Roteiro – Laboratório de Microscopia e Caracterização de Estruturas 2019

Prof. Rogerio Hein

EXPERIMENTO 1: MICROSCÓPIOS ÓPTICOS, OBJETIVAS, ALINHAMENTO E

CALIBRAÇÃO

Parte I: Lupas Estereoscópicas

Lupas estereoscópicas, ou microscópios estereoscópicos, ou estereomicroscópios, são equipamentos voltados à
investigação de superfícies irregulares em baixa ampliação. São equipamentos compostos por sistemas ópticos
duplicados, com um pequeno ângulo de convergência entre seus eixos ópticos (da ordem de 3° a 5°), para
aproveitar a paralaxe natural dos olhos humanos e criar a sensação de profundidade. Há duas construções
encontradas no mercado (Figuras 1 e 2): o sistema Greenough, de menor custo e que consiste em manter os eixos
ópticos com o mesmo ângulo de convergência em toda a sua extensão; e o sistema telescópico, em que os eixos
seguem paralelos em parte da extensão do sistema, permitindo a instalação de módulos de polarização, filtros,
lentes secundárias de ampliação, etc. Há uma variedade de sistemas de iluminação das amostras, geralmente
externos à estrutura do microscópio, com base nos mesmos tipos de lâmpadas (incandescentes de halogênio-
tungstênio, fluorescentes de xenônio ou mercúrio e, mais recentemente, LEDs).

Greenough Telescópico
Figura 1: Caminhos ópticos para os sistemas Greenough e telescópico.

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(a) Greenough (b) Telescópico

Figura 2: Exemplos de microscópios estereoscópicos: a) Greenough; b) telescópico

Nossos laboratórios estão dotados de estereomicroscópios Zeiss Stemi 2000, com iluminação por LEDs (superior
oblíqua e inferior axial) e baseadas no sistema Greenough, com objetiva e oculares para ampliações totais até 50x,
sendo que um deles está montado com um anel de LEDs. Temos também um estereomicroscópio Leica GZ-6.

A parte experimental consistirá na apresentação das lupas e na observação de algumas amostras, fotografando
alguns exemplos.

Parte II: Microscópios ópticos de luz refletida

Microscópios ópticos de luz refletida, ou baseados em sistema de iluminação episcópica, são usados para a
inspeção de amostras opacas ou com translúcidas. A iluminação, assim como nos microscópios diascópicos, pode
ser reta (upright microscope) ou invertida (inverted microscope), e pode ser feita usando lâmpadas incandescentes
(halogênio-tungstênio), de arco voltaico (xenônio ou mercúrio) e, mais recentemente, LEDs. Também podem
receber acessórios para contraste de fases, por polarização, contraste por interferência e outros, além de prover
iluminação em campo claro (brightfield) e em campo escuro (darkfield). A maior diferença destes sistemas para os
microscópios de luz transmitida reside no fato de que, para a incidência da luz na amostra, a própria objetiva fará
o papel de condensar o feixe luminoso, eliminando-se a necessidade de um condensador.

A parte experimental consistirá na observação de várias amostras para demonstrar o uso de iluminação em campos
claro e escuro, de filtros de absorção e cor, de luz polarizada e contraste por interferência. Será utilizado um
microscópio Nikon Epiphot 200 (Figura 3), dotado de sistema de iluminação por lâmpada a arco voltaico com gás
xenônio, filtros de absorção de intensidade e de cor, prismas Nomarski para contraste por interferência diferencial,
polarizador linear rotativo, compensador  e analisador. Também possui objetivas plana-acromáticas e plana-
apocromáticas, para iluminação em campo claro e campo escuro.

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Também será apresentado um microscópio óptico motorizado Zeiss AxioImager Z2m (Figura 4), dotado de
praticamente todos os modos de contraste para luz refletida1: campo claro, campo escuro, polarização linear
(qualitativa, com compensador  fixo, e quantitativa, com analisador rotativo), polarização circular, contraste por
interferência diferencial linear (Nomarski), contraste por interferência circular (C-DIC).

Figura 3: Imagens do microscópio Nikon Epiphot 200

Figura 4: Microscópio Zeiss AxioImager Z2m

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Exceto fluorescência.

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Parte II: Microscópios ópticos de luz transmitida

Microscópios ópticos de luz transmitida são sistemas voltados à investigação de amostras com certo grau de
transparência, normalmente cortados em lâminas finas, ou de partículas de pós, onde se busca, por exemplo, medir
o tamanho das partículas e avaliar quantitativamente sua morfologia. Estes sistemas se caracterizam pelo uso de
uma lente com a função de concentrar o feixe de luz incidente, conhecida como “condensador”. A seleção dos
condensadores obedece a princípios similares aos da especificação de objetivas, como a correção de aberrações e
a definição de abertura numérica e distâncias de trabalho. Contudo, no mercado, existem hoje condensadores
“universais”, projetados para atender a uma ou mais gamas de objetivas com aberturas numéricas variadas. A
iluminação por luz transmitida, quando os raios de luz “atravessam” a amostra, é também conhecida pelo termo
“iluminação diascópica”.

Um microscópio de luz transmitida trabalha com os conceitos de iluminação em campo claro e de contraste de
fases, polarização, contraste por interferência e fluorescência.

A parte experimental consistirá na descrição dos componentes de um microscópio óptico de luz transmitida Zeiss
Axioskop 40 (Figura 5), dotado de recursos de polarização e objetivas plana-acromáticas e plana-fluoritas, estas
para distâncias de trabalho elevadas. Serão adquiridas imagens usando os recursos de contraste por luz polarizada
e comparadas objetivas de mesma ampliação, mas com aberturas numéricas diferentes.

Figura 5: Representações esquemáticas do microscópio Zeiss Axioskop 40 (fonte: catálogo Zeiss G-42-110 IV e).

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Parte IV: Objetivas

As objetivas são as lentes mais importantes de um microscópio, pois definem a resolução das imagens. As objetivas
carregam inscrições em seu corpo que definem suas propriedades e aplicações. O objetivo desta aula prática é
ensinar a “ler” e selecionar objetivas para o uso adequado, com a identificação de suas classes e aplicações. A tabela
1 traz um exemplo do código de inscrições.

Classe Aberração Aberração

cromática esférica
acromática 2λ 1λ

Semi- 2λ 2λ
apocromática
ou fluorita
apocromática 3 λ 2λ

Correção de Plan, plana, plano, PL,

curvatura de campo P, CP
Abertura numérica Inscrição ao lado da
indicação de
ampliação
Distância de trabalho Inscrição geralmente
(Working Distance) indicada pelas letras
“WD”, em [mm]

Iluminação Inscrições “BD”

(brightfield-darkfield)
para objetivas para
iluminação em
campo claro ou
campo escuro.
Correção para Inscrição ∞ para
comprimento de objetivas universais
(“correção no infinito”)
tubo ou o valor do
comprimento do tubo
em [mm]
Tabela 1: Inscrições para identificação de objetivas

O objetivo desta parte da aula é identificar diversas objetivas das marcas Zeiss e Nikon e classificá-las quanto a
aplicações, qualidade de imagem e custo, separando diversas objetivas pelas inscrições nelas contidas.

Parte V: Alinhamento de microscópios com o padrão de iluminação de Koehler (ou

Köhler)
Os microscópios ópticos modernos são, em sua absoluta maioria, construídos pelo método de iluminação de Köhler
(também grafado como “Koehler” na literatura). Esta técnica de iluminação provê uma combinação ótima de
resolução e contraste a partir do correto alinhamento do eixo óptico do sistema e foco da imagem, ajustando os

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diafragmas de abertura e de campo de acordo com a abertura numérica das objetivas utilizadas. A figura 6 mostra
um esquema do sistema de iluminação de Köhler

Figura 6: Iluminação de Köhler.

O procedimento para alinhamento de um microscópio baseado no sistema de iluminação de Koehler consiste em

seis passos:

1. Foque o objeto com o condensador (luz transmitida) ou a objetiva (luz refletida): Use uma objetiva de 5X
de ampliação. Feche o diafragma de abertura e faça o foco movimentando o ajuste fino da objetiva (luz
refletida) ou do condensador (luz transmitida).
2. Troque a objetiva pela de 10x disponível no porta-objetivas.
3. Feche o diafragma de campo (luz refletida) ou o diafragma de irís do condensador (luz transmitida) e
centralize a imagem do diafragma: usando os parafusos de ajuste, centralize o diafragma de campo (luz
refletida) ou o condensador (luz transmitida), sempre observando a imagem pelas lentes oculares, e não
pela imagem da câmera, tal que as bordas do diafragma apareçam centralizadas na ocular. Se preferir, abra
o diafragma (formato sextavado ou oitavado) até suas bordas tocarem a parte interna do círculo observado
na ocular.
4. Foque novamente a objetiva (luz refletida) ou o condensador (luz transmitida) até que as bordas do
diafragma apareçam bem nitidas nas oculares.
5. Centralize o diafragma de abertura, focalizando as bordas do diafragma, e abra totalmente o diafragma de
abertura.
6. Abra o diafragma de campo (luz refletida) ou o diafragma de irís do condensador (luz transmitida) até que
suas bordas desapareçam da imagem formada nas oculares.

A prática do laboratório consistirá em alinhar o sistema de iluminação em microscópios de luz transmitida Zeiss
Axioskop 40, do Laboratório de Microscopia Óptica do DMT.

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Parte VI: Calibração

Esta etapa consistirá de demonstrações para a calibração metrológica dos microscópios Nikon Epiphot 200 e Zeiss
Axioskop 40, além da demonstração do uso de gabaritos para a aferição da lupa estereoscópica Zeiss Stemi 2000
quanto à presença de aberrações de distorção e astigmatismo. Os gabaritos para calibração demonstrados serão
(vide Figura 7):

a) Círculos concêntricos para aferição de astigmatismo;

b) Grade de retículos quadrados para aferição de distorção;
c) Escalas micrométricas para calibração dimensional;
d) Inserto com escala micrométrica para o Nikon Epiphot 200.

a) Gabarito para aferição de astigmatismo b) Imagem do gabarito em (a)

c) Gabarito para aferição de distorção d) Imagem do gabarito em (b)

geométrica

e) Escala de calibração linear f) Escala de calibração para Nikon Epiphot 200

Figura 7. Gabaritos e escalas para aferição e calibração de microscópios ópticos.

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EXPERIMENTO 2: MICROSCÓPIOS ÓPTICOS, OBJETIVAS, ALINHAMENTO E

CALIBRAÇÃO
Parte IV: Exercícios para pensar

1. No laboratório, nosso microscópio Nikon Epiphot 200 pode ser equipado com estes dois modelos
de lentes objetivas de 50x (ampliação total de 500x, compondo com oculares de 10x):
 ELWD BD/DIC 50x/0,55 – WD 8.2 mm
 BD/DIC Plan Achromat 50x/0.8 – WD 0.54 mm

Pergunta-se: quando usar cada uma delas? Justifique.

2. Qual a classe do conjunto polarizador/analisador do nosso Nikon Epiphot 200?

3. Qual a principal vantagem de um estereomicroscópio do sistema telescópico sobre um

Greenough? E qual a principal vantagem de um modelo Greenough sobre um telescópico? Qual
deles você teria num laboratório para trabalhos de campo (numa mineradora, por exemplo)?

4. Classifique as objetivas montadas nos microscópios Carl Zeiss Jena Neophot 2 e Neophot 30, Zeiss
Axioskop 40 e Nikon Epiphot 200, quanto à classe, abertura numérica, meio de imersão e utilização.

Zeiss EC Plan-Neofluar 2,5X/0,075 Pol

Zeiss CP-Achromat 5X/0,12

Zeiss EC Plan-Neofluar 5X/0,16 Pol

Zeiss CP-Achromat 10X/0,25

Zeiss LD Plan-Neofluar 20x/0,4 Korr

Nikon CF Plan BD DIC 50X/0,8

Nikon CF Plan Apo 150X/0,95

Carl Zeiss Jena Planachromat HI

100X/1,30
Carl Zeiss Jena Planachromat 50x/0,80
Pol
Carl Zeiss Jena GF- Planapochromat HD
50x/0,90

5. Como você mediria aberrações de distorção e de astigmatismo?

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