163 161 175 171 229 221 174 168 122 124 193 195 171 157
♀ 226 219 177 167 193 195 161 163 163 161 175 171 229 221 174 168 122 124 197 195 171 157
♂ 226 177 193 161 167 175 223 174 126 197 171
♂ 226 179 198 165 167 180 229 176 126 197 169
♀ 229 219 177 167 198 195 165 163 167 161 175 171 229 221 176 168 122 124 193 195 169 157
♂ 226 179 198 161 163 180 223 174 122 193 171
♀ 229 219 179 167 193 195 161 163 167 161 180 171 223 221 174 168 122 124 193 195 171 157
♀ Mãe 226 229 177 179 193 198 161 165 163 167 175 180 223 229 174 176 122 126 193 197 171 169
♂ Pai 219 167 195 163 161 171 221 168 124 195 157
Anexo VII.
Ninho 7/Família 7 (NF7) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha,
mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 219 229 179 177 198 208 175 161 163 175 169 173 221 229 176 172 120 118 193 197 157 169
♀ 219 229 179 177 198 208 175 161 173 175 169 173 221 229 168 172 120 118 191 197 157 169
♀ 219 229 193 177 204 208 175 161 173 175 171 173 226 229 176 172 124 118 191 197 161 169
♂ 223 193 204 173 173 171 226 176 124 191 161
♂ 219 193 198 173 163 169 221 168 124 193 157
♀ 223 229 179 177 204 208 173 161 163 175 171 173 226 229 176 172 124 118 191 197 161 169
♀ 219 229 193 177 204 208 175 161 173 175 171 173 221 229 176 172 120 118 191 197 161 169
♀ 223 229 193 177 204 208 175 161 163 175 169 173 221 229 176 172 120 118 193 197 161 169
♂ 219 179 198 173 163 171 226 176 124 193 157
♂ 223 179 204 175 173 169 226 168 124 193 161
♀ Mãe 219 223 179 193 198 204 173 175 163 173 169 171 221 226 168 176 120 124 191 193 157 161
♂ Pai 229 177 208 161 175 173 229 172 118 197 169
Anexo VIII.
Ninho 8/Família 8 (NF8) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha,
mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 217 219 179 191 193 208 169 177 163 161 165 163 226 221 168 172 120 124 161 157 167 175
♀ 217 219 179 191 193 208 169 177 163 161 165 163 226 221 174 172 120 124 165 157 167 175
♀ 217 219 179 191 193 208 169 177 163 161 165 163 226 221 174 172 118 124 161 157 167 175
♀ 217 219 179 191 195 208 169 177 174 161 171 163 229 221 168 172 118 124 165 157 167 175
♂ 221 195 195 169 174 171 226 174 118 165 177
♂ 221 195 193 175 174 171 226 174 120 165 177
♂ 217 195 193 175 163 165 229 168 120 161 167
♀ 217 219 179 191 195 208 175 177 163 161 171 163 226 221 168 172 118 124 161 157 167 175
♂ 221 195 193 169 163 171 229 168 118 161 177
♀ Mãe 217 221 179 195 193 195 169 175 163 174 165 171 226 229 168 174 118 120 161 165 167 177
♂ Pai 219 191 208 177 161 163 221 172 124 157 175
Anexo IX.
Ninho 9/Família 9 (NF9) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa melanotricha,
mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 211 229 177 195 202 198 171 175 163 159 169 171 221 223 176 170 122 118 179 191 165 171
♀ 211 229 177 195 202 198 171 175 163 159 169 171 221 223 176 170 122 118 165 191 179 171
♀ 211 229 179 195 202 198 171 175 163 159 169 171 221 223 174 170 122 118 179 191 179 171
♂ 211 177 204 171 171 177 226 176 126 165 165
♀ 211 229 179 195 202 198 173 175 171 159 177 171 221 223 176 170 122 118 179 191 165 171
♀ 219 229 177 195 204 198 173 175 171 159 169 171 226 223 176 170 126 118 179 191 179 171
♂ 211 177 204 173 163 169 226 174 126 165 179
♂ 211 177 202 171 163 177 226 176 122 165 179
♀ Mãe 211 219 177 179 202 204 171 173 163 171 169 177 221 226 174 176 122 126 165 179 165 179
♂ Pai 229 195 198 175 159 171 223 170 118 191 171
Anexo X.
Ninho 10/Família 10 (NF10) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 223 226 167 191 195 201 167 169 159 161 173 177 221 226 168 172 118 124 179 167 167 171
♀ 223 226 167 191 195 201 167 169 159 161 173 177 221 226 168 172 118 124 193 167 167 171
♀ 229 226 167 191 195 201 171 169 159 161 169 177 223 226 168 172 122 124 193 167 169 171
♂ 229 177 195 167 163 173 223 170 118 193 167
♀ 223 226 167 191 198 201 171 169 159 161 173 177 223 226 170 172 122 124 193 167 167 171
♀ 223 226 167 191 198 201 171 169 159 161 173 177 221 226 168 172 118 124 179 167 169 171
♂ 229 167 198 167 163 169 221 168 122 193 169
♂ 223 177 195 167 159 173 221 170 118 179 167
♂ 223 177 195 171 159 173 223 168 118 193 167
♀ Mãe 223 229 167 177 195 198 167 171 159 163 169 173 221 223 168 170 118 122 179 193 167 169
♂ Pai 226 191 201 169 161 177 226 172 124 167 171
Anexo XI.
Ninho 11/Família 11 (NF11) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 219 232 193 179 193 208 169 175 171 163 173 171 217 229 166 170 120 126 167 155 163 169
♀ 229 232 193 179 193 208 173 175 171 163 177 171 217 229 166 170 120 126 167 155 163 169
♂ 219 193 195 173 174 177 217 166 124 179 171
♀ 229 232 197 179 193 208 173 175 174 163 173 171 221 229 172 170 120 126 179 155 171 169
♂ 229 197 195 169 171 177 221 172 124 167 171
♂ 219 197 195 169 174 177 217 166 124 167 163
♀ Mãe 219 229 193 197 193 195 169 173 171 174 173 177 217 221 166 172 120 124 167 179 163 171
♂ Pai 232 179 208 175 163 171 229 170 126 155 169
Anexo XII.
Ninho 12/Família 12 (NF12) – Fundação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal simples com uma mãe e um pai (monoginia-monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 229 219 177 179 202 195 169 191 159 167 167 175 223 221 168 174 118 124 195 165 171 167
♀ 229 219 177 179 202 195 169 191 163 167 167 175 223 221 168 174 118 124 195 165 177 167
♂ 232 191 204 171 163 169 226 176 124 195 177
♂ 232 191 202 171 159 167 226 168 118 197 177
♀ 229 219 177 179 204 195 169 191 163 167 169 175 226 221 168 174 118 124 197 165 171 167
♀ Mãe 229 232 177 191 202 204 169 171 159 163 167 169 223 226 168 176 118 122 195 197 171 177
♂ Pai 219 179 195 191 167 175 221 174 124 165 167
Representados em azul os alelos herdados da mãe e em laranja os do pai.
Anexos | 148
Anexo XIII.
Ninho 1/Família 13 (N1FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♂ 217 193 211 157 159 169 223 166 122 161 171
♂ 217 197 211 157 161 171 223 166 124 167 171
♀ 223 217 179 167 204 206 157 169 161 165 169 173 226 221 174 176 124 118 165 191 175 177
♀ 217 229 193 165 204 208 167 159 161 163 169 177 226 221 174 168 124 126 161 157 175 169
♂ 219 170 211 157 167 171 232 174 128 165 175
♀ 223 229 197 165 211 208 157 159 159 163 169 177 226 229 166 168 122 126 161 157 171 169
♀ 217 229 193 165 211 208 167 159 159 163 169 177 223 229 174 168 122 126 161 157 171 169
♀ 217 229 197 165 204 208 157 159 159 163 171 177 223 229 166 168 124 126 161 157 171 169
♀ 223 229 197 165 211 208 157 159 159 163 169 177 226 229 166 168 122 126 161 157 171 169
♀ 217 229 193 165 204 208 157 159 161 163 169 177 223 229 174 168 122 126 167 157 175 169
♂ 223 197 211 167 161 169 226 166 122 167 175
♂ 217 197 204 157 159 171 223 166 124 167 171
♀Irmã (D) 217 223 197 193 204 211 157 167 159 161 169 171 223 226 166 174 122 124 161 167 171 175
♂ Pai 229 165 208 159 163 177 229 168 126 157 169
♀Irmã (S) 219 223 193 179 204 211 157 161 161 167 169 171 226 232 174 166 124 128 161 165 171 175
♂ Pai 217 167 206 169 165 173 221 176 118 191 177
Representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da
esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 149
Anexo XIV.
Ninho 1/Família 14 (N1FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♂ 219 181 193 159 163 175 221 172 128 191 175
♂ 219 179 195 173 167 169 221 176 132 191 179
♀ 226 211 179 167 195 204 159 151 163 171 177 173 221 232 176 182 128 109 191 193 179 175
♀ 226 221 181 177 193 201 159 149 163 155 175 179 223 217 172 188 124 118 197 152 175 171
♂ 229 179 193 163 163 175 223 186 128 191 179
♂ 229 179 193 163 163 175 223 186 128 191 179
♀ 219 221 179 177 193 201 159 149 167 155 169 179 223 217 172 188 128 118 191 152 175 171
♀ Irmã (D) 219 226 179 181 193 195 159 173 163 167 175 169 221 223 172 176 128 132 191 197 175 179
♂ Pai 221 177 201 149 155 179 217 188 118 152 171
♀Irmã (S) 226 229 181 179 193 195 159 163 163 167 175 177 221 223 176 186 128 132 191 195 179 181
♂ Pai 211 167 204 151 171 173 232 182 109 193 175
Representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da
esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 150
Anexo XV.
Ninho 2/Família 15 (N2FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 217 223 183 181 204 202 177 175 169 161 171 175 229 235 170 176 120 132 155 193 175 191
♀ 217 223 183 181 204 202 177 175 179 161 177 175 229 235 170 176 120 132 155 193 181 191
♂ 217 189 204 191 174 177 232 182 122 157 181
♂ 217 189 204 191 174 177 232 182 122 157 181
♂ 219 189 204 191 174 171 229 170 120 155 181
♀ 219 223 183 181 208 202 177 175 169 161 171 175 229 235 182 176 120 132 157 193 175 191
♀ 219 223 183 181 208 202 191 175 169 161 171 175 232 235 170 176 122 132 155 193 181 191
♂ 221 193 204 188 169 177 229 186 120 155 181
♀ 217 223 189 181 204 202 177 175 174 161 177 175 232 235 170 176 120 132 155 193 175 191
♀ Irmã (D) 217 219 183 189 204 208 177 191 169 174 171 177 229 232 170 182 120 122 155 157 175 181
♂ Pai 223 181 202 175 161 175 235 176 132 193 191
♀Irmã (S) 219 221 183 193 204 208 188 191 169 171 177 179 229 232 182 186 120 122 155 157 181 191
♂ Pai*
Representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da
esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai. *Não foi possível atribuir á prole da subordinada a um pai em razão da ausência de
irmãs completas para identificação do alelo.
Anexos | 151
Anexo XVI.
Ninho 2/Família 16 (N2FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 223 217 177 183 209 204 157 171 161 155 149 151 221 232 172 186 118 124 191 195 167 181
♀ 223 217 177 183 211 204 157 171 161 155 149 151 221 232 172 186 126 124 197 195 179 181
♂ 226 195 211 163 171 167 229 182 126 191 167
♂ 223 177 211 157 171 149 229 172 126 191 167
♀ 226 217 177 183 209 204 163 171 171 155 167 151 221 232 182 186 118 124 191 195 179 181
♀ 223 217 195 183 211 204 157 171 161 155 149 151 221 232 172 186 118 124 197 195 179 181
♂ 226 195 209 163 171 167 221 172 126 191 179
♂ 223 191 211 157 174 149 229 172 128 191 171
♀ Irmã (D) 223 226 177 195 209 211 157 163 161 171 149 167 221 229 172 182 118 126 191 197 167 179
♂ Pai 217 183 204 171 155 151 232 186 124 195 181
♀Irmã (S) 223 226 177 191 209 211 157 163 171 174 149 167 229 235 172 182 118 128 191 197 167 171
♂ Pai*
Representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da
esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai. *Não foi possível atribuir á prole da subordinada a um pai em razão da ausência de
irmãs completas para identificação do alelo.
Anexos | 152
Anexo XVII.
Ninho 2/Família 17 (N2FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 211 221 195 189 202 211 171 173 157 169 173 149 232 221 170 188 124 130 155 197 163 179
♂ 211 195 209 171 157 173 223 170 124 161 181
♂ 223 179 202 171 163 179 232 170 124 161 181
♂ 223 179 202 188 157 179 232 174 128 161 181
♀ 211 221 179 189 209 211 188 173 163 169 173 149 232 221 170 188 124 130 155 197 163 179
♀ 211 221 189 189 202 211 171 173 157 169 179 149 223 221 174 188 124 130 161 197 181 179
♂ 211 183 202 165 163 173 235 170 132 155 163
♀ Irmã (D) 211 223 179 195 202 209 171 188 157 163 173 179 223 232 170 174 124 128 155 161 163 181
♂ Pai 221 189 211 173 169 149 221 188 130 197 179
♀Irmã (S) 211 223 179 183 202 209 163 165 156 163 173 179 223 235 170 174 124 132 155 161 163 181
♂ Pai*
Representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da
esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai. *Não foi possível atribuir á prole da subordinada a um pai em razão da ausência de
irmãs completas para identificação do alelo.
Anexos | 153
Anexo XVIII.
Ninho 3/Família 18 (N3FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 219 223 183 193 206 198 153 177 174 171 175 169 226 229 168 186 118 120 191 157 167 191
♂ 219 183 206 165 174 175 235 182 118 191 179
♂ 219 197 208 165 174 175 226 182 118 193 179
♀ 226 223 197 193 208 198 165 177 169 171 179 169 226 229 182 186 122 120 191 157 179 191
♀ 226 223 183 193 206 198 153 177 169 171 179 169 226 229 182 186 122 120 193 157 167 191
♀ 219 223 197 193 208 198 165 177 169 171 179 169 235 229 168 186 118 120 191 157 167 191
♂ 229 197 206 179 169 171 226 182 124 193 179
♀ Irmã (D) 219 226 183 197 206 208 153 165 169 174 175 179 226 235 168 182 118 122 191 193 167 179
♂ Pai 223 193 198 177 171 169 229 186 120 157 191
♀Irmã (S) 226 229 183 197 206 208 153 179 169 174 175 171 226 235 168 182 122 124 191 193 167 179
♂ Pai*
Representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na coluna da
esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai. *Não foi possível atribuir á prole da subordinada a um pai em razão da ausência de
irmãs completas para identificação do alelo.
Anexos | 154
Anexo XIX.
Ninho 4/Família 19 (N4FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 229 226 165 167 208 206 153 157 159 174 157 161 221 226 166 172 124 122 165 179 177 165
♂ 223 197 193 151 161 157 223 174 124 167 177
♀ 223 226 165 167 193 206 151 157 161 174 157 161 221 226 174 172 126 122 167 179 177 165
♀ 229 226 197 167 193 206 151 157 159 174 153 161 221 226 166 172 124 122 167 179 181 165
♀ 229 226 165 167 193 206 151 157 161 174 157 161 223 226 166 172 124 122 165 179 181 165
♀ 223 226 197 167 208 206 153 157 161 174 153 161 223 226 174 172 126 122 167 179 177 165
♂ 223 165 208 153 159 157 223 174 124 165 _
♂ 223 181 208 151 167 153 221 176 128 167 179
♂ 223 181 208 161 161 153 223 166 124 165 179
♀ Irmã (D) 223 229 165 197 193 208 151 153 159 161 153 157 221 223 166 174 124 126 165 167 177 181
♂ Pai 226 167 206 157 174 161 226 172 122 179 165
♀Irmã (S) 223 229 165 181 193 208 151 161 161 167 153 157 221 223 166 176 124 128 165 167 179 181
♂ Pai* _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
- missing data; representado em vermelho à prole atribuído a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na
coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai. *Não foi possível atribuir á prole da subordinada a um pai em razão da
ausência de irmãs completas para identificação do alelo.
Anexos | 155
Anexo XX.
Ninho 5/Família 20 (N5FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (Mãe e filha) e seus respectivos pais (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 211 223 167 177 208 204 159 171 167 155 175 173 229 232 177 185 120 132 195 197 177 191
♂ 211 167 211 159 171 175 226 177 128 191 181
♂ 217 179 211 159 171 173 226 177 128 191 181
♀ 217 223 179 177 211 204 161 171 171 155 173 173 226 232 179 185 128 132 191 197 181 191
♂ 211 179 211 161 167 173 229 179 120 191 181
♂ 211 165 _ 161 167 173 226 185 120 191 _
♀ 211 226 167 189 208 202 161 155 167 169 173 165 226 235 177 179 132 130 191 193 191 175
♂ 211 167 204 171 155 173 232 177 132 197 177
♀ Mãe 211 217 167 179 208 211 159 161 167 171 173 175 226 229 177 179 120 128 191 195 177 181
♂ Pai 223 177 204 171 155 173 232 185 132 197 191
♀Filha 211 223 167 177 208 204 161 171 167 155 175 173 226 232 177 185 120 132 191 197 177 191
♂ Pai 226 189 202 155 169 165 235 179 130 193 175
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os
alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 156
Anexo XXI.
Ninho 6/Família 21 (N6FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas mães (irmãs) e seus respectivos pais (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 211 221 189 165 206 204 173 175 174 169 149 169 229 223 177 167 118 109 157 179 181 161
♂ 211 177 202 155 _ 167 217 186 118 157 191
♂ 211 189 198 155 171 149 217 177 118 157 191
♀ 226 221 189 165 202 204 155 175 159 169 167 169 229 223 186 167 120 109 195 179 191 161
♂ 226 177 202 155 171 149 217 186 120 195 181
♀Irmã (D) 211 226 177 189 198 202 155 173 159 171 149 167 217 229 177 186 118 120 157 195 181 191
♂ Pai 221 165 204 175 169 169 223 167 109 179 161
♀Irmã S* 226 229 177 189 198 202 155 173 169 171 167 171 217 229 177 186 118 120 157 177 181 191
- missing data; representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na
coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai. *Não há prole atribuída a fêmea subordinada.
Anexos | 157
Anexo XXII.
Ninho 6/Família 22 (N6FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Mãe e filha) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 223 232 179 195 193 211 175 153 167 155 169 151 226 229 167 179 111 118 195 165 177 181
♀ 223 232 193 195 193 211 191 153 171 155 169 151 226 229 177 179 111 118 195 165 191 181
♂ 226 193 206 191 171 179 226 177 111 197 191
♀ 223 232 193 195 193 211 175 153 171 155 169 151 217 229 177 179 109 118 197 165 191 181
♂ 223 179 193 191 167 169 229 167 111 195 177
♀ 223 232 193 195 206 211 191 153 167 155 179 151 217 229 177 179 111 118 197 165 191 181
♂ 223 179 211 153 167 151 226 177 109 197 177
♂ 232 179 211 153 155 151 229 177 109 197 177
♀ Mãe 223 226 179 193 193 206 175 191 167 171 169 179 217 226 167 177 109 111 195 197 177 191
♂ Pai 232 195 211 153 155 151 229 179 118 165 181
♀Filha 223 232 179 195 206 211 175 153 167 155 151 179 226 229 177 179 109 118 165 197 177 181
♂ Pai*
Representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente (♀ Mãe) do ninho, e em verde a prole atribuída a sua irmã subordinada (♀Filha). Em cada loco, na coluna da
esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai. .* Não foi possível determinar os alelos dos pais para a prole da filha subordinada em
razão da ausência de irmãs completas.
Anexos | 158
Anexo XXIII.
Ninho 6/Família 23 (N6FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e respectivos pais da prole (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 211 223 181 189 201 193 171 191 171 167 149 167 221 226 174 172 122 120 197 155 165 181
♂ 211 183 201 188 _ 161 221 174 122 197 165
♂ 211 181 201 171 171 161 223 174 122 197 169
♀ 217 223 181 189 195 193 171 191 159 167 161 167 221 226 176 172 126 120 193 155 169 181
♀ 217 223 181 189 195 193 171 191 159 167 161 167 223 226 174 172 126 120 193 155 169 181
♂ 211 183 197 171 161 167 223 174 124 193 165
♀Irmã (D) 211 217 181 183 195 201 171 188 159 171 161 165 221 223 174 176 122 126 193 197 165 169
♂ Pai 223 189 193 191 167 167 226 172 120 155 181
♀Irmã (S) 211 217 181 183 195 197 171 188 159 161 165 167 221 223 174 176 122 124 193 197 165 169
♂ Pai*
- missing data; representado em vermelho à prole atribuída a irmã dominante (♀Irmã D) do ninho; em azul a prole atribuída à irmã subordinada (♀Irmã S); em cada loco, na
coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita de cor laranja estão os alelos do pai.* Não foi possível determinar os alelos dos pais para a prole da filha
subordinada em razão da ausência de irmãs completas.
Anexos | 159
Anexo XXIV.
Ninho 6/Família 24 (N6/FR4) – Quarta Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e respectivos pais da prole (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 229 226 195 189 206 198 159 173 161 163 169 180 229 226 182 188 109 118 167 179 179 175
♀ 229 226 195 189 202 198 188 173 161 163 169 180 223 226 176 188 109 118 167 179 181 175
♀ 235 226 165 189 206 198 188 173 161 163 173 180 223 226 176 188 113 118 152 179 181 175
♀ 235 226 165 189 202 198 159 173 155 163 173 180 229 226 176 188 109 118 152 179 _ _
♂ 229 165 202 159 161 _ _ 176 113 167 179
♂ 229 165 202 159 155 _ _ 176 113 167 179
♂ 229 195 206 161 155 169 223 182 113 152 179
♀ 229 232 189 183 202 208 159 163 155 171 173 177 229 235 176 186 113 124 179 191 179 169
♂ 226 189 202 159 155 180 229 176 118 152 175
♂ 229 189 202 173 163 _ 229 188 118 152 175
♀ 229 226 165 189 202 198 188 173 161 163 169 180 229 226 182 188 113 118 152 179 179 175
♀ Mãe 229 235 165 195 202 206 159 188 155 161 173 169 223 229 176 182 109 113 152 167 179 181
♂ Pai 226 189 198 173 163 180 226 188 118 179 175
♀Filha 229 226 165 189 202 198 159 173 155 163 173 180 229 226 176 188 113 118 152 179 179 175
♂ Pai 232 183 208 163 171 177 235 186 124 191 169
- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os
alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 160
Anexo XXV.
Ninho 7/Família 25 (N7FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Mãe e filha) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 229 219 179 177 204 202 173 151 169 174 173 169 223 226 166 182 113 122 155 167 169 191
♀ 229 219 179 177 208 202 173 151 169 174 179 169 223 226 168 182 113 122 155 167 169 191
♂ 229 195 204 177 169 173 223 166 113 152 179
♀ 232 219 179 177 204 202 177 151 159 174 173 169 223 226 168 182 111 122 155 167 169 191
♂ 223 195 204 177 169 179 229 166 111 153 179
♂ 232 177 208 151 169 173 223 168 111 155 179
♂ 232 179 208 151 169 173 223 168 111 167 179
♀ Mãe 229 232 179 195 204 208 173 177 159 169 173 179 223 229 166 168 111 113 152 155 169 179
♂ Pai 219 177 202 151 174 169 226 182 122 167 191
♀Filha 232 219 179 177 208 202 173 151 169 174 173 169 223 226 168 182 111 122 155 167 179 191
♂ Pai*
- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os
alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai. * Não foi possível determinar os alelos dos pais para a prole da filha subordinada.
Anexos | 161
Anexo XXVI.
Ninho 7/Família 26 (N7FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Mãe e filha) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 223 219 181 189 201 189 171 191 167 161 175 179 217 226 168 177 118 122 195 157 171 169
♀ 223 219 181 189 201 189 171 191 171 161 175 179 217 226 168 177 118 122 195 157 181 169
♂ 217 183 201 188 _ 175 229 168 126 197 181
♀ 223 219 181 189 209 189 171 191 171 161 177 179 217 226 170 177 126 122 179 157 181 169
♂ 223 189 189 188 161 175 226 177 126 195 171
♀ 217 219 181 189 209 189 171 191 169 161 177 179 217 226 170 177 118 122 179 157 171 169
♂ 223 189 201 191 161 175 229 168 122 195 171
♀ Mãe 217 223 181 183 201 209 171 188 169 171 175 177 217 229 168 170 118 126 179 195 171 181
♂ Pai 219 189 189 191 161 179 226 177 122 157 169
♀Filha 223 219 181 189 201 189 188 191 169 161 175 179 229 226 168 177 126 122 195 157 171 169
♂ Pai*
- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os
alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.* Não foi possível determinar os alelos dos pais para a prole da filha subordinada.
Anexos | 162
Anexo XXVII.
Ninho 7/Família 27 (N7FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e os respectivos pais da prole (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 229 211 195 189 209 193 169 188 159 155 151 163 217 223 170 176 109 113 191 161 171 175
♀ 229 211 195 189 211 193 169 188 163 155 151 163 217 223 170 176 109 113 191 161 171 175
♂ 229 183 211 171 163 151 221 172 111 191 171
♀ 229 211 183 189 211 193 171 188 159 155 161 163 221 223 172 176 109 113 197 161 171 175
♀ 229 211 185 189 211 193 171 188 163 155 161 163 _ _ 172 176 111 113 191 161 169 175
♂ 221 195 211 169 163 161 217 172 109 191 169
♀ 229 211 195 189 209 193 169 188 163 155 161 163 217 223 172 176 111 113 197 161 171 175
♂ 221 183 209 171 163 151 217 170 111 191 169
♀ 221 211 195 189 209 193 169 188 159 155 161 163 217 223 _ _ 109 113 197 161 171 175
♀ 221 217 195 181 211 195 188 169 155 157 151 167 221 226 170 174 111 120 197 179 171 177
♂ 221 189 211 188 155 _ 221 176 111 197 171
♂ 221 189 211 188 159 163 221 170 111 161 171
♀ Mãe 221 229 195 183 209 211 169 171 159 163 151 161 217 221 170 172 109 111 191 197 169 171
♂ Pai 211 189 193 188 155 163 223 176 113 161 175
♀Filha 221 211 195 189 211 193 169 188 159 155 151 163 221 223 170 176 111 113 197 161 171 175
♂ Pai 217 181 195 169 157 167 226 174 120 179 177
- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os
alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 163
Anexo XXVIII.
Ninho 8/Família 28 (N8FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e os respectivos pais da prole (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 221 229 191 193 204 208 181 177 157 155 173 179 222 235 168 172 128 118 191 197 177 191
♂ 221 191 204 181 169 173 217 _ 128 195 177
♀ 232 229 191 193 206 208 181 177 157 155 173 179 171 179 168 172 130 118 195 197 177 191
♀ 232 229 183 193 204 208 188 177 157 155 171 179 223 235 174 172 130 118 191 197 179 191
♂ 229 193 204 181 155 171 223 172 128 197 191
♀ 232 229 191 193 206 208 181 177 169 155 171 179 223 235 174 172 130 118 195 197 177 191
♂ 223 193 204 181 157 171 235 172 128 191 191
♀ 232 229 191 193 204 208 188 177 157 155 173 179 217 235 168 172 130 118 191 197 179 191
♀ Mãe 221 232 183 191 206 204 181 188 157 169 171 173 217 223 168 174 128 130 191 195 177 179
♂ Pai 229 193 208 177 155 179 235 172 118 197 191
♀Filha 223 229 183 193 204 208 181 177 157 155 171 179 223 235 174 172 128 118 191 197 177 191
♂ Pai*
- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os
alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai. * Não foi possível determinar os alelos dos pais para a prole da filha subordinada.
Anexos | 164
Anexo XXIX.
Ninho 8/Família 29 (N8FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e os respectivos pais da prole (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 219 217 178 197 193 189 169 165 167 171 169 161 223 221 168 174 124 120 157 155 165 177
♂ 219 193 195 169 161 163 229 168 124 157 165
♂ 229 193 195 173 161 169 223 168 126 167 165
♀ 229 217 193 197 193 189 169 165 167 171 163 161 223 221 168 174 126 120 157 155 175 177
♀ 229 223 178 191 195 201 169 167 161 155 161 165 223 226 176 172 124 122 167 161 175 169
♂ 229 178 195 169 161 161 223 174 120 167 175
♀ 229 217 193 197 195 189 173 165 167 171 169 161 229 221 176 174 126 120 157 155 165 177
♀ Mãe 219 229 178 193 193 195 169 173 161 167 163 169 223 229 168 176 124 126 157 167 165 175
♂ Pai 217 197 189 165 171 161 221 174 120 155 177
♀Filha 229 217 178 197 195 189 169 165 161 171 169 161 223 221 176 174 124 120 167 155 175 177
♂ Pai 223 191 201 167 155 165 226 172 122 161 169
- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os
alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 165
Anexo XXX.
Ninho 9/Família 30 (N9FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Irmãs) e os respectivos pais da prole (monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 211 223 179 177 208 195 159 163 161 167 165 173 223 229 168 176 124 122 165 191 165 175
♀ 211 223 167 177 208 195 159 163 157 155 169 173 223 229 168 176 124 122 195 191 165 175
♂ 217 167 208 155 161 165 226 168 126 195 177
♀ 217 223 167 177 211 195 155 163 159 167 165 173 226 229 168 176 126 122 165 191 177 175
♂ 217 179 211 159 159 165 223 168 124 195 165
♀ 223 221 177 171 208 204 163 167 159 165 165 171 226 221 176 172 124 120 191 161 175 161
♂ 223 177 195 163 167 173 226 176 124 191 177
♀ 211 223 179 177 208 195 159 163 161 167 165 173 226 229 174 176 126 122 193 191 177 175
♀ Mãe 211 217 167 179 208 211 155 159 159 161 165 169 223 226 168 174 124 126 193 195 165 177
♂ Pai 223 177 195 163 167 173 229 176 122 191 175
♀Filha 211 223 167 177 208 195 159 163 159 167 165 173 226 229 174 176 124 122 193 191 177 175
♂ Pai 221 171 204 167 165 171 221 172 120 161 161
- missing data; representados em vermelho a prole atribuída a mãe (♀ Mãe), e em verde a prole atribuída a filha (♀Filha). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os
alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 166
Anexo XXXI.
Ninho 9/Família 31 (N9FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 223 221 179 191 206 211 157 167 169 155 171 175 221 232 166 171 122 118 167 161 161 171
♀ 217 221 179 191 206 211 157 167 157 155 169 175 221 232 174 171 124 118 157 161 179 171
♂ 217 193 208 161 _ 171 223 174 124 157 179
♂ 217 193 206 157 169 171 223 174 122 157 161
♀ 226 223 167 195 195 202 171 188 169 155 171 173 226 221 168 174 126 120 157 195 161 177
♀ 219 223 197 195 204 202 171 188 157 155 171 173 226 221 168 174 124 120 165 195 175 177
♂ 226 197 195 171 157 171 223 166 124 157 161
♂ 226 197 204 171 157 171 223 166 124 165 161
♀Residente (D1) 217 223 179 193 206 208 157 161 157 169 169 171 221 223 166 174 122 124 157 167 161 179
♂ Pai 221 191 211 167 155 175 232 171 118 161 171
♀Invasora (D2) 219 226 167 197 195 204 169 171 157 169 171 177 223 226 166 168 124 126 157 165 161 175
♂ Pai 223 195 202 188 155 173 221 174 120 195 177
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente (♀ Mãe Residente) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmeas invasora (♀Invasora). Em
cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 167
Anexo XXXII.
Ninho 10/Família 32 (N10FR1) – Primeira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♂ 219 179 198 161 163 153 226 166 120 157 167
♀ 219 229 179 191 198 193 157 167 169 171 153 177 226 223 166 179 120 124 157 161 169 171
♀ 223 229 193 191 198 193 157 167 163 171 153 177 226 223 166 179 122 124 157 161 169 171
♂ 223 193 198 161 169 180 229 166 122 157 167
♂ 223 193 201 157 169 180 226 174 120 157 169
♀ 211 226 177 181 195 195 163 167 159 169 171 175 223 226 168 176 122 126 197 195 161 169
♀ 211 226 179 181 195 195 171 167 159 169 171 175 223 226 168 176 122 126 197 195 161 169
♀ 223 226 179 181 193 195 171 167 161 169 171 175 221 226 174 176 124 126 193 195 157 169
♂ 223 179 193 171 161 _ 221 174 122 _ 157
♂ 223 177 195 171 161 173 223 168 122 193 157
♀ 211 226 177 181 193 195 163 167 159 169 171 175 221 226 174 176 124 126 193 195 157 169
♀ 223 226 177 181 193 195 171 167 161 169 173 175 221 226 174 176 _ _ 197 195 157 169
♀ 211 226 177 181 195 198 171 167 161 169 171 175 223 226 168 176 124 126 193 195 161 169
♀Residente (D1) 219 223 179 193 201 198 157 161 163 169 153 180 226 229 166 174 120 122 157 167 167 169
♂ Pai 229 191 193 167 171 177 223 179 124 161 171
♀Invasora (D2) 211 223 177 179 195 193 163 165 159 161 171 173 221 223 168 174 122 124 193 197 157 161
♂ Pai 226 181 195 167 169 175 226 176 126 195 169
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente (♀ Mãe Residente) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmeas invasora (♀Invasora). Em
cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 168
Anexo XXXIII.
Ninho 10/Família 33 (N10FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♂ 219 165 202 167 159 169 217 166 _ 155 167
♀ 232 226 191 167 202 204 173 177 159 167 169 181 221 226 166 171 122 126 155 193 175 169
♀ 219 226 191 167 208 204 173 177 171 167 169 181 221 226 166 171 124 126 155 193 175 169
♂ 219 165 202 167 171 171 _ 166 124 155 175
♀ 226 229 167 177 198 193 169 175 159 169 175 179 223 232 172 176 120 122 167 165 161 163
♀ 226 229 197 177 195 193 171 175 159 169 173 179 226 232 172 176 118 122 161 165 161 163
♀ 226 229 167 177 195 193 169 175 161 169 173 179 226 232 172 176 118 122 161 165 161 163
♂ 235 167 198 171 161 173 223 172 120 167 169
♂ 235 167 198 171 161 _ 223 174 118 167 169
♀ 235 229 197 177 198 193 171 175 159 169 173 179 226 232 172 176 120 122 161 165 171 163
♀ 235 229 167 177 195 193 169 175 161 169 175 179 226 232 174 176 120 122 161 165 171 163
♀ 235 229 197 177 198 193 171 175 161 169 175 179 _ _ 172 176 120 122 161 165 171 163
♀Residente (D1) 219 232 165 191 202 208 167 173 159 171 169 171 217 221 166 170 122 124 155 179 167 175
♂ Pai 226 167 204 177 167 181 226 171 126 193 169
♀Invasora (D2) 226 235 167 197 198 195 169 171 161 167 173 175 223 226 172 174 118 120 161 167 169 171
♂ Pai 229 177 193 175 163 179 232 176 122 165 163
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente (♀ Mãe Residente) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmeas invasora (♀Invasora). Em
cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 169
Anexo XXXIV.
Ninho 10/Família 34 (N10FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♂ 223 189 195 169 171 _ 221 _ 118 157 171
♂ 223 177 198 177 171 169 221 166 _ 179 _
♀ 223 211 177 181 195 193 169 175 159 161 169 177 223 217 172 176 124 122 191 167 161 165
♀ 223 211 189 181 195 193 169 175 171 161 169 177 223 217 172 176 126 122 179 167 161 165
♂ 229 177 198 169 171 175 223 166 126 191 167
♀ 229 219 179 183 193 204 169 171 163 159 171 181 223 226 172 174 118 120 157 179 161 175
♀ 226 219 179 183 202 204 188 171 163 159 171 181 223 226 172 174 118 120 157 179 161 175
♀ 223 219 179 183 202 204 169 171 167 159 167 181 223 226 172 174 124 120 167 179 171 175
♂ 223 191 202 169 167 171 229 168 124 157 177
♂ 223 191 202 169 167 167 229 168 124 157 177
♂ 229 179 193 188 163 167 223 168 124 167 171
♀ 223 219 181 183 193 204 169 171 163 159 167 181 223 226 172 174 124 120 157 179 171 175
♀Residente (D1) 219 223 177 189 195 198 169 177 159 171 169 175 221 223 166 172 124 126 179 191 161 167
♂ Pai 211 181 193 175 161 177 217 176 122 167 165
♀Invasora(D2) 223 229 179 191 193 202 169 188 163 167 167 171 223 229 168 172 118 124 157 167 171 177
♂ Pai 219 183 204 171 159 181 226 174 120 179 175
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente (♀ Mãe Residente) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmeas invasora (♀Invasora). Em
cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 170
Anexo XXXV.
Ninho 10/Família 35 (N10FR4) – Quarta Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♂ 223 179 198 171 167 169 _ 167 120 193 175
♀ 223 232 189 171 198 191 171 163 174 155 169 173 221 229 167 185 120 118 193 195 175 173
♂ 223 189 198 _ 167 177 221 167 126 197 _
♀ 219 232 189 171 206 191 171 163 174 155 169 173 221 229 167 185 126 118 193 195 175 173
♀ 221 211 167 189 202 195 169 188 169 159 173 179 217 232 166 170 118 130 157 165 179 191
♀ 221 211 167 189 202 195 169 188 161 159 173 179 223 232 166 170 111 130 157 165 179 191
♀ 235 211 167 189 202 195 169 188 161 159 173 179 223 232 166 170 111 130 152 165 181 191
♂ 221 183 202 173 169 180 217 172 111 157 179
♂ 221 167 202 169 169 180 223 166 111 157 179
♀Residente (D1) 219 223 189 179 198 206 171 191 167 174 169 177 221 226 167 179 120 126 193 197 175 179
♂ Pai 232 171 191 163 155 173 229 185 118 195 193
♀Invasora (D2) 221 235 167 183 202 208 169 173 161 169 173 180 217 223 166 172 111 118 152 157 179 181
♂ Pai 211 189 195 188 159 179 232 170 130 165 191
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente dominante (♀ Mãe ResidenteD1) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmea invasora que
assumiu a dominância (♀Invasora D2). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 171
Anexo XXXVI.
Ninho 11/Família 36 (N11FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 223 232 167 165 202 204 188 169 167 169 167 163 223 217 170 172 128 113 157 167 163 181
♀ 223 232 197 165 202 204 191 169 167 169 177 163 223 217 174 172 122 113 157 167 163 181
♂ 223 167 204 191 169 177 226 170 122 157 175
♀ 226 232 167 165 202 204 191 169 169 155 177 163 226 217 170 172 122 113 152 167 175 181
♂ 226 167 193 188 169 177 223 174 128 157 175
♀ 221 223 177 181 193 195 175 171 163 161 169 174 221 226 174 181 130 128 161 157 191 169
♂ 221 179 198 175 163 169 217 168 126 165 191
♂ 221 _ 198 177 163 171 217 _ 126 161 191
♀Residente (D) 223 226 167 197 202 208 188 191 167 169 167 177 223 226 170 174 122 128 152 157 163 175
♂ Pai 232 165 204 169 155 163 217 172 113 167 181
♀Invasora (S) 221 229 177 179 193 198 175 177 157 163 169 171 219 221 168 174 126 130 161 165 175 191
♂ Pai 223 181 195 171 161 174 226 181 128 157 169
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente dominante (♀ Mãe Residente D) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmea invasora
subordinada (♀Invasora S). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 172
Anexo XXXVI.
Ninho 11/Família 37 (N11FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 211 229 165 167 193 198 161 171 161 169 173 175 221 223 170 176 118 120 165 161 169 179
♂ 223 191 204 161 161 173 221 170 126 165 177
♀ 211 229 165 167 193 198 161 171 161 169 173 175 221 223 170 176 118 120 165 161 169 179
♀ 211 229 165 167 193 198 161 171 161 169 173 175 221 223 170 176 118 120 165 161 169 179
♂ 223 191 204 161 161 171 221 170 126 165 177
♂ 219 177 195 191 163 171 217 176 122 155 177
♂ 219 177 195 191 163 171 217 176 122 155 177
♂ 219 177 195 191 163 171 217 174 122 155 177
♀ 219 223 167 179 198 193 165 161 163 165 171 171 229 226 176 188 126 128 161 157 177 191
♀Residente (D) 211 223 165 191 193 204 161 168 159 161 173 182 221 226 172 170 118 126 152 165 169 177
♂ Pai 229 167 198 171 169 175 223 176 120 161 179
♀Invasora (S) 219 221 167 177 195 198 165 191 163 171 171 177 217 229 174 176 126 122 155 161 177 181
♂ Pai 223 179 193 161 165 171 226 188 128 157 191
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente dominante (♀ Mãe Residente D) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmea invasora
subordinada (♀Invasora S). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 173
Anexo XXXVIII.
Ninho 12/Família 38 (N12FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 229 221 167 165 206 201 188 177 169 159 157 153 221 226 170 170 130 126 165 165 167 181
♂ 229 167 208 191 169 157 221 170 130 165 167
♀ 229 221 167 165 206 201 191 177 169 159 151 153 221 226 170 170 122 126 165 165 171 181
♀ 235 221 167 165 206 201 191 177 169 159 151 153 223 226 170 170 122 126 165 165 167 181
♂ 223 177 198 161 171 177 232 172 109 161 181
♂ 223 177 202 167 171 177 217 172 109 _ 181
♀ 223 219 177 171 202 195 161 163 169 165 177 161 217 235 182 185 109 113 161 151 191 175
♀Residente (D) 229 235 167 177 206 208 188 191 169 174 151 157 221 223 170 174 122 130 155 167 167 171
♂ Pai 221 165 201 177 159 153 226 170 126 165 181
♀Invasora (S) 217 223 163 177 198 202 161 167 169 171 177 177 217 232 172 182 109 111 161 161 181 191
♂ Pai 219 171 195 163 165 161 235 185 113 151 175
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente dominante (♀ Mãe Residente D) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmea invasora
subordinada (♀Invasora S). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 174
Anexo XXXIX.
Ninho 12/Família 39 (N12FR3) – Terceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 226 232 191 165 202 208 188 177 167 171 149 151 232 223 172 174 124 128 165 155 171 177
♂ 219 191 202 175 167 157 232 172 124 165 171
♀ 219 232 195 165 206 208 175 177 161 171 157 151 232 223 176 174 130 128 165 155 175 177
♀ 219 232 191 165 202 208 175 177 161 171 157 151 232 223 176 174 124 128 197 155 175 177
♂ 221 _ 193 _ 161 180 221 182 120 155 179
♂ 221 177 193 153 163 180 217 188 122 157 179
♂ 229 177 193 153 163 173 221 182 122 157 191
♀ 229 235 177 181 198 195 155 157 163 174 180 153 217 229 182 186 120 118 157 161 179 175
♀Residente (D) 219 226 191 195 202 206 175 188 161 167 149 157 217 232 172 176 124 130 165 197 171 175
♂ Pai 232 165 208 177 171 151 223 174 128 155 177
♀Invasora (S) 221 229 177 179 193 198 153 155 161 163 173 180 217 221 182 188 120 122 155 157 179 191
♂ Pai 235 181 195 157 174 153 229 185 118 161 175
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente dominante (♀ Mãe Residente D) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmea invasora
subordinada (♀Invasora S). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 175
Anexo XL.
Ninho 13/Família 40 (N13FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 223 226 167 179 195 211 177 188 163 174 173 175 221 223 174 172 118 126 191 197 167 171
♀ 223 226 167 179 201 211 177 188 163 174 173 175 221 223 174 172 124 126 191 197 167 171
♂ 223 165 201 177 163 _ 217 174 124 193 175
♀ 232 226 167 179 201 211 191 188 163 174 173 175 221 223 166 172 _ _ 191 197 167 171
♂ 232 165 201 191 169 173 217 172 126 193 167
♂ 219 177 202 167 155 171 226 172 122 161 179
♂ 219 177 209 167 155 171 226 172 122 161 191
♀ 217 223 183 165 209 204 173 165 159 167 171 171 229 229 176 182 122 130 179 165 191 181
♀ 219 223 177 165 202 204 167 165 155 167 171 171 229 229 176 182 128 130 161 165 191 181
♀Residente (D) 223 232 165 167 195 201 177 191 163 169 173 182 217 221 166 174 118 124 191 193 167 175
♂ Pai 226 179 211 188 174 175 223 172 126 197 171
♀Invasora (S) 217 219 177 183 202 209 167 173 155 159 171 177 229 226 172 176 128 122 161 179 179 191
♂ Pai 223 165 204 165 167 171 229 182 130 165 181
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente dominante (♀ Mãe Residente D) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmea invasora
subordinada (♀Invasora S). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 176
Anexo XLI.
Ninho 14/Família 41 (N14FR2) – Segunda Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 211 219 197 193 211 209 165 173 169 171 151 151 223 232 166 170 118 130 155 152 181 171
♂ 211 197 211 165 169 151 235 232 166 124 155 181
♀ 211 219 195 193 201 209 165 173 174 171 163 151 223 232 172 170 118 130 157 152 _ _
♀ 211 219 197 193 201 209 149 173 169 171 163 151 223 232 170 170 118 130 157 152 191 171
♂ 223 183 198 167 174 171 _ 176 126 195 179
♂ 221 189 193 167 174 171 221 176 126 193 181
♀ 221 226 189 181 193 195 159 161 174 167 177 179 221 217 176 185 126 120 193 167 181 177
♀Residente (D) 211 217 195 197 201 211 149 165 169 174 151 163 223 235 166 172 118 124 155 157 181 191
♂ Pai 219 193 209 173 171 151 232 170 130 152 171
♀Invasora (S) 221 223 183 189 198 193 159 167 161 174 171 177 221 232 176 179 126 126 193 195 179 181
♂ Pai 226 181 195 161 167 179 217 185 120 167 177
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente dominante (♀ Mãe Residente D) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmea invasora
subordinada (♀Invasora S). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 177
Anexo XLII.
Ninho 14/Família 42 (N14FR3) – Teceira Reativação. Análise da segregação mendeliana dos alelos de locos microssatélites da prole de Euglossa
melanotricha, mostrando a estrutura genética intranidal com a prole atribuída a duas fêmeas (Residente e invasora) e os respectivos pais da prole
(monoandria).
Indivíduos Locos
Sexo Egc17 Egc18 Egc24 Ecg26 Egc35 Egc37 Egc51 Ann03 Ann04 Ann24b Ann37b
♀ 211 235 181 183 209 202 167 155 169 159 173 180 226 221 176 174 126 109 157 167 181 171
♀ 211 235 181 183 209 202 167 155 169 159 177 180 226 221 182 174 126 109 157 167 130 109
♂ 229 181 209 151 163 177 226 _ 130 165 181
♀ 211 235 183 183 211 202 151 155 163 159 173 180 226 221 182 174 130 109 165 167 179 171
♀ 211 235 181 183 211 202 167 155 169 159 177 180 226 221 182 174 130 109 157 167 179 171
♂ 211 181 209 167 161 173 226 188 130 157 179
♂ 221 179 201 149 161 153 219 177 109 157 161
♂ 221 179 198 149 161 153 _ 168 109 165 _
♀ 221 223 179 191 198 204 159 151 171 167 157 151 229 226 168 179 118 126 165 167 157 169
♀ 221 223 189 191 198 204 149 151 171 167 157 151 229 226 177 179 118 126 157 167 157 169
♀Residente (D) 211 229 181 189 209 211 151 167 163 169 173 177 226 232 182 188 122 130 179 191 179 181
♂ Pai 235 183 202 155 159 180 221 174 109 193 171
♀Invasora (S) 221 221 179 189 198 201 149 159 161 171 153 157 219 229 168 177 109 118 157 165 157 161
♂ Pai 223 191 204 151 167 151 226 179 126 167 169
- missing data, representados em vermelho a prole atribuída a mãe residente dominante (♀ Mãe Residente D) do ninho, e em preto a prole atribuída a fêmea invasora
subordinada (♀Invasora S). Em cada loco, na coluna da esquerda estão os alelos da mãe e na coluna da direita em laranja estão os alelos do pai.
Anexos | 178
Anexo XLIII.
Sumários dos valores da medida de assimetria reprodutiva gerados por família de reativação (n = 30) pelo programa Skew Calculator 2003 para
oito índices de assimetria. O índice considerado nas análises deste estudo foi o índice B (Nonacs 2003).
Anexos | 179
Anexo XLIV.
Manuscrito submetido a Animal Behaviour em Jan/2015: ANBEH-D-15-00021.
Reproductive regulation in an orchid bee: social context, fertility and chemical signaling
Aline Candida Ribeiro Andrade e Silvaa, Fábio Santos Nascimentoa,
a
Laboratório de Comportamento e Ecologia de Insetos Sociais - Departamento de Biologia - FFCLRP – Universidade de São Paulo,
Ribeirão Preto, Brasil
Correspondence: Aline Candida Ribeiro Andrade Silva (a.crandrade@usp.br) or Fábio Santos do Nascimento (fsnascim@usp.br),
Laboratório de Comportamento e Ecologia de Insetos Sociais - Departamento de Biologia - FFCLRP – Universidade de São Paulo - Av.
Bandeirantes, 3900, CEP. 14040-901 Ribeirão Preto - SP, Brasil.
Highlights
In social insects, the communication of social status helps individuals to evaluate each other’s
reproductive potential, thus reducing conflict. Queens communicate their status through chemical
signals and the responses of workers to these signals include the suppression of ovarian activation. In
most species of primitively social insects, dominant individuals indicate their status through
aggressive behaviour, which also inhibits reproduction in workers. In some species, which lack queen-
worker dimorphism, chemical signaling may act synergistically with agonistic interactions to establish
the division of labor between females. Here, we investigated which mechanisms are involved in
reproductive regulation in the orchid bee Euglossa melanotricha. Our long-term observations showed
that dominant females monopolized egg laying and were able to recognize the eggs of subordinates.
The overt aggression towards subordinates affected the egg laying behaviour of these females but did
not inhibit their ovarian development. We showed that dominants maintained their monopoly on
reproduction even after their experimental removal. When subordinates were removed, the
productivity of the nest was reduced significantly, indicating clear benefits of the division of labor
between females. We then analyzed the chemical cuticular profile of the females and showed that the
variation in the composition of hydrocarbons reflected the social status of the different individuals in
Euglossa melanotricha. The results of this study suggest that chemical signals evolved as honest
signals and workers restrain themselves to reproduce. This reduces reproductive options but increases
selection pressures on the workers to obtain indirect fitness.
Keywords: dominance behaviour, chemical signalling, status reproductive, Euglossa melanotricha,
social evolution.
Anexos | 180
The evolution of fertility signals in social species with reproductive division of labor provides a
mechanism for group members to evaluate an individual’s reproductive status (Smith, Hölldobler &
Liebig, 2009). In social insects, for example, the process by which the presence of a productive
breeder affects the behaviour of other group members has been previously described (Liebig, 2010;
Nunes et al., 2014). These studies have demonstrated that honest signaling among competing
individuals can increase colony fitness. However, conflicts are known to be more likely when rivals
are reproductively equivalent (Ratnieks, Foster & Wenseleers, 2006). Conflict can be expressed
through physical dominance, which is a fundamental aspect of the establishment of the division of
labor between breeders and non-breeders (Liebig, Peeters & Hölldobler, 1999). On the other hand,
overt dominance is potentially deleterious because individuals involved in agonistic interactions may
be less productive than non-competing ones (Gobin & Ito, 2003; Zanette et al., 2012).
In social insects, cuticular hydrocarbons (CHCs) constitute the main source of the signals used for
communication and chemical recognition (Blomquist & Bagnères, 2010). The occurrence of specific
chemical compounds on the cuticule, which can be used for communication of the activation of the
ovaries or social status have been reported in several studies (Nunes et al 2014; Teseo, Kronauer,
Jaisson & Cháline, 2013). Reproductive signaling is particularly important when a group of totipotent
fertile females dispute dominance (Zanette & Field, 2009). Empirical evidence indicates that the
unidirectional nature of the dominance hierarchy in primitively eusocial hymenopterans evolved from
the coercion and secondarily through odor recognition (e.g. Polistes, Downing & Jeanne, 1985;
Ropalidia, Premnath, Sinha & Gadagkar, 1996; Dinoponera, Monnin & Peeters, 1999; Bombus,
According to the honest signal hypothesis, the odors emitted by reproductive females advertise
both mating status and fertility (Keller & Nonacs, 1993), and the response of the other members of the
group may be proportional to the reproductive status of the queen (Evison, Ferreira, d’Ettorre,
Fresneau & Poteaux, 2012). The etho-physiological effects of putative queen pheromones have been
demonstrated in workers of some species of ants, bees, and wasps (Holman, Jørgensen, Nielsen &
d’Ettorre, 2010; Nunes et al., 2014; van Oystaeyen et al., 2014; van Zweden, Bonckaert, Wenseleers &
d’Ettorre, 2014). Recent evidence also indicates that the cuticular hydrocarbons of the queen
Anexos | 181
pheromone are conserved over a range of eusocial taxa, suggesting that the fertility associated signals
is an ancestral trait, and was probably present in the ancestral solitary insects that gave rise to the
The orchid bees (tribe Euglossini) are considered a key group for the understanding of the
evolution of eusociality in the corbiculates (Apini + Meliponini + Bombini), because they present
from solitary, communal to primitively eusocial species (Augusto & Garófalo 2010; Cocom Pech,
May-Itza, Medina Medina & Quezada-Euan, 2008; Soucy, Giray & Roubik, 2003; Cardinal &
Danforth, 2011). Previous studies have speculated that solitary behaviour in the orchid bees would be
an evolutionary reversion, with some Euglossa species retaining some eusocial traits (Cameron 2003,
Cardinal et al., 2010). Other reports, however, state that eusociality was inherited from an eusocial
ancestor to all corbiculates (Zucchi, Sakagami & Camargo, 1969; Chavarría & Carpenter, 1994; Noll,
2002, Canevazzi & Noll, 2014). Therefore, the study of behavioural biology of orchid bees can
Despite the existence of an extensive database for bumblebees (Ayasse et al., 1999), honeybees
(Wossler & Crewe, 1999) and stingless bees (Nunes et al., 2014), no evidence is available on the
possible chemical modulation of social relationships in bees of the genus Euglossa. In this study, we
investigated which factors contribute to the social structure of the nest of an orchid bee, Euglossa
melanotricha. We tested how reproductive dominance is established and maintained in these simple
societies. We predicted that, as in other primitively eusocial species, overt aggression towards
subordinate individuals affected egg laying behaviour of these females but did not inhibit their ovarian
development. In addition, we verified using a series of removal experiments whether dominant status
METHODS
Life history
Euglossa melanotricha is a medium-sized bee (body length 13 mm) commonly found in open areas of
savanna habitat in Brazil and Bolivia (Nemésio, 2009). Solitary females found new nests, or females
Anexos | 182
can reuse an old nest, resulting in multi-female nests. Reused nests are occupied by two to five
females. All females can potentially mate and lay eggs, although only one female becomes the main
reproductive dominant (Andrade-Silva & Nascimento, 2012). A process of nest reuse (R) is initiated
when two newly emerged females remain in their natal nest and one begins to reproduce in it. The
duration of the reuse process (from when the new females started foraging for resin to their final
oviposition) ranged from 18 to 79 days (mean±SD: 46.4±14.9 days, N = 30 nests). Following reuse,
the females remained in the nest without engaging in any further outside activities. This period of
inactivity lasted from 15 to 63 days (mean±SD: 34.11±11.7 days). To control the number of females in
each reused nest, we removed the females during this period of inactivity, and waited for the next nest
Fourteen multi female nests of E. melanotricha were housed in wooden boxes (12 x 10 x 8 cm)
covered with a glass lid. Each box had a circular opening of 1 cm in diameter that allowed the bees to
fly freely, following the same transfer protocol as that adopted by Andrade-Silva and Nascimento
(2012).
The nests were observed prior to the experiments in order to identify the roles of the different
occupants. From each nest, the observation sessions followed methods: all-events records in which we
recorded every performance of a selected set of behaviours by every individual and focal individual to
record the behavioural state of each individual. Both methods followed the same schedule: three times
using mini-cameras (Citrox 5001 color digital day/night). The cameras were positioned on the top of
glass lid, approximately 15 cm above the cells. We marked all bees on each nest with unique spots of
quick drying non-toxic colored paint (Magic®) on their thorax for individual identification.
Anexos | 183
During the course of study, we observed 12 nest invasions by foreign females. So, the distinct
analyzed separately.
We used the data for the focal individuals to compute the proportion of time spent by each bee in a
number of common behaviours, and data from all the events sessions to calculate the hourly rates of
(1) Dominance: ten pairs of females with a stable reproductive structure (i.e. one individual had
been dominant for several weeks) were videotaped for 24 h continuously (240 days; 5760 hours; LD
12:12 h). We focused on the performance of the dominant female, including behaviours as attacking
(overt unidirectional act in which the dominant bites or pulls the antennae, legs or wings of a
subordinate), heading (dominant bumps her head toward the subordinate’s abdomen), overflying
(short threaten flights on the subordinate without direct contact) and pursuing (dominant runs toward
the subordinates pushing her from the cells), and cannibalism of the subordinate’s eggs. We computed
the rates of dominant acts for each bee, after correcting for the proportion of time spent by bees at their
nests, on the given day. Results were analyzed using with Wilcoxon’s exact test.
interactions of the pair, that is, antennating and approaching (dominant follows or touches the
subordinate without removing her from the cells). We computed the rates of non-dominance
(3) Subordinate behaviour: female hides under part of cells or escape to avoid confront.
(4) Other activities: the proportion of time that a bee engaged in activities such as foraging trips or
remained inside the nest engaging in activities such as resting (female stays motionless inside the
nest), self-grooming (both dominant and subordinate clean legs, antennae and wings), and cell
provisioning for egg laying (subordinates build a collar with resin on the edge of a food provisioned
cell, then she performs circular movements along the cell with the head and forelegs inside it, and
Ethical note
additional females removed during the experiments. Research was carried out under permission of
We conducted the experimental sessions in five repetitions for each time interval (N = 10 nests; Table
A1 Supplementary material) between May 2013 and October 2013. Each repetition focused on a new
process of nest reuse, following the emergence of two new females. We manipulated the number of
females, so that only two were monitored in each experiment. In this case, females that emerged from
the nest after the identification of the resident pair of individuals were removed from the experiment
In each nest, the experimental sessions were conducted over three days, between 6 h and 18 h. On
the first day, we observed the nests as described above, without any manipulation. Ten of the 14 nests
From each nest, we removed the dominant on the second day morning, between 0500 h to 0600 h,
and observed the nest on that day, as described above. The dominant removed were maintained in
individual cages (size 3 plastic hair curlers, 2.8 x 6.3 cm). Each cage was provisioned with cotton
wool soaked in a 40% honey water solution in a 2 ml plastic tube. The dominants were reintroduced to
We removed dominants to verify (1) the effects of their presence on the reproductive activity of
the subordinates and (2) recognition and cannibalism of the subordinates’ eggs after dominants’
reintroduction.
Following the same procedure used for the removal of dominant individuals (Table A2,
Supplementary material) we conducted the experimental sessions in which the subordinate individual
Anexos | 185
was removed from ten nests, with five trials for each time interval. As described previously for the
dominant removal experiment, we initiated these experiments using pairs of reproductive females that
had restarted a nest. These experiments were conducted between November 2013 and April 2014.
After verifying the hierarchical order of the pair, we removed the subordinates permanently from each
nest to evaluate the effect of the presence of helpers on the productivity of the dominant females. To
evaluate the effect of the absence of the subordinate on productivity, we compared egg laying rates
before and after removal of the subordinate from each nest using a paired Wilcoxon test.
We recorded during observation time of nests, twelve invasions by females that were successful to
replace dominant position. To evaluate whether body size conferred an advantage for invading
females, the body size of residents and invaders was measured and compared. For this, each individual
was placed in a metal restraining device covered with a glass plate. The intertegular distance of all the
individuals was measured from the photographs taken by a digital camera coupled to a Leica MZ16
stereomicroscope, using Leica Soft IM50 software. For the analysis, only the intertegular distance was
considered, as this is a standard parameter used in studies of Bombus (Couvillon, Fitzpatrick &
Dornhaus, 2010; Goulson et al., 2002) and solitary species (Cane, 1987).
Later, we euthanized bees by freezing them and carefully removed the ovaries from the resident
individuals in each nest in ringer solution and photographed the material under stereomicroscope. The
contents of the ovaries were quantified by counting the number of oocytes that were larger than 70%
the length of a mature egg (LME), and mature oocyte length (not including the adjoining trophocyte
chamber) was measured. The spermatheca was removed and placed on a slide in a 1:1 solution of
Chemical analyses
The CHCs of each individual were sampled with a Supelco 7-µmpolydimethylsiloxane fiber, designed to
extract compounds of high molecular weight. Following the current rules for solid phase micro extractions
Anexos | 186
(SMPE) quantification (Romeo, 2009), we used the same conditions and a single fiber to analyze the
compounds from each individual. The bees were first anesthetized for five minutes in a refrigerator (4°C) until
complete immobilization. The fiber was carefully rubbed against the thorax and abdomen for 2 min, and then
desorbed in the injection port of a gas chromatograph for 4 min. Each sample was analyzed by gas
chromatography (GC) associated with mass spectrometry (MS) (SHIMADZU, model QP2010plus, Tokyo,
Japan). The apparatus was equipped with a DB-5MS capillary column, using helium as the carrier gas. The
temperature protocol was 150–280°C at a rate of 3°C/min (held for 15 min), and then raised to 300°C at
5°C/min and held for 15 min. Analyses were conducted in splitless mode, and individual mass spectra were
compared with Wiley library data (McLafferty, 2000) or standard synthetic compounds (n-C25 to n-C29,
Sigma-Aldrich). The double-bond positions of the alkenes were identified through the derivatization of the
hexane extracts obtained from five individuals of each group, based on the procedure described by Carlson,
Statistical analyses
We compared behavioural and physiology variables by using general linear mixed models,
GLMMs (Bolker et al., 2009). We first ran a GLMM to verify whether the level of aggression,
measured by the rate of aggressive behaviours per observed period, was influenced by reproductive
role, body size and/or ovarian development. We then tested whether egg cannibalism was also
regulated by dominance or body size. Each treatment was specified as the fixed effect, and the identity
of the nest as a random effect (Neter, Kutner, Wasserman, Nachtseim & Neter, 1996).
For the chemical analyses, principal components analysis (PCA) was used to identify the main
compound peaks for comparison. Compounds contributing less than 5 % to the first two PCA factors
were excluded from the statistical analysis. The relative concentrations of the compounds used in the
discriminant analysis were then readjusted to 100%. A stepwise forward discriminant analysis was
used to observe whether combinations of variables were characteristic of a given group of females. To
avoid errors in the compositional sample data, the area of each peak was transformed by the following
formula: Z = ln [Ap/g(Ap)], where Ap is the area of the peak, g (Ap) is the geometric mean for each
Anexos | 187
individual compound group, and Z is the transformed peak area (Aitchinson, 1986). All analyses were
RESULTS
Dominance contests
During the 240 days of monitoring of the dominant/subordinate relationships, we recorded a total of
3965 agonistic events (a mean of 33.04 ± 30.57 per nest, N = 14 nests), which allowed us to determine
the hierarchical rank of the bees successfully. Significant unidirectional dominance was recorded in all
nests (Table A1 Supplementary material), in other words, only one individual in each nest presented
agonistic behaviour. Of the total number of events recorded, 2541 (64%) were classified as non-
aggressive and 1424 (36%) as aggressive or involving dominance (Table A1 Supplementary material).
The GLMM indicated that these hostile acts were typically mediated by the relative reproductive
roles of the females in the nests (F1, 59 = 237.66; p< 0.0001), rather than body size (F1, 59 = 0.94; p =
0.34) or ovarian development (F1, 59 = 0.15; p = 0.69). Aggressive encounters consisted in biting in
40% of events (296 of 745), pushing in 24% (182 of 745), overflying in 19% (138 of 745), and pursuit
The dominant females rarely interrupted egg laying by subordinates (18 of 463 laying events
(Table 1). The behavioural dominance, after egg laying by subordinate was followed by active
cannibalism eggs instead (185 out of 252; 73% of ovipositions). The GLMM also confirmed that
cannibalism of eggs could be predicted by dominance position (F1, 165 = 6.62; p< 0.05), rather than
body size (F1, 59 = 0.27, p = 0.60) or ovarian development (F1, 59 = 0.65; p = 0.42). The duration of
cannibalism eggs ranged from 758 s to 1301 s (mean± standard deviation = 999.00 ± 140.70 s; N =
65), and the events were invariably followed by egg-laying by the dominant female.
In 12 event invasions, one per nest, five invader females were significantly larger that dominant
residents; such invaders were able to overthrow reproductive dominance successfully (SI = successful
females, Figure 1). The other seven invaders females of the twelve had no difference of size from
Anexos | 188
dominant residents and remained in the nest performing subordinate activities (Unsuccessful invaders
= UI).
3.77±0.33mm) in comparison with resident dominant (RD: mean± standard deviation = 2.37 ± 0.21
mm; SI vs RD: t = 7.64, p<0.0001) but, dominant residents had no longer ovarioles than subordinates
did (S: mean±standard deviation = 2.25 ± 0.18 mm; RD vs Subordinates: t = 1.57, p = 0.12). Analyses
of the spermatheca of different individuals revealed that all females were inseminated.
Dominants that were removed for less than 36 h were able to recognize the cells containing the eggs of
subordinates in all nests (15 out 15 laid eggs in the period). In this case, after opening a cell and
ingesting the subordinate’s egg, the dominant female immediately laid her own egg in the cell.
However, females returning after periods longer than 36 h did not ingest the eggs laid by subordinates
and also were replaced by their former subordinates. The females that were replaced abandoned the
nest on average two days after the reintroduction (see Table A2 Supplementary material).
In the absence of the subordinate, dominants began cell provisioning, but mean productivity was
significantly lower (4.8 ± 1.19 provisioned cells) than when the subordinates were present (8.4±1.97
provisioned cells: Wilcoxon rank sum test: T = 3, Z = 2.82, p = 0.002, N = 10 nests). Foraging trips
were restarted by dominants in the absence of subordinates (0.0 trips/h to 2.03±0.45 trips/h, N = 10
nests).
The analysis of the cuticular hydrocarbons revealed 63 peaks. Hydrocarbon chains varied from C20 to
C38. Linear alkanes were the most abundant compounds followed by alkenes, and mono- and
Anexos | 189
significantly among the groups of analyzed females (n-alkanes: F1,104 = 139.71; p< 0.00001; alkenes:
F1,104 = 179.19; p< 0.00001; methyl-alkanes: F1,104 = 41.44; p< 0.00001; Figure 2). Dominant females
had more n-alkanes than subordinates, while subordinates presented significantly higher proportions of
Stepwise discriminant analysis separated females significantly by group (global model: Wilks’s λ
= 0.0297; F15,36 = 42.17; p < 0.00001; Fig. 3). The principal compounds separating the groups were n-
2). The classification matrix allocated 92.3% of the individuals tested to their predicted functional
DISCUSSION
Reproductive dominance
In this study, the main results showed that dominant Euglossa melanotricha females monopolize
reproduction by coercion and egg oophagy. The occurrence of coercion in some Euglossa species is
expected because colonies are established by associations of two or three females, and also, that
competition between potential breeders is expected to occur in small societies, when egg laying by
competing females is likely. Thus, in terms of reproductive benefits, dominants would be selected to
recognize and remove the eggs of subordinates, given that they are more closely related to their own
brood (r = 0.5) than to those of a full sister (r = 0.375) or daughter, r = 0.25 (Ratnieks, Foster &
Wenseleers, 2006).
Dominance in E. melanotricha is expressed through direct aggression and active egg oophagy.
Interestingly, these behavioural traits clearly defined the division of labor and hierarchy between
breeders and non-breeders, although their outcomes did not affect the activation of the ovaries of the
subordinates. Founding colonies of primitively eusocial wasps usually present high rates of aggressive
interactions which result in one of the foundresses becoming the breeding queen, while reproduction
Anexos | 190
in the workers is suppressed physiologically (Reeve & Gamboa, 1983, 1987). In bees, substitution by
one of the older subordinates has been observed following the death or disappearance of the dominant
female in Euglossa cordata (Garófalo, 1985), Euglossa fimbriata (Augusto & Garófalo, 2009),
rubicundus (Soucy & Danforth, 2002), and Exoneura bicolor (Schwarz & O’Keefe, 1991). In fact,
conflicts are frequent between residents and invaders in Lasioglossum zephyrum, but never occur
when opponents are genetically related (Kukuk, Breed, Sobti & Bell, 1977). In Xylocopa sulcatipes,
reproductive partitioning among unrelated females involves coercion and egg policing by the
dominant female (Stark, Hefetz, Gerling & Velthuis, 1990). In other primitively eusocial species, such
as Lasioglossum villosulus, dominance disputes are common during the development of the nest, and
egg oophagy may be undertaken by the dominant and the subordinates (Plateaux-Quénu, 1989).
Dominant females that were removed from the nest between 12 and 36 h were subsequently able
to recognize the eggs of subordinates and eat them. This indicates that these incoming females did
regain their reproductive dominance. However, subordinates were more likely to take over the nest
when the dominant females were absent for longer than 36 h. These results demonstrated that the
presence of a dominant female might inhibit both direct reproduction and changes of chemical
hydrocarbon profiles of subordinates. Also, the removal of the subordinate affected dominants’
behavioural activities and nest productivity. Indeed, nest productivity, as measured by the number of
provisioned cells, was significantly reduced when the subordinates were removed from the nest,
indicating clear benefits of the division of labor between breeders and non-breeders. A number of
previous studies have shown that solitary nesting is adaptive only when reproductive incentives for
subordinates are greater than the potential of inheriting the dominant position in the natal nest (Reeve
In E. melanotricha, reproductive dominance did not suppress ovarian activity in the subordinates.
Therefore, while chemical signaling in this species is a reflection of social status, it is not linked to
insemination or ovary activation. Our data clearly showed that dominant females present higher
proportions of n-alkanes than subordinates. The effects of the social environment on the cuticular
Anexos | 191
profiles are particularly interesting here, given the apparently significant role of alkanes in suppressing
The predominant compounds in the cuticle profile of the E. melanotricha females have also been
shown related to dominance in polistine wasps (Polistes fuscatus: Espelie et al., 1994; P. dominulus:
Bonavita-Cougourdan et al., 1991; Polistes dominula: Dapporto, Dani & Turillazzi, 2007; Polistes
satan: Tannure-Nascimento et al., 2008), bumblebees (Bombus terrestris: Sramkova et al., 2008) and
ponerine ants, in which the dominance hierarchy may be established before the development of the
reproductive signal (Cuvillier-Hot, Lenoir, Crewe, Malosse & Peeters, 2004). If chemical compounds
convey social status honestly, as in other insects, the potential risks of fighting could be reduced to
Previous studies suggest that euglossine bees are predominantly solitary or communal, with only a few
species presenting rudimentary eusociality (reviewed in Cameron, 2004 and Dressler, 1982).
However, recent phylogenies indicate that eusociality evolved only once in the common ancestor of
the corbiculate apids, and was subsequently lost in the orchid bees (Cardinal & Danforth, 2011;
Canevazzi & Noll, 2014). The results of the present study provide new insights, and indicate that
elements of eusociality are well-defined in some euglossine bee species. For example, strong
correlation between cuticular profiles and the reproductive status of females have been demonstrated
in many eusocial Hymenoptera (reviewed in Liebig, 2010). However, in this study we showed that this
relationship in Euglossa melanotricha seems to be only partially evolved. Our data support that
dominance hierarchy was primarily established through behaviour, and then reinforced chemically.
Indeed, cuticular hydrocarbons mirror their social ranking, not a result of ovarian activation or its
regression. However, CHCs seem to be effective in keeping the reproductive dominance even in such
a kind of society as we observed in our removal experiments. These aspects of the results suggest that
the organization of typical simple societies such as Euglossa bees can be modulated by more complex
Acknowledgements
The authors thank to Nicolas Châline, Editor Michelle Scott and two anonymous referees for their
important suggestions and improvements on the manuscript. We also thank I.C.C. Turatti for technical
assistance in chemical analyses, Sidnei Mateus for dissections, and Daniel Kronauer and Abraham
Hefetz for inspiring discussions on the study. This study was supported by FAPESP (ACRAS Proc.
2010/19490-0 and FSN Proc. 2010/10027-5).
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Anexos | 193
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Scientific Reports, 4, 1-7.
Anexos | 194
Table 1
Number of ovipositions by subordinates that were completed or interrupted as a result of aggression
by the dominant female.
Table 2
Relative proportion (mean±s.d.) of the 11 peaks selected by discriminant analysis among dominant,
dominant invader and subordinate Euglossa melanotricha females.
Table 3
Discriminant analysis of the cuticular chemical compounds recorded in the groups of successful
invaders, resident dominants and subordinates Euglossa melanotricha females.
4.8
1 mm
4.6
4.4
Intertegular distance (mm)
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
SI UI RD
Figure 1. Body size (Mean ±SD) of successful invader (SI, N=5), unsuccessful invader (UI, N=7) and
resident dominant (RD, N= 12) females in the nests of Euglossa melanotricha. SI x UI: 14.95,
p<0.0001, SI x RD: t = 16.85, p<0.0001, UI x RD: t = 1.35, p=0.19
Anexos | 199
35
30
Proportion of compounds (Mean ± SD)
25
20
15
10
-5
Invader + Dominant Subordinate
5
Inv ader
4 Dominant
Subordinate
3
1
Root 2
-1
-2
-3
-4
-15 -10 -5 0 5 10 15
Root 1
Figure 3. Discriminant analysis based on cuticular hydrocarbon (CHC) profiles of resident dominant
(N = 30), SI invader (N = 5) and subordinate (N = 30) of fourteen nests of Euglossa melanotricha.
Elipses encompass 95% of data.
Anexos | 201
Supplementary material
Table A1
Aggressive and non-aggressive behavioural events recorded for dominant and subordinate Euglossa
melanotricha females and the number of eggs cannibalized in each nest.
23 0 0 Subordinate
N11R3 39 35 8 Dominant
21 0 0 Subordinate
N12R2 31 35 4 Dominant
9 0 0 Subordinate
N12R3 28 27 5 Dominant
11 0 0 Subordinate
N13R2 24 33 4 Dominant
8 0 0 Subordinate
N14R2 59 27 6 Dominant
13 0 0 Subordinate
N14R3 33 32 5 Dominant
15 0 0 Subordinate
Total 2541 1424 185
Anexos | 203
Table A2
Results of the removal experiments: effect of the presence of Euglossa melanotricha dominant
females on the interactions that occurred after their return to the ten nests.
Time After reintroduction:
Experimental Nest Number of females
trials out of Number of Number of
sessions reuse the nest
Dominant Subordinate eggs eaten remained abandoned
1 N1/R1 1 1 (h)
12h 1 1 0
2 N2/R1 1 1 12h 1 1 0
1 3 N3/R1 1 1 12h 1 1 0
4 N4/R1 1 1 12h 1 1 0
5 N5/R1 1 1 12h 1 1 0
1 N6/R1 1 1 24h 1 1 0
2 N7/R1 1 1 24h 1 1 0
2 3 N8/R1 1 1 24h 1 1 0
4 N9/R1 1 1 24h 1 1 0
5 N10/R1 1 1 24h 1 1 0
1 N1/R2 1 1 36h 1 1 0
2 N2/R1 1 1 36h 1 1 0
3 3 N3/R2 1 1 36h 1 1 0
4 N4/R2 1 1 36h 1 1 0
5 N5/R2 1 1 36h 1 1 0
1 N6/R2 1 1 48h 0 0 1
2 N7/R2 1 1 48h 0 0 1
4 3 N8/R2 1 1 48h 0 0 1
4 N9/R2 1 1 48h 0 0 1
5 N10/R2 1 1 48h 0 0 1
1 N1/R3 1 1 60h 0 0 1
2 N2/R3 1 1 60h 0 0 1
5 3 N3/R3 1 1 60h 0 0 1
4 N4/R3 1 1 60h 0 0 1
5 N5/R3 1 1 60h 0 0 1
1 N6/R3 1 1 72h 0 0 1
2 N7/R3 1 1 72h 0 0 1
6 3 N8/R3 1 1 72h 0 0 1
4 N9/R3 1 1 72h 0 0 1
5 N10/R3 1 1 72h 0 0 1
Anexos | 204
Table A3
Relative proportions of cuticular hydrocarbons in resident dominant, invader (SI) and subordinate
Euglossa melanotricha females. Bold letters represent the 11 peaks selected by the statistical analysis.
Nº Dominant Invader Subordinate
KI Compounds
peak Mean ±SD Mean ±SD Mean ±SD
1 2000 Eicosane C20 0.36 ± 0.35 0.35 ± 0.26 0.44 ± 0.38
2 2091 7-Heneicosene C21 0.25 ± 0.07 0.22 ± 0.02 0.20 ± 0.07
3 2100 Heneicosane C21 0.21 ± 0.16 0.24 ± 0.03 0.37 ± 0.08
4 2200 Docosane C22 0.90 ± 0.65 0.97 ± 0.23 0.70 ± 0.68
5 2271 9- Tricosene C23 1.53 ± 0.48 1.24 ± 0.10 0.74 ± 0.04
6 2283 5- Tricosene C23 1.18 ± 0.84 1.20 ± 0.49 2.92 ± 1.64
7a 2300 Tricosane C23 6.03 ± 2.26 8.63 ± 1.44 3.79 ± 2.00
8 2374 9-Tetracosene C24 0.60 ± 0.23 0.65 ± 0.02 0.32 ± 0.05
9 2383 5-Tetracosene C24 0.78 ± 0.56 0.15 ± 0.05 0.86 ± 0.66
10 2400 Tetracosane C24 2.66 ± 0.20 2.16 ± 0.97 7.66 ± 2.48
11 2459 11-Pentacosene C25 0.15 ± 0.00 0.13 ± 0.01 2.42 ± 0.77
12 2479 7-Pentacosene C25 6.03 ± 2.08 6.24 ± 1.61 0.33 ± 0.08
13b 2485 5-Pentacosene C25 10.00 ± 3.61 6.32 ± 0.15 5.46 ± 1.91
14 2495 6,8-Dimethyl C24 _ _ 0.11 ± 0.03
15c 2500 Pentacosane C25 9.66 ± 4.67 16.67 ± 0.67 ± 0.54
16 2505 4,10- Dimethyl C24; 4.8- _ _ 0.36 ± 0.30
17 2530 13-; 11-; 9-Methyl C25 0.06 ± 0.05 0.06 ± 0.03 0.04 ± 0.04
18 2532 7-Methyl C25 0.05 ± 0.05 0.04 ± 0.04 0.04 ± 0.04
19d 2541 5-Methyl C25 0.05 ± 0.05 0.08 ± 0.03 1.33 ± 0.67
20 2552 9,13-Dimethyl C25 0.61 ± 0.56 0.59 ± 0.07 _
21 2560 3-Methyl C25 0.91 ± 0.59 0.86 ± 0.04 0.74 ± 0.45
22 2565 9-Hexacosene C26 0.59 ± 0.42 0.58 ± 0.10 0.84 ± 0.94
23 2578 7-Hexacosene C26 0.09 ± 0.02 0.07 ± 0.02 2.27 ± 0.79
24 2585 5-Hexacosene C26 _ _ 1.45 ± 2.23
25e 2600 Hexacosane C26 2.45 ± 0.47 2.49 ± 0.20 4.26 ± 2.79
26 2603 6,8-Dimethyl C25 0.12 ± 0.06 0.10 ± 0.03 _
27 2608 8,10-Dimethyl C25 0.13 ± 0.05 0.11 ± 0.02 _
28 2632 12-. 10-Methyl C26 _ _ 0.19 ± 0.06
29 2643 3,5-Dimethyl C25 0.16 ± 0.23 0.13 ± 0.03 _
30 2665 11- Heptacosene C27 _ _ 7.54 ± 3.94
31f 2670 9- Heptacosene C27 3.07 ± 0.99 3.12 ± 1.29 5.25 ± 2.02
32 2679 7- Heptacosene C27 1.62 ± 1.13 1.32 ± 0.26 3.92 ± 4.42
33 2686 5- Heptacosene C27 4.01 ± 1.24 3.70 ± 0.25 5.44 ± 3.32
34g 2700 Heptacosane C27 2.99 ± 1.65 6.10 ± 0.28 0.79 ± 0.35
35h 2727 13-; 11-; 9-Methyl C27 0.62 ± 1.32 0.52 ± 0.11 0.88 ± 0.66
36 2730 7-Methyl C27 0.04 ± 0.02 0.03 ± 0.02 0.04 ± 0.03
37 2745 5-Methyl C27 0.04 ± 0.04 0.03 ± 0.02 0.04 ± 0.03
38 2757 3-Methyl C27 2.49 ± 0.35 2.68 ± 1.11 0.31 ± 0.08
39 2765 9- Octacosene C28 0.29 ± 0.07 0.25 ± 0.33 0.48 ± 0.76
40 2678 7- Octacosene C28 0.24 ± 0.24 0.29 ± 0.08 1.66 ± 0.47
41 2800 Octacosane C28 0.56 ± 0.45 0.52 ± 0.04 0.27 ± 0.08
42 2864 11-Nonacosene C29 1.74 ± 0.42 1.47 ± 0.15 3.29 ± 2.69
43i 2876 9-Nonacosene C29 7.90 ± 1.84 6.63 ± 0.56 0.24 ± 0.04
44 2886 7-Nonacosene C29 _ _ 2.80 ± 2.26
45j 2900 Nonacosane C29 3.31 ± 1.65 5.28 ± 0.49 1.96 ± 1.88
46 2904 4,8-Dimethyl C28 _ _ 0.13 ± 0.07
47 2919 13-; 11-; 9-Methyl C29 0.27 ± 0.29 0.19 ± 0.09 0.55 ± 0.35
48 2926 7-Methyl C29 0.12 ± 0.11 0.11 ± 0.08 0.35 ± 0.27
49 2934 5-Methyl C29 0.05 ± 0.05 0.04 ± 0.03 0.04 ± 0.04
Anexos | 205