R - T - Betina Westphal Ferreira

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
BETINA WESTPHAL FERREIRA
LINHAGENS GENÉTICAS EM Anopheles cruzii Dyar & Knab, 1908

(DIPTERA: CULICIDAE): ASPECTOS MOLECULARES, ECOLÓGICOS E
MORFOMÉTRICOS
CURITIBA
2017
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
BETINA WESTPHAL FERREIRA
LINHAGENS GENÉTICAS EM Anopheles cruzii Dyar & Knab, 1908

(DIPTERA: CULICIDAE): ASPECTOS MOLECULARES, ECOLÓGICOS E
MORFOMÉTRICOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas, área de
concentração Entomologia, Departamento de
Zoologia, Setor de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Paraná, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Doutor em Ciências Biológicas (Entomologia).
Orientador: Prof. Dr. Mario Antônio Navarro

da Silva
CURITIBA
2017
AGRADECIMENTOS
Ao longo desta caminhada do doutorado, tive a colaboração (direta ou

indiretamente) de muitas pessoas, a estas não poderia deixar de agradecer e
mencionar seus nomes.
Aos Prof. Dr. Maurício Osvaldo Moura e Dr. Rodrigo dos Santos Machado
Feitosa, por todo o apoio, orientação e confiança, principalmente nas etapas
finais do meu doutorado.
Ao Prof. Dr. Mário Antônio Navarro, pela oportunidade de trabalhar em
seu laboratório pelos últimos nove anos de minha carreira.
À Dra. Luísa Damazio Rona Pitaluga, por todas as discussões sobre os
dados e por ter cedido parte das amostras analisadas.
Ao Dr. Andreas Luiz Schwarz Meyer pelas sugestões e colaboração nas
análises de sobreposição de nicho.
À Universidade Federal do Paraná e ao programa de Pós-graduação em
Entomologia, pela estrutura e oportunidade de realização do doutorado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) pela concessão da bolsa.
À banca examinadora, por aceitarem o convite de participar da avaliação
da tese e pelas valiosas sugestões para o aprimoramento deste trabalho.
Ao Dr. Vitor Becker, sua esposa Clemira e filha Moema, por todo o apoio
para a realização da coleta na Reserva Natural Serra Bonita (Camacan-BA).
A todos os integrantes (atuais e passados) do LAMFIC2 pelas discussões,
inúmeros cafezinhos e pelo convívio. Especialmente Thalita Bastida Vieira e
Gisele dos Santos Morais pela valiosa amizade! Thali, obrigada pela ajuda com
as análises de morfometria e pela parceria de sempre, seja em trabalhos de
campo ou trabalhos paralelos, e Gi por todos esses anos de convívio e apoio
desde a IC. A Vinícius Sobrinho Richardi pelos ótimos trabalhos de campo, em
que os mosquitos quase nos carregaram!
As meninas da Sala 7 (RIP), Camila Fediuk de Castro Guedes a Maria
Fernanda da Cruz Caneparo. Obrigada pelos ótimos anos de amizade, que me
ajudaram muito nos momentos difíceis e que estavam lá para se alegrar com
cada conquista também!
À Silvana Lampert e Marcoandré Savaris por compartilharem comigo
tanta experiência e amor pelo que fazem. Obrigada pelos exemplos e pelos
divertidos e produtivos trabalhos de campos em que tive a oportunidade de
trabalhar com vocês.
À toda a minha família, em especial aos meus pais por todo incentivo e
esforços em nos proporcionar sempre a melhor formação, obrigada por tantos
maravilhosos exemplos em nossas vidas. Ao meu pai agradeço especialmente
por toda a ajuda quando precisava ir até Morretes coletar os mosquitos para o
doutorado ou trabalhos paralelos.
Ao meu marido Leandro Danderfer Alves Ferreira, obrigada por tornar
essa trajetória mais leve e divertida! Agradeço por tanto incentivo, amor,
paciência, carinho e inúmeros exemplos de como aprender a lidar com os
tropeços e pedras no caminho... Só você sabe o que passei (e passamos juntos)
para concluir esta etapa e agradeço por sempre estar ao meu lado! Ich liebe dich!
Com carinho,
Betina
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,
mas lutei para que o melhor fosse feito.
Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus,
não sou o que era antes”.
Martin Luther King
GENERAL ABSTRACT
The Culicidae (Diptera) family comprises a diverse group of mosquitoes spread

through temperate and tropical regions around the world. There are 3,555
species included in this family, many of which are vectors for a number of
pathogens to humans. Anopheles cruzii is considered the main vector of the
etiologic agent of malaria in the south and southeast regions of Brazil. Given its
epidemiologic relevance, a number of studies have been carried on morphologic
and molecular characteristics of An. cruzii. Those studies suggest that An. cruzii
may represent a complex of species, however the distribution, quantity and status
of the different lineages is still uncertain. In light of this, the objective of this thesis
is to characterize the genetic lineages of An. cruzii in regards with morphological,
molecular and ecological variances. The thesis is divided in two chapters, the first
one named “Analysis of population structure of Anopheles (Kerteszia) cruzii Dyar
& Knab, 1908 (Diptera: Culicidae) through mitochondrial markers and wing
geometric morphometry” and the second one “Ecological niche overlap among
genetic lineages of Anopheles (Kerteszia) cruzii Dyar & Knab, 1908 (Diptera:
Culicidae)”. As results of the first chapter four genetic lineages were described
for An. cruzii, being these located in Camacan-BA, Itaparica-BA, Morretes-PR +
Tapiraí-SP and Florianópolis-SC + Itatiaia-RJ. All of these lineages presented
high levels of Fst, absence of migrants and exclusive clades in phylogenetic
analyzes of maximum likelihood. The interpopulational phenotypic variation was
also observed, being the wings of the populations of Camacan-BA and Ilha do
Mel-PR morphologically distinct from the other populations analyzed. The second
chapter evaluated the existence of ecological niche conservatism among the
different genetic lineages of An. cruzii. The results revealed the existence of
available habitat overlap for the occurrence of the two lineages in the States of
São Paulo and Rio de Janeiro. The results suggest that the climatic niche
characteristics of the groups A and B may not have been the most important to
guide a possible speciation process in progress, since the overlap of niches
among the analyzed lineages was observed.
Keywords: genetic diversity, phenotypic variability, ecological niche.
RESUMO GERAL
A família Culicidae (Diptera) compreende um diverso grupo de mosquitos
distribuídos entre as regiões temperadas e tropicais no mundo, na qual estão
incluídas 3.555 espécies, sendo muitas destas capazes de transmitir diversos
patógenos para os humanos. Anopheles cruzii é considerado o principal vetor do
agente etiológico malária nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. Devido à sua
importância epidemiológica, alguns estudos sobre a caracterização morfológica
e molecular da espécie foram realizados. Estes estudos sugerem que An. cruzii
pode representar um complexo de espécies, porém a distribuição, quantidade e
o status destas diferentes linhagens ainda é incerto. Diante deste cenário, o
objetivo da tese foi caracterizar as linhagens genéticas de An. cruzii quanto a
variações morfológicas, moleculares e ecológicas. Com isso, a tese apresenta-
se dividida em dois capítulos, o primeiro intitulado “Análise da estrutura
populacional de Anopheles (Kerteszia) cruzii Dyar & Knab, 1908 (Diptera:
Culicidae) com base em marcadores mitocondriais e morfometria geométrica” e
o segundo “Sobreposição de nicho ecológico entre linhagens genéticas de
Anopheles (Kerteszia) cruzii Dyar & Knab, 1908 (Diptera: Culicidae)”. Como
resultados do primeiro capítulo quatro linhagens genéticas foram descritas para
An. cruzii, sendo estas localizadas em Camacan-BA, Itaparica-BA, Morretes-PR
+ Tapiraí-SP e Florianópolis-SC + Itatiaia-RJ. Todas estas linhagens
apresentaram altos índices Fst, ausência de migrantes e representação em
clados exclusivos nas análises filogenéticas de máxima verossimilhança. A
variação fenotípica interpopulacional também foi constatada, sendo as asas das
populações de Camacan-BA e da Ilha do Mel-PR distintas morfologicamente das
demais populações analisadas. No segundo capítulo foi avaliada a existência de
conservação de nicho ecológico entre as diferentes linhagens genéticas de An.
cruzii. Os resultados revelaram a existência de sobreposição de hábitat
disponível para a ocorrência das duas linhagens nos Estados de São Paulo e
Rio de Janeiro. Os resultados apresentados sugerem que as características do
nicho climático dos grupos A e B talvez não tenham sido as mais importantes
para dirigir um possível processo de especiação em andamento, já que
observou-se a sobreposição de nichos entre as linhagens analisadas.
Palavras-chave: diversidade genética, variações fenotípicas, nicho ecológico.
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I
ANÁLISE DA ESTRUTURA POPULACIONAL DE Anopheles (Kerteszia)
cruzii Dyar & Knab, 1908 (DIPTERA: CULICIDAE) COM BASE EM
MARCADORES MITOCONDRIAIS E MORFOMETRIA GEOMÉTRICA ALAR
Figura 01: Ciclo de Vida de Anopheles cruzii, com os estágios de ovo, larva, pupa e
adulto. Escala com 0,5mm.............................................................................................15
Figura 02: Remanescentes florestais de Mata Atlântica no Brasil. Modificado de: Atlas
dos remanescentes florestais da mata atlântica período 2014-2015. Fundação SOS
Mata Atlântica Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais..............................................18
Figura 03: Mapa com as localidades amostradas nas análises de morfometria
geométrica alar. Legenda: 1. Camacan-BA; 2: Cananéia-SP; 3: Ilha do Mel-PR; 4:
Antonina-PR; 5: Morretes-PR; 6: São Francisco do Sul-SC; 7: Florianópolis-SC; 8: Santo
Amaro da Imperatriz-SC................................................................................................28
Figura 04: Localização dos marcos anatômicos do tipo 1 utilizados nas análises de
morfometria geométrica da asa direita de fêmeas de Anopheles cruzii..........................31
Figura 05: Alterações de forma dos 23 marcos anatômicos (LMs) nas asas de
Anopheles cruzii evidenciadas através de uma análise de componentes principais PCA.
Representação do quadrante positivo do primeiro componente principal (PC1). A cor
azul clara indica a configuração consenso e a azul escura a variação de
forma.............................................................................................................................37
Representação do quadrante negativo do primeiro componente principal (PC1). A cor
forma.............................................................................................................................38
Representação do quadrante positivo do segundo componente principal (PC2). A cor
forma.............................................................................................................................38
Representação do quadrante negativo do segundo componente principal (PC2). A cor
forma.............................................................................................................................39
Figura 09: Diagrama de dispersão em relação a Análise de Variáveis Canônicas (CVA),
resultante da comparação da forma das asas de Anopheles cruzii de acordo com os
quatro Estados analisados. Legenda: Ba: Bahia, PR: Paraná, SC: Santa Catarina, SP:
São Paulo......................................................................................................................40
quatro Estados analisados. Legenda: Ba: Bahia, PR: Paraná, SC: Santa Catarina, SP:
São Paulo......................................................................................................................41
Figura 11: Diagrama de deformação derivado da variável canônica 1 (CV1) nas asas
de Anopheles cruzii. Os vetores indicam as direções das deformações da configuração
das asas dos Estados analisados, em relação a configuração consenso. A.
representação do extremo positivo, onde existe maior representação de amostras de
São Paulo e Santa Catarina. B. Representação do extremo negativo, onde há maior
distribuição da Bahia e Paraná.......................................................................................42
Figura 12: Reconstruções gráficas das asas de Anopheles cruzii derivadas das
deformações obtidas através da análise de variável canônica 1 (CV1), resultante da
comparação entre os Estados analisados, com escala de visualização de 10x. As linhas
claras indicam a configuração consenso e as escuram as observadas nas populações.
A. Reconstrução gráfica das asas do extremo positivo. B. Reconstrução gráfica das
asas do extremo negativo..............................................................................................42
Bahia, São Paulo e Santa Catarina. B. Representação do extremo negativo, onde há
maior distribuição do Paraná..........................................................................................43
deformações obtidas através da análise de de variável canônica 2 (CV2), resultante da
comparação dos Estados analisados, com escala de visualização de 10x. As linhas
Bahia e São Paulo. B. Representação do extremo negativo, onde há maior distribuição
do Paraná e Santa Catarina...........................................................................................45
deformações obtidas através da análise de de variável canônica 3 (CV3), resultante da
comparação entre os Estados analisados, com escala de visualização de 10x. As linhas

resultante da comparação da forma das asas de Anopheles cruzii de acordo com as oito
populações analisados. Legenda: ANT: Antonina-PR; CAM: Camacan-BA; CAN:
Cananéia-SP; FLO: Florianópolis-SC; MEL: Ilha do Mel: PR; MOR: Morretes-PR; SAM:
Santo Amaro da Imperatriz-SC; SFR: São Francisco do Sul-
SC..................................................................................................................................48
Figura 18: Diagrama de deformação derivado da variável canônica 1 (CV1). Os vetores
indicam as direções das deformações da configuração das asas das populações de
Anopheles cruzii analisadas, em relação a configuração consenso. A. representação do
extremo positivo, onde existe maior representação da amostra de Camacan-BA. B.
Representação do extremo negativo, onde há maior distribuição de Cananéia-
SP..................................................................................................................................49
Figura 19: Reconstruções gráficas das asas derivadas das deformações obtidas
através da análise de CV1, resultante da comparação das populações de Anopheles
cruzii analisadas, com escala de visualização de 10x. As linhas claras indicam a
configuração consenso e as escuram as observadas nas populações. A. Reconstrução
gráfica das asas do extremo positivo. B. Reconstrução gráfica das asas do extremo
negativo.........................................................................................................................50
Figura 20: Diagrama de deformação derivado da variável canônica 2 (CV2). Os vetores
indicam as direções das deformações da configuração das asas das populações de
Anopheles cruzii analisadas, em relação a configuração consenso. A. representação do
extremo positivo, onde existe maior representação da amostra de Santo Amarro da
Imperatriz-SC. B. Representação do extremo negativo, onde há maior distribuição da
Ilha do Mel-PR...............................................................................................................51
através da análise de CV2, resultante da comparação das populações de Anopheles
cruzii analisadas, com escala de visualização de 10x. As linhas claras indicam a
configuração consenso e as escuram as observadas nas populações. A. Reconstrução
gráfica das asas do extremo positivo. B. Reconstrução gráfica das asas do extremo
negativo.........................................................................................................................52
Figura 22: Rede de haplótipos gerada a partir da análise do fragmento do gene COI de
sete populações brasileiras de Anopheles cruzii. Os retângulos indicam os haplótipos
ancestrais e o tamanho das elipses é proporcional ao número de indivíduos encontrado
em cada haplótipo. Os círculos menores que ligam os haplótipos representam haplótipos
intermediários não amostrados (missing haplotype)......................................................61
Figura 23: Análise de máxima verossimilhança entre os exemplares de Anopheles cruzii
amostrados em sete localidades, analisados através de fragmento do gene mitocondrial
COI. A história evolutiva foi inferida através do modelo general time reversible. Suporte
dos ramos de acordo com o teste de Bootstrap (1.000 réplicas)....................................65
Figura 24: Rede de haplótipos gerada a partir da análise do fragmento do gene ND4 de
seis populações brasileiras de Anopheles cruzii. Os retângulos indicam os haplótipos
ancestrais e o tamanho das elipses é proporcional ao número de indivíduos encontrado
em cada haplótipo. Os círculos menores que ligam os haplótipos representam haplótipos
intermediários não amostrados (missing haplotype)......................................................71
amostrados em seis localidades, analisados através de fragmento do gene mitocondrial
ND4. A história evolutiva foi inferida através do modelo general time reversible. Suporte
dos ramos de acordo com o teste de Bootstrap (1.000 réplicas)....................................75
Figura 26: Análises de máxima verossimilhança entre os haplótipos provenientes da
análise dos fragmentos dos genes mitocondriais COI e ND4 de Anopheles cruzii. A
história evolutiva foi inferida através do modelo general time reversible. Suporte dos
ramos de acordo com o teste de Bootstrap (1.000 réplicas)...........................................76
CAPITULO II
SOBREPOSIÇÃO DE NICHO ECOLÓGICO ENTRE LINHAGENS
GENÉTICAS DE Anopheles (Kerteszia) cruzii Dyar & Knab, 1908
(DIPTERA: CULICIDAE)
Figura 01: Registros de ocorrência de Anopheles cruzii (Grupos A e B) utilizados na

confecção dos modelos de distribuição........................................................................113
Figura 02: Mapa da modelagem de nicho ecológico para o grupo A de Anopheles cruzii.
A escala de cores refere-se a adequabilidade ambiental de cada região, sendo a cor
azul o hábitat mais inadequado (próximo a 0) e a cor vermelha o habitat mais adequado
(próximo a 1)................................................................................................................114
Figura 03: Mapa da modelagem de nicho ecológico para o grupo B de Anopheles cruzii.
A escala de cores refere-se a adequabilidade ambiental de cada região, sendo a cor
azul o hábitat mais inadequado (próximo a 0) e a cor vermelha o habitat mais adequado
(próximo a 1)................................................................................................................114
Figura 04: Estimativa de sobreposição de nichos entre os grupos analisados (linhagens
genéticas de Anopheles cruzii) e índices de similaridade de Schoener D e Hoellinger’s I
(linhas pontilhadas) na combinação dos três componentes principais mais
informativos.................................................................................................................117
Figura 05: Gráficos representativos da disponibilidade e ocupação dos habitats para os
grupos A e B (linhagens) de Anopheles cruzii analisados, com relação as variáveis de
componentes principais PC1 vs. PC2..........................................................................118
grupos A e B (linhagens) de Anopheles. cruzii analisados, com relação as variáveis de
grupos A e B (linhagens) de Anopheles. cruzii analisados, com relação as variáveis de
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 01: Localidades com exemplares de Anopheles cruzii amostrados para as

análises de morfometria geométrica alar e moleculares (COI e ND4). *Amostras obtidas
no GenBank, sob códigos KM507293 até KM507314....................................................27
Tabela 02: Localização dos 23 marcos anatômicos do tipo 1 utilizados nas análises de
morfometria geométrica alar de fêmeas de Anopheles cruzii. Nomenclatura segundo
Forattini (1996)..............................................................................................................30
Tabela 03: Análise de variáveis Canônicas entre os Estados onde Anopheles cruzii
foram amostrados..........................................................................................................39
Tabela 04: Distâncias de Mahalanobis (triângulo inferior) e percentuais de acerto e
confiabilidade de separação entre os Estados com Anopheles cruzii amostrados, obtida
através da validação cruzada da função discriminante (triângulo superior). Os valores
de p para o teste de permutação (1000 rounds):p˂0,001..............................................46
Tabela 05: Análise de variáveis Canônicas entre as populações de Anopheles cruzii
amostradas em quatro Estados brasileiros....................................................................47
Tabela 06: Distâncias de Mahalanobis (triângulo inferior) e percentuais de acerto e
confiabilidade de separação entre as populações, obtida através da validação cruzada
da função discriminante (triângulo superior). Os valores de p para o teste de permutação
(1000 rounds): ˂0,001. Legenda: ANT: Antonina-PR; CAM: Camacan-BA; CAN:
Santo Amaro da Imperatriz-SC; SFR: São Francisco do Sul-SC....................................53
Tabela 07: Frequências haplotípicas observadas em sete populações de Anopheles.
cruzii analisadas através do fragmento do gene COI. Legenda: CAM: Camacan-BA, ITP:
Itaparica-BA, ITA: Itatiaia-RJ, BOC: Bocaina-RJ, TAP: Tapiraí-SP, MOR: Morretes-PR,
FLO: Florianópolis-SC...................................................................................................55
Tabela 08: Posição da variação nucleotídica entre os sítios 09-129 do fragmento do
gene mitocondrial COI de Anopheles cruzii de sete populações brasileiras. Os
nucleotídeos invariáveis estão indicados com pontos, caso contrário, com o nucleotídeo
alternativo......................................................................................................................56
Tabela 09: Diversidade genética e testes de neutralidade calculados para as sete
populações de Anopheles cruzii. Legenda: k=número médio de diferenças nucleotídicas;
h=diversidade haplotípica; π=diversidade nucleotídica.................................................62
Tabela 10: Análise de variância molecular (AMOVA) para as sete populações de
Anopheles cruzii. Legenda: Gl: graus de liberdade; p:
significância...................................................................................................................62
Tabela 11: Número efetivo de migrantes (triângulo superior) e valores de Fst par-a-par
para COI (triângulo inferior) (p < 0,05). Legenda: CAM: Camacan-BA; ITP: Itaparica: BA;
MOR: Morretes-PR; ITT: Itatiaia-RJ; BOC: Bocaina-RJ; FLO: Florianópolis-SC; TAP:
Tapiraí-SP.....................................................................................................................63
Tabela 12: Resultado da seleção de modelo de evolução nucleotídica, para o gene COI,
realizado entre 24 modelos, usando o modelo Akaike (AIC). Legenda: *Modelo
selecionado; -lnL= probabilidade; K=número de parâmetros do modelo; AIC= valor
Akaike; Delta= diferença entre o valor AIC do melhor modelo com o modelo
especificado; Weight= Peso de AIC; cumWeight= peso acumulado do AIC...................64
Tabela 13: Frequências haplotípicas observadas em seis populações de Anopheles
cruzii analisadas através do fragmento do gene ND4. Legenda: CAM: Camacan-BA,
ITP: Itaparica-BA, ITA: Itatiaia-RJ, BOC: Bocaina-RJ, MOR: Morretes-PR, FLO:
Florianópolis-SC............................................................................................................67
gene mitocondrial ND4 de Anopheles cruzii de seis populações brasileiras. Os
alternativo......................................................................................... ............................68
Tabela 15: Diversidade genética e testes de neutralidade calculados para as seis
h=diversidade haplotípica; π=diversidade nucleotídica.................................................72
Tabela 16: Análise de variância molecular (AMOVA) para as seis populações de
Anopheles cruzii. Legenda: Gl: graus de liberdade; p:
significância...................................................................................................................72
para ND4 (triângulo inferior) (p < 0,05). Legenda: CAM: Camacan-BA; ITP: Itaparica-BA;
MOR: Morretes-PR; ITT: Itatiaia-RJ; BOC: Bocaina-RJ; FLO: Florianópolis-SC............73
Tabela 18: Resultado da seleção de modelo de evolução nucleotídica, para o gene ND4,
especificado; Weight= Peso de AIC; cumWeight= peso acumulado do AIC...................74
CAPITULO II
Tabela 01: Registros georreferenciados de ocorrência de Anopheles cruzii utilizados na

confecção dos modelos de distribuição, com localidades e fonte dos dados. Legenda:
DZUP: Coleção Pe. Jesus Santiago Moure-UFPR e FIOCRUZ: Coleção de Culicidae do
Instituto Oswaldo Cruz.................................................................................................106
Tabela 02: Variáveis climáticas utilizadas nas análises de modelagem de nicho e

sobreposição de nicho. Autovalores da análise de componentes principais (PCA)
apresentados para cada variável ambiental analisada. Os valores das três variáveis
mais informativas de cada PCA estão em negrito.......................................................110
Tabela 03: Sobreposição de nicho entre os dois grupos (linhagens) de Anopheles cruzii
computado com Schoener’s D e Hellinger I, baseada na análise de componentes
principais (PCA)...........................................................................................................115
SUMÁRIO
CAPÍTULO I
1. INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................................ 1

2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 5
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 13
1.1 Malária ............................................................................................................................. 13
1.2 Anopheles cruzii –ciclo de vida, aspectos bioecológicos e distribuição. .............. 15
1.3 Mata Atlântica ................................................................................................................. 17
1.4 Métodos de caracterização populacional em Culicidae........................................... 18
1.4.2 Marcadores moleculares mitocondriais............................................................... 23
2. JUSTIFICATIVA................................................................................................................... 25
3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 26
3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 26
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 26
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................... 27
4.1 Área de estudo ............................................................................................................... 27
4.2 Morfometria geométrica ................................................................................................ 29
4.2.1 Preparo das amostras............................................................................................ 29
4.2.2 Análises estatísticas ............................................................................................... 31
4.3 Variabilidade genética ................................................................................................... 32
4.3.2 Método de extração de DNA ................................................................................ 32
4.3.3 Amplificação, purificação e sequenciamento ..................................................... 33
4.3.4 Alinhamento e edição das sequencias................................................................ 34
4.3.5 Escolha de modelo de evolução molecular ........................................................ 34
4.3.6 Análises estatísticas ............................................................................................... 34
5. RESULTADOS ..................................................................................................................... 37
5.1.1 Análises entre Estados .......................................................................................... 39
5.1.2 Análises por População ......................................................................................... 46
5.2 Variabilidade genética ................................................................................................... 54
5.2.1 Citocromo c oxidase subunidade 1 – COI .......................................................... 54
5.2.2 NADH desidrogenase subunidade 4 – ND4 ....................................................... 66
6. DISCUSSÃO......................................................................................................................... 77
6.2 Marcadores moleculares – COI e ND4 ...................................................................... 78
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................... 82
8. REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 83
CAPITULO II
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 100

2. JUSTIFICATIVA................................................................................................................. 103
3. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 104
3.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 104
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 104
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................. 105
4.1 Obtenção dos dados de distribuição de An. cruzii ................................................. 105
4.2 Seleção de variáveis climáticas................................................................................. 109
4.3 Modelagem de nicho ecológico ................................................................................. 111
4.4 Índices de sobreposição de nicho ............................................................................. 111
5. RESULTADOS ................................................................................................................... 113
5.1 Modelagem de nicho ecológico ................................................................................. 113
5.2 Índices de sobreposição de nicho ecológico ........................................................... 115
6. DISCUSSÃO....................................................................................................................... 121
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 124
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 125
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS GERAIS ............................................................................ 133
10. REFERÊNCIAS GERAIS ............................................................................................... 134
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
A família Culicidae Meigen pertence à Ordem Diptera e inclui atualmente

3.555 espécies válidas de mosquitos, divididas em duas subfamílias
(Anophelinae e Culicinae) e 122 gêneros (Harbach, 2017).
Dentre os Anophelinae, o gênero Anopheles Meigen conta com 475
espécies descritas, distribuídas em oito subgêneros: Anopheles Meigen, Baimaia
Harbach, Rattanarithikul & Harrison, Cellia Theobald, Christya Theobald,
Kerteszia Theobald, Lophopodomyia Antunes, Nyssorhynchus Blanchard e
Stethomyia Theobald. Aproximadamente 100 espécies possuem distribuição
restrita à Região Neotropical e destas, 29 já foram confirmadas como potenciais
vetoras de malária (Sallum et. al., 2000; Marelli et al., 2006; Harbach, 2017).
Dentre as 12 espécies de culicídeos atualmente pertencentes a
Kerteszia, sete possuem registros de ocorrência para o Brasil, sendo estas:
Anopheles bambusicolus (Komp, 1937), Anopheles bellator (Dyar & Knab, 1906),
Anopheles boliviensis (Theobald, 1905), Anopheles cruzii (Dyar & Knab, 1908),
Anopheles homunculus (Komp, 1937), Anopheles laneanus (Correa & Cerqueira,
1944) e Anopheles neivai (Howard, Dyar & Knab 1912) (Colluci & Sallum, 2003).
Diante do cenário de transmissão autóctone de malária em áreas de Mata
Atlântica, vários trabalhos vêm sendo realizados para tentar esclarecer as
características ecológicas, morfológicas e genéticas destes anofelinos. Dentre
estes, An. cruzii destaca-se por ser considerado vetor primário do agente
etiológico causador da malária na região Sul e Sudeste do Brasil (Ferreira & Luz,
2003).
An. cruzii foi inicialmente descrito por Theobald em 1901, como Anopheles
lutzii com base em exemplares coletados no Rio de Janeiro-RJ. Porém, em uma
revisão realizada por Dyar & Knab, 1908, atribuiu-se o nome An. cruzii para a
espécie, tendo em vista que o epíteto específico de Anopheles lutzii já estava
sendo utilizado para Anopheles (Nyssorhynchus) lutzii Cruz, 1901.
Segundo Forattini (2002), a área de distribuição de An. cruzii no Brasil se
estende desde Sergipe até o Rio Grande do Sul, limitando-se ao sistema
montanhoso caracterizado pela Floresta Atlântica e parte da região argentina
representada pelas províncias de Chaco e Missiones.
2
As fêmeas de An. cruzii podem ser diferenciadas das demais espécies

de An. (Kerteszia), exceto de An. homunculus, pela presença de manchas de
escamas brancas na região superior e mediana do mesanepímero, veia R 4+5 com
mancha basal e mediana longa de escamas brancas, base da veia M com
escamas escuras, tarsômeros posteriores 2-5 com ápice branco e ausência de
cerdas acrosticais, escutelares e dorso-centrais (Wilkerson & Peyton, 1991).
An. cruzii é morfologicamente semelhante à An. homunculus, sendo difícil
a identificação através de caracteres taxonômicos tradicionais (Calado et al.,
2005). As fêmeas são diferenciáveis apenas pelos caracteres de coloração dos
palpos maxilares e coloração do tegumento abdominal. Já as larvas podem ser
identificadas pela coloração do tegumento e grau de quitinização do segmento
anal (Martins, 1958; Wilkerson & Peyton, 1991). Como esses caracteres são
difíceis de serem visualizados e possuem um alto grau de variabilidade, a
identificação precisa destes espécimes é possível com o auxílio da análise de
genitália masculina ou análises moleculares.
Lorenz et al. (2012) realizou a distinção das espécies An. cruzii, An.
homunculus e An. bellator, com base na técnica de morfometria geométrica alar
em fêmeas; porém, foi analisada somente uma população de cada espécie,
sendo a variação intraespecífica de cada grupo ainda desconhecida.
Devido à importância epidemiológica de An. cruzii na transmissão de
Plasmodium, alguns estudos sobre a caracterização morfológica e molecular
foram realizados (Carvalho-Pinto & Lourenço de Oliveira, 2004; Rona et al. 2009,
2010, 2013; Malafronte et al. 2007). Estes estudos sugerem que a espécie pode
representar um complexo de espécies, como observado em análises de padrões
de bandas de cromossomos politênicos de uma população de Aldeia dos Índios,
em São Paulo, na qual verificou-se a existência de um alto grau de polimorfismo
e a existência de pelo menos duas espécies crípticas na região (Ramirez et al.,
1994).
A análise de populações de An. cruzii de São Paulo e Santa Catarina
através de padrões de bandas dos cromossomos politênicos levou à descrição
de três padrões geneticamente diferentes, sugerindo a existência de pelo menos
três espécies crípticas. Cada uma dessas espécies apresenta um formato de
cromossomo X (denominadas A, B e C) e indivíduos heterozigotos nunca foram
encontrados nestas populações (Ramirez & Dessen, 2000a,b).
3
Calado et al. (2005) analisaram a variabilidade genética em populações

de An. cruzii utilizando a técnica de PCR-RAPD. As análises indicaram que a
espécie apresenta um alto nível de polimorfismos, expressos na diversidade
genética entre indivíduos irmãos, em indivíduos coletados na mesma localidade
ou em regiões diferentes. Da mesma forma, a análise de sequencias do gene
ITS2 de populações de São Paulo e Santa Catarina revelou a existência de
polimorfismos genéticos e alto grau de diversidade genética entre as populações
(Malafronte et al. 2007).
A possibilidade de An. cruzii representar um complexo de espécies
também foi observada utilizando-se a análise de padrões isoenzimáticos de
várias populações. Carvalho-Pinto & Lourenço de Oliveira (2004) analisaram os
perfis isoenzimáticos de populações de An. cruzii provenientes do Nordeste,
Sudeste e Sul do Brasil. Verificaram a existência de dois grupos geneticamente
isolados, sugerindo a existência de uma população distribuída em uma área
contínua (Santa Catarina, São Paulo e Rio de Janeiro) que é isolada de uma
espécie distinta encontrada no sul da Bahia. Este mesmo resultado foi obtido por
Rona et al. (2009), em um estudo no qual a variabilidade genética do gene
timeless foi avaliada.
A análise de diferenciação genética através de diferentes marcadores,
entre populações de An. cruzii coletadas no Espírito Santo, Rio de Janeiro, São
Paulo e Santa Catarina demonstrou que a população de Itaparica-BA é uma
espécie isolada geneticamente há cerca de 2.4 milhões de anos (Rona et al.
2010a). Além disso, a amostra de Itatiaia-Rio de Janeiro pode ser composta por
duas espécies simpátricas (Rona et al. 2010b, 2013).
Vários estudos vêm demostrando que muitos dos vetores dos agentes
etiológicos da malária como, por exemplo, Anopheles albitarsis Lynch
Arribálzaga, Anopheles gambiae Giles, Anopheles farauti Laveran e Anopheles
oswaldoi (Peryassú), são representados por complexos de espécies, muitas
vezes ocorrendo em simpatria (Rosa-Freitas et al., 1998; Bangs, et al. 2015).
Estas espécies pertencentes a complexos, possuem como característica o fato
de sua identificação não poder ser realizada somente com base em dados
morfológicos, o que ressalta a importância das técnicas de sistemática molecular
para a correta identificação destes vetores (Singh, et al. 2010).
4
An. gambiae e An. quadriannulatus são morfologicamente idênticos e

ambas as espécies possuem competência vetorial para o Plasmodium, já que
são encontradas infectadas por este parasito no ambiente. Porém, somente An.
gambie apresenta capacidade vetorial para transmissão da malária para
humanos, isso porque An. quadriannulatus realiza o repasto sanguíneo em
bovinos ao invés de humanos como observado em An. gambiae (Rinker et al
2013, Neafsey et al. 2015). Diante deste cenário observamos a importância da
correta identificação destes complexos de espécies para a compreensão da
dinâmica desta doença no ambiente.
A degradação ambiental, elevada densidade demográfica em áreas de
Mata Atlântica, fluxo migratório de pessoas com malária para a região extra-
amazônica e as mudanças climáticas têm forte influência na fauna de anofelinos
e consequentemente na transmissão de malária. Portanto, a caracterização da
estruturação genética, fenotípica e de fatores ambientais como ferramentas para
identificar a grande variabilidade genética de An. cruzii, principal vetor do agente
etiológico causador da malária na Mata Atlântica, se faz altamente necessária.
5
2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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10
CAPÍTULO I

MARCADORES MITOCONDRIAIS E MORFOMETRIA GEOMÉTRICA
11
ABSTRACT
The population structure of An. cruzii across the rain forest has been studied
through the analysis of the distribution of genetic and morphometric variances
among populations, which are indicators from the micro-evolutionary perspective.
The samples were collected through traps, suction of hydric contents stored in
bromeliad and engorged wild females. The immatures were breed in the
laboratory up to the adult stage. The morphological variance was studied through
the wing geometric morphometry technique among eight populations, taking
twenty-three anatomic markers from wings of females. The interpopulation
phenotypic variance in An. cruzii was verified, especially in regards with the
population from Camacan-BA and Ilha do Mel-PR. These two populations
presented distinct wing characteristics, being more dissimilar when compared to
the other populations. The genetic diversity analysis of mitochondrial genetic
fragments COI and ND4 was performed for seven populations distributed from
the state of Bahia to Santa Catarina. As a result, four different genetically distinct
lineages were identified: two of them located in Bahia (Camacan and Itaparica);
one in São Paulo (Tapiraí) and Paraná (Morretes); and a fourth one in Rio de
Janeiro (Itatiaia and Bocaina) and Santa Catarina (Florianópolis). The four
groupings are driven by high levels of Fst, absence of migrants and exclusive
clades in the phylogenetic analysis. The results indicate that wing geometry has
informative morphological markers, which can be analyzed along mitochondrial
markers in order to evidence the micro-evolutive processes taking place, which
can be applied for the investigation of the structural population in Culicidae. The
results indicated that An. cruzii represents a complex of at least four genetically
distinct lineages, being the lineage of Camacan-BA also phenotypically distinct,
with regard to the morphology of female wings.
Keywords: Anopheles cruzii, genetic diversity, microevolution, COI, ND4, wing
geometric morphometry.
12
RESUMO
A estrutura populacional de An. cruzii ao longo da Mata Atlântica, foi avaliada por
meio da análise da distribuição de variações genéticas e morfométricas entre as
populações, informativas do ponto de vista microevolutivo. As amostras foram
obtidas em coletas realizadas com armadilha Shannon, sucção de conteúdo
hídrico de bromélias e fêmeas ingurgitadas de campo, sendo os imaturos criados
em laboratório até a obtenção dos adultos. A variação morfológica foi avaliada
com a técnica de morfometria geométrica alar entre oito populações, utilizando-
se 23 marcos anatômicos das asas de fêmeas. A variação fenotípica
interpopulacional em An. cruzii foi constatada, principalmente no que se refere à
população de Camacan-BA e Ilha do Mel-PR. Estas duas populações
apresentaram asas distintas das demais, sendo mais dissimilares quando
comparadas às outras populações. A análise da diversidade genética de
fragmentos dos genes mitocondriais COI e ND4 foi realizada entre sete
populações distribuídas desde o estado da Bahia até Santa Catarina. No que se
refere a diversidade genética foram constatadas quatro linhagens geneticamente
distintas, sendo duas localizadas na Bahia (Camacan e Itaparica), uma em São
Paulo (Tapiraí) + Paraná (Morretes), e a quarta no Rio de Janeiro (Itatiaia e
Bocaina) + Santa Catarina (Florianópolis), todas sustentadas por altos índices
de Fst, ausência de migrantes e clados exclusivos nas análises filogenéticas. Os
resultados apresentados indicam que An. cruzii representa um complexo de pelo
menos quatro linhagens distintas geneticamente, sendo a linhagem de
Camacan-BA também distinta fenotipicamente, no que se refere a morfologia
das asas de fêmeas.
Palavras-chave: Anopheles cruzii, diversidade genética, microevolução, COI,

ND4, morfometria geométrica alar.
13
1. INTRODUÇÃO
1.1 Malária
Dentre as doenças causadas por agentes etiológicos transmitidos por
mosquitos, a malária recebe destaque devido às suas altas taxas de incidência
e mortalidade mesmo existindo métodos de tratamento, prevenção e controle
dos vetores (Manguin & Böete, 2011). No Brasil, cerca de 99% dos casos de
malária são registrados na Região Amazônica, onde estima-se que cerca de 10-
15% da população resida em áreas de risco de transmissão (WHO, 2008). Essa
é considerada a região endêmica da doença no Brasil, onde a transmissão é
sustentada pelos anofelinos pertencentes ao subgênero Nyssorhynchus
Blanchard, dentre os quais o Anopheles (Nys.) darlingi Root, 1926 é considerado
o principal vetor (Oliveira-Ferreira, et al. 2010).
Uma combinação de vários fatores favorece a transmissão da doença na
região. A extensa Bacia Amazônica, com grandes áreas de planície inundável e
rios, fornece o habitat ideal para o desenvolvimento das formas imaturas de
Nyssorhynchus (Lourenço-de-Oliveira et al, 1998). Além disso, algumas
condições de trabalho (extrativismo e desmatamento) e condições precárias de
vida expõe a população ao vetor (Tauil et al. 1998).
Focos isolados da doença também são registrados em regiões extra-
amazônicas, ao longo do bioma da Mata Atlântica nos Estados da Bahia
(SVS/MS, 2015), Espírito Santo (Cerutti, 2007), Paraná (Ferreira & Luz, 2003,
Falavigna-Guilherme et al 2005), Rio de Janeiro (Miguel et al. 2014), Santa
Catarina (Machado et al. 2003) e São Paulo (Branquinho et al. 1997; Marques et
al. 2008; Laporta et al. 2016). Estes casos são provocados pela presença de
humanos infectados (vindos da região Amazônica e outros países) em locais
onde a densidade de vetores é alta o suficiente para permitir o reestabelecimento
do ciclo, o que confirma que estes casos autóctones não são eventos raros e
que necessitam de vigilância constante (Barata, 1995).
Os casos de malária extra-amazônica também são conhecidos como
“bromélia-malária”, assim denominada devido à associação dos registros da
doença com áreas de ocorrência de bromélias, abundantes na Mata Atlântica,
revestindo os vales e montanhas da Serra do Mar (Oliveira-Ferreira et al. 2010).
Nessas áreas, os principais vetores são os anofelinos pertencentes ao
14
subgênero Kerteszia, cujas formas imaturas se desenvolvem na água

acumulada nas axilas de bromélias, com exceção de An. bambusicolus Komp
que se desenvolve em internódios de bambu (Zavortink, 1973; Marelli et al.,
2007).
Diante da relação entre a malária, as bromélias na Mata Atlântica e o
elevado número de casos registrados nos anos 1940, medidas de controle e
prevenção incluíam desmatamento e eliminação das bromélias nas matas,
juntamente com o uso de inseticidas químicos e antimaláricos. Essas medidas
resultaram na drástica diminuição dos casos na região da Mata Atlântica (de
40.000 em 1940 para apenas 71 em 1982) (Deane, 1988).
Apesar das medidas de controle implementadas no passado terem
reduzido drasticamente o número de casos, a malária não foi erradicada na
região. Com a preservação da Mata Atlântica através de legislações ambientais,
o desmatamento e extração de bromélias é proibido atualmente (Marelli et al.
2007). Com isso, os An. (Ker.) são coletados em abundância em locais com
grande oferta destes criadouros (Bona & Navarro-Silva, 2008). Este cenário atual
em que os anofelinos, o Plasmodium e o homem coexistem, exige vigilância
constante para prevenir episódios epidêmicos (Marelli et al. 2007).
A detecção de An. cruzii naturalmente infectados por Plasmodium vivax

Grassi & Feletti 1890 e Plasmodium malariae (Feletti & Grassi, 1889) já foi
relatada em estudos realizados na Mata Atlântica no estado de São Paulo, nas
regiões de Itanhaém, Juquitiba, Parrelheiros e São Vicente (Branquinho et al,
1997; Duarte et al. 2013; Neves et al. 2013; Kirchgatter et al. 2014). A infecção
de An. cruzii por Plasmodium falciparum Welch, 1897 foi recentemente relatada
por Laporta et al. (2015) no Estado de São Paulo na localidade de Tapiraí,
sugerindo que este mosquito também pode estar envolvido na sua transmissão.
An. cruzii também é considerado o principal vetor de malária simiana nas
regiões Sul e Sudeste do Brasil. Neste ciclo, o culicídeo pode ser infectado e
transmitir Plasmodium simium Fonseca, 1952 e Plasmodium brasilianum Gonder
& von Berenberg-Gossler, 1908 para macacos bugio (Aloutta spp.) (Deane,
1992).
15
1.2 Anopheles cruzii –ciclo de vida, aspectos bioecológicos e distribuição.

Os adultos de An. cruzii podem sobreviver de 35 a 56 dias em
observações realizadas em ambiente natural (Ferreira et al. 1969a). As fêmeas
ovipositam em média 30 ovos por postura, sendo que estes possuem cerca de
0,5mm de comprimento e possuem flutuadores laterais que permitem a sua
permanência na superfície da água (fig. 01) (Wilkerson & Peyton, 1991; Calado
2005). O tempo de desenvolvimento pode variar dependendo das condições
ambientais, mas em laboratório este período, compreendido entre o estágio de
ovo até adulto, é de aproximadamente 35 dias (Wilkerson & Peyton, 1991).
Figura 01: Ciclo de Vida de Anopheles cruzii, com os estágios de ovo, larva, pupa e
adulto. Escala com 0,5mm.
Em ambiente natural foi observado um número baixo de larvas da mesma

espécie por criadouro, o que indica que as fêmeas provavelmente ovipositam em
pequenas quantidades para evitar a competição por recursos pelos imaturos
(Forattini, 1961; Calado 2005).
Os imaturos desenvolvem-se nas axilas de bromélias, tanto epífitas como
terrestres, com diferentes capacidades hídricas, variando desde 5 ml até 2 litros.
Além disso, as bromélias são encontradas em vários habitats, desde o nível do
mar até 600 m de altitude, tanto no solo como no dossel (Zavortink, 1973).
Aragão (1964) verificou que existem diferenças comportamentais quanto
à utilização de criadouros nas populações de Brusque-SC e Guaratuba-PR.
16
Nestas localidades, as fêmeas ovipositam em dois estratos distintos, um ao nível

do solo e outro na copa das árvores, sugerindo a existência de duas entidades
taxonômicas distintas nestes locais. Geralmente An. cruzii move-se com grande
facilidade entre os estratos verticais na mata, do dossel para o solo e vice-versa,
mas apresenta diferentes graus de acrodendrofilia entre as regiões do Brasil. Em
Joinville-SC é eclética, alimentando-se próximo ao solo, mas também em
diferentes níveis na mata. Já na Floresta de Cantareira-SP, observou-se que a
espécie é tipicamente acrodendrófila (Deane, 1992). A possível evidência de
estruturação vertical na espécie foi evidenciada em Cananéia-SP, com base em
dados moleculares e morfometria de asas de amostras de planície e montanhas,
o que levantou suspeitas quanto ao status taxonômico da espécie (Lorenz et al.
2014).
As fêmeas de An. cruzii realizam hematofagia preferencialmente durante
os crepúsculos matutino e vespertino, podendo picar também durante o dia. É
uma espécie exofílica, sendo mais frequente dentro da mata; no entanto, pode
invadir domicílios em algumas áreas (Guimarães et al., 2000). Em relação à fonte
de repasto sanguíneo, a espécie parece ser bem eclética, realizando o repasto
sanguíneo em humanos, outros mamíferos e aves (Deane, 1984). A capacidade
de dispersão de An. cruzii foi avaliada por Ferreira et al. (1969) em Guaratuba-
PR, onde observou-se que os adultos conseguem se dispersar por até 1000
metros na direção do vento predominante.
As espécies do subgênero Kerteszia possuem ampla distribuição nas
Américas, sendo registradas desde o México até o Sul do Brasil. A maioria das
espécies ocorre em áreas costeiras do oceano Pacífico e Atlântico onde as
Bromeliaceae, criadouros dos imaturos, são abundantes (Zavortink, 1973;
Marelli, et al. 2007).
A distribuição de An. cruzii no Brasil se estende desde o Estado de
Sergipe até o Rio Grande do Sul em áreas de Mata Atlântica (Zavortink, 1973;
Forattini, 2002). Segundo Forattini et al. (1986), em Cananéia-SP a espécie é
mais frequente em áreas montanhosas e suas encostas, do que nas planícies.
Nas montanhas da Serra da Bocaina, nos municípios localizados nas divisas
entre São Paulo e Rio de Janeiro, An. cruzii foi o mosquito mais abundante em
coletas em altas altitudes (Guimarães et al. 2000).
17
1.3 Mata Atlântica

A Mata Atlântica (MA) é considerada um dos biomas mais diversos e
ameaçados do planeta, representando um dos 25 hotspots mundiais de
biodiversidade, com mais de 8.000 espécies de plantas e vertebrados endêmicos
(Meyers et al 2000). A área original revestida pela MA abrangia cerca de
1.300.000km2, estendendo-se ao longo da costa brasileira, chegando até o
Paraguai e Argentina. Atualmente somente cerca de 7,5% da floresta primária
permanece intacta (fig. 02) e desta, apenas 35% está em áreas protegidas
(Meyers et al 2000, Galindo Leal & Câmara, 2003).
A MA é caracterizada por uma sazonalidade bem acentuada, altos
gradientes ambientais (devido à topografia) e chuvas orográficas, como
resultado dos ventos do leste do Oceano Atlântico. Devido a esta complexidade
de fatores, a MA apresenta uma paisagem diversificada, composta por florestas
abertas, fechadas, deciduais e semi-deciduais (IBGE, 2012).
No que se refere a história evolutiva da MA, vários estudos apontam para
a existência de descontinuidades filogeográficas ao longo de sua extensão,
observadas em diferentes organismos como: abelhas (Batalha-Filho et al. 2010),
aves (Cabanne et al. 2008), mamíferos (Martins et al. 2009), plantas (Palma-
Silva et al. 2009), répteis e anfíbios (Carnaval et al. 2014).
A teoria dos refúgios florestais é a principal hipótese de diversificação
utilizada para explicar as descontinuidades de distribuição das espécies
estudadas. Segundo esta hipótese, oscilações climáticas ocorridas durante o
quaternário, foram marcadas por ciclos de expansão e retração de geleiras
durante períodos glaciais (alternando-se climas frios e secos) e períodos
interglacias (quentes e úmidos), que levaram a alteração da distribuição de
plantas e animais, com implicações sobre os padrões atuais de diversidade
(Barnosky, 2005; Benett & Provan, 2008).
18
Figura 02: Remanescentes florestais de Mata Atlântica no Brasil. Modificado de: Atlas
dos remanescentes florestais da mata atlântica período 2014-2015. Fundação SOS
Mata Atlântica Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais.
O isolamento espacial entre estes refúgios pode agir como barreira de

dispersão para alguns organismos que apresentam distribuição restrita a estas
áreas, ocasionando a interrupção do fluxo gênico entre populações de uma
espécie, levando a especiação por vicariância e divergência genética (Haffer,
1982).
Esses endemismos filogeográficos são resultado de três mecanismos
principais: diferenciação das linhagens, manutenção destas linhagens ao longo
do tempo e restrição de ocorrência (devido a fatores abióticos ou bióticos)
(Pressey et al. 1994).
1.4 Métodos de caracterização populacional em Culicidae

Os culicídeos, de modo geral, apresentam uma grande capacidade
adaptativa, evidenciada em Anophelinae pela grande quantidade de espécies
crípticas, como por exemplo An. albitarsis Lynch Arribálzaga, An. farauti Lavern,
19
An. gambiae Giles, An. oswaldoi (Peryassú) e An. triannulatus (Neiva & Pinto)
(Rosa-Freitas et al. 1998). An. cruzii apresenta um desenvolvimento rápido em
condições ambientais controladas (temperatura, luminosidade e alimento),
completando o seu ciclo de vida em média em 35 dias, o que permite uma rápida
taxa de evolução entre suas populações (Wilkerson & Peyton, 1991).
A microevolução pode ser definida como uma mudança na frequência
alélica observada dentro e entre populações, sendo a formação de novas
espécies movida por processos como seleção natural e sexual, deriva genética
e fluxo gênico (Hendry & Kinnison, 2001). Análises que visam descrever padrões
e processos microevolutivos devem incluir diferentes variáveis biológicas para
garantir maior precisão nos resultados, uma vez que as taxas de evolução entre
os caracteres são diferentes na espécie (Paupy et al. 2010, Vidal & Suesdek,
2012).
O primeiro passo para a detecção de microevolução é a caracterização
populacional, comparadas em transectos geográficos e/ou temporais, realizada
através de padrões genéticos, morfológicos e comportamentais. Isso pode ser
realizado utilizando-se técnicas como morfometria geométrica (caracterização
morfológica) e sequenciamento de fragmentos de genes mitocondriais
(caracterização molecular).
1.4.1 Morfometria geométrica - marcador morfológico
A morfometria geométrica é um conjunto de técnicas com um propósito

em comum: a análise estatística de diferenças de forma utilizando uma descrição
quantitativa que preserva a geometria (Viscosi & Cardini, 2011). As análises de
morfometria geométrica são baseadas em marcos anatômicos que capturam a
forma de uma estrutura usando uma configuração de pontos em coordenadas
cartesianas. Estes pontos devem ter uma correspondência entre os espécimes
a serem comparados e o tipo de correspondência (topográfica, anatômica ou
desenvolvimento) dependerá das questões científicas a serem analisadas
(Oxnard & O’Higgins, 2009).
A morfometria geométrica aplicada para estudos envolvendo insetos em
geral, normalmente utiliza as asas como estruturas para análise, por serem
20
rígidas e praticamente bidimensionais, o que reduz as chances de erros

associados à posição dos marcos anatômicos (Jamillo et al. 2015).
Existem várias vantagens na utilização desta técnica em estudos de
variação de forma em Culicidae. As técnicas morfométricas modernas,
principalmente as bidimensionais, são baratas e não necessitam de muitos
equipamentos para execução dos estudos, tendo em vista que um computador,
uma lupa e conexão com a internet são suficientes. A técnica para montagem do
material exige somente a dissecção e montagem da asa entre lâmina e lamínula,
sendo que o material restante ainda pode ser utilizado em outras análises, como
por exemplo, moleculares. Além disso, centenas de imagens podem ser obtidas
em pouco tempo (uma semana) e as etapas para as análises levam alguns dias
para serem realizadas (Garros & Dujardin, 2013).
Os marcos anatômicos disponíveis nas asas estão nas intersecções de
veias ou bordas que são submetidos a análises estatísticas específicas,
fornecendo dados sobre tamanho e forma. Essas análises permitem a
visualização de mudanças de forma entre diferentes tratamentos, localidades ou
espécies (Rohlf & Archie 1984; Rohlf & Marcus 1993; Stegman et al. 2002;
Dujardin, et al. 2008, 2014).
Os efeitos de variações de temperatura e quantidade de alimento na
criação de imaturos de Culicidae já foram observados em asas de Aedes aegypti
(Linnaeus) (Jirakanjanakit et al. 2007) e Anopheles (Cellia) superpictus Grassi
(Aytekin et al. 2009). Em ambas as espécies as asas diminuíram de tamanho em
temperaturas de criação mais altas.
Mesmo variações fenotípicas em níveis individuais, como dimorfismo
sexual podem ser detectadas. Por exemplo, um evidente dimorfismo sexual alar
de Aedes scapularis (Rondoni) foi observado por Devicari et al. (2011) através
da técnica de morfometria geométrica. Ainda o nível de acurácia de 100% foi
obtido com os testes de reclassificação, independentemente da origem
geográfica dos exemplares, indicando o grau de confiabilidade da análise.
A evidência da expressão fenotípica da forma das asas sendo específica
do sexo dos mosquitos também já foi observada em espécies pertencentes aos
gêneros Aedes, Culex, Ochlerotatus e Anopheles. Dentre as espécies
analisadas está An. cruzii, que juntamente com An. homunculus apresentaram
as asas das fêmeas menores que as dos machos (Virginio et al. 2015).
21
A evidência de Culex coronator Dyar & Knab representar uma espécie

polimórfica no que se refere ao tamanho e forma de asas, foi demonstrada por
meio da análise de morfometria geométrica entre várias populações coletadas
no Brasil (Demari-Silva et al. 2014).
As análises de morfometria geométrica de asas de Aedes aegypti
revelaram que a sua forma possui padrões de variação entre diferentes gerações
consecutivas mantidas em laboratório (Jirakanjanaki et al. 2008), entre
populações geograficamente distantes (Henry et al. 2010) ou até mesmo em uma
pequena área urbana (Vidal & Suesdek, 2012).
Exemplares de Culex (Culex) quinquefasciatus Say apresentaram
variações do formato das asas que estão correlacionadas com a variabilidade
genética observada entre cinco regiões eco-geográficas Sul-americanas (Morais
et al. 2010). Já o efeito das regiões eco-geografias brasileiras sobre populações
de An. (Nys.) darlingi foi avaliado por Motoki et al. (2012), observando que os
indivíduos coletados na costa e interior da Mata Atlântica são mais similares
entre si do que se comparados com os indivíduos coletados no Cerrado e Rio
Amazonas.
Stephens & Juliano (2012) utilizaram marcos tradicionais, analisados em
conjunto com semilandmarks, como ferramenta para tentar indicar as condições
de desenvolvimento de larvas de Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse) e Aedes
(Stegomyia) aegypti, através da análise de morfologia de asas de adultos
expostos a diferentes condições de temperatura e competição. As duas espécies
foram separadas distintamente por meio da forma das asas independentemente
do tratamento realizado. Porém, diferenças intraespecíficas entre os diferentes
tratamentos não foram observadas.
Dujardin et al. (2014) comparou os resultados obtidos utilizando
semilandmarks e marcos anatômicos (landmarks-based) em estudos para
identificação de espécies Anopheles (Nyssorhynchus) strodei Root e Anopheles
(Nyssorhynchus) oswaldoi Peryassú. Estas duas espécies são difíceis de
identificar através das chaves dicotômicas existentes, mas a distinção fenotípica
com base na análise morfométrica das asas foi observada. O resultado obtido
para o reconhecimento das espécies crípticas foi semelhante entre as duas
metodologias testadas.
22
A identificação de Culex pipiens Linnaeus e Culex torrentium (Martini)

através de caracteres alares foi testada por Börstler et al. (2014). A utilização de
uma pequena região das asas (veias R2+3) demostrou ser suficiente para
distinguir as duas espécies com mais de 90% de acurácia. Neste caso, a correta
diferenciação destas espécies só era possível através de análises moleculares
e agora, com a descrição das asas através da técnica de morfometria
geométrica, os custos e o tempo gasto para confirmar a identificação serão muito
mais baixos.
A técnica de morfometria geométrica alar também foi utilizada para testar
a hipótese de que existe uma diferença fenotípica, entre o formato das asas de
Culex quinquefasciatus que está ou não infectado com os nematoides da filariose
(Wuchereria bancrofti Bancroft). O estudo demonstrou que essa técnica é
eficiente para identificar mosquitos parasitados, pois estes possuem alterações
morfológicas no ápice e base das asas (Sendayego et al. 2014).
Jamillo et al. (2015) analisaram oito combinações diferentes de marcos
anatômicos tradicionais e duas formas (outlines) para a análise de contornos,
objetivando buscar um padrão que melhor identificasse 11 espécies de
Anopheles (Nyssorhynchus). A técnica de morfometria geométrica demonstrou
ser eficiente para distinguir fêmeas de espécies próximas e simpátricas, que
muitas vezes não podem ser identificadas por meio de chaves dicotômicas.
Com base no estudo das variações na forma e tamanho das asas de An.
cruzii, com o auxílio da técnica de morfometria geométrica, verificou-se que as
asas eram diferentes entre as populações da planície litorânea e da Serra do
Mar. Quanto maior a altitude na qual os insetos eram coletados, maior era o
tamanho das asas. A análise de diversidade genética, também identificou uma
alta taxa de polimorfismos entre as populações analisadas. Através deste estudo
foi possível verificar que An. cruzii é estruturado verticalmente e possui uma
elevada diversidade genética, o que confirma os resultados já obtidos com outras
técnicas, sendo que a espécie pode representar um complexo de espécies
(Lorenz et al. 2014).
23
1.4.2 Marcadores moleculares mitocondriais

Quando se analisa as características morfológicas de culicídeos
pertencentes a complexos de espécies, que possuem características
morfológicas idênticas ou semelhantes, é grande a dificuldade de definição de
cada táxon e de seus caracteres diagnósticos. Nestes casos, muitas vezes as
análises moleculares são necessárias para uma identificação mais precisa das
espécies.
Uma grande quantidade de marcadores moleculares está disponível
atualmente, dentre estes, o genoma mitocondrial é frequentemente escolhido
para estudos filogenéticos em vários níveis taxonômicos (Gissi et al. 2008). O
DNA mitocondrial possui cerca de 16.000 pares de bases dispostos em uma fita
dupla com cerca de 13 genes, dos quais dois codificam RNAs ribossômicos, 13
codificam polipeptídeos e 22 codificam a formação de RNAs transportadores
(Hobertis & Hib, 2006).
O DNA mitocondrial (mtDNA) tem demonstrado ser uma ferramenta
importante para a delimitação de espécies, estudos de genética de populações
(fluxo gênico, tamanho efetivo de populações e história evolutiva) e
relacionamentos filogenéticos (Hebert, 2003). Dentre as vantagens da análise do
mtDNA podemos citar: altas taxas de mutação, ausência de íntrons, herança
materna (sem recombinação) e alta quantidade nas células, o que facilita a sua
amplificação (Gissi et al. 2008).
A rápida taxa de evolução do mtDNA também está refletida na presença
de alta variabilidade de sequências nucleotídicas, que são um pré-requisito para
análises filogenéticas (Avise, et al. 2009). Dentre os genes mais utilizados em
estudos com Anophelinae podemos citar a subunidade 4 da NADH
desidrogenase (ND4) e o citocromo c oxidase, subunidade I (COI) (Sallum et al.
2002; Wilkerson et al. 2005; Angêlla et al. 2007).
O marcador molecular ND4 possui cerca de 400 pares de bases, sendo
constantemente utilizado em estudos de diversidade genética de Aedes aegypti
Linnaeus (Bracco et al. 2007; Scarpassa et al. 2008; Aguirre-Obando et al. 2015;
Souza et al. 2017). Em Anophelinae uma alta taxa de polimorfismos foi detectada
em amostras de An. darlingi (Conn et al. 1998; Angêlla et al. 2007) e similaridade
de diversidade nucleotídica com outros genes mitocondriais da mesma família
24
em An. nuneztovari Gabaldon, An. rangeli Gabaldon, Covas García & Lopez e
An. trinkae Faran (Conn et al. 1997, 2006).
A terceira posição nucleotídica dos códons do gene COI apresenta uma
elevada quantidade de substituições, o que resulta em uma taxa de evolução
molecular cerca de três vezes maior do que a observada em rDNA como 16S e
18S (Knowlton & Weigt, 1998). Além disso, este marcador possui outras
vantagens para análises, como primers universais bem estabelecidos para a
maioria dos filos e taxa de evolução rápida o suficiente para a discriminação não
somente de espécies próximas, mas também complexos de espécies (Folmer et
al. 1994; Hebert et al. 2003).
Com cerca de 700 pares de bases, marcador molecular COI é
amplamente utilizado em investigações de estrutura populacional em
Anophelinae (Mirabello & Conn, 2006; Juri et al. 2014; Ambrose et al. 2014) e
descrição de complexos de espécies como An. albitarsis Lynch-Arribálzaga (Lehr
et al. 2005), An. barbirostris Van der Wulp (Taai et al 2015) e An. punctimacula
Dyar & Knab (Loaiza et al. 2013), sendo eficiente para análises de estruturação
genética e dinâmicas populacionais.
A análise de variabilidade genética dentro e entre populações, em função
de gradientes geográficos, pode fornecer dados que permitem observar se uma
população está em equilíbrio, expandindo ou em extinção. Além disso, a
compreensão da história evolutiva e epidemiologia de doenças pode ser
auxiliada através de diferenças genéticas observadas em culicídeos vetores
(Yan, et al. 1998).
25
2. JUSTIFICATIVA
Diante da variabilidade morfológica, comportamental, molecular e

cromossômica observada em An. cruzii, juntamente com a sua importância
epidemiológica, o esclarecimento da estruturação genética para compreensão
da dinâmica populacional, bem como a caracterização morfométrica, baseada
em asas, das populações se faz necessária. Até o momento, nenhum trabalho
avaliando a diversidade genética baseada em dados do genoma mitocondrial e
análise de morfometria geométrica entre essas populações desta espécie foi
realizado.
26
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
 Analisar a estruturação populacional de Anopheles cruzii ao longo da

Mata Atlântica, com base na análise da distribuição de variações
genéticas e morfométricas entre as populações.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Testar a existência e o grau de diferenciação fenotípica alar entre as

populações de An. cruzii ao longo da Mata Atlântica;
 Estimar o grau de diferenciação genética entre as populações de An.
cruzii;
 Avaliar o fluxo gênico e outros parâmetros de estruturação populacional
entre estas populações e verificar se há correlação entre os diferentes
marcadores moleculares utilizados.
27
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Área de estudo

Os exemplares analisados através das técnicas moleculares e
morfométricas foram obtidos em incursões a campo realizadas em áreas de Mata
Atlântica nos Estados do Paraná, São Paulo e Bahia. Para a análise
morfométrica foram utilizados também, exemplares depositados na Coleção
Entomológica Pe. Jesus Santiago Moure da Universidade Federal do Paraná
(DZUP).
Os exemplares analisados através da técnica de sequenciamento de
fragmentos de genes mitocondriais abrangeram amostras de cinco Estados
brasileiros e sete populações. Para as análises de morfometria geométrica foram
examinadas oito populações de An. cruzii abrangendo quatro Estados
brasileiros: Bahia, São Paulo, Paraná e Santa Catarina (tab. 01) (fig.03).
Tabela 01: Localidades com exemplares de Anopheles cruzii amostrados para as

análises de morfometria geométrica e moleculares (COI e ND4). *Amostras obtidas no
GenBank, sob códigos KM507293 até KM507314.
Estado Localidade Data Morfometria COI ND4 Latitude Longitude

Santa Catarina Florianópolis 13.01.2014 27 15 14 -27.530578 -48.512306
Santo Amaro da Imperatriz 28.04.2014 11 0 0 -27.687096 -48.737426
São Francisco do Sul 08.11.2001 34 0 0 -26.243611 -48.639444
Paraná Antonina 10.10.2008 34 0 0 -25.366667 -48.783333
Morretes 16.04.2014 35 14 5 -25.586223 -48.724168
Ilha do Mel 18.02.2003 11 0 0 -25.510000 -48.312417
São Paulo Cananéia 09.02.2003 21 0 0 -24.890694 -47.837917
Tapiraí 11.2012 0 22* 0 -23.971872 -47.507966
Rio de Janeiro Itatiaia 05.09.2013 0 10 17 -22.450000 -44.600000
Bocaina 02.2013 0 6 12 -23.024131 -44.718464
Bahia Camacan 24.03.2015 10 10 10 -15.391937 -39.565188
Itaparica 08.09.2005 0 14 12 -13.093750 -38.791892
28
Figura 03: Mapa com as localidades amostradas nas análises de morfometria

geométrica (vermelho), molecular (azul) e para as duas técnicas (verde). Legenda: 1.
Itaparica-BA; 2: Camacan-BA; 3: Itatiaia-RJ; 4: Bocaina-RJ; 5: Tapiraí-SP; 6: Cananéia-
SP; 7: Ilha do Mel-PR; 8: Antonina-PR; 9: Morretes-PR; 10: São Francisco do Sul-SC;
11: Florianópolis-SC; 12: Santo Amaro da Imperatriz-SC.
Durante as incursões a campo realizou-se a busca por imaturos em

criadouros naturais como axilas de bromélias, tanto epífitas como ao nível de
solo. Os imaturos foram capturados no conteúdo hídrico localizados nestes
criadouros, com o auxílio de uma bomba manual de sucção. Os exemplares
foram acondicionados em potes plásticos devidamente rotulados com data,
localidade e criadouro, sendo transportados ao Laboratório de Morfologia e
Fisiologia de Culicidae e Chironomidae (LAMFIC2) da Universidade Federal do
Paraná.
Após a triagem do material, os imaturos foram mantidos em sala de
criação sob condições controladas de temperatura (25ºC) e fotoperíodo (12h
claro/12h escuro), acondicionados individualmente em potes plásticos com água
do criadouro e água destilada, sendo alimentados com ração de peixe triturada.
29
As exúvias de larvas e pupas foram mantidas em etanol 80% e montadas

em lâminas permanentes, para confirmação da identificação. Os adultos obtidos
a partir das larvas coletadas foram armazenados em freezer -80ºC até o
momento das extrações de DNA e análises morfométricas.
Os exemplares adultos foram capturados com o auxílio de armadilha de
Shannon operada durante três horas no período crepuscular vespertino nas
mesmas localidades onde os imaturos foram coletados. A coleta foi iniciada uma
hora e meia antes e após o crepúsculo, com base nas informações do CEPETC
(Centro de Previsão do Tempo e Estudos Climáticos).
A cada trinta minutos os mosquitos foram capturados no interior e nas
abas da armadilha de Shannon com auxílio de um aspirador manual, sendo
então acondicionados em embalagens plásticas, sacrificados em congelador a
-20ºC e transportados até o laboratório onde foram acondicionados em
congelador -80ºC até serem utilizados nas análises.
4.2 Morfometria geométrica

4.2.1 Preparo das amostras
Os marcos anatômicos analisados nas asas de Culicidae são as
intersecções das veias alares, que muitas vezes não são fáceis de serem
visualizadas devido às escamas presentes sobre as veias. Por isso, a asa direita
de fêmeas foi dissecada e imersa em hipoclorito de sódio (NaClO) 10% por cerca
de um minuto, para que as escamas fossem removidas.
Após remover as escamas, as asas foram imersas em etanol absoluto por
30 segundos e, logo em seguida, foram coradas em fucsina ácida a 3% por um
minuto. Com isso, as veias alares adquirem a coloração rosada, o que facilita a
observação das intersecções para posterior marcação. As asas foram lavadas
rapidamente com etanol a 70% e montadas em vista dorsal, entre lâmina e
lamínula, para então serem fotografadas sob lupa com um aumento de 5x. As
imagens foram obtidas através de uma câmera AxioCam MRc acoplada ao
estéreo microscópio ZEISS - Discovery V.20.
Com o auxílio do programa computacional TpsDig2 V.2.14 (Rohlf, 2008)
foram tomadas as coordenadas de 23 marcos anatômicos do tipo 1 (tab. 02),
30
pontos onde existe a justaposição de tecidos ou onde estruturas se encontram

(fig. 04).
Tabela 02: Localização dos 23 marcos anatômicos do tipo 1 utilizados nas análises de
morfometria geométrica alar de fêmeas de Anopheles cruzii conforme ilustrado na fig.
04. Nomenclatura segundo Forattini (1996).
LM Localização
1 Intersecção da veia costa (C) com a veia humeral (h)
2 Junção da veia umeral (h) e subcosta (Sc)
3 Intersecção da veia cubital anterior (CuA) e cubital posterior (CuP)
4 Ápice da veia anal (A1)
5 Ápice da veia cubital posterior (CuA2)
6 Ápice da veia cubital anterior (CuA1)
7 Ápice da veia média posterior (M3+4)
8 Ápice da veia média anterior (M1+2)
9 Ápice da veia radial (R4+5)
10 Ápice da veia radial (R3)
11 Ápice da veia radial (R2)
12 Ápice da veia radio anterior (R1)
13 Intersecção da veia costa (C) com veia subcosta (Sc)
14 Intersecção da veia radial (R) com subcosta radial (sc-r)
15 Intersecção da veia radial (R) com radial setorial (r1-rs)
16 Bifurcação da veia cubital (CuA) em cubital anterior (CuA1) e cubital posterior (CuA2)
17 Intersecção da veia setor radial (Rs) com veia radio (R2+3)
18 Intersecção da veia transversal radio-média (r-m) com radial (R4+5)
19 Encontro da veia transversal radio-média (r-m) com a media (M)
20 Intersecção da veia média (M) com a média cubital (m-cu)
21 Encontro da veia transversal média-cubital (m-cu) com a veia cubital anterior (CuA1)
22 Bifurcação da veia radial (R2+3) em radial dois (R2) e radial três (R3)
23 Bifurcação da veia média (M) em média anterior (M1+2) e posterior (M3+4)
31
Figura 04: Localização dos marcos anatômicos do tipo 1 da asa direita de fêmeas de
Anopheles cruzii utilizados nas análises de morfometria geométrica. A descrição de
cada marco encontra-se na tab. 02.
4.2.2 Análises estatísticas

O programa MorphoJ versão 1.06c foi utilizado para realizar as seguintes
análises: Análise Generalizada de Procrustes (Superposição), Análise de
Componentes Principais (PCA), Análise de Função Discriminante (DFA) e
Análise de Variáveis Canônicas (CVA).
A análise de Superposição de Procrustes (ANOVA) permitem remover as
variações de tamanho, posição e orientação. Além disso, determina o grau de
acurácia e evita erros de medida decorrentes da alocação dos marcos
anatômicos. O processo começa com a padronização de escalonamento das
coordenadas, movendo-as para a mesma posição. Em todas as análises
subsequentes, a matriz de variáveis resposta utilizada foi a matriz de
coordenadas Procrustes. O tamanho da amostra é quantificado utilizando-se
todos os marcos presentes em uma asa, com base no “tamanho do centroide”.
(Klingenberg, 2010; Viscosi & Cardini, 2011).
Após remover todas estas variações foi realizada a Análise de
Componentes Principais (PCA - Principal Component Analysis) que tem como
objetivo verificar se alguns componentes podem explicar a maior parte da
variação encontrada nos dados originais, encontrando componentes que são
mais próximos às variáveis originais, mas dispostos em ordem decrescente de
variação. Nesta análise obtém-se a representação gráfica de um conjunto de
dados multivariados (no caso da morfometria seriam as mensurações tomadas)
32
que é a forma mais simples de se obter alguma informação sobre a existência

de padrões em termos de associação entre indivíduos ou variáveis, variando ao
longo do vetor (PC1, PC2, ...) (Monteiro & Reis, 1999; Klingenberg, 2010, Viscosi
& Cardini, 2011).
A análise de variância multivariada (MANOVA – Multivariate Analysis of
Variance) é utilizada para determinar se existem diferenças entre os Estados e
populações analisadas, com base na forma das asas (Fornel et al. 2010).
A Análise de Variáveis Canônicas (CVA - Canonical Variate Analysis) foi
realizada após a PCA e fornece uma descrição das diferenças entre os grupos,
em um conjunto de dados multivariados (Monteiro & Reis, 1999). Estes grupos,
especificados a priori, foram representados pelos Estados analisados (Bahia,
São Paulo, Paraná e Santa Catarina) e as populações.
A Análise de Função Discriminante (DFA – Discriminant Function
Analysis) foi utilizada para verificar o grau de alocação correta entre as diferentes
amostras, baseado na forma das asas, com validação cruzada par a par entre
as amostras (Dhivya & Manimegali 2013).
4.3 Variabilidade genética
4.3.2 Método de extração de DNA

A extração do DNA foi realizada segundo o protocolo de Bona et al.
(2012). Os exemplares adultos foram macerados individualmente em microtubos
de 1,5 ml contendo 160 µl de solução tampão de lise (Tris-HCl, pH 8,0 200 mM,
NaCl 2,0 M, EDTA, pH 8,0 70 mM e 25 µl dodecil sulfato de sódio 10%). A
solução foi homogeneizada e incubada em banho maria a 60°C por meia hora.
Na sequência adicionou-se 50 µl de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1) à
solução para a desproteinização. As amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm
por 15 minutos. O DNA presente no sobrenadante foi transferido para um novo
microtubo de 1,5 ml ao qual adicionou-se 80 µl de acetato de amônio 7,5 M e
400 µl de etanol a 96%. As amostras foram homogeneizadas por inversão e
levadas ao congelador por meia hora para precipitação do DNA. As amostras
foram centrifugadas a 13.000 rpm por 15 minutos, sendo então o sobrenadante
descartado. O precipitado foi lavado adicionando-se 400 µl de etanol a 70% e
33
novamente centrifugado a 13.000 rpm por cinco minutos. Após a centrifugação

o sobrenadante foi descartado e as amostras foram levadas a estufa para
secagem a 40ºC por 30 minutos. O DNA foi ressuspendido em 30 µl de tampão
TE (Tris-HCl 10mM, EDTA, pH 8.0 1.0mM e água Milli-Q®) e armazenado em
congelador a -20°C. A quantificação do DNA foi realizada em espectrofotômetro
NanoDrop®.
4.3.3 Amplificação, purificação e sequenciamento

Após a extração, fragmentos de dois genes mitocondriais foram
amplificados. Para a amplificação do fragmento do gene COI de
aproximadamente 700 pb utilizou-se os iniciadores LCO-1490: 5’-GGT CAA CAA
ATC ATA AAG ATA TTG G-3’ e HCO-2198: 5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA
AAA AAT CA-3’. A reação de amplificação foi realizada contendo 20 ng de DNA,
2 µl de dNTP a 2,5 mM, 2,5 µl tampão a 10x (Sigma-Aldrich), 1U de Taq DNA
Polimerase (Sigma-Aldrich), 0,3 µl de cada iniciador a 10 pmol (IDT, USA), 5 µl
de MgCl2 a 25 mM (Promega) e água Milli-Q® para completar o volume final de
25 µl.
As amostras foram amplificadas utilizando-se os seguintes ciclos de
temperatura para a amplificação do fragmento do gene COI: desnaturação inicial
a 95°C por 3 minutos, seguidos de 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 1
minuto, anelamento a 45°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 1:30 minutos
e extensão final a 72°C por 7 minutos.
Para a amplificação do fragmento do gene ND4 de aproximadamente 340
pb foram utilizados os seguintes iniciadores: Forward (iniciador universal): 5’-
ATT GCC TAA GGC TCA TGT AG-3’; Reverse (iniciador reverso): 5’-TCG GCT
TCC TAG TCG TTC AT-3’. A reação de amplificação do fragmento do gene ND4
foi realizada contendo 20 ng de DNA, 1 µl de dNTP a 2,5 mM, 2,5 µl tampão 10x
(Sigma-Aldrich), 1U de Taq DNA Polimerase (Sigma-Aldrich), 0,5 µl de cada
iniciador a 10 pmol/µl (IDT, USA), 3 µl de MgCl2 a 25 mM (Promega) e água Milli-
Q® para completar o volume final de 25 µl.
Os seguintes ciclos foram utilizados para a reação de amplificação:
desnaturação inicial a 94°C por 2 minutos, seguidos de 30 ciclos de
desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 53°C por 30 segundos,
extensão a 72°C por 1 minuto e extensão final a 72°C por 7 minutos.
34
A correta amplificação dos fragmentos de DNA de COI e ND4 foi verificada

através de gel de agarose a 1%, contendo 3 µl do produto de PCR, 2 µl de
corante saffer dye (KASVI) e 2 µl de marcador de peso molecular de 100 pb ou
1 kpb (Ladder-Thermo Scientific).
A purificação dos produtos de PCR foi realizada com kit Qiaquik® PCR
purification Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) segundo as instruções do fabricante.
As amostras purificadas foram enviadas para sequenciamento no Centro de
Pesquisas sobre o Genoma Humano e Células-Tronco, Instituto de Biociências,
Universidade de São Paulo (USP).
4.3.4 Alinhamento e edição das sequencias

As sequencias obtidas foram editadas no programa BioEdit Sequence
Alignment Editor versão 7.2.5 (Hall, 1999) e alinhadas no programa MEGA
versão 7.0 (Kumar et al. 2016) com a ferramenta MUSCLE (Edgar, 2004).
As sequencias foram comparadas com as já disponíveis no GenBank
através da ferramenta BlastX (GenBank database, 2017), para confirmar o
fragmento de DNA amplificado.
4.3.5 Escolha de modelo de evolução molecular

A escolha do modelo de substituição nucleotídica mais apropriado para
as análises de máxima verossimilhança, foi realizada com o auxílio do programa
jModelTest (Posada, 2008) selecionando-se o critério de informação de Akaike
(AIC; Akaike, 1973). Utilizamos o modelo com o menor valor de AIC nas análises,
pois este representa o modelo que mais se aproxima do padrão real de
substituição de bases nucleotídicas (Posada & Buckley, 2004).
4.3.6 Análises estatísticas

4.3.6.1 Análise dos haplótipos
A genealogia entre os haplótipos foi inferida através da construção de uma
rede de haplótipos, elaborada com o programa TSC versão 1.21 (Clement et al.
2000). Os cálculos para a obtenção desta rede foram realizados com base no
método de parcimônia, agrupando-se os haplótipos com base nas mutações
presentes nas sequências e no número máximo de conexões entre os
35
haplótipos. Com isso, a genealogia obtida expressa a reconstrução evolutiva da

história genealógica de variação genética encontrada nas sequências que
tiveram pouca ou nenhuma recombinação (Templeton et al. 1992).
4.3.6.2 Análises filogenéticas

O programa MEGA 7.0 foi utilizado para a análise de reconstrução
filogenética com base no critério de máxima verossimilhança, com o modelo de
substituição nucleotídica segundo o modelo de evolução molecular general time
reversible GTR+I+G, sendo o teste de suporte de ramos o Bootstrap com 1000
réplicas.
4.3.6.3 Análise de polimorfismos moleculares

Os parâmetros populacionais como o número de haplótipos, distribuição
nas populações, índices de fixação (Fst) par-a-par (Wright, 1978), diversidade
haplotípica (h), estimativa de fluxo gênico (Nm) e diversidade nucleotídica (π)
foram calculados através do software Arlequin versão 3.5 (Excoffier & Lischer
2010) e DnaSP versão 5.0 (Librado & Rozas 2009).
O índice Fst é um descritor que mede a quantidade de diferenciação
genética entre populações e, consequentemente, o quanto os indivíduos de uma
mesma população são semelhantes entre si. Esse índice vem sendo utilizado
para investigar processos que influenciam a distribuição da variação genética
dentro e entre as populações (Holsinger & Weir, 2009). O índice Fst é
frequentemente relacionado ao número de migrantes por geração (Nm), que
fornece informações sobre o fluxo gênico entre as populações.
A diversidade haplotípica (h) indica o número de haplótipos diferentes
existentes na amostra e representa a probabilidade de que se dois indivíduos
retirados ao acaso de uma amostra possuam dois haplótipos distintos (Ney,
1987). No que se refere a sequências nucleotídicas, qualquer diferença em um
ou mais nucleotídeos representa um novo haplótipo.
O índice de diversidade nucleotídica (π) indica o número médio de
nucleotídeos diferentes por sítio entre duas sequências retiradas ao acaso de
uma amostra (Ney, 1987).
36
4.3.6.4 Testes de Neutralidade

Para avaliar se os dados observados são significativamente diferentes
daqueles esperados realizaram-se os testes de neutralidade: teste D de Tajima
(Tajima, 1989) e os testes Fu e Li de seletividade neutra (Fu & Li, 1993), sendo
todos gerados pelo programa DnaSP v.5.
4.3.6.5 Análise de Variância molecular (AMOVA)

A análise da estrutura populacional através da AMOVA permite avaliar o grau de
significância da variabilidade genética inter e intrapopulacional.
Os indivíduos são previamente reunidos em grupos baseados em critérios
não genéticos, como a sua distribuição geográfica, dados ecológicos, etc. Neste
caso utilizou-se a distribuição geográfica para a escolha dos grupos hierárquicos.
Os cálculos se baseiam em uma matriz de distâncias das diferenças entre
a diversidade nucleotídica dos haplótipos, sendo que a distribuição desta
diversidade entre as populações e indivíduos revela a estruturação da(s)
espécie(s). A análise da estrutura populacional pela AMOVA foi realizada com o
programa Arlequin versão 3.5 com 1.000 réplicas (Excoffier & Lischer 2010).
37
5. RESULTADOS

A análise de componentes principais (PCA) gerou 42 eixos de variação
(PCs), sendo que os dois primeiros eixos (PC1 e PC2) explicam cerca de 33%
da variação de forma.
O primeiro componente principal (PC1) explica 18,64% da variação total
observada. Os indivíduos do Paraná e São Paulo posicionados em sua maioria
no quadrante positivo (fig.05), têm asas com a região basal mais curta e apical
mais longa. As veias deslocadas em direção ao centro da asa (LMs 1, 2 e 3) e
os marcos do centro deslocados em direção a base da asa (LMs 13, 17 a 21).
Além disso, observa-se o distanciamento do ápice da asa em relação ao centro
(LMs 6 ao 12).
Representação do quadrante positivo do primeiro componente principal (PC1). A cor
azul clara indica a configuração consenso e a azul escura a variação de forma.
No quadrante negativo do PC1, no qual estão localizados a maioria dos

exemplares da Bahia e Santa Catarina (fig. 06), os indivíduos possuem um
padrão oposto, ou seja, uma região basal aumentada (LMs 1 a 3) um
distanciamento dos marcos do centro da asa em relação a região apical (LMs 17
a 23), aproximando o centro com o ápice (setor radial e mediano encurtados).
38
Representação do quadrante negativo do primeiro componente principal (PC1). A cor
O segundo componente principal (PC2) explica 14,5% dos dados (fig. 07).
No quadrante positivo observa-se um alongamento do setor radial e mediano,
alongando o ápice da asa (LMs 7 a 12). Além disso, ocorre o encurtamento da
base (LMs 1 a 3) e o ápice da veia radio anterior (R1) está localizado mais
próximo a base da asa (LM 13).
Representação do quadrante positivo do segundo componente principal (PC2). A cor
No quadrante negativo do PC2 (fig. 08) está evidenciado o encurtamento

do ápice da asa (LMs 7 a 12) e alongamento da região anterior (LMs 1 a 3).
Observa-se ainda o ápice da veia radio anterior (R1) localizado mais próximo ao
ápice da asa.
39
Representação do quadrante negativo do segundo componente principal (PC2). A cor
5.1.1 Análises entre Estados

A análise de MANOVA permite observar que as populações dos Estados
da Bahia, São Paulo, Paraná e Santa Catarina apresentam diferenças
significativas na forma das asas (λWilks=0,1228; df1=132; df2=423,4; F=3,251;
p<0,0001). Além disso, a análise de ANOVA de Procrustes demonstra que os
erros de medida dos marcos anatômicos nas asas são aleatórios e com efeitos
pequenos, tanto para a forma (F=2,47; p<0,0001; QM= 0,000041931; SQ=
0,0052833) quanto para o tamanho (F=20,65; p<0,0001; QM= 161034,70868;
SQ= 483104,12604), indicando que estas variações não são produzidas por
efeitos no processo de marcação dos pontos nas asas
A análise de variáveis canônicas (CVA) revelou três variáveis que
explicam 100% da variação total entre os Estados analisados (Bahia, Paraná
Santa Catarina, São Paulo), sendo que nos dois primeiros eixos (CV1 e CV2)
85% da variação total é explicada (tab. 03) (fig. 09).
Tabela 03: Análise de variáveis Canônicas entre os Estados onde Anopheles cruzii
foram amostrados.
% de Variância
Autovalores % de Variância
Acumulada
CV1 1,41303638 54,536 54,536
CV2 0,77868278 30,053 84,59
CV3 0,39927703 15,41 100
40
Segundo a análise de variáveis canônicas (fig. 09), evidencia-se uma

distinta separação entre Bahia e São Paulo no eixo CV1 e CV2. Além disso,
diferenças encontradas nas formas das asas agrupam no primeiro eixo de
variação (CV1), quadrante positivo, as populações de São Paulo e Santa
Catarina. Já no quadrante negativo observa-se a maior distribuição das
populações do Paraná e Bahia. No quadrante positivo do segundo eixo de
variação (CV2), as populações de Santa Catarina e São Paulo se aproximam,
sendo que o quadrante também inclui a população da Bahia. No quadrante CV2
negativo localiza-se a maioria dos exemplares das populações do Paraná.

quatro Estados analisados. Legenda: BA: Bahia, PR: Paraná, SC: Santa Catarina, SP:
São Paulo. Os indivíduos dentro de um mesmo círculo não diferem significativamente
(p˂0,05).
A figura 10 ilustra a projeção das populações segundo os eixos CV1 e

CV3. Neste caso, as populações da Bahia, São Paulo e Paraná estão mais
41
localizadas no quadrante positivo da CV3 e Santa Catarina está mais relacionada

a valores negativos da CV3.

quatro Estados analisados. Legenda: BA: Bahia, PR: Paraná, SC: Santa Catarina, SP:
São Paulo. Os indivíduos dentro de um mesmo círculo não diferem significativamente
(p˂0,05).
A visualização das grades de deformação e reconstruções gráficas das

asas de An. cruzii permite observar o que diferencia cada população no espaço
multivariado na projeção dos eixos 1, 2 e 3 da CVA. No que se refere a primeira
variável canônica, as variáveis que mais contribuíram para a discriminação das
populações foram as variáveis 2, 4 ,5, 13, 14, 16, 22 e 23.
Nas figuras 11A e 12A observamos a conformação das asas de maior
distribuição das populações de São Paulo e Santa Catarina em que os marcos
1 e 2 se distanciam dos marcos 4, 14 e 16, o que por sua vez resulta no
alongamento da região basal da asa. A deformação dos marcos 5, 13 e 23
longitudinalmente em direção a porção basal da asa, encurta a região mediana.
As populações da Bahia e Paraná seguem um padrão de deformação que
é o oposto ao observado para as populações de São Paulo e Santa Catarina.
Sendo a região basal e mediana aproximadas (marcos 1, 2, 4, 14 e 16) e a região
mediana levemente alongada (marcos 5, 13 e 23) (fig. 11B e 12B).
42
de Anopheles cruzii. Os vetores indicam as direções das deformações da
configuração das asas dos Estados analisados, em relação à configuração consenso.
A. representação do extremo positivo, onde existe maior representação de amostras
de São Paulo e Santa Catarina. B. Representação do extremo negativo, onde há
maior distribuição da Bahia e Paraná.
deformações obtidas através da análise da variável canônica 1 (CV1), resultante da
comparação entre os Estados analisados, com escala de visualização de 10x. As
linhas claras indicam a configuração consenso e as escuram as observadas nas
populações. A. Reconstrução gráfica das asas do extremo positivo. B. Reconstrução
gráfica das asas do extremo negativo.
43
Analisando as grades de deformações relacionadas à segunda variável

canônica (CV2), quadrante positivo (fig. 13A e 14A), onde localiza-se a maior
distribuição das populações de Bahia, São Paulo e Santa Catarina, observa-se
uma expansão ântero-posterior da asa (marcos 1, 2, 4, 5, 6, 7, 12 e 13) e
aproximação dos marcos 16 a 21 em relação ao ápice (marcos 6 a 12). A junção
de todas estas rotações dos marcos resulta em uma asa mais alargada, com
ápice mais ovalado.
As deformações observadas para a maioria da população do Paraná na
CV3 (fig. 13B e 14B) ocorrem nos mesmos marcos observados para as
populações da Bahia, São Paulo e Santa Catarina, porém com todos os vetores
na direção contrária. Com isso, os marcos 1, 2, 4, 5, 6 e 13 se aproximam, o que
resulta em uma asa mais estreita. Além disso, o alongamento da asa e o ápice
mais pontiagudo ocorre devido ao deslocamento dos marcos 6 a 12 no eixo
horizontal na direção do ápice da asa.
de Bahia, São Paulo e Santa Catarina. B. Representação do extremo negativo, onde
há maior distribuição do Paraná.
44
comparação dos Estados analisados, com escala de visualização de 10x. As linhas
claras indicam a configuração consenso e as escuram as observadas nas
A maior parte dos indivíduos das populações da Bahia e São Paulo no

CV3 estão localizados no quadrante positivo em que as asas possuem a região
anterior e central aproximadas (marcos 1, 2, 14, 17 a 21), além de um leve
distanciamento do ápice em relação à região central (marcos 10 e 22) (fig. 15A
e 16A).
No quadrante negativo deste componente de variação (CV3 -), na qual

estão representadas a maioria das asas das populações de Santa Catarira e
Paraná, os indivíduos possuem asas com um distanciamento entre a região
anterior e mediana (marcos 1, 2, 14, 17 a 21) e margem posterior mais curta
(marcos 10 e 22) (fig. 15B e 16B).
45
de Bahia e São Paulo. B. Representação do extremo negativo, onde há maior
distribuição do Paraná e Santa Catarina.
comparação entre os Estados analisados, com escala de visualização de 10x. As
46
Na tabela 04 estão descritos os resultados obtidos com a análise de

função discriminante realizada entre as populações da Bahia, São Paulo, Paraná
e Santa Catarina. A distância de Mahalanobis revelou uma separação bem
definida entre as populações analisadas, com base na combinação par a par
entre elas. O valore de p ˂0,001 indica que a separação dos grupos apresenta
uma probabilidade muito baixa de ter ocorrido ao acaso.
O grau de alocação correta entre as populações (teste de validação

cruzada) variou de 67% (Paraná com Bahia e São Paulo) a 81% para Santa
Catarina e Bahia (tab. 04). Os maiores percentuais de alocação correta foram
observados na população da Bahia (média de 75%) quando comparada às
demais populações.
Tabela 04: Distâncias de Mahalanobis (em negrito) e percentuais de acerto e

confiabilidade de separação entre os Estados com Anopheles cruzii amostrados, obtida
através da validação cruzada da função discriminante (sem negrito). Os valores de p
para o teste de permutação (1000 rounds): p˂0,001.
Bahia São Paulo Paraná Santa Catarina

Bahia - 78 67 81
São Paulo 5,8393 - 67 69
Paraná 4,2873 3,1156 - 69
Santa Catarina 4,5442 2,4700 2,0023 -
Com base nestes dados (tab. 04), observa-se que as populações de

Santa Catarina e Paraná possuem as asas mais semelhantes morfologicamente
no que se refere ao padrão de conformação das veias alares. Já as populações
da Bahia e São Paulo apresentam as asas mais distintas entre si.
5.1.2 Análises por População

A análise de MANOVA permite observar que as populações de Antonina-
PR, Camacan-BA, Cananéia-SP, Florianópolis-SC, Ilha do Mel- PR, Morretes-
PR, Santo Amaro da Imperatriz-SC e São Francisco do Sul-SC possuem
diferenças no formato das asas analisadas pela técnica de morfometria
geométrica (λWilks=0,01108; df1=308; df2=961,4; F=2,861; p<0,0001).
A análise de ANOVA de Procrustes demonstra que os erros de medida

dos marcos anatômicos nas asas são aleatórios e com efeitos pequenos, tanto
47
para a forma (F=2,85; p<0,0001; QM= 0,0000464021; SQ= 0,01364223) quanto

para o tamanho (F=17,43; p<0,0001; QM= 110695,464455; SQ=
774868,251184) indicando que estas variações não são produzidas por efeitos
no processo de marcação dos pontos nas asas.
A análise de variáveis canônicas (CVA) revelou sete variáveis que

explicam 100% da variação observada, sendo que os eixos 1 e 2 explicam cerca
de 51% dos dados (tab. 05).
Tabela 05: Análise de variáveis Canônicas entre as populações de Anopheles cruzii

amostradas em quatro Estados brasileiros.
Variáveis % de % de variância
Autovalores
Canônicas variância acumulada
CV1 1,82534770 34,361 34,361
CV2 0,91246283 17,176 51,537
CV3 0,87743956 16,517 68,054
CV4 0,69098205 13,007 81,061
CV5 0,40427101 7,610 88,671
CV6 0,37479048 7,055 95,726
CV7 0,22702961 4,274 100
Uma distinção das amostras de Camacan-Bahia (CAM) e Cananéia-São

Paulo (CAN) é clara através do eixo CV1 (que representa cerca de 34% dos
dados), por meio da comparação entre as populações em morfo-espaço
bidimensional de componentes principais (fig. 17). Já no eixo CV2, que explica
17% dos dados, a amostra da Ilha do Mel, Paraná (MEL) está inteiramente
representada no eixo negativo e a de Santo Amaro de Imperatriz-SC no eixo
positivo.
48

resultante da comparação da forma das asas de Anopheles cruzii de acordo com as oito
populações analisados. Legenda: ANT: Antonina-PR; CAM: Camacan-BA; CAN:
Santo Amaro da Imperatriz-SC; SFR: São Francisco do Sul-SC. Os indivíduos dentro de
um mesmo círculo não diferem significativamente (p˂0,05).
Nas grades de deformação e na reconstrução gráfica derivadas da

primeira variável canônica que separa as populações de Camacan-BA e de
Cananéia-SP, podemos observar que os marcos 2 a 5 e 12 a 14 são importantes
para as projeções da CV1.
Nas figuras 18A e 19A que demonstram as grades de deformação para a
população de Camacan-BA, o marco 2 se desloca na direção posterior da asa e
o marco 3 em direção à região basal. O vetor do marco 14 desloca-se na direção
basal da asa, enquanto que o porto 4 direciona-se obliquamente em direção à
região antero-basal. Estas deformações configuram a asa com uma expansão
da região basal e levemente estreita em comparação a configuração consenso.
As deformações observadas para a população de Cananéia-SP ocorrem
nos mesmos pontos observados para a população de Camacan-BA, porém com
os vetores na direção oposta (fig. 18B e 19B). O marco 2 se desloca na direção
49
anterior da asa e o marco 3 move-se em direção à região mediana, assim como

o vetor do marco 14. Já o ponto 14 se desloca obliquamente em direção à região
posterior da asa. A junção destas rotações dos marcos resulta em uma asa com
a base mais estreita e mais dilatada.
Figura 18: Diagrama de deformação derivado da variável canônica 1 (CV1). Os

vetores indicam as direções das deformações da configuração das asas das
populações de Anopheles cruzii analisadas, em relação a configuração consenso. A.
representação do extremo positivo, onde existe maior representação da amostra de
Camacan-BA. B. Representação do extremo negativo, onde há maior distribuição de
Cananéia-SP.
50
através da análise da variável canônica 1 (CV1), resultante da comparação das
populações de Anopheles cruzii analisadas, com escala de visualização de 10x. As
Com relação à deformação dos marcos referentes a segunda variável

canônica, observa-se a separação entre as populações de Santo Amaro da
Imperatriz-SC e Ilha do Mel-PR (fig. 17), sendo os marcos da região basal (1 a 3
e 14) e a mediana (4 a 5 e 15 a 21) os mais importantes nas projeções desta
variável (fig. 20 e 21).
A grade de deformação e representação gráfica para a população de

Santo Amaro da Imperatriz-SC estão representadas nas figuras 20A e 21A.
Neste caso, ocorre a aproximação dos marcos da região basal (1 a 3) com a
região mediana (15 a 21) e deslocamento dos marcos 4 a 7 na direção do eixo
posterior da asa. Em decorrência destas deformações, as asas possuem um
formato mais alargado com a região basal-mediana encurtada em relação a
configuração consenso.
Nas figuras 20B e 21B estão representadas a grade de deformação e

representação gráfica da população da Ilha do Mel-PR, localizadas no quadrante
51
negativo da CV2. Os marcos localizados na base da asa (1 a 3) e na região

mediana (15 a 21) se distanciam, o ponto 4 se desloca em direção à porção
anterior e os marcos 5 a 7 movem-se na direção basal da asa. A junção destas
rotações de marcos resulta em uma asa mais estreita e alongada.
Figura 20: Diagrama de deformação derivado da variável canônica 2 (CV2). Os

vetores indicam as direções das deformações da configuração das asas das
populações de Anopheles cruzii analisadas, em relação a configuração consenso. A.
representação do extremo positivo, onde existe maior representação da amostra de
Santo Amarro da Imperatriz-SC. B. Representação do extremo negativo, onde há
maior distribuição da Ilha do Mel-PR.
52
através da análise da variável canônica 2 (CV2), resultante da comparação das
populações de Anopheles cruzii analisadas, com escala de visualização de 10x. As
Na tabela 06 estão indicados os resultados obtidos com a análise

discriminante realizada com as oito populações de An. cruzii amostradas. O teste
de validação cruzada apresentou um êxito na classificação correta das
populações que variou de 42 a 95%. A população de Camacan-BA, em relação
à de São Francisco do Sul-SC, apresentou a menor porcentagem de erro, 5%.
As populações de Camacan-BA e Morretes-PR apresentaram as menores
porcentagens de acerto no que se refere à classificação de um indivíduo em um
dos dois grupos, com valor de 42%.
53
Tabela 06: Distâncias de Mahalanobis (em negrito) e percentuais de acerto e

confiabilidade de separação entre as populações de Anopheles cruzii, obtida através da
validação cruzada da função discriminante (sem negrito). Os valores de p para o teste
de permutação (1000 rounds): ˂0,001. Legenda: ANT: Antonina-PR; CAM: Camacan-
BA; CAN: Cananéia-SP; FLO: Florianópolis-SC; MEL: Ilha do Mel: PR; MOR: Morretes-
PR; SAM: Santo Amaro da Imperatriz-SC; SFR: São Francisco do Sul-SC.
ANT CAM CAN FLO MEL MOR SAM SFR

ANT - 62 68 70 62 68 60 62
CAM 4,6413 - 78 74 68 42 75 95
CAN 3,2686 6,0192 - 68 67 63 81 43
FLO 2,9247 4,4522 3,2021 - 61 75 72 62
MEL 4,2374 5,1256 4,8051 3,7994 - 85 78 64
MOR 2,5036 4,6245 3,5082 2,6245 3,8138 - 66 77
SAM 3,5164 5,0103 4,0221 3,5162 5,3292 3,4400 - 60
SFR 2,6245 5,1210 2,2683 2,2004 4,0881 2,6290 3,2115 -
Com base nos dados de validação cruzada, observa-se que as

populações de Morretes-PR e Camacan-BA possuem as asas mais semelhantes
entre si no que se refere ao padrão de conformação de veias alares. De forma
contrária, as populações de São Francisco do Sul-SC e Camacan-BA
apresentam as asas mais distintas entre si.
54
5.2 Variabilidade genética
5.2.1 Citocromo c oxidase subunidade 1 – COI

A análise do fragmento amplificado do gene COI gerou um fragmento de
624pb de 91 indivíduos, com a existência de 96 sítios polimórficos e 432 sítios
monomórficos. Com relação à diversidade nucleotídica foram obtidos 50
haplótipos (H1-H50) para as sete populações de An. cruzii analisadas (tab. 07),
sendo as frequências relativas representadas na tabela 09.
O haplótipo mais frequente foi o H14 (9,89%), presente na população de

Morretes-PR (tab. 07). Os haplótipos foram exclusivos de cada população, não
sendo o mesmo haplótipo encontrado em mais de uma população.
As diferenciações que permitiram a distinção entre os haplótipos

ocorreram através de 73 transições e 39 transversões. As transições são
caracterizadas pela transformação de uma purina (Adenina [A] ou Guanina [G])
em outra purina (A↔G), ou uma pirimidina (Citosina [C] ou Timina [T]) em outra
pirimidina (C↔T). Foram observadas 46 transições C ↔ T e 27 A ↔ G (tab. 08).
entre as transversões, ou seja, quando uma purina sofre mutação e se torna
uma pirimidina, ou vice-versa, observou-se 5 (A ↔C), 31 (A ↔T), 1 (G ↔ T) e 2
(G↔C) (tab.08).
A rede de haplótipos foi gerada com base no método de parcimônia e
evidencia três grupos (fig. 22). A topologia apresenta grupos consistentes, com
a separação das populações da Bahia em dois grupos. Os demais haplótipos
configuram uma rede única na qual se encontram os haplótipos das populações
do Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná e Santa Catarina, sendo o haplótipo
ancestral (H49) pertencente à população de Tapiraí-SP.
55
Tabela 07: Frequências haplotípicas observadas em sete populações de Anopheles

cruzii analisadas através do fragmento do gene COI. Legenda: CAM: Camacan-BA, ITP:
Itaparica-BA, ITA: Itatiaia-RJ, BOC: Bocaina-RJ, TAP: Tapiraí-SP, MOR: Morretes-PR,
FLO: Florianópolis-SC.
Haplótipo CAM ITP ITA BOC TAP MOR FLO Total %
H1 2 2 2,20
H2 2 2 2,20
H3 2 2 2,20
H4 2 2 2,20
H5 1 1 1,10
H6 1 1 1,10
H7 1 1 1,10
H8 2 2 2,20
H9 6 6 6,59
H10 1 1 1,10
H11 2 2 2,20
H12 1 1 1,10
H13 1 1 1,10
H14 9 9 9,89
H15 2 2 2,20
H16 3 3 3,30
H17 2 2 2,20
H18 2 2 2,20
H19 2 2 2,20
H20 2 2 2,20
H21 2 2 2,20
H22 2 2 2,20
H23 2 2 2,20
H24 2 2 2,20
H25 3 3 3,30
H26 1 1 1,10
H27 1 1 1,10
H28 2 2 2,20
H29 1 1 1,10
H30 1 1 1,10
H31 2 2 2,20
H32 1 1 1,10
H33 1 1 1,10
H34 1 1 1,10
H35 6 6 6,59
H36 1 1 1,10
H37 1 1 1,10
H38 1 1 1,10
H39 1 1 1,10
H40 1 1 1,10
H41 2 2 2,20
H42 1 1 1,10
H43 1 1 1,10
H44 1 1 1,10
H45 1 1 1,10
H46 1 1 1,10
H47 2 2 2,20
H48 1 1 1,10
H49 1 1 1,10
H50 1 1 1,10
56

alternativo.
9 13 15 21 30 33 36 39 42 44 45 50 54 57 67 72 84 88 90 105 117 122 123 126 129
H01 T G T T A T C T A T T G T T A T C G T C G T C A G
H02 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . .
H04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H05 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G .
H06 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G .
H07 . A . . . . . . T . C . C . . A T . A T A . T . A
H08 . A . . T . . . T . C . C . . A T . A T A . T . .
H09 . A . . T . . . T . C . C . . A T . A T A . T . .
H10 . A . . T . . . T . C . C . . A T . A T A A T . .
H11 . A . . T . . . T . C . C . . A T . A T A . T . A
H12 . A . . T . . . T . C . C . . A T . A T A . T . A
H13 . A . . T . T A T . C . C . . A T . A T A . T . .
H14 C . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H15 C . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . .
H16 C . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H17 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H18 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H19 . . A A . . - A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H20 . . A A . . T A . . . . . C T . T . . T A . T . A
H21 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H22 . . A A . . T A . . . A . C . . T . . T A . T . A
H23 . . A A . . T A . . . A . C . . T . . T A . T . A
H24 . . A A . . T A . . . A . C . . T . . T A . T . A
H25 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H26 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H27 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H28 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H29 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H30 - . A A . . T A . C . . . C . . T C . T A . - . A
H31 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H32 - . A A . . T A . C . . . C . . T C . T A . - . A
H33 . . A A . . T A . C . . . C . . T C . T A . T . A
H34 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H35 C . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H36 C . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H37 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H38 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H39 C . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . .
H40 C . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . .
H41 C . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H42 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H43 . . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H44 C . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H45 C . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H46 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H47 . . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H48 . . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H49 C . A A . C T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
H50 C . A A . . T A . . . . . C . . T . . T A . T . A
57

alternativo.
150 151 160 161 162 163 165 168 169 171 174 175 177 192 208 210 213 216 223 234
H01 T T G G G G C T G T A G T T T G T C A T
H02 . . . . A . . . . . . . . . . . . . . .
H03 . . . . A . . . . . . . C . . . C . . .
H04 . . . . A . . . . . . . . . . A C . . .
H05 . . . . A . . . . . . . C . . . . . . .
H06 . . . . A . . . . . . . C . . . . . . .
H07 . . . . A . A A . . . . C . C A . T . .
H08 . . . . A . A A . . G . C . C A . T . .
H09 . . . . A . A A . . G . C . C A . T . .
H10 . . . . A . A A . . G . C . C A . T . .
H11 . . . . A . A A . . . . C . C A . T . .
H12 . . . . A . A A . . G . C . C A . T . .
H13 . . . . A . A A . . G . C . C A . T . .
H14 A . . . A . T . . . . . C . . A . T . C
H15 A . . . A . T . . . . . C . . A . T . C
H16 A . . . A . T . . . . . C . . A . T . C
H17 A . . . A . T C . . G . C . . A . T . C
H18 A . A . A . T C . . . . C . . A . T . C
H19 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . C
H20 A . . A A A T C . . . . C . . A . T . C
H21 A . . . A . T C . . G . C . . A . T . C
H22 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . C
H23 A . . . A . T C . . G . C . . A . T . C
H24 A . . . A . T C . . G . C . . A . T . C
H25 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . C
H26 A . . . A . T C . . G . C . . A . T . C
H27 A . . . A . T C . . G . C . . A . T . C
H28 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . C
H29 A . . . A . T C A . . . C . . A . T . C
H30 A . . . A C . C A . . C C A . A C T C .
H31 A . . . A . T C . . G . C . . A . T . C
H32 A . . . A C . C A A . C C A . A C T C .
H33 A . . . A C T C A A . . C A . A C T . .
H34 A A . . A . T C . . G . C . . A . T . C
H35 A . . . A . T . . . . . C . . A . T . C
H36 A . . . A . T . . . . . C . . A . T . C
H37 A . . . A . . C . . . . C . . A . T . C
H38 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . C
H39 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . .
H40 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . .
H41 A . . . A . T . . . . . C . . A . T . C
H42 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . C
H43 A . . . A . T . . . . . C . . A . T . C
H44 A . . . A . T . . . . . C . . A . T . C
H45 A . . . A . T . . . . . C . . A . T . C
H46 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . C
H47 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . C
H48 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . C
H49 A . . . A . T . . . . . C . . A . T . C
H50 A . . . A . T C . . . . C . . A . T . C
58

alternativo.
240 248 257 266 272 278 281 284 287 290 293 296 297 302 305 307 308 311 314 318
H01 G A G G A A A T T T C C T T T G G T T G
H02 . . . . . . G . . . . . . . . . . . . .
H03 . . . . . . . . . . . T . . . . . . . .
H04 . . . . . . . . . C . T . . . . . . . .
H05 . . . . . . . . . . . T . . . . . . . .
H06 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H07 . C A . . T . . A C T . C A . . A C . .
H08 . C A . . T . . A C T . C A . . A C . .
H09 . C A . . T . . A C T . C A . . A C . .
H10 A C A . . T . . A C T . C A . . A C . .
H11 . C A . . T . . A C T . C A . . A C . .
H12 . C A . . T . . A C T . C A . . A C . .
H13 . C A . . T . . A C T . C A . . A C . .
H14 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H15 . . A . G . . A A C T T . . A . . . C .
H16 . . A . G . . A A C T T . . A . . . C .
H17 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H18 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H19 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H20 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H21 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H22 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H23 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H24 . . A . G . . A A C T T . . A . A . . .
H25 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H26 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H27 . . A . G . . A A C T T . . A . A . . .
H28 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H29 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H30 . . A . G . . A A C T T . . A A . . . C
H31 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H32 . . A . G . . A A C T T . . A A . . . C
H33 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . C
H34 . . A . G . . A A C T T . . A . A . . .
H35 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H36 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H37 . . A . G . . A A C T T . . A . . . C .
H38 . . A . G . . A A C T T . . A . . . C .
H39 . . A . G . . A A C T T . . A . . . C .
H40 . . A . G . . A A C T T . . A . . . C .
H41 . . A . G . . A A C T T . . A . . . C .
H42 . . A . G . . A A C T T . . A . . . C .
H43 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H44 . . A . G . . A A C T T . . A . . . . .
H45 . . A . G . . A A C T T . . A . A . . .
H46 . . A A G . . A A C T T . . A . . . C .
H47 . . A . G . . A A C T T . . A . . . C .
H48 . . A . G . . A A C T T . . A . A . C .
H49 . . A A G . . A A C T T . . A . . . C .
H50 . . A . G . . A A C T T . . A . . . C .
59

alternativo.
320 323 329 336 341 343 350 365 368 374 383 342 357 363 366 372 375 378 384 390
H01 C G T T T T A G T T A T T C A C A A T T
H02 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H03 . A . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H04 . A . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H05 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H06 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H07 . A A C A . T T C . . C C T . T . . C .
H08 . A A C A . T T C . . C C T . T . . C .
H09 . A A C A . T T C . . C C T . T . . C .
H10 . A A C A . T T C . . C C T . T . . C .
H11 . A A C A . T T C . . C C T . T . . C .
H12 . A A C A . T T C . . C C T . T . . C .
H13 . A A C A . T T C . . C C T . T . . C .
H14 T A . . A C T . . A T . . T G T T T A C
H17 T . . . A . T . . A T . . T G T T . A .
H18 T . . . A . T . . A T . . T G T T . A .
H19 T . . . A . T . . A T . . T G T T . A .
H20 T . . . A . T . . A T . . T G T T . A .
H21 T . . . A . T . . A T . . T G T T . A .
H22 T . . . A . T . . A T . . T G T T . A .
H23 T . . . A . T . . A T . . T G T T . A .
H24 T A . . A . T . . A T . . T G T T . A .
H25 T . . . A . T . . A T . . T G T T T A .
H26 T . . . A . T . . A T . . T G T T T A .
H27 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A .
H28 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A .
H29 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A .
H30 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A .
H31 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A .
H32 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A .
H33 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A .
H34 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A .
H35 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H36 T A . . A . T . . A T . . T . T T T A C
H37 T . . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H38 T . . . A . T . . A T . . T . T T T A C
H39 T . . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H40 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H41 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H42 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H43 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H44 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H45 T A . . A . T . . A T . . T . T T T A C
H46 T . . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H47 T . . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H48 T . . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H49 T A . . A . T . . A T . . T G T T T A C
H50 T . . . A . T . . A T . . T G T T T A .
60
Tabela 08: Posição da variação nucleotídica entre os sítios 399- 536 do fragmento do
alternativo.
399 408 411 414 417 418 436 438 442 447 453 456 474 477 484 488 507 510 519 528 534 536
H01 T T A T A G T A T T T T A A A A C T T A T C
H02 . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . .
H03 . . G . . . . . . - . . . . . . . . . . . .
H04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H05 . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . .
H06 . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . .
H07 A A . C T . C C C C C . T . . . A C C . C .
H08 A A . C T . C C C C C . T . G G A C C . C .
H10 A A . C T . C . C C C . T . G G A C C . C .
H12 A A . C T . C . . C C . T . . . A C C . C .
H14 C A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H15 C A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H16 C A . A . . . . . . . . T . . . A - A . C .
H17 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H18 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H19 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H20 . A . A . . . . . . . C T . . . A . A . C .
H21 . A . A . . . . . . . C T . . . A . A . C .
H22 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H23 . A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H24 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H25 . A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H26 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H27 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H28 . A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H29 . A . A . . . . . . . . T . . . A - A . C .
H30 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H31 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H32 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C T
H33 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H34 . A . A . . . . . . . . T . . . A C A . C .
H35 . A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H36 . A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H37 . G . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H38 . G . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H39 . G . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H40 . G . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H41 . A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H42 . G . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H43 . A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H44 C A . A G . . . . . . . T . . . A . A . C .
H45 . A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H46 . G . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H47 . G . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H48 . G . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H49 . A . A . . . . . . . . T . . . A . A . C .
H50 . A . A . A . . . . . . T . . . A - A G C .
61
Figura 22: Rede de haplótipos gerada a partir da análise do fragmento do gene COI de sete populações brasileiras de Anopheles cruzii. Os
retângulos indicam os haplótipos ancestrais e o tamanho das elipses é proporcional ao número de indivíduos encontrado em cada haplótipo. Os
círculos menores que ligam os haplótipos representam haplótipos intermediários não amostrados (missing haplotype).
62
As populações analisadas apresentaram um número médio de diferenças

nucleotídicas de k=23,107, diversidade genética de h=0,978 e diversidade
nucleotídica de π=0,04376. Os resultados para os testes de neutralidade não
foram significativos para Tajima’s D (p>0,10), Fu & Li’s F (0,10<p>0,005) e
significativo para Fu & Li’s D (p<0,02) (tab. 09).
Tabela 09: Diversidade genética e testes de neutralidade calculados para as sete

h=diversidade haplotípica; π=diversidade nucleotídica.
Diversidade Testes de neutralidade

k h π Tajima's D Fu & Li's D Fu & Li's F Fu's Fs
23,107 0,978 0,04376 0,43004 1,807997 1,47961 -5,986
A análise de variância molecular (AMOVA) demonstrou que as variações

observadas foram maiores entre as populações (88,11%) do que dentro das
populações (11%). Sendo o resultado das análises significativo (Fst: 0,8811 e
p<0,05), o que evidencia a estruturação genética e alto grau de diferenciação
entre as populações (tab.10).
Tabela 10: Análise de variância molecular (AMOVA) para as sete populações de

Anopheles cruzii. Legenda: Gl: graus de liberdade; p: significância.
Tipo de variação Gl Variação (%) Índice de fixação valor de p
Entre populações 6 88,11 0,8811 p<0,05
Dentro da população 84 11,89
Na tabela 11 estão ilustrados os resultados dos valores do índice de

fixação (Fst par-a-par) e o número de migrantes efetivos por geração (Nm)
distribuídos de acordo com as sete populações analisadas. Os valores de Fst
apresentaram-se muito altos entre as populações da Bahia e as demais (0,87-
0,97), sendo o maior índice observado entre a população de Morretes-PR e
Itaparica-BA (0,97). O número de migrantes efetivos por geração (Nm) foi baixo
entre todas as populações analisadas.
63
para COI (triângulo inferior) (p < 0,05). Legenda: CAM: Camacan-BA; ITP: Itaparica: BA;
MOR: Morretes-PR; ITT: Itatiaia-RJ; BOC: Bocaina-RJ; FLO: Florianópolis-SC; TAP:
Tapiraí-SP.
CAM ITP MOR ITT BOC FLO TAP

CAM - 0,02 0,01 0,02 0,02 0,04 0,03
ITP 0,93693 - 0,01 0,01 0,01 0,02 0,02
MOR 0,94757 0,97140 - 0,05 0,03 0,14 0,28
ITT 0,91031 0,94910 0,84134 - 0,54 0,72 0,20
BOC 0,91227 0,95357 0,89349 0,31817 - 0,64 0,18
FLO 0,87297 0,91664 0,63999 0,25654 0,28107 - 0,42
TAP 0,90426 0,93861 0,46961 0,55340 0,58736 0,37367 -
De acordo com os resultados obtidos pelo programa JmodelTest, o melhor

modelo de evolução nucleotídica para os dados apresentados é o modelo GTR
+G (general time reversible) (tab. 12). A análise filogenética entre os indivíduos
das sete populações amostradas foi realizada e está representada na figura 24.
64
Tabela 12: Resultado da seleção de modelo de evolução nucleotídica, para o gene COI,
especificado; Weight= peso de AIC; cumWeight= peso acumulado do AIC.
Modelo -lnL K AIC Delta Weight cumWeight

GTR+G* 2115,8780 191 4613,7560 0,0000 0,4934 0,4934
GTR+I 2115,1949 192 4614,3899 0,6338 0,3594 0,8528
GTR+I+G 2117,1708 191 4616,3416 2,5856 0,1354 0,9882
HKY+I+G 2123,3808 188 4622,7615 9,0055 0,0055 0,9937
HKY+I 2124,4411 187 4622,8822 9,1262 0,0051 0,9988
HKY+G 2125,8949 187 4625,7897 12,0337 0,0012 1,0000
SYM+I+G 2171,9990 189 4721,9980 108,2420 0,0000 1,0000
SYM+G 2173,4114 188 4722,8228 109,0668 0,0000 1,0000
SYM+I 2174,0321 188 4724,0643 110,3082 0,0000 1,0000
GTR 2184,9005 190 4749,8011 136,0450 0,0000 1,0000
F81+I 2191,7717 186 4755,5435 141,7874 0,0000 1,0000
F81+I+G 2191,2445 187 4756,4889 142,7329 0,0000 1,0000
F81+G 2193,0443 186 4758,0886 144,3326 0,0000 1,0000
K80+I+G 2195,6687 185 4761,3374 147,5814 0,0000 1,0000
K80+G 2197,6689 184 4763,3377 149,5817 0,0000 1,0000
HKY 2197,2704 186 4766,5409 152,7849 0,0000 1,0000
K80+I 2201,4621 184 4770,9243 157,1682 0,0000 1,0000
SYM 2231,9658 187 4837,9316 224,1755 0,0000 1,0000
JC+I 2245,3801 183 4856,7603 243,0043 0,0000 1,0000
JC+I+G 2245,1533 184 4858,3066 244,5505 0,0000 1,0000
JC+G 2247,6476 183 4861,2953 247,5392 0,0000 1,0000
F81 2254,4757 185 4878,9515 265,1954 0,0000 1,0000
K80 2257,4121 183 4880,8241 267,0681 0,0000 1,0000
JC 2305,8950 182 4975,7900 362,0340 0,0000 1,0000
A análise filogenética apresentou dois clados principais, sendo que a

população de Itaparica-BA aparece como grupo-irmão do clado que reúne as
demais populações. A população de Morretes-PR está mais proximamente
relacionada filogeneticamente com a população de Tapiraí-SP. Além disso,
observa-se ainda um clado representado pelas populações de Florianópolis-SC
e Rio de Janeiro (Itatiaia e Bocaina) (fig. 23).
65

amostrados em sete localidades, analisados através de fragmento do gene mitocondrial
COI. A história evolutiva foi inferida através do modelo general time reversible. Suporte
dos ramos de acordo com o teste de Bootstrap (1.000 réplicas). Grupo externo:
Anopheles homunculus GenBank: JQ291240.1 (Cananéia-SP).
66
5.2.2 NADH desidrogenase subunidade 4 – ND4

A análise do fragmento do gene mitocondrial ND4 foi realizada com 70
indivíduos provenientes de seis populações de quatro Estados brasileiros (Bahia,
Rio de Janeiro, Paraná e Santa Catarina). O DNA amplificado gerou um
fragmento de 361pb, com 249 sítios monomórficos e 112 sítios polimórficos.
Estes polimorfismos geraram 29 haplótipos (H1-H29), sendo o H21 o mais
frequente (41,4%) distribuído entre as populações de Florianópolis-SC, Bocaina-
RJ e Itatiaia-RJ (tab. 13).
As distinções entre os haplótipos ocorreram através de 47 transições e 50
transversões. Dentre as transições, foram observadas 32 transições C ↔ T e 15
A ↔ G. Quanto as transversões, ou seja, quando uma purina sofre mutação e se
torna uma pirimidina, ou vice-versa, observou-se 11 (A ↔C), 34 (A ↔T), 3 (G ↔
T) e 32 (G↔C) (tab.14).
A rede de haplótipos gerada a partir do método da parcimônia evidencia

cinco grupos. Os haplótipos encontrados na população de Camacan-BA
representam duas redes distintas, que também não são compartilhados com a
população de Itaparica-BA.
A rede de haplótipos nos quais os representantes de Morretes-PR estão

incluídos, também apresenta haplótipos da população de Florianópolis-SC e o
haplótipo ancestral (H17) pertencente a população de Morretes-PR. Além disso,
os demais haplótipos encontrados em Florianópolis-SC estão inseridos na rede
representativa da população de Bocaina-RJ e Itatiaia-RJ (fig. 24).
67
Tabela 13: Frequências haplotípicas observadas em seis populações de Anopheles

cruzii analisadas através do fragmento do gene ND4. Legenda: CAM: Camacan-BA,
ITP: Itaparica-BA, ITA: Itatiaia-RJ, BOC: Bocaina-RJ, MOR: Morretes-PR, FLO:
Florianópolis-SC.
Haplótipo CAM ITP ITA BOC MOR FLO Total %
H1 2 2 2,86
H2 1 1 1,43
H3 1 1 1,43
H4 2 2 2,86
H5 1 1 1,43
H6 1 1 1,43
H7 1 1 1,43
H8 1 1 1,43
H9 1 1 1,43
H10 4 4 5,71
H11 1 1 1,43
H12 2 2 2,86
H13 1 1 1,43
H14 1 1 1,43
H15 2 2 2,86
H16 1 1 1,43
H17 2 2 2,86
H18 1 1 1,43
H19 1 1 1,43
H20 2 2 2,86
H21 15 10 4 29 41,4
H22 2 2 2,86
H23 1 1 1,43
H24 3 3 4,29
H25 1 1 1,43
H26 1 1 1,43
H27 1 1 1,43
H28 1 1 1,43
H29 2 2 2,86
68
Tabela 14: Posição da variação nucleotídica entre os sítios 23-187 do fragmento do gene mitocondrial ND4 de Anopheles cruzii de seis
populações brasileiras. Os nucleotídeos invariáveis estão indicados com pontos, caso contrário, com o nucleotídeo alternativo.
23 35 44 46 56 59 65 80 82 86 88 89 93 95 97 98 112 113 118 121 122 125 131 137 146 149 152 163 164 166 178 179 184 186 187
H01 G T C A A C A T C A A A G C A C A A A G C A A T G T C T A T C G A C T
H02 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . .
H03 A . T G . T . A . T C C . . C . . . . A . T . . . A . . T A T . . . .
H04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H05 A . T G . T . A . T C C . . C . . . . A . T . . . A . . T A T . . . .
H06 A . T G . T . A . T C C T . C . . . . A . T . . . A . . T A T . . . .
H07 A . T G . T . A . T C C T . C . . . . A . T . . . A . . T A T . . . .
H08 . . . . . . . . . . . . T . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . .
H09 A . T G . T . A . T C C T . C . . . T A . T . C . A . . T A T . T . .
H10 A . T G . T . A . T C C T . C . . . T A . T . C . A . . T A . . T . .
H12 . . T . . T . . . . C C T . . . . . T A . T . C . A . . . A . . T . .
H13 . . T . . T . . . . C C T . . . . . T A . T . C . A . . . A . . T . .
H14 . . T . . T . . . . C C T . . . . . T A . T . C . A . . . A . . T . .
H16 A C T . G T G A T T . C T T . T T T T A A T . C A A A C . A T A . G C
H20 A C T . G T . A T T . C T T . T T T T A T T T C A A . . . A T A T A .
H23 A C T . G T . A T T . C T T . T T T T A A T . C A A A C . A T A . G C
H27 A C T . G T . A T T . C T T . T T T T A T T T C A A A . . A T A T A .
69
199 204 214 217 219 228 229 232 235 236 238 239 240 248 250 251 253 255 256 259 260 264 265 268 270 274 280 282 283 286
H01 T T C T T C T A A C T C A T C T A C T A G T T T A A T T T C
H02 . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H03 . . T A . . . . . . . . . . . . C . . T . C . . . . C . . T
H04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H05 . . T A . . . . . . . . . . . . C . . T . C . . . . C . . T
H06 . . T A . . . . . . . . . . . . C . . T . C . C T . C . . T
H07 . . T A . . . . . . . . . . . . C . . T . C . . . . C . . T
H08 . . T . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . .
H09 . . T A . . . . . . . A T . T C C T A T . C . . T . C . . T
H14 . . T A . . . . . . . T . . T C C T A T . C . . T . C . . T
H15 . . T A . . . . . . . . . . . C C T C T . C . . T . C . . T
H16 . . T A C T A . . A . . . . . . . . . T A . . . . . . . . T
H17 . . T A C T A . . A . . . . . . . . . T A . . . . . . . . T
H18 . . T A C T A . . A . . . . . . . . . T A . . C T . . . . T
H19 . . T A C T A . . A . . . . . . . . . T A . . . T . . . . T
H20 A C T A . T A G T . A A T A T . C T A T A C . C T . . C C T
H21 A C T A . T A G T . A A T A T . C T A T A C . C T . . C C T
H22 A C T A . T A G T . A A T A T . C T A T A C . C . . . C C T
H23 . . T A C T A G . A . . . A . . . . . . A . . . . . . . . T
H24 . . T A C T A G . A . . . A . . . . . . A . . . . T . . . T
H25 . . T A C T A G . A . . . A . . . . . . A . . . . T . C C T
H26 . . T A C T A G . A . . . . . . . T C T A . . . T . . . . T
H27 A C T A . T A G T . A A T A T . T T A T A C C C T . . C C T
H28 A C T A . T A T T . A A T A T . T T A T A C . C T . . C C T
H29 A C T A . T A T T . A A T A T . C T A T A C . C T . . C C T
70
287 288 291 292 295 298 301 307 313 316 317 319 322 325 326 334 337 340 343 344 346 349 356
H01 A G G T G A T T T A A T A T A T C A A A T G A
H02 . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H03 . T A C . C C . C C . A . . . G T . T . A A .
H04 . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H05 . A A C . C C . C C . A . . . G T . T . A A .
H06 T A A C . C . . C C . A . . . G . . T . A . .
H07 . A A C . C C . C C . A . . . G . . T . A . .
H08 . . . C . . . . . C . . . . . . . . . . . . .
H09 . A A C C C . . C C . A C C . G . . . . A A .
H10 . A A C C C . . C C . A C C . G . . . . A A .
H11 . A A C C C . . C C . A C . . G . . T . A . .
H12 . A A C C C . . C C . A C . . G . . . . . . .
H13 . A A C C C . . C C . A C C . G . . . . A . .
H14 . A A C C C . . C C . A C C . G . . . . A . .
H15 . A A C C C C . C C . A C C . G . . T . A . .
H16 . A A . A C . C . T . C . . . . T . . . A A .
H17 . A A . A C . C . T . C . . . . T . . G A A .
H18 . A A . A C . C . T . C . . . . T . . G A A .
H19 . A A . A C . C . T . C . . . . T . . G A A .
H20 . A A A A C . . . . . A T C . . . T . . . . .
H21 . A A A A C . . . . . A T C . A . T . . A A .
H22 . A A A A C . . . . . A T C . A . T . . A A .
H23 . T A . A C . . . T . C . . . . T . . . A A .
H24 . A A . A C . . . T . C . . . . T . . . A A .
H25 G A A A A C . . . . T C T . T . T . . . A A .
H26 . A A . A C . C . T . C T . . . T . . . A A .
H27 . A A A A C . . . . . A T C . . . T . . A . T
H28 . A A A A C . . . . . A T C . A . T . . A A .
H29 . A A A A C . . . . . A T C . A . T . . A A .
71
Figura 24: Rede de haplótipos gerada a partir da análise do fragmento do gene ND4 de seis populações brasileiras de Anopheles cruzii. Os
retângulos indicam os haplótipos ancestrais e o tamanho das elipses é proporcional ao número de indivíduos encontrado em cada haplótipo. Os
círculos menores que ligam os haplótipos representam haplótipos intermediários não amostrados (missing haplotype).
72
O número médio de diferenças nucleotídicas observado entre as

populações foi de k=30,237, diversidade genética de h=0,83 e diversidade
nucleotídica de π=0,08376. Os resultados para os testes de neutralidade não
foram significativos (p>0,10) para Tajima’s D, Fu & Li’s F e Fu & Li’s F (tab. 15).
Tabela 15: Diversidade genética e testes de neutralidade calculados para as seis

h=diversidade haplotípica; π=diversidade nucleotídica.
Diversidade Testes de neutralidade

k h π Tajima's D Fu & Li's D Fu & Li's F Fu's Fs
30,237 0,83 0,08376 0,51757 -0,46363 -0,08274 3,531
Segundo a análise de variância molecular (ANOVA), as variações

observadas foram maiores entre as populações (76,02%) do que dentro das
populações (23,98%). Além disso, observa-se estruturação genética e alto grau
de diferenciação entre as populações (Fst: 0,76021 e p<0,05) (tab. 16).
Tabela 16: Análise de variância molecular (ANOVA) para as seis populações de

Anopheles cruzii. Legenda: Gl: graus de liberdade; p: significância.
valor de
Tipo de variação Gl Variação (%) Índice de fixação
p
Entre populações 6 76,02 0,76021 p<0,05
Dentro da população 64 23,98
Na tabela 17 estão ilustrados os resultados dos valores do índice de

fixação (Fst par-a-par) e o número de migrantes efetivos por geração (Nm),
distribuídos de acordo com as sete populações analisadas. Elevados valores de
Fst foram obtidos entre as amostras da Bahia (Camacan e Itaparica) em relação
às demais populações (Fst de 0,63462 até 0,93031). Além disso, a população de
Morretes-PR também apresentou elevados valores de Fst quando comparada às
populações do Rio de Janeiro (Itatiaia e Bocaina). O número de migrantes
efetivos (Nm) foi muito baixo entre todas as populações analisadas.
73
para ND4 (triângulo inferior) (p < 0,05). Legenda: CAM: Camacan-BA; ITP: Itaparica-BA;
MOR: Morretes-PR; ITT: Itatiaia-RJ; BOC: Bocaina-RJ; FLO: Florianópolis-SC.
CAM ITP MOR BOC ITT FLO

CAM - 0,16 0,10 0,05 0,04 0,14
ITP 0,60547 - 0,03 0,03 0,02 0,11
MOR 0,71613 0,89252 - 0,01 0,00 0,30
BOC 0,83646 0,90815 0,97134 - 2,03 0,55
ITT 0,87065 0,93031 0,98729 0,10941 - 0,42
FLO 0,63462 0,69721 0,45842 0,31313 0,3749 -
Segundo o programa jModelTest o melhor modelo de evolução

nucleotídica para os dados de ND4 também é o general time reversible (GTR+G)
(tab. 18). A árvore representativa das relações filogenéticas entre os indivíduos
das seis populações analisadas está representada na figura 25.
De acordo com a árvore de relações filogenéticas, observa-se um clado

representado pelas populações de Camacan-BA e Itaparica-BA. Já os
representantes da população de Florianópolis-SC apresentam-se
randomicamente distribuídos na topologia obtida (não formam um clado). Parte
da população está em um clado compartilhado com a população de Morretes-
PR e os demais representantes da população de Florianópolis-SC estão em um
clado compartilhado com as amostras de Itatiaia-RJ e Bocaina-RJ (fig. 25).
A análise filogenética baseada nos haplótipos obtidos com a análise dos

fragmentos mitocondriais dos genes COI e ND4 está representada na figura 26.
As duas topologias (ND4 e COI) apresentam um clado com as populações de
Morretes-PR, Florianópolis-SC e Itatiaia-RJ (a população de Tapiraí-SP não foi
analisada no ND4). No que se refere as populações da Bahia, estas
apresentaram-se em um clado único. Ao analisar as populações separadamente,
a população de Camacan-BA está representada em dois clados na análise de
ND4. Neste caso parte desta população está em um clado compartilhado com
as amostras de Itaparica-BA.
74
Tabela 18: Resultado da seleção de modelo de evolução nucleotídica, para o gene ND4,
especificado; Weight= peso de AIC; cumWeight= peso acumulado do AIC.
Modelo -lnL K AIC Delta weight cumWeight

GTR+G* 1662,95490 149 3623,909900 0,0000000 0,293300 0,293300
HKY+I+G 1666,25230 146 3624,504600 0,5947000 0,217800 0,511100
GTR+I 1663,26010 149 3624,520200 0,6103000 0,216100 0,727300
HKY+I 1667,99690 145 3625,993700 2,0839000 0,103500 0,830700
HKY+G 1668,05880 145 3626,117600 2,2077000 0,097200 0,928000
GTR+I+G 1663,35880 150 3626,717500 2,8076000 0,072000 1,000000
F81+I+G 1697,07190 145 3684,143800 60,2340000 0,000000 1,000000
F81+I 1701,05180 144 3690,103600 66,1938000 0,000000 1,000000
SYM+I+G 1716,16610 147 3726,332100 102,4222000 0,000000 1,000000
SYM+G 1717,49690 146 3726,993800 103,0839000 0,000000 1,000000
SYM+I 1717,98490 146 3727,969800 104,0599000 0,000000 1,000000
GTR 1727,18000 148 3750,360100 126,4502000 0,000000 1,000000
HKY 1737,97460 144 3763,949300 140,0394000 0,000000 1,000000
K80+I+G 1749,07880 143 3784,157500 160,2476000 0,000000 1,000000
K80+G 1750,11190 142 3784,223800 160,3139000 0,000000 1,000000
K80+I 1750,27580 142 3784,551700 160,6418000 0,000000 1,000000
JC+G 1765,24520 141 3812,490400 188,5805000 0,000000 1,000000
JC+I+G 1764,25320 142 3812,506300 188,5964000 0,000000 1,000000
JC+I 1766,42020 141 3814,840400 190,9306000 0,000000 1,000000
SYM 1775,59320 145 3841,186500 217,2766000 0,000000 1,000000
K80 1810,36130 141 3902,722600 278,8127000 0,000000 1,000000
JC 1824,61860 140 3929,237200 305,3274000 0,000000 1,000000
75

amostrados em seis localidades, analisados através de fragmento do gene mitocondrial
ND4. A história evolutiva foi inferida através do modelo general time reversible. Suporte
dos ramos de acordo com o teste de Bootstrap (1.000 réplicas). Grupo externo: An.
homunculus coletado em Morretes-PR.
76
Figura 26: Análises de máxima verossimilhança entre os haplótipos provenientes da

análise dos fragmentos dos genes mitocondriais COI e ND4 de Anopheles cruzii. A
história evolutiva foi inferida através do modelo general time reversible. Suporte dos
ramos de acordo com o teste de Bootstrap (1.000 réplicas).
77
6. DISCUSSÃO

As populações de An. cruzii analisadas com a técnica de morfometria
geométrica alar apresentam diferenças significativas no formato das asas. As
deformidades observadas não se restringiram a um setor específico das asas e,
segundo a análise de Superposição de Procrustes, os marcos mais informativos
estavam localizados na base (LM 1 a 3), região mediana (LM13, 17 a 21) e ápice
(LM 6 a 12). Essas variações entre o ápice e a região mediana da asa são
congruentes com observações realizadas em outras espécies de Culicidae
(Devicari et al. 2011; Vidal & Suesdeck, 2012) e mesmo em An. cruzii (Lorenz et
al. 2014, 2015). Com a inclusão de mais marcos anatômicos (n=23) foi possível
descrever variações ainda não observadas para a espécie, principalmente na
base e região mediana da asa.
A variação fenotípica interpopulacional em An. cruzii foi constatada,

principalmente no que se refere à população de Camacan-BA. Alguns estudos
vêm apontando a existência de uma linhagem geneticamente distinta no Estado
da Bahia, localizada em Itaparica (Rona et al. 2009, 2010). Na análise de
distância de Mahalanobis, a população de Camacan de fato se mostrou mais
distanciada (dissimilar) que as demais populações analisadas, o que corrobora
a possível existência destas linhagens geneticamente diferentes no Estado.
Além da dissimilaridade da população de Camacan-BA nas análises

morfométricas por população, as amostras da Ilha do Mel-PR apresentaram um
formato das asas mais estreito e alongado em relação às demais e alta
dissimilaridade na análise de distância de Mahalanobis. Ferreira et al. (1969b)
realizaram um estudo sobre o raio de voo de An. cruzii em Guaratuba-PR e
demonstraram que este anofelino poderia deslocar-se por até 1.000 metros na
direção dos ventos predominantes. A Ilha do Mel está localizada a cerca de 2.600
metros de distância da costa do Paraná (Pontal do Paraná) e 1.700 metros da
Ilha de Superagui, fato que chama a atenção diante da variação morfológica
observada nesta população. Apesar desta população estar localizada além da
capacidade de dispersão ativa desta espécie, provavelmente não está isolada
geneticamente devido a provável ocorrência de dispersão passiva decorrente do
78
transporte marítimo de pessoas e produtos entre os portos de Paranaguá, Pontal

do Sul e a Ilha do Mel.
A diferenciação morfológica desta população da Ilha do Mel-PR

principalmente com relação às demais populações localizadas no Paraná
(Antonina e Morretes) evidencia uma possível diferenciação morfológica
ocorrendo na população da ilha. Com isso, a análise desta população através de
caracteres moleculares seria interessante para a compreensão da estrutura
populacional da espécie na região.
6.2 Marcadores moleculares – COI e ND4

Os dados analisados com base nos fragmentos de genoma mitocondrial
de COI e ND4 apresentaram um alto nível de diferenciação entre várias
populações de An. cruzii no Brasil. Além disso, a diversidade genética
apresentou-se alta para ambos os genes analisados (COI h=0,978; π+0,04376
e ND4 h=0,83; π+0,08376), indicando alta taxa de polimorfismos em An. cruzii.
O número de migrantes efetivos por geração (Nm) foi muito baixo (ou inexistente)
entre as populações analisadas, o que é consistente com os altos índices de Fst
observados para ambos marcadores analisados.
A análise de diversidade genética revelou a existência de 50 haplótipos e

96 polimorfismos para COI e 29 haplótipos e 112 polimorfismos para ND4.
Ambos marcadores resultaram em haplótipos exclusivos para as populações da
Bahia.
As populações da Bahia (Camacan-BA e Itaparica-BA) apresentaram

altos índices de Fst quando comparadas entre si (0,60547 para ND4 e 0,93693
para COI). Ainda, estas populações apresentaram elevados índices de Fst
quando comparadas às demais populações do Sudeste e Sul do Brasil, variando
de 0,97140 (Itaparica-Morretes, COI) a 0,63463 (Camacan-Florianópolis, ND4).
No que se refere às populações da Bahia, somente Itaparica havia sido

analisada em trabalhos realizados previamente, nos quais a análise do gene
timeless indicou que esta população provavelmente corresponderia a uma
79
espécie diferente das demais que ocorrem no Sul e Sudeste do Brasil (Rona et
al. 2009).
A distinção entre Itaparica-BA e Florianópolis-SC foi avaliada por Rona et

al. (2010) através de vários marcadores moleculares (timeless, cycle, clock,
Rp49, RpS2 e RpS29) e neste caso os altos índices de Fst obtidos variaram de
0,5806 (clock) até 0,8865 (RpS29), reforçando a existência de um complexo de
espécies em An. cruzii.
Os resultados obtidos no presente estudo não somente corroboram a

existência de uma espécie isolada em Itaparica-BA, como também indicam a
existência de uma segunda espécie críptica ocorrendo em Camacan-BA. Esses
dados também são confirmados através da análise filogenética, na qual a
população de Camacan aparece em um clado único, separado dos terminais de
Itaparica (nas análises de COI) e um clado formado por parte dos terminais de
Camacan, mas separado do clado do restante dos indivíduos de Camacan e
Itaparica (em ND4). Além disso, os haplótipos encontrados em cada uma destas
populações são exclusivos e não apresentam um ancestral comum.
Calado & Navarro (2005) analisaram a variabilidade genética pela técnica

de PCR-RAPD da região ITS2 entre exemplares de An. cruzii de São Paulo,
Paraná e Santa Catarina, observando uma grande variação entre os fragmentos
amplificados obtidos, não sendo possível obter fragmentos fixados para as
amostras analisadas. Resultados similares foram obtidos por Malafronte et al.
2007, entre populações de São Paulo e Santa Catarina, com sequências de
ITS2. No presente trabalho, a amostra de Morretes-PR revelou altos índices de
Fst tanto para COI quanto para ND4, comparando-se tanto com a população de
Florianópolis-SC quanto com as demais, o que possivelmente indica que a
população de Morretes-PR compõe uma linhagem genética distinta das demais,
que está em um processo de diferenciação e especiação.
Zavortink (1973) observou a existência de variações morfológicas entre

larvas coletadas no Rio de Janeiro e Santa Catarina, sugerindo a existência de
um complexo de espécies em An. cruzii. Análises moleculares realizadas por
Rona et al. (2013) envolvendo as populações de Itatiaia-RJ e Florianópolis-SC
indicaram que estas seriam duas espécies distintas e sugeriram a existência de
80
duas espécies ocorrendo em simpatria em Itatiaia-RJ. Nas análises realizadas

com os marcadores COI e ND4 obteve-se valores parecidos de Fst entre a
população de Florianópolis-SC e Itatiaia-RJ no que se refere ao marcador ND4
e os genes timeless (Itatiaia A), cycle (Itatiaia A) e R49 (Itatiaia B), e com o
marcador COI quando comparado aos genes cycle (Itatiaia geral e B), Rp49
(Itatiaia A) e RpS2 (Itatiaia geral e A).
Quanto às demais populações, o índice Fst da população de Itatiaia-RJ

manteve-se alto no que se refere ao marcador molecular ND4 em relação às
populações da Bahia e Morretes-PR e em COI entre as populações da Bahia,
Bocaina-RJ, Morretes-PR e Tapiraí-SP. Quanto à filogenia, a população de
Itatiaia agrupou-se em um clado único somente na análise de COI, sendo
polifilética na análise com o marcador ND4. Estes resultados indicam um alto
grau de diferenciação entre a populações de Itatiaia-RJ em relação às do Sul e
Sudeste do Brasil.
O fragmento do gene COI apresentou uma alta diversidade genética entre

as linhagens e a morfometria das asas se mostrou mais sensível para a distinção
da população da Bahia. Aparentemente, a forma da asa é menos estável
evolutivamente quando comparada ao gene COI, como previamente apontado
em Motoki et al. (2012) e Petersen et al. (2015).
Endemismos filogenéticos, que são o grau em que a história de

linhagens recentemente evoluídas está restrita espacialmente, refletem
processos evolutivos como divergência, adaptação e respostas biológicas a
heterogeneidades ambientais. As principais hipóteses aceitas para explicar os
altos níveis de endemismos nos trópicos frequentemente envolvem
heterogeneidades climáticas, tempo e a observação de que as espécies tropicais
possuem tolerâncias fisiológicas restritas (Rosauer et al. 2009). Ao se analisar a
história filogeográfica da Mata Atlântica, observa-se descontinuidades
recorrentes em diferentes grupos de organismos. Uma das principais hipóteses
utilizadas para explicar a diversificação e estas descontinuidades é a teoria de
refúgios florestais. De acordo com esta teoria, os refúgios seriam ilhas de
florestas densas e úmidas isoladas por vegetação aberta, formadas durante o
período glacial intenso do hemisfério Norte durante o Pleistoceno, que
81
consequentemente levaram à aridificação no hemisfério Sul e fragmentação das

florestas, inclusive a Mata Atlântica. (Barata-Filho & Miyaki, 2011). Essa
fragmentação teria originado três principais descontinuidades (refúgios): i) norte
da Mata Atlântica (acima de 20° latitude Sul), até as proximidades da foz do Rio
Doce (Norte do Espirito Santo e Bahia), ii) ao sul do Rio Doce até o norte do
Estado de São Paulo e iii) sul de São Paulo até Santa Catarina (Carnaval &
Moritz, 2008; Carnaval et al. 2009)
A localização destas possíveis zonas de instabilidade climática é

congruente com os dados apresentados no presente estudo, nos quais as
espécies crípticas da Bahia estariam localizadas em um refúgio localizado ao
norte do Rio Doce. Rona et al. (2009, 2010) analisaram o tempo de divergência
entre amostras de Itaparica-BA e as populações do Sul e Sudeste do Brasil e
observaram que estas possivelmente divergiram durante as mudanças
climáticas do Pleistoceno e não trocaram migrantes deste a separação. Segundo
Carnaval (2014), as mudanças climáticas do passado refletem melhor os
padrões de endemismos filogeográficos desta região.
No que se refere aos refúgios localizados ao sul do Rio Doce, condições

climáticas atuais explicam melhor os padrões de endemismos observados
(Carnaval et al. 2014). Altos índices de Fst foram obtidos para a população de
Morretes-PR em relação às demais, indicando um provável processo de
especiação e diferenciação em andamento. Como esta linhagem geneticamente
distinta está localizada no refúgio localizado mais ao sul da Mata Atlântica (junto
com as populações de Florianópolis e Tapiraí-SP), outros processos de
divergência, não ligados a teorias de refúgios, como por exemplo cadeias de
montanhas isolando populações, provavelmente explicam este padrão de
diferenciação em estudos futuros.
82
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A análise da estrutura populacional de An. cruzii ao longo da Mata

Atlântica, com base em técnicas de morfometria e moleculares, evidenciaram a
existência de diferentes linhagens genéticas e morfológicas ocorrendo na região.
A técnica de morfometria geométrica possibilitou a distinção fenotípica da

população de Camacan-BA através de variações da forma das asas nas análises
por Estado e população. As amostras da Ilha do Mel-PR apresentaram-se
distintas das demais, sendo as asas mais estreitas e alongadas em relação às
demais populações. Essa característica aliada ao fato da ilha estar localizada,
além da capacidade de dispersão da espécie, revela a necessidade de
investigação da estrutura populacional da espécie na região.
Os resultados obtidos nas análises de fragmentos dos genes

mitocondriais ND4 e COI indicaram estruturação populacional em An. cruzii com
baixo fluxo gênico entre as amostras analisadas e grupos geneticamente
diferentes. Os dois marcadores utilizados evidenciam que os exemplares de An.
cruzii coletados em Itaparica-BA e Camacan-BA representam pelo menos duas
linhagens geneticamente diferentes entre si quando comparados às amostras do
Sul e Sudeste do Brasil. Além disso, as amostras de Morretes-PR apresentaram
altos índices de Fst e número de migrantes muito baixo quando comparadas às
demais populações, indicando que esta população provavelmente está em
processo de diferenciação e especiação.
83
8. REFERÊNCIAS
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97
CAPITULO II
98
ABSTRACT
Anopheles cruzii is a culicid considered the main vector of the etiological agent
of malaria in the South and Southeastern regions of Brazil. Due to its
epidemiological importance, several studies involving the genetic structure of this
species were carried out, revealing that this species probably represents a
species complex. The objective of this chapter was to evaluate the existence of
ecologic niche variations among the genetically distinct groups of Anopheles
cruzii, obtaining additional information to understand the taxonomic status of the
species. Occurrence records of An. cruzii from six Brazilian states (Rio Grande
do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Rio de Janeiro e Espírito Santo) were
collected and geo-referenced. The climatic variables applied in the niche
modeling and ecological niche overlap analyses were obtained from WorldClim
and ENVIREM. The ecologic niche modeling was performed in order to obtain
maps of the lineage distribution while the existence of ecological niche overlap
was evaluated through Schoener’s D and Hellinger’s indices. The ENM indicated
the habitats available for the occurrence of both studied lineages in the states of
Santa Catarina, Paraná and São Paulo. Ecological niche overlap of adequate
habitat for the studied lineages was detected in São Paulo and Rio de Janeiro,
regions where the existence of distinct genetic lineages occurring in sympatry
has been previously pointed out. The results suggest that the characteristics of
the modelled niches may not have been the most relevant to drive the speciation,
considering that there is a niche overlap among the studied lineages. Many
speciation processes may have acted, and are still acting, for the diversification
of those genetically diverse groups in An. cruzii.
Keywords: Anopheles cruzii, genetic lineages, ecological niche overlap.

99
RESUMO
Anopheles cruzii é um culicídeo considerado vetor primário do agente etiológico
da malária nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. Devido a sua importância
epidemiológica, vários estudos envolvendo a análise da estruturação genética
desta espécie foram realizados, revelando que esta espécie provavelmente
representa um complexo de espécies. O objetivo deste capítulo foi avaliar a
possível existência de variações de nicho ecológico entre os grupos
geneticamente distintos de Anopheles cruzii, obtendo-se informações adicionais
para a compreensão do status taxonômico desta espécie. Foram coletados e
georreferenciados registros de ocorrência da espécie provenientes de seis
Estados brasileiros (Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Rio
de Janeiro e Espírito Santo) e as variáveis climáticas utilizadas nas análises de
modelagem de nicho e sobreposição de nicho foram obtidas no WorldClim e no
ENVIREM. Realizou-se a modelagem de nicho ecológico para a obtenção de
mapas de distribuição das linhagens e a existência de sobreposição de nichos
foi avaliada através dos índices de Schoener’s D e Hellinger’s I. A MNE
demostrou a existência de habitats disponíveis para a ocorrência das duas
linhagens analisadas nos Estados de Santa Catarina, Paraná e São Paulo. A
sobreposição de habitats adequados para as linhagens analisadas foi observada
em São Paulo e Rio de Janeiro, locais onde a existência de linhagens genéticas
distintas ocorrendo em simpatria já foi previamente indicada. Os resultados
apresentados sugerem que as características dos nichos modelados talvez não
tenham sido as mais importantes para dirigir a especiação, já que observou-se
a sobreposição de nichos entre as linhagens analisadas. Vários processos de
especiação devem ter atuado/estão atuando para a diversificação destes grupos
geneticamente distintos em An. cruzii.
Palavras-chave: Anopheles cruzii, linhagens genéticas, sobreposição de nicho

ecológico.
100
1. INTRODUÇÃO
A compreensão de muitas incertezas sobre o status taxonômico de
determinadas espécies pode ser obtida através da análise em conjunto de dados
morfológicos e moleculares. Além disso, propostas recentes incluem a análise,
em conjunto, de abordagens de nicho ecológico, dados ambientais e de
distribuição de espécies para auxiliar na delimitação taxonômica de espécies
crípticas (Rissler & Apodaca, 2007).
O conjunto de fatores abióticos e bióticos nos quais uma determinada

espécie é capaz de manter uma taxa de crescimento positiva (≥ 0) define o
conceito de nicho (sensu Hutchinson; Holt, 2009). O nicho seria um espaço
hipervolumétrico que pode ser dividido em: (1) nicho fundamental, que se define
pelas condições ambientais (fatores abióticos) necessários para que uma
espécie mantenha uma taxa de crescimento positiva e (2) nicho realizado, no
qual as interações bióticas (fatores bióticos) são levadas em consideração para
uma taxa de crescimento positiva da espécie. Dessa maneira a área definida
pelo nicho fundamental é, via de regra, maior que o nicho realizado (Holt, 2009).
Vários são os fatores envolvidos nesta delimitação de nicho, dentre estes
densidade populacional, predação, adaptações alimentares e condições
ambientais como pH, intensidade luminosa, precipitação, umidade e temperatura
(Wiens et al. 2010). Espécies próximas podem se adaptar a condições
ambientais com habitats específicos e a atuação da seleção divergente pode
impulsionar a especiação por isolamento reprodutivo, entre as populações que
ocorrem em alopatria ou simpatria. Esse fenômeno pode resultar em pares de
populações geneticamente divergentes que diferem em caracteres fenotípicos
mais adaptados para cada condição ambiental específica (Schluter, 2001).
Elucidar a história evolutiva de organismos é fundamental para se

entender o grau de evolução de nichos ecológicos ao longo de intervalos de
tempo evolutivos, revelando-se como e quando fatores ambientais podem
influenciar a seleção natural (MacColl, 2011).
Uma grande variedade de abordagens para construção de modelos

quantitativos de nichos ecológicos de espécies vem sendo desenvolvida nas
últimas décadas, essas técnicas são comumente denominadas de modelagem
101
de nicho ecológico (MNE) (Peterson et al .2011). Esses modelos baseiam-se em

dados ambientais em macroescala (que apresentam os requerimentos
ecológicos para a ocorrência da espécie) e extrapolam a distribuição potencial
da espécie para áreas pouco ou mal amostradas, com base em dados de registro
de ocorrência confirmada da espécie (Elith et al. 2006).
A MNE tem se tornado uma ferramenta importante em estudos de

ecologia, biogeografia, taxonomia, biologia da conservação e sobre os efeitos
ecológicos de mudanças climáticas na distribuição de espécies, muitas vezes já
ameaçadas de extinção (Blair et al. 2013; Zhang et al. 2014). Além disso, a MNE
auxilia na compreensão de quais variáveis ambientais são mais importantes para
manter a distribuição de organismos, afetando os limites geográficos de
linhagens genéticas e, consequentemente, permite testar se nichos ecológicos
são diferentes ou idênticos entre espécies (Warren et al. 2008).
Para a realização das análises de MNE das espécies, utiliza-se dados

provenientes de registros de ocorrência e variáveis ambientais comumente
associadas a distribuição geográfica dos organismos (Peterson, 2011). Os dados
abióticos, também chamados de camadas ambientais, usualmente utilizados nas
análises são: dados climáticos (temperatura, precipitação) e topográficos
(relevo). Além destes, também podem ser analisados dados sobre o solo e
índices de vegetação (Blair et al. 2013; Zhang et al. 2014).
A MNE é uma técnica ainda pouco utilizada para dados provenientes de

registros de ocorrência de Culicidae (Diptera). A maioria dos estudos aplica a
técnica para a modelagem de distribuição potencial de culicídeos vetores de
agentes etiológicos, para implementação de medidas de vigilância, como
observado em Aedes albopictus (Skuse) na Europa (Fischer et al. 2011) e sua
distribuição pelo mundo (Medley, 2010); Anopheles farauti Laveran na Austrália
(Sweeney et al. 2007); Anopheles quadrimaculatus Say, Culex tarsalis Coquillett
e Culex pipiens Linnaeus nos Estados Unidos (Levine et al. 2004; Larson et al.
2010); Anopheles spp. na África (Moffett et al. 2007), na Ásia (Foley et al. 2008)
e no Vale do Ribeira no Brasil (Laporta et al. 2011).
A distribuição espacial de Anopheles cruzii Dyar & Knab foi avaliada por
Laporta et al. (2011) no Vale do Ribeira em São Paulo-BR por meio da técnica
102
de MNE. Observou-se que a ocorrência desta espécie está correlacionada às

áreas de encosta da Serra do Mar, ao contrário de An. bellator Dyar & Knab, cuja
distribuição está associada a áreas de planície costeira. An. cruzii é um anofelino
pertencente ao subgênero Kerteszia altamente especializado em utilizar
bromélias para o desenvolvimento de suas formas imaturas, ocorrendo em
regiões de Mata Atlântica do Estado do Rio Grande do Sul até Sergipe
(Zavortink, 1973; Forattini, 2002).
An. cruzii é um culicídeo considerado vetor primário do agente causador

da malária nas regiões Sul e Sudeste do Brasil (Ferreira & Luz, 2003).
Exemplares desta espécie já foram encontrados naturalmente infectados com
Plasmodium vivax e Plasmodium malariae em áreas de Mata Atlântica
(Branquinho et al. 1997; Duarte et al. 2013; Neves et al. 2013; Kirchgatter et al.
2014). A infecção de An. cruzii por Plasmodium falciparum foi recentemente
relatada por Laporta et al. (2015) no Estado de São Paulo, sugerindo que este
mosquito também pode estar envolvido na sua transmissão. An. cruzii também
é considerado o principal vetor de malária simiana nas regiões Sul e Sudeste do
Brasil. Neste ciclo, o culicídeo pode ser infectado e transmitir Plasmodium
simium e Plasmodium brasilianum para macacos bugio (Aloutta spp.) (Deane,
1992).
Devido a sua importância epidemiológica, vários estudos envolvendo a
análise da estruturação genética desta espécie foram realizados, revelando que
An. cruzii provavelmente representa um complexo de espécies (Zawortink, 1973;
Ramirez et al. 1994; Ramirez & Dessen, 2000a,b; Calado & Navarro-Silva 2005,
Malafronte et al. 2007; Carvalho & Lourenço de Oliveira, 2004, Rona et al. 2009,
2010a,b, 2013).
103
2. JUSTIFICATIVA
A alta diversidade genética e morfométrica encontrada entre as

populações de An. cruzii em São Paulo e no Paraná com relação às demais
populações analisadas no Capítulo 1 indica que estas sejam linhagens
geneticamente distintas das demais analisadas.
A possibilidade de An. cruzii representar um complexo de espécies já foi

levantada em vários estudos sobre as populações da Mata Atlântica com base
em análises moleculares, porém ainda não se sabe se estas linhagens
apresentam nichos ecológicos distintos e se fatores ambientais estão
influenciando em sua distribuição.
A análise da possível existência de diferenciação de nicho ecológico

delimitando a distribuição destas linhagens poderá auxiliar no esclarecimento do
status taxonômico de An. cruzii.
104
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
 Avaliar a existência de variações de nicho ecológico entre os grupos

geneticamente distintos de Anopheles cruzii, obtendo-se informações
adicionais para a compreensão do status taxonômico desta espécie.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Desenvolver modelos de nicho ecológico utilizando dados de ocorrência

de An. cruzii nos Estados do Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo,
Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul e camadas ambientais;
 Avaliar a existência de conservação de nicho ecológico entre as linhagens
genéticas analisadas.
105
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção dos dados de distribuição de An. cruzii

Os dados de distribuição de An. cruzii foram obtidos através da literatura
especializada, contato com coleções onde exemplares estão depositados e na
base de dados do speciesLink (splink.cria.org.br). Somente registros dos quais
os dados de latitude e longitude poderiam ser obtidos com precisão foram
utilizados nas análises.
Os registros foram separados em dois grupos (A e B) de acordo com os

trabalhos mais recentes de diversidade genética entre populações de An. cruzii,
segundo os quais observa-se uma diferenciação genética entre os exemplares
coletados no Paraná e São Paulo com relação às demais populações da Mata
Atlântica. Portanto o Grupo A é representado pelos registros dos Estados do
Paraná, Santa Catarina (Brusque, Itapoá, Itapema, Garuva e São Francisco do
Sul) e São Paulo (exceto os registros da Serra da Bocaina). Já o grupo B é
representado pelos registros do Rio Grande do Sul, Santa Catarina
(Florianópolis), Rio de Janeiro e São Paulo (Serra da Bocaina).
Foram coletados e georreferenciados dados provenientes de seis Estados

brasileiros (Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Rio de
Janeiro e Espírito Santo) distribuídos em 55 localidades, totalizando 80 registros
de ocorrência (tab. 01). As ocorrências nos Estados da Bahia, Pernambuco e
Sergipe não foram incluídas nas análises devido ao número reduzido de registros
obtidos. Para reduzir uma possível dependência entre os registros de ocorrência,
foram excluídos aleatoriamente aqueles com menos de 10 km de distância entre
si. Como resultado, o conjunto de dados final apresentou 36 registros para o
grupo A e 25 para o grupo B.
106
Tabela 01: Registros georreferenciados de ocorrência de Anopheles cruzii utilizados na confecção dos modelos de distribuição, com localidades
e fonte dos dados. Legenda: DZUP: Coleção Pe. Jesus Santiago Moure-UFPR e FIOCRUZ: Coleção de Culicidae do Instituto Oswaldo Cruz.
Estado Grupo Cidade Localidade Latitude Longitude Coleção/Referência

Rio Grande do Sul Grupo B São Francisco de Paula Centro de Proteção e Conservação da Natureza-Pró Mata -29.486111 -50.195000 Cardoso et al 2004
Grupo B Viamão Fazenda Quinta da Estância Grande -30.046389 -50.986389 Cardoso et al 2004
Grupo B Osório Balneário de Atlântida Sul -29.865833 -50.078611 Cardoso et al 2004
Grupo B Maquiné -29.589556 -50.262639 Oliveira et al 2016
Grupo B São Francisco de Paula -29.448100 -50.583600 FIOCRUZ
Santa Catarina Grupo A São Francisco do Sul Tapera Forest -26.234278 -48.685917 Deane et al 1984
Grupo A São Francisco do Sul Propriedade particular -26.243611 -48.639444 Calado & Navarro-Silva 2005
Grupo A Itapema São Paulinho -27.107494 -48.643850 Marchi et al 2010
Grupo A Itapema Praia Grossa -27.084297 -48.597544 Marchi et al 2010
Grupo A Brusque -27.098012 -48.917394 FIOCRUZ
Grupo A Garuva -26.011297 -48.741401 B. Westphal-Ferreira
Grupo A Itapoá -26.014890 -48.610339 B. Westphal-Ferreira
Grupo B Florianópolis Unidade de Conservação de Desterro -27.530578 -48.512306 Calado & Navarro-Silva 2005
Paraná Grupo A Paranaguá Parque Estadual do Palmito -25.583333 -48.533333 Dalla Bona & Navarro-Silva, 2006
Grupo A Paranaguá -25.547813 -48.573558 DZUP
Grupo A Paranaguá Praça Eufrásio Correa -25.520005 -48.509200 FIOCRUZ
Grupo A Foz do Iguaçu Parque Nacional do Iguaçu -25.652376 -54.432943 Guimarães et al 1995
Grupo A Morretes IAPAR -25.500000 -48.816667 Calado & Navarro-Silva 2005
Grupo A Morretes Chácara -25.586223 -48.724168 Westphal-Ferreira, B.
Grupo A Piraquara Mananciais da Serra -25.416667 -49.050000 DZUP
Grupo A Ilha do Mel -25.510000 -48.312417 Calado & Navarro-Silva 2005
Grupo A Guaratuba -25.877004 -48.593440 Ferreira, 1969
Grupo A Matinhos -25.772158 -48.518836 DZUP
Grupo A Matinhos -25.817500 -48.542800 FIOCRUZ
Grupo A Guaraqueçaba Tagaçaba -25.297962 -48.315176 DZUP
Grupo A Jociaba Fazenda Álamo -24.800000 -51.233333 DZUP
Grupo A São Mateus do Sul -25.855556 -50.318889 DZUP
Grupo A Antonina Preserva Natural Morro da Mina -25.366667 -48.783333 DZUP
107
Tabela 01: Continuação. Registros georreferenciados de ocorrência de Anopheles cruzii utilizados na confecção dos modelos de distribuição,
com localidades e fonte dos dados.
São Paulo Grupo A Cananéia -24.890694 -47.837917 Calado & Navarro-Silva 2005
Grupo A Cananéia -25.016667 -47.950000 Oliveira et al 2016
Grupo A Cananéia Aroeira -24.885000 -47.850278 Lorenz et al 2015 (morfometria)
Grupo A Cananéia Sítio Andrade -24.939568 -47.973995 Forattini et al. 1993
Grupo A Cananéia Sítio Itapoã -24.936786 -47.969619 Forattini et al. 1993
Grupo A Bertioga Boracéia -23.516667 -45.716667 Malafronte et al 2007
Grupo A Juquitiba -23.950000 -47.050000 Rona et al 2009
Grupo A Juquitiba Reserva Estadual Pedro de Toledo -24.066667 -47.000000 Branquinho et al 1997
Grupo A Juquitiba -24.885000 -47.850278 Kirchgatter et al 2014
Grupo A São Vicente Parque Estadual da Serra do Mar -23.959482 -46.495343 Branquinho et al 1997
Grupo A Salto -23.200003 -47.279997 FIOCRUZ
Grupo A São Paulo Parque Estadual da Cantareira -23.401389 -46.590000 Oliveira et al 2016
Grupo A Cananéia -25.016667 -47.916667 Rona et al 2009
Grupo A Cananéia Fazenda Folha Larga -24.908531 -47.933893 Forattini 1978; 1986; 1990
Grupo B São José do Barreiro Serra da Bocaina -22.682872 -44.597477 Guimarães et al 2000
Grupo A Cananéia Sítio Vilarinho -24.999833 -48.027275 Forattini 1986
Grupo A Sete Barras Reserva Florestal de Sete Barras -24.055300 -47.994251 Fiocruz, Forattini, 1978
Grupo A Iguape Escola Agrícola -24.670948 -47.546249 FIOCRUZ
Grupo A Ilha Comprida -24.900613 -47.787462 Ueno et al 2007
Grupo A Pariquera Açu Fazenda Experimental-APTA -24.609822 -47.884200 Forattini et al 1978 FIOCRUZ
Grupo A Peruíbe -24.233333 -46.883333 Malafronte et al 2007
Grupo A Peruíbe Aldeia do Índios -24.316667 -47.000000 Ramirez, et al 1994
Grupo A Salesópolis Estação Biológica da Borácea -23.630833 -45.869722 Heineman & Belkin, 1979
Grupo A Ilhabela Estância Balneária de Ilha Bela -23.806892 -45.361231 Marques & Forattini, 2009
Grupo A Ubatuba Parque Estadual da Serra do Mar - Núcleo Picinguaba -23.357361 -44.850317 Guimarães et al 2000
108
Tabela 01: Continuação. Registros georreferenciados de ocorrência de Anopheles cruzii utilizados na confecção dos modelos de distribuição,
com localidades e fonte dos dados.
Rio de Janeiro Grupo B Parati -23.217800 -44.713100 FIOCRUZ
Grupo B Petrópolis Km 49 -22.505000 -43.178600 FIOCRUZ
Grupo B Teresópolis Parque Nacional da Serra dos Órgãos Sub sede -22.412200 -42.965600 FIOCRUZ
Grupo B Nova Iguaçu -22.720000 -43.422500 Carvalho-Pinto & Lourenço de Oliveira 2004
Grupo B Itatiaia -22.450000 -44.600000 Rona et al 2009
Grupo B Macaé -22.370800 -41.786900 FIOCRUZ
Grupo B Taquari Parque Nacional da Serra da Bocaina -23.024131 -44.718464 L. Rona D.P
Grupo B Guapimirim Condomínio Monte Olivetti -22.537200 -42.981900 FIOCRUZ
Espirito Santo Grupo B Cariacica -20.272500 -40.418056 Rezende, Cerutti Júnior e Santos (2005)
Grupo B Domingos Martins -20.362222 -40.660000 Rezende, Cerutti Júnior e Santos (2005)
Grupo B Guarapari* -20.670833 -40.498889 Deane, Ferreira Neto e Sitônio (1968),
Grupo B Itapemirim -20.009444 -40.834167 Rezende, Cerutti Júnior e Santos (2005)
Grupo B Marechal Floriano -20.077222 -40.673333 Deane, Ferreira Neto e Sitônio (1968),
Grupo B Santa Leopoldina -25.416667 -49.050000 Deane, Ferreira Neto e Sitônio (1968),
Grupo B Santa Teresa -19.936667 -40.591111 Deane, Ferreira Neto e Sitônio (1968),
Grupo B Santa Teresa Valsugana -19.966222 -40.567833 Sallum et al 2008; Rezende et al 2009
Grupo B Serra -20.127778 -40.306944 Rezende, Cerutti Júnior e Santos (2005)
Grupo B Vargem Alta -20.671389 -41.660278 Deane, Ferreira Neto e Sitônio (1968),
Grupo B Santa Teresa -19.933333 -40.583333 Rona et al 2009
Grupo B Vila Velha -20.336667 -40.291111 Rezende, Cerutti Júnior e Santos (2005)
109
Em estudos de modelagem de distribuição de espécies é preciso delimitar

a área de estudo com base na capacidade de dispersão dos organismos (Barve
et al. 2011). Portanto, foi criado um buffer de 100 km ao redor de cada registro,
sendo as áreas resultantes consideradas as áreas de ocorrência estimada para
cada população. Além disso, para comparação do ambiente no qual cada
linhagem está inserida, criou-se um buffer de 200 km ao redor de cada registro
de ocorrência. Um buffer final de 300 km ao redor dos registros de ocorrência foi
analisado, representando toda a área de estudo, no qual incluiu-se os limites
finais da Mata Atlântica.
4.2 Seleção de variáveis climáticas

As variáveis climáticas utilizadas nas análises de modelagem de nicho e
sobreposição de nicho foram obtidas no WorldClim (Hijmans et al. 2005;
http://www.worldclim.org/bioclim) e no ENVIREM (Title & Bemmels 2017;
http://envirem.github.io), com uma resolução de 2,5 minutos (aprox. 5km2 na
linha do equador). Foram utilizadas seis variáveis do WordClim selecionadas
com base em sua relação com a fisiologia de culicídeos (Medley 2010) e todas
as variáveis do ENVIREM foram utilizadas nas análises, uma vez que elas estão
associadas com uma melhora no desempenho dos modelos (Title & Bemmels
2017) (tab. 02).
110
Tabela 02: Variáveis climáticas utilizadas nas análises de modelagem e sobreposição de nicho para Anopheles cruzii. Autovalores da análise
de componentes principais (PCA) apresentados para cada variável ambiental analisada. Os valores das variáveis mais informativas de cada
PCA estão em negrito.
Autovalores da PCA
Variável Descrição Referência PC 1 PC 2 PC 3
Bio1 Temperatura anual média WorldClim -0,283978 0,129464 -0,155891
Bio 5 Temperatura máxima do mês mais quente WorldClim -0,209383 0,332218 0,003311
Bio6 Temperatura máxima do mês mais frio WorldClim -0,243036 0,089787 -0,369777
Bio12 Precipitação anual WorldClim 0,207264 0,072318 -0,135172
Bio13 Precipitação do mês mais chuvoso WorldClim -0,056279 -0,348366 -0,067250
Bio14 Precipitação do mês mais seco WorldClim 0,217910 0,297018 -0,058585
AnnualPET Evaporação potencial anual ENVIREM -0,243237 0,040566 0,311509
aridityIndexThornthwaite Índice de aridez de Thornthwaite ENVIREM -0,191456 -0,285069 0,127696
climaticMoistureIndex Métrica de umidade relativa e aridez ENVIREM 0,270515 0,043755 -0,206850
Continentality Temperatura média do mês mais quente - temperatura média do mês mais frio ENVIREM 0,173544 0,355354 0,110968
embergerQ Quociente pluviométrico de Emberger ENVIREM 0,156956 -0,093146 -0,472950
growingDegDays0 Soma da temperatura mensal média para meses com temperatura média ENVIREM -0,283985 0,129508 -0,155943
superior a 0ºC multiplicada por número de dias
growingDegDays5 Soma da temperatura mensal média para meses com temperatura média ENVIREM -0,283985 0,129508 -0,155943
superior a 5ºC multiplicada por número de dias
maxTempColdestMonth Temperatura máxima do mês mais frio ENVIREM -0,295094 -0,069147 -0,030879
minTempWarmestMonth Temperatura mínima do mês mais quente ENVIREM -0,199663 0,274088 -0,310612
monthCountByTemp10 Contagem do número de meses com temperatura média superior a 10ºC ENVIREM -0,033397 0,050696 0,006969
PETColdestQuarter Evapotranspiração potencial mensal média do trimestre mais frio ENVIREM -0,261074 -0,185747 0,121491
PETDriestQuarter Evapotranspiração potencial mensal média do trimestre mais seco ENVIREM -0,065059 0,040885 0,119424
PETseasonality Variabilidade mensal na evapotranspiração potencial ENVIREM 0,125971 0,411816 0,166983
PETWarmestQuarter Evapotranspiração mensal média do trimestre mais seco ENVIREM -0,115889 0,302577 0,363040
PETWettestQuarter Evapotranspiração mensal média do trimestre mais chuvoso ENVIREM -0,169676 -0,040664 0,222704
thermicityIndex Índice de rugosidade do terreno ENVIREM -0,281514 0,123412 -0,190208
111
4.3 Modelagem de nicho ecológico

A modelagem de nicho foi realizada no software Maxent v3.4.1 (Phillips et
al. 2006. O modelo gerado pelo Maxent geralmente apresenta um melhor
desempenho quando comparado a outros modelos de nicho ecológico e vêm
sendo amplamente utilizados desde a sua disponibilização (Elith et al. 2006;
Phillips et al. 2006). Este modelo pode ser baseado somente em registros de
ocorrência da espécie (sem dados de ausência) e com base nestes dados
calcula os fatores ambientais mais importantes para o nicho da espécie (ou
linhagens genéticas), avaliando a adequabilidade ambiental de cada célula da
grade na área de estudo, com base nos seus fatores ambientais característicos
(Phillips et al 2006).
4.4 Índices de sobreposição de nicho

A Análise de Componentes Principais Espacial (PCA - Principal
Component Analysis) foi realizada para reduzir a dimensionalidade dos dados
(Santo, 2012). A PCA espacial foi feita no pacote RStoolbox do programa R
versão 3.4.0. Os três primeiros componentes principais explicaram 78% da
variância do clima e, portanto, foram selecionados para as análises
seguintes.
O índice de Schoener’s D assume que os índices de adequação são
proporcionais à abundância de espécies, enquanto que o índice Hellinger’s I
mede a probabilidade de distribuição de dois modelos de nichos ecológicos
(Warren et al. 2008). Estes dois índices variam de 0 (sem sobreposição de nicho)
a 1 (nichos idênticos).
Segundo esta análise, o nicho das duas linhagens genéticas é mais (D
e I=1) ou menos (D e I=0) similar do que o esperado sob um modelo nulo,
levando em consideração as diferenças nos ambientes onde as duas linhagens
de An. cruzii ocorrem. Sendo a hipótese inicial (H0) que não existe sobreposição
significativa no nicho das espécies e H1 seria que existe. O modelo nulo
representado em rosa na fig. 04, indica o padrão observado segundo a H 0, ou
seja de que não existe sobreposição significativa no nicho das linhagens.
Entretanto, ao invés de realizar o teste usando o resultado da
modelagem de nicho de Warren et al. (2008), utilizou-se a versão do teste
112
proposta por Broennimann et al. (2012) e Di Cola et al. (2017). Neste caso a
densidade de cada espécie é calculada para cada célula da grade com base na
suavização da função de densidade de Kernel para estimar a densidade das
linhagens no espaço ambiental, sendo então a sobreposição dos nichos
calculada pelos índices de Schoener’s D e Hellinger’s I. Esse método permite
testar hipóteses de sobreposição de nicho realizadas diretamente no espaço
ambiental, permitindo assim a correção do viés associado à dimensão geográfica
(Broennimann et al. 2012). Esses testes só correlacionam dois eixos ambientais
de cada vez, portanto, eles são realizados geralmente entre combinações par a
par com os principais eixos de componentes principais (PCs) de um conjunto de
ambientes. Neste caso, utilizamos os componentes principais PC1, PC2 e PC3,
que juntos explicaram 78% da variação observada. As análises de sobreposição
de nicho foram realizadas nos pacotes ENMTools (Warren, 2016) e ECOSPAT
(Di Cola et al. 2017) no programa R versão 3.4.0.
113
5. RESULTADOS
5.1 Modelagem de nicho ecológico

Os mapas desenvolvidos através da técnica de MNE estão representados
na figura 2 para o grupo A e na figura 3 para o grupo B, indicando as áreas
ambientalmente adequadas para a ocorrência destes grupos.
Devido ao limiar de corte utilizado nas análises, os resultados tendem a

se mostrar conservados para a área de ocorrência dos grupos. Os mapas
apresentados mostram-se congruentes com grande parte da extensão de
ocorrência dos grupos (fig. 01), porém os limites norte e sul do grupo A estão
expandidos (fig. 02), enquanto que os resultados obtidos para o grupo B se
estendem para a região do litoral de São Paulo (fig. 03).
Figura 01: Registros de ocorrência de Anopheles cruzii (Grupos A e B) utilizados na

confecção dos modelos de distribuição.
114
Figura 02: Mapa da modelagem de nicho ecológico para o grupo A de Anopheles

cruzii. A escala de cores refere-se a adequabilidade ambiental de cada região, sendo
a cor azul o hábitat mais inadequado (próximo a 0) e a cor vermelha o habitat mais
adequado (próximo a 1).
Figura 03: Mapa da modelagem de nicho ecológico para o grupo B de Anopheles

cruzii. A escala de cores refere-se a adequabilidade ambiental de cada região, sendo
a cor azul o hábitat mais inadequado (próximo a 0) e a cor vermelha o habitat mais
adequado (próximo a 1).
115
Os dados mais fortemente associados ao primeiro eixo (PC1) estão

ligados à precipitação, umidade relativa e aridez (tab. 02). Já no que se refere
ao segundo componente (PC2), os dados estão relacionados a temperaturas
quentes (temperatura média e temperatura máxima do mês mais quente) e à
evapotranspitação potencial mensal. O terceiro componente (PC3) está
associado aos índices de evapotranspiração potencial anual, da média do mês
mais seco e do mês mais quente.
5.2 Índices de sobreposição de nicho ecológico

Os testes do Ecospat permitem estimar a ocorrência dos grupos A e B no
espaço ambiental. Através desta análise corrige-se a ocupação de cada grupo
de acordo com a disponibilidade do espaço ambiental e mede-se a sobreposição
de nicho através dos teste de Schoener’s D e Hellinger’s I. A análise da
estimativa de ocupação do espaço ambiental foi realizada entre os três primeiros
componentes (PC1, PC2 e PC3), que representaram a maior percentagem de
variação observada.
De acordo com os valores dos índices de similaridade Schoener’s D e

Hellinger’s I (tab. 03) e a representação gráfica da sobreposição de nichos entre
os grupos (linhagens) de An. cruzii (fig. 04), os nichos são mais semelhantes do
que se comparados com o modelo nulo, levando-se em consideração o
ambiente.
Segundo a análise do primeiro componente versus o segundo (PC1 vs.

PC2) (fig. 04), observa-se a ausência de sobreposição de nichos entre as
linhagens (p>0,05) (tab. 03). De acordo com o primeiro componente versus o
terceiro (PC1 vs. PC3) e o segundo componente versus o terceiro (PC2 vs. PC3)
existe sobreposição significativa dos nichos, pois p<0,05, com isso rejeita-se H0
(tab. 03) (fig. 04).
Tabela 03: Sobreposição de nicho entre os dois grupos (linhagens) de

Anopheles cruzii computado com Schoener’s D e Hellinger I, baseada
na análise de componentes principais (PCA).
Variável D I p-value D p-value I

PC1 vs. PC2 0,430 0,622 0,18 0,15
PC1 vs. PC3 0,353 0,492 0,03 0,03
PC2 vs. PC3 0,592 0,722 0,02 0,01
116
Os gráficos representativos da disponibilidade e ocupação do espaço

ambiental para os grupos A e B (linhagens) de An. cruzii analisados em relação
às combinações entre os componentes principais PC1, PC2 e PC3, estão
representados nas figuras 05, 06 e 07. Na correlação entre a PC1 vs. PC2
observa-se que a presença do grupo A no espaço ambiental não está
abrangendo todo o ambiente disponível para a ocorrência desta linhagem (fig.
05). Quando analisa-se a ocorrência ponderada pela disponibilidade, observa-
se que o grupo A está ocupando regiões do espaço ambiental que estão menos
disponíveis. No que se refere ao grupo B, esta linhagem está ocupando todo o
ambiente considerado disponível na correlação PC1 vs. PC2, com densidade
maior em regiões do espaço ambiental que seriam consideradas menos
disponíveis.
Ao se analisar os gráficos representativos da PC1 vs. PC3 verifica-se que

o grupo A está ocorrendo em regiões bem maiores do espaço ambiental se
comparado ao ambiente disponível para esta linhagem (fig. 06). No gráfico
referente ao ambiente ponderado pela disponibilidade, observa-se que o grupo
A está ocupando regiões do espaço ambiental consideradas adequadas para a
ocorrência desta linhagem. Estas mesmas características também são
observadas nas análises referentes ao grupo B.
Nas análises realizadas entre a PC2 vs. PC3, observa-se que as

ocorrências do grupo A no espaço ambiental estão restritas às regiões
consideradas disponíveis pela modelagem (fig. 07). Além disso, existe uma
concentração de ocorrências (ocupação) desta linhagem em regiões do espaço
ambiental menos disponíveis. No que se refere ao grupo B, estes mesmos
padrões de distribuição (ocupação) do ambiente são observados.
117
Figura 04: Estimativa de sobreposição de nichos entre os grupos analisados (linhagens genéticas de Anopheles cruzii – grupos A e
B) e índices de similaridade de Schoener D e Hoellinger’s I (linhas pontilhadas) na combinação dos três componentes principais mais
informativos.
118
Figura 05: Gráficos representativos da disponibilidade e ocupação dos habitats para os grupos
analisados (linhagens genéticas de Anopheles cruzii – grupos A e B), em relação às variáveis
de componentes principais PC1 vs. PC2.
119
analisados (linhagens genéticas de Anopheles cruzii – grupos A e B) em relação às variáveis
de componentes principais PC1 vs. PC3.
120
analisados (linhagens genéticas de Anopheles cruzii – grupos A e B) em relação às variáveis de
componentes principais PC2 vs. PC3.
121
6. DISCUSSÃO
Muitos anofelinos pertencem a complexos de espécies que são difíceis de

distinguir através dos métodos taxonômicos tradicionais. Vários estudos têm
apontado a existência de um complexo de espécies em An. cruzii com base em
dados morfológicos (Zavortink, 1973), padrões de bandas de cromossomos
politênicos (Ramirez et al. 1994, 2000a,b), análises isoenzimáticas (Carvalho-
Pinto & Lourenço de Oliveira, 2004) e análises moleculares (Calado & Navarro-
Silva, 2005; Malafronte et al. 2007, Rona et al. 2009, 2010a,b, 2013). Além disso,
no Capítulo 1 foi observado baixo fluxo gênico entre as populações e uma grande
diversidade genética entre as amostras do Paraná e São Paulo, em relação às
de Santa Catarina e Rio de Janeiro.
A caracterização ambiental acompanhada da análise de modelagem de

nicho ecológico pode fornecer uma visão adicional sobre o status taxonômico e
da distinção de nicho entre espécies (Nakasato et al. 2010).
Segundo os registros de ocorrência analisados, a linhagem genética

representada pelo grupo A é encontrada nos Estados do Paraná e São Paulo,
enquanto que o grupo B ocorre no Rio de Janeiro e Santa Cataria. Com base na
modelagem de nicho ecológico (MNE) a distribuição das linhagens genéticas de
An. cruzii demonstraram uma expansão de habitat disponível no Rio de Janeiro
e Santa Catarina para o grupo A e uma expansão para a região de São Paulo
para o grupo B. Além da existência de sobreposição de habitat disponível para
os dois grupos em São Paulo e na região serrana do Rio de Janeiro.
Segundo Laporta (2011), a distribuição de An. cruziii está localizada em

áreas de encosta da Serra do Mar. Este fato foi confirmado na análise de MNE,
na qual a distribuição de habitats potenciais para a ocorrência de An. cruzii está
restrita a áreas de Mata Atlântica ainda preservada, com a presença de
bromélias.
A análise da diversidade genética entre populações de An. cruzii

provenientes de Florianópolis (SC) e Itatiaia-(RJ) foi realizada por Rona et al.
(2013) e entre as populações de Santa Teresa (ES), Itatiaia (RJ), Juquitiba (SP),
Cananéia (SP) e Florianópolis (SC) por Rona et al. (2010). Nestes trabalhos foi
122
evidenciada a existência de duas espécies crípticas ocorrendo em simpatria em

Itatiaia-RJ, região serrana do Rio de Janeiro, próximo à divisa entre os Estados
de São Paulo e Minas Gerais. Esta localidade foi indicada como um habitat
disponível nas análises de MNE, mas menos provável para a ocorrência das
duas linhagens analisadas. Segundo as análises realizadas, o habitat disponível
e mais adequado para a ocorrência das duas linhagens no Rio de Janeiro está
localizado na região serrana da Reserva Ecológica de Tinguá e no Parque
Nacional da Serra dos Órgãos. A diversidade genética das populações destes
parques não foi analisada até o momento, para confirmação ou não da existência
de linhagens genéticas distintas ocorrendo nesta região.
As análises de MNE realizadas indicam as regiões de Peruíbe, Bertioga e

Juquitiba em São Paulo como sendo habitats disponíveis para as duas linhagens
analisadas. Análises de padrões de bandas cromossômicas de An. cruzii
coletados em Peruíbe apresentaram alto grau de inversão de bandas
cromossômicas, fato que forneceu os primeiros indícios da existência de um
complexo de espécies em An. cruzii (Ramirez & Dessen, 1994). Fragmentos do
DNA ribossomal ITS2 de exemplares de An. cruzii coletados nestas localidades
e também em Santa Catarina foram analisados por Malafronte et al. (2007),
observando-se a existência de quatro linhagens genéticas distintas entre as
amostras e um alto grau de polimorfismos. Segundo as análises de MNE
realizadas observa-se que estas regiões possuem habitats disponíveis para
linhagens genéticas distintas de An. cruzii.
De acordo com os testes de similaridade de nicho, também conhecidos

como testes de background, obteve-se o resultado de seis índices, resultantes
da combinação par a par entre três componentes principais (PC1, PC2 e PC3).
Quatro dos seis índices analisados (PC1 vs. PC3: D e I; PC2 vs. PC3: D e I)
indicam a existência de sobreposição de nicho entre as duas linhagens (grupo A
e grupo B) de An. cruzii analisadas, o que demonstra que existe grande
similaridade entre os nichos. Observou-se sobreposição entre os nichos
somente no Estado de São Paulo e na região serrana do Rio de Janeiro, como
evidenciado nos mapas de MNE. Com isso, existem nichos onde somente uma
das linhagens ocorre, como observado no Estado do Paraná, Santa Catarina e
Rio Grande do Sul.
123
A conservação filogenética de nicho é conhecida como a tendência geral

de espécies filogeneticamente próximas manterem características ecológicas
semelhantes (Wiens et al. 2010; Peterson et al. 2010). Esse processo pode
desempenhar um papel fundamental na ocorrência de isolamento por vicariância
e especiação em ambientes onde os habitats favoráveis alternam com habitats
desfavoráveis, como em regiões montanhosas (Wiens, 2004; Kozak et al. 2006),
que são locais de ocorrência de An. cruzii. Espécimes em diferentes montanhas
podem estar adaptados a algumas condições climáticas atuais diferentes, mas
seu isolamento inicial pode ter sido impulsionado principalmente pela ocorrência
de um vale seco entre elas (Wiens e Graham, 2005). Como An. cruzii é uma
espécie característica de encostas da Serra do Mar (Laporta et al. 2011), a
distribuição atual das linhagens pode ter sido influenciada por processos de
vicariância em ambientes com alternância de habitats favoráveis e
desfavoráveis, observados em regiões montanhosas.
A existência de similaridade de nichos entre as linhagens indica a

provável existência de outros processos de divergência ocorrendo em An. cruzii,
como a existência de possíveis barreiras geográficas, visto que fatores
ambientais não estão delimitando a distribuição destas linhagens. Este fato já foi
observado em outros estudos que relataram múltiplos mecanismos gerando
especiação em grupos taxonômicos estreitamente relacionados, como em
salamandras (Kozak & Wiens, 2006), lêmures (Blair et al. 2013), gafanhotos
(Carstens & Knowles, 2007), lagartixas (Zhang et al. 2014) e cobras (Pyron &
Burbrink, 2009).
124
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A semelhança climática pode explicar grande parte da sobreposição de

habitats observada através da técnica de MNE e os testes de similaridade de
nicho apresentaram grande capacidade preditiva para os modelos analisados.
Os resultados apresentados sugerem que as características do nicho

climático dos grupos A e B talvez não tenham sido as mais importantes para
dirigir um possível processo de especiação em andamento, já que observou-se
a sobreposição de nichos entre as linhagens analisadas. Vários processos de
especiação devem ter atuado ou estão atuando para a diversificação destes
grupos geneticamente distintos em An. cruzii. Trabalhos futuros seriam
importantes na busca da existência de barreiras geográficas que possam estar
atuando sobre os processos de especiação destas populações.
A análise molecular futura de exemplares dos Estados de São Paulo e Rio

de Janeiro (Reserva Ecológica de Tinguá e Parque Nacional da Serra dos
Órgãos) será extremamente importante para a compreensão de quais linhagens
estão ocorrendo na região, como a estruturação genética de An. cruzii está
estabelecida nestes Estados e se os resultados confirmam a distribuição dos
nichos propostos para as duas linhagens analisadas no presente estudo.
125
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. CONSIDERAÇÕES FINAIS GERAIS
A análise da diferenciação genética entre as populações de An. cruzii ao

longo da Mata Atlântica através das técnicas de morfometria e moleculares
evidenciaram que este vetor do agente causador da malária é representado por
pelo menos quatro linhagens geneticamente distintas e com variações
fenotípicas encontradas nas populações de Camacan-BA e Ilha do Mel-PR.
A análise de sobreposição de nichos revelou que os nichos destas

linhagens são mais similares entre si do que comparados ao o modelo nulo.
Provavelmente outros processos de especiação devem ter atuado ou estão
atuando para a diversificação destes grupos geneticamente distintos em An.
cruzii.
134
10. REFERÊNCIAS GERAIS
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

BETINA WESTPHAL FERREIRA

LINHAGENS GENÉTICAS EM Anopheles cruzii Dyar & Knab, 1908

BETINA WESTPHAL FERREIRA

LINHAGENS GENÉTICAS EM Anopheles cruzii Dyar & Knab, 1908

Orientador: Prof. Dr. Mario Antônio Navarro

Ao longo desta caminhada do doutorado, tive a colaboração (direta ou

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ANÁLISE DA ESTRUTURA POPULACIONAL DE Anopheles (Kerteszia)

Palavras-chave: Anopheles cruzii, diversidade genética, microevolução, COI,

subgênero Kerteszia, cujas formas imaturas se desenvolvem na água

A detecção de An. cruzii naturalmente infectados por Plasmodium vivax

1.2 Anopheles cruzii –ciclo de vida, aspectos bioecológicos e distribuição.

Em ambiente natural foi observado um número baixo de larvas da mesma

Nestas localidades, as fêmeas ovipositam em dois estratos distintos, um ao nível

1.3 Mata Atlântica

O isolamento espacial entre estes refúgios pode agir como barreira de

1.4 Métodos de caracterização populacional em Culicidae

1.4.1 Morfometria geométrica - marcador morfológico

A morfometria geométrica é um conjunto de técnicas com um propósito

rígidas e praticamente bidimensionais, o que reduz as chances de erros