UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUíMICA
ÁREA DE BIOQUÍMICA

Bioquímica Experimental

Medicina Veterinária
Roteiros de Práticas e Fundamentos Teóricos

2018-2
INTRODUÇÃO
A disciplina de Bioquímica (IC660) compreende um programa de aulas práticas
para Medicina Veterinária. Na parte de aulas práticas serão focalizados os tópicos
apresentados no cronograma abaixo.
A avaliação do desempenho nas aulas práticas será realizada através da média
de duas provas (a primeira de Teoria da Prática e a segunda de Prática) adicionada a
média dos relatórios apresentados e a nota de frequência. Todo o comportamento em
sala de aula será avaliado.

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
- Nelson, D.L.; Cox, M.M. (2011). Princípios de Bioquímica de Lehninger. Ed. Artmed.
5ª ed.
- Berg, J.M.; Tymoczko, J.L.; Stryer, L. (2014). Bioquímica. Ed. Guanabara Koogan. 7ª
ed.
- Voet, D.; Voet, J.G. (2013). Bioquímica. Ed. Artmed. 4ª ed.

INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

O laboratório de Bioquímica, assim como qualquer outro laboratório de ensino ou
pesquisa, abrange um grande número de equipamentos, materiais e reagentes
utilizados com frequência no desenvolvimento das atividades de trabalho. Nesse
ambiente, vários riscos são inerentes às atividades desenvolvidas e dessa forma
merecem atenção especial.
Tão importante quanto o conhecimento dos equipamentos, materiais e reagentes
é o conhecimento das Boas Práticas de Laboratório (BPL). As BPL são técnicas normas
e procedimentos que visam a minimizar e a controlar a exposição dos indivíduos aos
riscos relacionados com as atividades de trabalho. O uso das BPL é indispensável para
a segurança do individuo, do produto que está manipulando e do ambiente em que
trabalha e deve constar na rotina de trabalho. As BPL devem fazer parte de uma
consciência profissional de cada indivíduo independente do grau de formação ou da
hierarquia na instituição em que atua. Abaixo seguem algumas BPL.
No Laboratório de Bioquímica o aluno deverá:

• Ser rigoroso na atenção, técnica e disciplina, evitando desta forma, a ocorrência

de erros que invalidam parcial ou totalmente o trabalho realizado e acarretam em
desperdício de material, reagentes e tempo;

• Não realizar experiências “extras” a título de curiosidade, pois podem levar a

reações inesperadas;

• Colocar sobre a bancada apenas o material estritamente necessário como lápis,

borracha, caneta, régua e apostila de trabalhos práticos. Demais objetos deverão ser
deixados fora da bancada de trabalho, em lugar designado;

• Conservar a bancada de trabalho sempre limpa, durante e ao término das aulas.

Ao término da aula, a bancada deverá estar em condições de ser novamente utilizada.

• Sempre que necessário, utilizar máscara, luvas, óculos e/ou qualquer outro
artigo de proteção indicado;

• Não fumar no laboratório;

• Cautela no trabalho com substâncias cáusticas, tóxicas, ácidos em geral,

substâncias inflamáveis e vidraria;

• Evitar tocar, cheirar ou manusear produtos que tenham derramado ou

extravasado de algum recipiente;

• Manter o rosto o mais distante possível durante as operações de mistura ou

aquecimento de reagentes;

• Não degustar nada no laboratório, exceto se for especialmente orientado a fazê-

lo;

Durante as aulas práticas:

 • Ao acender o bico de Bunsen, ter o cuidado de não abrir a torneira do gás antes
que tenha à mão a chama que deve acendê-lo;

• Terminado o uso do bico de Bunsen, verifique se as torneiras do gás estão bem

fechadas, evitando assim explosões e intoxicações;

• Cuidado com as substâncias inflamáveis (álcool, éter) nas proximidades de uma

chama;

• Jamais aquecer um sistema completamente fechado;

• Os reagentes utilizados não devem retornar ao recipiente estoque;

• Use uma pipeta para cada reagente evitando a contaminações;

• Antes de introduzir pipetas nas soluções certifique-se de que estão limpas;

• A fim de alcançar a eficiência desejada, é necessário ler as práticas com

antecedência;

• Reagentes e respectivas pipetas estarão dispostas junto aos mesmos, em uma

bancada especifica e deverão ser utilizadas com atenção para evitar trocas. Também
deverão ser transferidas alíquotas dos reagentes para beckers para evitar
contaminação.

• Os reagentes corrosivos ou tóxicos (ácidos ou bases fortes, quando muito

concentrados) não deverão ser pipetados diretamente, sendo medidos em provetas ou,
em alguns casos, em buretas ou com auxílio de uma pêra;

• Para medir volumes entre 0 e 1 mL deve-se usar pipetas de 1 mL graduada em

centésimos. Entre 1 e 2 mL usar pipetas de 2 mL graduada em centésimos. Entre 2 e 5
mL usar pipetas de 5 mL graduada em décimos. Entre 5 e 10 mL usar pipetas de 10 mL
graduada em décimos;

• As pipetas volumétricas são de maior precisão e são utilizadas para o preparo

de soluções padrões;

• O líquido no interior de medidores de volume (pipetas, buretas, provetas, balões

volumétricos, etc.) forma menisco. A leitura de ser feita na parte inferior do menisco e
na altura da linha dos olhos.

Observações

• É obrigatório o uso de jaleco, sapato fechado e calças compridas e no caso de

cabelos compridos eles devem estar amarrados para trás, portanto não será
permitida a entrada do aluno no laboratório sem estar usando-os.
 • A pontualidade é importante para a boa condução dos trabalhos. Será tolerado um
atraso de 10 minutos do início da prática, após o qual o aluno será considerado ausente.

• De acordo com a legislação vigente há um limite de faltas de 25% para essa disciplina.
Acima desse limite, o aluno está reprovado por faltas.

• Em caso de acidentes (oral, contato com a pele, com os olhos, etc.) devem -se tomar
as devidas precauções de acordo com a lista de primeiros-socorros.

• Só deixar a aula quando terminado o trabalho ou, em qualquer caso, com a autorização
do professor, caso contrário o aluno receberá falta.

Principais frascos utilizados em laboratórios de Bioquímica

Os principais frascos utilizados em um laboratório de Bioquímica compreendem o
becker, o erlenmeyer, o balão volumétrico, a proveta e os tubos de ensaios (Fig. 1)

Figura 1. Principais frascos utilizados em um laboratório de Bioquímica

O becker, o erlenmeyer e o tubo de ensaio são utilizados para mistura e

eventualmente para estoque de soluções (não mais que uma semana). O balão
volumétrico e a proveta são utilizados apenas para mensuração de soluções e jamais
para estoque. Ambos apresentam variações de volume conhecidas dependendo da
capacidade de cada frasco. O balão volumétrico deve ser utilizado apenas quando se
deseja medir volumes exatos: 5, 10, 25, 50 mL etc. de acordo com a capacidade de
cada balão. Já a proveta deve ser utilizada quando se deseja medir volumes
fracionados: 25,5; 35,3; 89,2 mL etc. É importante lembrar que o menisco (Fig. 2) (curva
de solução no frasco) deve estar posicionado sempre acima da marca que descreve o
volume do frasco.
I. MANUSEIO DE FRASCOS E EQUIPAMENTOS:

1. Objetivo:
Fornecer conhecimento do uso dos principais frascos e equipamentos utilizados no
laboratório de Bioquímica
2. Procedimento:
A) Uso de frascos
• Medir os seguintes volumes água destilada nos diferentes frascos :
➢ 25 mL em uma proveta
➢ 50 mL em um balão volumétrico
• Pipetar os seguintes volumes em tubos de ensaio:
➢ 2,0 mL
➢ 1,25 mL
➢ 7,5 mL
B) Diluição
• Numerar 4 tubos de 2 a 5 (no tubo 1 manter o corante sem diluição).
• Diluir o corante de acordo com o esquema abaixo (utilizar água destilada para a
diluição).

SOLUÇÕES E VOLUMETRIA
INTRODUÇÃO
Soluções
 As soluções são definidas como misturas homogêneas de duas ou mais
substâncias puras. Em geral, o componente de uma solução presente em maior
quantidade é chamado de solvente e o que está em menor quantidade, de soluto.
Entretanto, esses termos podem ser trocados quando for necessário. Este é o caso das
soluções de sólidos em líquidos, em eu o líquido é tomado comumente como solvente
e o sólido como soluto independente das proporções relativas. Assim podemos ter
soluções de sacarose me água a 10% e 60% e em ambos os casos a água é solvente
e a sacarose é soluto.
Métodos de expressar as concentrações das soluções
A concentração de uma solução pode ser expressa em função da quantidade de
soluto em um volume de solução ou a quantidade de soluto em massa definida de
solução ou de solvente. Entretanto para a melhor compreensão desse métodos é
necessário recordar alguns conceitos:
1) Mol ou molécula-grama é o peso molecular expresso em gramas. O peso
molecular de um composto é a soma de todos os pesos atômicos dos átomos
da molécula. Por exemplo: o peso molecular da sacarose (C 12H22O11) é igual
a 342 g (12x12+22x1+16x11). O milimol (mmol) é igual a 0,001 mol e micromol
(mmol) é igual a 0,001 mmol (1x10-6 mols)
2) O número de mols de uma determinada massa de uma substância é igual a
razão entre massa e o seu mol:
No de mols = massa (g)/mol

Expressão da concentração das soluções:

1) A molaridade (M) é o número de mols de soluto em 1 litro de solução;
2) A porcentagem em peso (%, p/p) corresponde a gramas de soluto por 100 g
de solução;
3) A porcentagem em volume (%, v/v) corresponde a mililitros de soluto por 100
mL de solução;
4) A porcentagem em peso por volume (%, p/v) corresponde a gramas de soluto
por 100 mL de solução. A expressão mg% (miligramas de soluto em 100 mL
de solução) também é muito empregada.
Cálculos relacionados com as diferentes formas de expressar a concentração:
Exemplo:
Foram pesados 41,50 g de FeSO4 anidro. O sal foi transferido para um balão volumétrico
de 1000 mL, dissolvido em água e a seguir completado o volume da solução. A
densidade da solução é 1,04 g/mL e o peso molecular do FeSO4 é 151,9. Calcular:
a) A molaridade
 No de mols de FeSO4 = gramas de FeSO4 = 41,50 = 0,273
mol 151,90

Molaridade = No de mols de FeSO4 = 0,273 = 0,273 M

Litros de solução 1 litro

b) Porcentagem em peso

% de FeSO4 em p/p = gramas de FeSO4 x 100 = 41,50 x 100 = 4%

gramas de solução 1040

☺ Se 1 g de FeSO4 equivale a 1,04 mL (densidade) então 100 mL

de equivalem a 1040 g de FeSO4

c) Porcentagem em peso por volume

% de FeSO4 em p/v = gramas de FeSO4 x 100 = 41,50 x 100 = 4,15%

mL de solução 1000

Reciprocidade nos cálculos de solução:

Duas soluções de concentração e volume iguais contêm a mesma quantidade de
soluto. Se, por diluição, o volume é aumentado, diminui a concentração, existindo uma
relação recíproca entre os dois; do que se deduz que o produto do volume pela
concentração é constante e não depende do grau de diluição:
Concentração x volume = constante, ou seja
Porcentagem 1 x volume 1 = porcentagem 2 x volume 2
Molaridade 1 x volume 1 = molaridade 2 x volume 2

concentração inicial x volume inicial = concentração final x volume final

C0 x V0 = Cf x Vf

Exemplo:
Quantos mL de uma solução de NaCl a 10% p/v são necessários para preparar 100 mL
de NaCl a 0,9% p/v?

C0 x V0 = Cf x Vf
10% x X = 0,9% x 100 mL
X = 0,9% x 100 mL = 9 mL
10%
 Volumetria
A volumetria consiste em determinar o volume de uma solução padrão
(concentração conhecida) necessário para reagir com um volume dado de solução de
uma substância em análise. A quantidade de substância que se determina é calculada
conhecendo-se o volume de solução empregada e aplicando a lei de equivalência
química.
A solução padrão é adicionada gradativamente com o auxilio de uma bureta. A
operação de adicionar a solução padrão até o ponto final é denominada titulação. O
ponto final da titulação é, e geral, reconhecido visualmente por alguma mudança
característica e nítida que não deixa dúvida, ou mais frequentemente com o auxílio de
um reativo denominado indicador.

I. TITULAÇÃO DA ACIDEZ DO VINAGRE

1. Objetivo:
Determinar a concentração de ácido acético do vinagre
2. Procedimento:
• Em um erlenmeyer de 125 mL, adicionar 20 mL de vinagre, 25 mL de água
destilada e duas gotas de fenolftaleína a 1%;
• Encher uma bureta de 25 mL com uma solução de NaOH 0,1M;
• Titular com NaOH, agitando sempre até o aparecimento de uma coloração rósea
que persiste no mínimo por 20 seg. Anotar o volume gasto de NaOH.
• Determinar a concentração de ácido acético (% p/v) na solução de vinagre.

Relatório da Prática 1: Soluções e Volumetria

Componentes do Grupo:
1) Calcular a molaridade de uma solução de NaOH a 10% p/v. (PM NaOH = 40)
2) Quantos gramas de NaOH sólido são necessários para preparar 500 mL de uma
solução 0,04 M? Exprima a concentração em termos de g/L, %, mg% (PMNaOH = 40)
3) Quantos mL de H2SO4 a 96% p/p e d= 1,84 são necessários para preparar 100mL de
cada uma das seguintes soluções
a. 5 M
b. 2 M
c. 1 M
d. 0,5 M
e. 0,1 M

4) A que volume devemos levar 50 mL de H2SO4 3,5 M para torna-lo 2 M?

5) Quantos mL de HCl a 36,5% são necessários para preparar 500 mL de uma solução
a 1 M?
6) Descreva a preparação de 2 L de HCl 0,4 M a partir de uma solução concentrada de
HCL (HCl 28%, d = 1,15 g/mL, PM = 36,5)
7) Uma solução contém 15 g de CaCl2 num volume total de 190 mL. Expresse em: g/L;
% p/v; mg%; M.
8) O rótulo de um frasco de adenosina trifosfato (ATP) uma importante coenzima indica
que há 98% de pureza na preparação. Contém 3,5 mols de água de hidrataçõa por mol
de ATP e está na forma de sal dissódico. Como você procederia para preparar 10 mL
de uma solução 0,03 M? O peso molecular do ATP livre é 507,2.
9) Na determinação da concentração de proteínas em líquidos biológicos é usada coo
referência uma solução padrão de albumina. Como proceder para preparar 100 m L de
uma solução de albumina a 1mg/mL em NaCl a 0,9%
10) Para determinações volumétricas de KOH foram utilizados 10 mL de amostra e
foram gastos 15 mL de H2SO4 0,105 M. calcule a molaridade da solução de KOH

IMPORTÂNCIA DO pH NOS FLUIDOS BIOLÓGICOS

INTRODUÇÃO:
A concentração de íons H + e OH- nos fluidos biológicos tem grande influência
sobre as biomoléculas presentes nas células. A presença desses íons pode modificar a
estrutura tridimensional dessas moléculas através do rompimento das interações,
alterando as suas propriedades biológicas.
As células podem perceber variações de pH de até 0,2 unidades. Sendo assim a
regulação e a manutenção do pH dos fluidos e tecidos dos organismos vivos são de
extrema importância. Esse controle do pH nos organismos vivos é obtido com o auxílio
de soluções compostas por uma mistura de um ácido fraco (HA) e sua base conjugada
(A-) chamada de solução-tampão.
O mecanismo de atuação de uma solução-tampão é simples: quando adicionamos
íons H+ e, uma solução-tampão, a base conjugada da mistura (A-) captura esses íons
impedindo a sua interação com as biomoléculas da solução. Da mesma forma quando
adicionamos uma base forte à solução, os prótons H + da mistura-padrão capturam os
íons OH- da base formando H2O.
No plasma, o tampão mais importante é o sistema ácido carbônico-bicarbonato
(H2CO3  H+ + HCO3-). Outro sistema tampão importante é a hemoglobina que carrega
moléculas de O2 para os tecidos trazendo H+ para o pulmão.
Intracelularmente, o ácido fosfórico (H3PO4  H+ + H2PO4-) atua como importante
sistema-tampão, sendo também largamente utilizado em laboratórios pois permite o
preparo de soluções de pH conhecido servido para controlar o pH dos meios de cultura
e ensaios enzimáticos.
O controle do pH e a equação de Henderson-Hasselbach
Segundo o conceito elaborado por Brönsted, ácidos são substâncias que doam
prótons e bases, as que recebem ou aceitam prótons.
Dessa forma, um ácido genérico HA em solução dissocia-se em um próton H+ e
uma base conjugada A-, de acordo com a equação seguinte:
HA  H+ + A-
Ou seja um ácido, ao doar próton, produz uma base correspondente, ao passo
que uma base, ao aceitar o próton produz um ácido. Os ácidos podem ser
classificados como fortes ou fracos de acordo com a facilidade de doar prótons em
soluções aquosas.
Ácidos fortes são aqueles que estão quase completamente dissociados em
solução aquosa como o HCl. Ácidos fracos são aqueles que encontram parcialmente
dissociados em solução.
A “força” de um ácido pode ser medida pela constante de equilíbrio ou constante
de dissociação do ácido chamada Ka. Esta por sua vez pode ser calculada pela
seguinte equação:
 Ka = [H ] . [A ]
+ -

[HA]

Nessa equação, Ka = constante de dissociação do ácido; [H +] = íon hidrogênio;

[A-] = ácido dissociado; [HA] = ácido não-dissociado; [ ] = concentração em mol/L.
Quanto maior a Ka, maior será a [H+] liberada por mol de um ácido em solução e
consequentemente mais forte será o ácido. Ka representa então a medida da força de
um ácido.
Henderson e Hasselbalch rearranjaram e aplicaram logaritmo dessa equação,
chegando à seguinte:

pH = pKa + log [A-]

[HA]

Esta terceira equação permite calcular a proporção entre o ácido e a base

conjugada que devem ser misturadas para obtermos uma solução-tampão em um pH
determinado.
Uma solução-tampão consiste em uma solução cujo pH varia pouco após a
adição de ácido e ou de base. O tampão é criado misturando-se a concentrações
iguais de um ácido fraco [HA] e sua base conjugada (A-) e nesse caso, o pH = pKa. O
efeito tamponante de uma mistura é mais eficiente dentro dos limites de uma unidade
de pH acima e abaixo do valor de pKa.

II. DETERMINAÇÃO DO pH COM USO DE INDICADOR UNIVERSAL E

DEMONSTRAÇÃO DO EFEITO DE TAMPÃO

1. Objetivo:
Comparar a evolução do pH em uma solução tamponada com outra não tamponada
quando da adição de um ácido ou uma base forte

2. Procedimento:
• Em um becker adicionar 10 gotas de indicador universal
• Cada grupo deverá utilizar uma solução diferente:
➢ Grupo 1: 20 mL de água destilada
➢ Grupo 2: 2 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,0 + 18 mL de água destilada
➢ Grupo 3: 20 mL de água destilada
➢ Grupo 4: 2 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,0 + 18 mL de água destilada
 • Observar a cor de cada solução e anotar no quadro 1
• Adicionar 2 gotas de NaOH nos beckeres dos grupos 1 e 2. Observar se ocorrerá
mudança de coloração.
• Por meio de uma pipeta soprar o ar expirado dentro da solução do becker do
grupo 1 durante 15 segundos. Observar se ocorrerá mudança de coloração.
• Por meio de uma pipeta soprar o ar expirado dentro da solução do becker do
grupo 2 durante 1 minuto. Observar se ocorrerá mudança de coloração.
• Adicionar nos beckeres dos grupos 3 e 4, 5 gotas de HCl 0,1 N. Observar se
ocorrerá mudança de coloração.
• No becker do grupo 4 continuar adicionando HCl, gota a gota. Determinar
quantas gotas devem ser adicionadas até que se obtenha a mesma coloração
do grupo 3.
• Anotar os resultados no quadro 1 (TODOS OS GRUPOS DEVERÃO ANOTAR
TODOS OS RESULTADOS):
Grupo 1 (água destilada) Grupo 2 (tampão)
pH inicial: pH inicial:
+ 2 gotas de NaOH + 2 gotas de NaOH
pH: pH:
+ ar expirado por 15 seg. + ar expirado por 1 min.
pH: pH:
Grupo 3 (água destilada) Grupo 4 (tampão)
pH inicial: pH inicial
+ 5 gotas de HCl + 5 gotas de HCl
pH: pH:

Foram necessárias _______ gotas de HCl 0,1 N no Becker do grupo 4 para se obter a
mesma coloração da solução do grupo 3.

Relatório da Prática 2: pH
Componentes do Grupo:
1) Resultado da Prática:

Grupo 1 (água destilada) Grupo 2 (tampão)

pH inicial: pH inicial:
+ 2 gotas de NaOH + 2 gotas de NaOH
pH: pH:
+ ar expirado por 15 seg. + ar expirado por 1 min.
pH: pH:
Grupo 3 (água destilada) Grupo 4 (tampão)
pH inicial: pH inicial
+ 5 gotas de HCl + 5 gotas de HCl
pH: pH:

Foram necessárias _______ gotas de HCl 0,1 N no Becker do grupo 4 para se obter a
mesma coloração da solução do grupo 3.

2) Supondo que o pH de uma solução é 5,0, calcular a concentração molar de OH -

3) Calcular o pH de uma solução de NaOH 0,1 M.
4) Qual é a relação bicarbonato para ácido carboônico na pressão sanguínea qual
corresponde a um pH de 7,4. O pKa do ácido é 6,1.
5) Uma amostra de 5 mL de suco gástrico obtida várias horas após uma refeição foi
titulada com NaOH 0,1 M até a neutralidade. Foram necessários 3,6 mL. Assumindo-
se que o estômago não continha alimentos e bebidas (ausência de tampões), calcular
o pH do suco gástrico.

ESPECTROFOTOMETRIA

INTRODUÇÃO:
 A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um
procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies
químicas mediante a absorção de energia radiante (luz).
Fotometria é uma técnica de análise quantitativa que envolve a medida de
intensidade de absorção de luz monocromática de um composto químico em solução.
Serve para identificar o comprimento de onda característico para cada composto e para
quantificação do composto através de: 1) absorção direta e 2) através de método
colorimétrico.
Quando uma radiação eletromagnética, por exemplo a luz visível, incide em uma
solução, se os fótons da radiação têm energia adequada, a energia associada a essa
radiação pode sofrer três diferentes tipos de variações:
1) Ser refletida nas interfaces entre o ar e a parede do frasco contendo a
solução;
2) Ser dispersa por partículas presentes na solução;
3) Ser absorvida pela solução

Nas aplicações espectrofotométricas, quando se usa energia monocromática em

um simples comprimento de onda (), a fração de radiação absorvida pela solução,
ignorando perdas por reflexão, será função da concentração da solução e da espessura
da solução. Portanto, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente
com o aumento da espessura atravessada (Lei de Lambert) e o aumento da
concentração ou intensidade de cor da solução (Lei de Beer). As relações quantitativas
nesta técnica são dadas então pela combinação das duas leis (Lei de Lambert-Beer):
• Lei de Lambert: quando um feixe de luz passa através de um meio
absorvente (sólido ou líquido), porções iguais deste meio irão absorver luz.
• Lei de Beer: a absorção da luz é proporcional à concentração do soluto na
solução.
A relação entre energia emergente (It) e energia incidente (Io) indica a

transmitância (T) da solução.

Figura 1: Io é intensidade de luz incidente; It é intensidade de luz transmitida após percorrer o caminho óptico (l) pela
solução da amostra.
 Em espectrofotometria, utiliza-se absorvância (A) como a intensidade de radiação
absorvida pela solução, seguindo a Lei de Lambert-Beer e definida pela relação:
Absorvância (A) = - log Transmitância (T)
Então, a intensidade de absorção depende:
• do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o λ máx – onde o composto
absorve mais luz);
• do percurso que o feixe de luz percorrerá na solução;
• da concentração do composto nessa solução.
A lei de Lambert-Beer relaciona esses três fatores e estabelece que:

A = ε.l.c

Onde:
A = absorvância;
-1
ε = absortividade molar (característico de cada substância), em L.(mol.cm) ;
l = caminho óptico (percurso da luz monocromática na solução), em cm;
c = concentração da substância em mol/L.

Desta forma, mantendo-se o caminho óptico constante, a absorvância torna-se

diretamente proporcional à concentração da substância no respectivo λmáx.
A absorção seletiva da radiação por muitas substâncias é utilizada para sua
determinação quantitativa através de dosagens colorimétricas e espectrofotométricas.
Para quantificarmos uma dosagem espectrofotométrica utiliza-se um equipamento
analítico chamado espectrofotômetro cuja representação esquemática encontra-se na
figura 2

Figura 2: Representação esquemáticas do funcionamento de um espectrofotômetro

A determinação da concentração de um soluto em uma solução problema por

espectrofotometria envolve a comparação da absorvância da solução-problema com
uma solução de referência, na qual já se conhece a concentração do soluto. Em geral,
é utilizada uma solução-padrão com diferentes concentrações (pontos) que tem sua
absorvância determinada. Esses pontos são preparados diluindo-se a solução-padrão
para a concentração desejada.
Com os valores de absorvância e de concentração conhecidos pode-se construir
um gráfico cujo perfil é conhecido como curva-padrão ou curva de calibração (Fig 3)
Nesse gráfico a reta que deve passar obrigatoriamente pela origem indica a
proporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorvbância e a porção linear
corresponde ao limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em
questão.

Figura 5: Um exemplo de uma curva padrão. ABS x concentração (mol/L)

I. DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO:

1. Objetivo:
Determinar o comprimento de onda ótimo (pico de absorção máximo) para um
corante indicado.
2. Procedimento:
• Branco: pipetar 3 mL do solvente (água) utilizado para solubilizar o corante na
cubeta de vidro;
• Realizar a leitura no espectrofotômetro (zerar a leitura - branco);
• Pipetar 3 mL da solução contendo o corante designado na cubeta de vidro;
• Realizar as leituras e anotar as absorvâncias nos comprimentos de onda
relacionados abaixo:

CORANTE: __________________________________________________________
 λ
400 420 440 470 500 530 570 600 630 660 690
(nm)
ABS

II. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO (DETERMINAÇÃO DA LEI DE

LAMBERT-BEER):

1. Objetivo:
Construir uma curva padrão e determinar a concentração de uma amostra de
corante desconhecida.

2. Procedimento:
• Em tubos de ensaio adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo;

TUBO B 1 2 3 4 5 D
Corante 1 mg% (mL) 0 1 2 3 4 5 0
Amostra (mL) 0 0 0 0 0 0 5
Água destilada (mL) 5 4 3 2 1 0 0
ABS
Concentração (mg%)

• Realizar as leituras no espectrofotômetro (tubos 1-5 e D) no comprimento de

onda ideal para o seu corante (volumes e procedimento similares ao efetuado
na prática anterior) e anotar os valores obtidos;

III. REGRESSÃO LINEAR E CONSTRUÇÃO DOS GRÁFICOS

Após a construção da curva padrão temos as absorvâncias para diferentes diluições

de uma solução de concentração conhecida (solução padrão). A absorvância de uma
solução é proporcional à concentração da solução e a distância percorrida pelo feixe de
luz através da solução (Lei de Lambert-Beer). Então, ao se construir o gráfico com os
dados obtidos acima (curva padrão), temos:

AN 


A3


A2


C1 = A1
C2
C2 = A2
Onde:
C3 = A3
A = absorvância;
...
C = concentração conhecida do padrão
CN = AN

Teoricamente, A1/C1 = A2/C2 = A3/C3 = AN/CN

No entanto, há dispersão dos pontos na prática, então, se traça a melhor reta, ou se
determina o coeficiente angular médio:
Segundo a equação da reta:
y = ax + b (sendo a o coeficiente angular da reta e b o coeficiente linear)
Ou seja:

A =  . C + b (b = 0) ou  = A/ C

Calcula-se o  para cada concentração (1 = A1/C1; 2 = A2/C2 ....)

O médio é obtido a partir do somatório de todos os  calculados e representa a

inclinação da reta.
Então:
Se  = A/ C então
C = A/ 
Pode-se calcular a Cd (desconhecida) com os seguintes dados:
Cd = Ad/ m

Relatório da Prática 3: Espectrofotometria

Componentes do Grupo:

1) Preencher os espaços abaixo, efetuando os cálculos necessários:

Corante utilizado: ____________________________________________________

Experimento 1:

λ
400 420 440 470 500 530 570 600 630 660 690
(nm)
ABS

Experimento 2

TUBO B 1 2 3 4 5 D
ABS
Concentração (mg%)
Coeficiente angular da
reta ()

2) Calcular o coeficiente angular médio (médio) da curva padrão

3) Determinar a concentração de corante na amostra desconhecida (D) utilizando os

dados de absorbância (A) e coeficiente angular médio (médio).

4) Construir um gráfico com as concentrações de corante na abscissa (mg%) e as

leituras de absorvância, na ordenada

TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS
INTRODUÇÃO
Os aminoácidos são as unidades estruturais (monômeros) das proteínas.
Estruturalmente são definidos como biomoléculas formadas por um carbono central a
(alfa) ligado a um grupamento carboxílico, um grupamento amino, um hidrogênio e um
radical R que diferencia cada um dos aminoácidos.
 Fig. 1 Estrutura geral de um aminoácido

Os aminoácidos podem ser classificados quanto às características químicas de

seus radicais. Embora existam algumas variações dessa classificação, a mais simples
delas enquadra os radicais dos aminoácidos em quatro grandes grupos:
- radicais polares, mas não carregados;
- radicais polares carregados positivamente;
- radicais polares carregados negativamente;
- radicais apolares.
Propriedades Iônicas dos aminoácidos
Tanto o grupo carboxílico quanto o grupo amina possuem hidrogênios ionizáveis
em solução. Ambos fornecem ao aminoácido um caráter anfótero, ou seja, permitem
que um aminoácido, de acordo com o pH do meio onde se encontra, possa agir como
um ácido, doando prótons ou como uma base, capturando prótons.
A maior parte dos aminoácidos livres em solução encontra-se com os grupos
carboxila e amina carregados – a porção carboxilato, negativamente e a amina,
positivamente. Os aminoácidos sem grupos carregados em suas cadeias laterais
existem em soluções neutras como zwiterions, sem nenhuma carga líquida. Isso ocorre
porque a carga negativa (grupo carboxílico) anula eletricamente a carga positiva (grupo
amina).
Curva de titulação
Quando um aminoácido é titulado, sua curva de titulação indica a reação de cada
grupo funcional com o íon hidrogênio.
Tomemos como exemplo o aminoácido alanina. Se partimos de um pH bem ácido
em torno de 1, ele se apresentará sob a forma apresentada na figura 2.

Fig. 2 estrutura da alanina em pH 1.

 Se formos adicionando quantidades pequenas de NaOH sobre a solução de
alanina e se plotarmos o pH da solução em função do número de equivalentes de OH-
adicionados, obteremos uma curva com três regiões bem definidas: AB, BC e CD
conforme demonstrados na figura 3.

Fig 3 Curva de titulação da alanina.

A região AB representa uma região de tamponamento, onde encontramos 50% da

alanina totalmente protonada e 50% da alanina, sem o próton do grupo carboxila. O
ponto isoelétrico (pI) é encontrado em pH 6,02 quando 100% da alanina encontra-se
sem o próton do grupo carboxila.
Continuando a adição de NaOH encontramos uma nova região de tamponamento
– região CD, onde 50% da alanina encontra-se protonada no grupo amina e 50% da
alanina, sem o próton do grupo amina (lembrando que 100% da alanina encontra-se
desprotonada no grupo carboxílico). A titulação é finalizada quando 100% da alanina
encontra-se totalmente desprotonada.
A titulação permite encontrar os pKas e o pI de um aminoácido. Dessa forma,
avalia o estado iônico de um aminoácido em diferentes pHs.
Determinação colorimétrica do pH:
O método colorimétrico basea-se no conhecimento dos pKas dos indicadores, os
quais podem ser considerados como ácido ou base fracos. A dissociação de um
indicador ácido em forma simplificada é a seguinte:
HIn  In- + H+
Á adição de ácido à solução de indicador aumenta a concentração de H+ e reprime
a dissociação do indicador e há predominância da cor ácida. A adição de uma base
diminui a concentração de H+, a equação se desloca para a direita produzindo mais
indicador In- e há predominância da cor básica. A cor do indicador é dada pela equação:

pH = pKIn + [In ]
-

[HIn]
 Sendo que o indicador exibe a sua cor intermediária quando a razão [In -]/[HIn] = 1
e pH = pKIn. O intervalo mais eficiente de um indicador é aproximadamente pK In±1.
Na tabela abaixo estão relacionados alguns indicadores com suas características:
Indicador pKIn Cor e zona de pH
Azul de timol (ácido) 1,7 Vermelho (1,2) Amarelo (2,8)
Amarelo de metila 3,3 Vermelho (1,2) Amarelo (4,0)
Laranja de metila 3,5 Vermelho (3,1) Amarelo (4,4)
Azul de bromofenol 4,0 Amarelo (3,1) Azul (4,7)
Verde de bromocresol 4,7 Amarelo (3,8) Azul (5,4)
Vermelho de metila 5,0 Vermelho (4,2) Amarelo (6,3)
Vermelho de clorofenol 6,0 Amarelo (5,1) Vermelho (6,7)
Púrpura de bromocresol 6,2 Amarelo (5,4) Vermelho (6,7)
Azul de bromotimol 7,1 Amarelo (6,1) Azul (7,7)
Vermelho de fenol 7,8 Amarelo (7,0) Vermelho (8,6)
Vermelho de cresol 8,3 Amarelo (7,4) Vermelho (9,0)
Azul de timol (alcalino) 8,9 Amarelo (8,0) Azul (9,6)
Fenolftaleína 9,4 Incolor (8,3) Vermelha (10,0)
Indicador universal (laranja de metila, Vermelho (3,0 ou menos), alaranjado
vermelho de metila, azul de bromotimol e (4,0), laranja (5,0), amarelo (6,0), verde
fenolftaleína) amarelado (7,0), verde azulado (8,0), azul
(9,0), violeta (10,0) e púrpura (11 ou mais)
Papel de tornasol Vermelho (4,5) Azul (8,3)
Papel indicador do congo Azul (3,0) Vermelho (4,5)
Papel indicador universal

Indicadores universais são misturas de indicadores a fim de abranger um intervalo

mais amplo de pH; Papéis indicadores são papéis impregnados de um ou mais
indicadores e usados para a determinação aproximada de pH.
Determinação potenciométrica do pH:
Este é um método mais preciso para a determinação de pH. Usa-se geralmente
um aparelho chamado protenciômetro que consiste em um eletrodo de vidro, um
eletrodo calomelano e um sistema para medida de voltagem. O potencial é dado pelo
eletrodo calomelano (cloreto mercuroso em contato com uma solução saturada de KCl).
O eletrodo de vidro compõe-se de um bulbo de vidro especial contendo HCl 0,1 N em
contato com um eletrodo metálico. Quando o eletrodo de vidro é imerso em solução
hidrogeniônica de concentração desconhecida, cria-se um potencial entreas soluções
 interna e externa. Como a voltagem do eletrodo calomelano é constante, a diferença de
potencial entre os dois eletrodos é diretamente relacionada com a concentração de íons
hidrogênio da solução desconhecida.

1. Objetivo:
Construir a curva de titulação de dois aminoácidos neutros e determinar os pKas e
pI da glicina e da alanina

2. Procedimento:
• Adicionar a um becker, 20 mL de solução de aminoácido (alanina ou leucina 0,02
M)
• Posicionar o becker sobre o agitador magnético
• Adicionar a barra magnética
• Adicionar 1 mL de HCl 1 M
• Para a determinação colorimétrica, adicionar 5 gotas de indicador universal à
solução de aminoácidos (grupo 1)
• Para a determinação potenciométrica, posicionar o eletrodo dentro da solução
(grupo 2)
• Preparar a bureta com NaOH 0,1 M
• Anotar o pH inicial das soluções de aminoácidos
• Adicionar 1,0 mL de NaOH e anotar o valor de pH
• Repetir o item anterior até que o valor de pH chegue a 12.
• Anotar os resultados na tabela abaixo:
Aminoácidos: ___________________________________________________________
1) Determinação colorimétrica:
Volume pH Volume Cor pH
Cor
de NaOH aproximado de NaOH aproximado
(mL) (mL)
0 13
1 14
2 15
3 16
4 17
5 18
6 19
7 20
8 21
9 22
10 23
11 24
12 25
2) Determinação potenciométrica:
Volume de NaOH pH Volume de NaOH pH
(mL) aproximado (mL) aproximado
0 13
1 14
2 15
3 16
4 17
5 18
6 19
7 20
8 21
9 22
10 23
11 24
12 25

Relatório da Prática 4: Titulação de aminoa´cidos

Componentes do Grupo:

Aminoácidos: ___________________________________________________________
1) Determinação colorimétrica:
Volume pH Volume Cor pH
Cor
de NaOH aproximado de NaOH aproximado
(mL) (mL)
0 13
1 14
2 15
3 16
 4 17
5 18
6 19
7 20
8 21
9 22
10 23
11 24
12 25

2) Determinação potenciométrica:
Volume de NaOH pH Volume de NaOH pH
(mL) aproximado (mL) aproximado
0 13
1 14
2 15
3 16
4 17
5 18
6 19
7 20
8 21
9 22
10 23
11 24
12 25

3) Construir um gráfico com os volumes de NaOH na abscissa (mL) e o pH na ordenada

(análise potenciométrica)

4) Calcule os pKas do aminoácido.

5) Calcule o pI do aminoácido
ANÁLISE QUALITATIVA DE AMINOÁCIDOS

OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA:

Identificar o/os aminoácidos presente(s) nas amostras biológicas fornecidas. Para tal
serão usados diferentes métodos qualitativos, cada um designado para a identificação
de um determinado aminoácido ou grupo de aminoácidos.

I. REÇÃO DA NINHIDRINA
1. Objetivo:
Identificação de aminoácidos.

2. Princípio do método:
 O grupo amino dos
aminoácidos é muito resistente à
hidrólise, porém pode ser
removido facilmente por oxidação.
A ninhidrina (hidrato de
tricetohidrindeno) é um poderoso
agente oxidante causando a
desaminação oxidativa de -
aminoácidos produzindo CO2,
NH3 e um aldeído com um
carbono a menos que o
aminoácido inicial. Então, a ninhidrina reduzida (hidridantina) reage com NH 3 liberado e
outra molécula de ninhidrina, formando um complexo arroxeado que apresenta
absorção máxima a 570 nm. A intensidade de cor, sob condições padrão, é a base para
um teste quantitativo extremamente útil. Outras aminas, além dos -aminoácidos,
também reagem com a ninhidrina dando uma coloração azul, mas sem a liberação de
CO2.
Cabe ressaltar que o produto da reação de iminoácidos, como a prolina e
hidroxiprolina, com ninhidrina apresenta coloração amarela ao invés de roxa, cujo
máximo de absorção ocorre em  = 440 nm. Neste caso não há liberação de NH 3, porém
há produção de teores quantitativos de CO2.

3. Procedimento:
• Separar uma tira de papel de filtro para cada reação a ser testada;
• Dividir a tira de papel de modo a aplicar com o auxílio de um conta gotas ou capilar
água (brando de reação), o(s) aminoácidos que dê(em) reação positiva, um aminoácido
que não dê reação positiva e uma proteína. Secar a frio. Cuidado para não tocar as tirar
de papel com os dedos. Manusear somente pelas extremidades.
• Aplicar as amostras na seguinte ordem: Água – Prolina – Alanina – Caseína.

água Pro Ala Cas

• Adicionar o reagente sobre as amostras aplicadas com o auxílio de um conta-gotas

ou capilar. Levar à estufa à 80oC até o aparecimento da cor.
• Anote os resultados observados
II.REAÇÃO DE SAKAGUCHI
1. Objetivo:
Identificação de arginina.
2. Princípio do método:
Este método é usado para a determinação da presença de arginina e envolve reações
químicas que são praticamente desconhecidas. Entretanto sabe-se que quando se trata
de uma solução alcalina de um composto guanidino monosubstituído com o  – naftol e
com hipoclorito ou hipobromito de sódio aparece uma coloração avermelhada que
desaparece em pouco tempo.

3. Procedimento:
• Separar uma tira de papel de filtro para cada reação a ser testada;
• Dividir a tira de papel de modo a aplicar com o auxílio de um conta gotas ou capilar
água (brando de reação), o(s) aminoácidos que dê(em) reação positiva, um aminoácido
que não dê reação positiva e uma proteína. Secar a frio. Cuidado para não tocar as tirar
de papel com os dedos. Manusear somente pelas extremidades.
• Aplicar as amostras na seguinte ordem: Água – Arginina – Alanina – Caseína.

água Arg Ala Cas

• Adicionar os reagentes sobre as amostras aplicadas com o auxílio de um conta gotas

ou capilar na seguinte ordem: 1-NaOH 2N; 2- -naftol 0,4% e 3- NaClO 0,5%.
• Anote os resultados observados

Importante: Após a adição de cada reagente esperar secar antes da aplicação do

próximo reagente.

III.REAÇÃO XANTOPROTÉICA
1. Objetivo:
Detecção de aminoácidos contendo anel aromático (triptofano, fenilalanina e
tirosina).

2. Princípio do método:
 A reação é específica para aminoácidos cíclicos como fenilalanina, triptofano, tirosina e
histidina. Aminoácidos aromáticos reagem com o ácido nítrico (HNO 3), levando a
formação de um nitrocomposto amarelo (1), que muda de cor para o laranja em meio
alcalino, levando a formação de um sal
(2).
(1)
dinitrotirosina
Nitrocomposto amarelo

(2)

Sal de amônio de dinitrotirosina

. (laranja)

3. Procedimento:
• Separar uma tira de papel de filtro para cada reação a ser testada;
• Dividir a tira de papel de modo a aplicar com o auxílio de um conta gotas ou capilar
água (brando de reação), o(s) aminoácidos que dê(em) reação positiva, um aminoácido
que não dê reação positiva e uma proteína. Secar a frio. Cuidado para não tocar as tirar
de papel com os dedos. Manusear somente pelas extremidades.
• Aplicar as amostras na seguinte ordem: Água – Tirosina – Fenilalanina - Triptofano -
Alanina – Caseína.

água Tyr Phe Trp Ala Cas

• Adicionar HNO3 concentrado sobre as amostras aplicadas com o auxílio de um conta-

gotas ou capilar.
• Anote os resultados observados

IV.REAÇÃO DE PAULY
1. Objetivo:
Detecção de histidina.
2. Princípio do método:
 O tratamento da histidina com uma solução de ácido sulfanílico diazotado e. após adição
de carbonato de sódio produz uma coloração vermelha. O mesmo resultado se obtém
com tirosina e fenóis similares, logo, a reação não é específica para histidina.
3. Procedimento:
• Separar uma tira de papel de filtro para cada reação a ser testada;
• Dividir a tira de papel de modo a aplicar com o auxílio de um conta gotas ou capilar
água (brando de reação), o(s) aminoácidos que dê(em) reação positiva, um aminoácido
que não dê reação positiva e uma proteína. Secar a frio. Cuidado para não tocar as tirar
de papel com os dedos. Manusear somente pelas extremidades.
• Aplicar as amostras na seguinte ordem: Água – Histidina - Alanina – Caseína.

água His Ala Cas

• Adicionar a solução 1 sobre as amostras aplicadas com o auxílio de um conta-gotas

ou capilar e secar à frio. Adicionar a solução 2 .
• Anote os resultados observados

Importante: Após a adição de cada reagente esperar secar antes da aplicação do

próximo reagente.

V.REAÇÃO DE EHRLICH
1. Objetivo:
Detecção de triptofano.
2. Princípio do método:
O método baseia-se na formação de um produto de coloração violeta de reações do
núcleo indol com p-dimetilamino benzaldeído em HCL concentrado. A reação do p-
dimetilamino benzaldeído ocorre no grupo pirrol, integrante do núcleo indol do triptofano.
3. Procedimento:
• Separar uma tira de papel de filtro para cada reação a ser testada;
• Dividir a tira de papel de modo a aplicar com o auxílio de um conta gotas ou capilar
água (brando de reação), o(s) aminoácidos que dê(em) reação positiva, um aminoácido
que não dê reação positiva e uma proteína. Secar a frio. Cuidado para não tocar as tirar
de papel com os dedos. Manusear somente pelas extremidades.
• Aplicar as amostras na seguinte ordem: Água – Triptofano – Tirosina - Alanina –
caseína.
 água Trp Tyr Ala Cas

• Adicionar os reagentes sobre as amostras aplicadas com o auxílio de um conta-gotas

ou capilar. Levar à estufa até o aparecimento da cor.
• Anote os resultados observados

Importante: Após a adição de cada reagente esperar secar antes da aplicação do

próximo reagente.

VI.REAÇÃO DO NITROPRUSSIATO
1.Objetivo:
Detecção de aminoácidos contendo grupamento sulfidrila.
2. Princípio do método:
Quando um composto com grupamento sulfidrila é colocado em solução alcalina de
nitroprussiato de sódio, aparece uma coloração avermelhada.
Procedimento:
• Separar uma tira de papel de filtro para cada reação a ser testada;
• Dividir a tira de papel de modo a aplicar com o auxílio de um conta gotas ou capilar
água (brando de reação), o(s) aminoácidos que dê(em) reação positiva, um aminoácido
que não dê reação positiva e uma proteína. Secar a frio. Cuidado para não tocar as tirar
de papel com os dedos. Manusear somente pelas extremidades.
• Aplicar as amostras na seguinte ordem: Água – Cisteína - Alanina – Caseína.

água Cys Ala Cas

• Adicionar o reagente sobre as amostras aplicadas com o auxílio de um conta-gotas

ou capilar. Secar à frio. Adicionar a solução 2.
• Anote os resultados observados.
Relatório da Prática: Aminoácidos

Componentes do Grupo:

1) Preencha a tabela com os resultados obtidos na aula prática

Método Amostra Resultado

 Ninhidrina Água
Prolina
Alanina
Caseína
Sakaguchi Água
Arginina
Alanina
Caseína
Xantoprotéica Água
Tirosina
Fenilalanina
Triptofano
Alanina
Caseína
Pauly Água
Histidina
Alanina
Caseína
Ehrlich Água
Triptofano
Tirosina
Alanina
Caseína
Nitroprussiato Água
Cisteína
Alanina
Caseína
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA
AMOSTRA BIOLÓGICA PELO MÉTODO DO BIURETO

INTRODUÇÃO
Métodos de determinação da concentração de proteínas
A determinação da concentração de proteínas em materiais biológicos é necessária
em diversas situações, como na purificação de uma determinada proteína a partir de um
extrato de material biológico para o estudo de suas propriedades e funções, ou na
avaliação dos níveis de certas proteínas que têm suas quantidades alteradas em
determinadas situações patológicas.
Existem diversos métodos para a determinação do conteúdo total de proteínas em
uma amostra. Suspensões puras de proteínas apresentam absorção de luz de
comprimento de onda abaixo de 230 nm com absorção máxima a 220 nm, correspondente
principalmente às ligações peptídicas. Entretanto, já que outros compostos como ácidos
carboxílicos, íons de tampão, alcoóis, bicarbonato e substâncias aromáticas também
absorvem nesta região, os resultados obtidos devem ser interpretados com cuidado. As
proteínas também absorvem luz ultravioleta em comprimentos de onda próximos a 280
nm que correspondem a presença de tirosina (275 nm), triptofano (280 nm) e fenilalanina
(260 nm) nas moléculas. Como o teor destes aminoácidos varia entre diferentes proteínas,
a absorção a 280 nm será particular de cada grupo de proteínas. A quantificação de
proteínas através da absorção a 280 nm é uma técnica rápida e eficiente, entretanto ela
está sujeita a interferências, particularmente de ácidos nucléicos que exibem absorção
máxima a 260 nm. Outros métodos bastante comuns baseiam-se no conteúdo de
nitrogênio de proteínas (todas as proteínas possuem um conteúdo médio de nitrogênio de
16%), como o “método de Kjeldahl”, ou na reação de sulfato de cobre em meio alcalino
com proteínas, que fornece um produto de coloração púrpura, como no “método do
Biureto”. Também bastante utilizado, o “método de Folin-Lowry” apresenta modificações
ao método do Biureto. Neste método, após a realização do método do Biureto é
adicionado à reação o reagente de Ciocalteau (ácido fosfotúngstico fosfomobilídico) que
é reduzido pela tirosina presente nas moléculas de proteínas. Nesta reação a coloração
desenvolvida é mais muito mais intensa, tornando o método 100 vezes mais sensível do
que o método do Biureto, sendo este bastante útil para amostras muito diluídas.
Todos os métodos possuem vantagens e limitações, portanto a escolha deve ser
cautelosa e levar em consideração os diversos fatores relativos aquela analise, como,
por exemplo, as características da amostra e a disponibilidade de recursos como
equipamentos e reagentes.
Nesta prática será realizado o método do Biureto, que será descrito em maiores
detalhes a seguir.

OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA:

Construir uma curva padrão de proteínas e determinar a concentração de
proteínas totais em uma amostra biológica desconhecida pelo método do Biureto.

I. CONSTRUÇÃO DE UMA CURVA PADRÃO E DETERMINAÇÃO DA

CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA:
1. Objetivo:
Determinação da concentração de proteínas através da formação de produtos com
coloração que poderão ser quantificados por espectrofotometria.

2. Princípio do método:
Este método é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo de
Biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos). Maiores detalhes podem
ser encontrados no roteiro da aula “Análise Qualitativa de Biomoléculas”.

3. Procedimento:
A) Construção da curva padrão (ou curva de calibração) e Determinação
da concentração de proteínas em uma amostra biológica de concentração
desconhecida

• Identificar 7 tubos de ensaio e colocar em uma estante;

• Adicionar os reagentes conforme a tabela seguinte:
Caseína Amostra Reativo de
o H2O Abs.
Tubo (N ) 10 mg/mL (mL) Biureto
(mL) 540 nm
(mL) (mL)
B 1,0 0 - 4,0
1 0,8 0,2 - 4,0
2 0,6 0,4 - 4,0
3 0,4 0,6 - 4,0
4 0,2 0,8 - 4,0
5 - 1,0 - 4,0
Amostra - - 1,0 4,0

• Após a adição do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso

por 15 minutos (a coloração púrpura formada é indicativa da presença de
proteínas);
• Neste momento, inicie a realização do protocolo seguinte (abaixo) para
a determinação da concentração de proteínas na amostra de concentração
desconhecida que seu grupo recebeu no inicio desta aula;
Relatório da Prática 5: Proteínas

Componentes do Grupo:

1) Preencher a tabela com os resultados da curva padrão:

 Concentração Abs.
Coeficiente
Tubo (N o ) de caseína 540 nm
angular ()
(mg/mL)
B
1
2
3
4
5
Amostra -

2) Calcular o coeficiente angular médio (médio) da curva padrão

3) Determinar a concentração da amostra desconhecida utilizando os dados de

absorbância (A) e coeficiente angular médio (médio).

4) Construir um gráfico com as concentrações de caseína na abscissa (mg/mL) e as

leituras de absorvância, na ordenada

CINÉTICA ENZIMÁTICA

OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA:

Determinação da atividade enzimática da invertase de levedura.

I. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO DE AÇUCAR REDUTOR:

1. Objetivo:
 A construção da curva padrão de açúcar redutor (glicose) servirá para determinar
a concentração de glicose produzida pela reação da invertase.
2. Princípio do experimento:
As reações químicas conduzidas pelos organismos vivos são, na sua grande
maioria, catalisadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatíveis
com as exigências metabólicas.
A enzima escolhida para este estudo é justamente a invertase da levedura
que catalisa a hidrólise da sacarose para produzir glicose e frutose:

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

sacarose água glicose frutose

Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (µg) de açúcar redutor formado, por

um cálculo estequiométrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente
(µg) sacarose hidrolisada.
Assim a levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermédio da "invertase"
hidrolisa a sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose,
açúcares esses que são absorvidos pela célula. A membrana plasmática é impermeável
à sacarose, e a levedura acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma exoenzima)
para a hidrólise ocorrer fora da célula de levedura.

Hidrólise da sacarose catalisada pela invertase. Tanto a glicose quanto a frutose são açúcares
redutores.
No presente experimento a invertase será obtida de levedura de panificação
(fermento Fleischmann) e adicionada à sacarose (açúcar não redutor), cuja hidrólise
resulta na formação de açúcares redutores (glicose e frutose) que serão estimados pela
reação de Somogyi-Nelson.
Para tal se colocará a enzima frente à diferentes concentrações de substrato
(sacarose), resultando em diferentes velocidades de reação enzimática, permitindo,
mediante um tratamento matemático adequado, determinar graficamente os valores de
Km e Vm para a reação enzimática da levedura.
 3. Procedimento:
• Identificar 6 tubos de ensaio, colocar em uma estante e adicionar os reagentes
conforme a tabela abaixo:
Tubos H2 O Glicose Reativo Reativo H2 O Glicose ABS
(mL) 0,2 de Agitar bem e de (mL) (mg) (530
mg/mL Somoggy levar ao Nelson nm)
B 1,0 0 1,0 banho-maria 1,0 7,0
(mL) (mL) (mL)
1 0,8 0,2 1,0 fervente 1,0 7,0
2 0,6 0,4 1,0 (100C) por 1,0 7,0
10 min
3 0,4 0,6 1,0 1,0 7,0
4 0,2 0,8 1,0 1,0 7,0
5 0 1,0 1,0 1,0 7,0

• Esta curva servirá para determinar a concentração do açúcar redutor produzido

a partir da sacarose por ação da invertase;
• Com os dados obtidos construir a curva-padrão (absorvância x concentração
de glicose).

II. CONSTRUÇÃO DA CURVA DE MICHAELIS-MENTEN E CÁLCULO DO

GRÁFICO DE LINEWEAVER-BURK:

1. Objetivo:
Determinação dos parâmetros cinéticos Km (constante de Michaelis) e Vmáx
(velocidade máxima) através da construção dos gráficos de Michaelis-Menten e de
Lineweaver-Burk.

2. Procedimento:
• Adicionar os reagentes em tubos de ensaio conforme a tabela a seguir:

Tampão* Sacarose Reativo de Reativo de H2 O Absorvância

(mL) 0,4 M Enzima Somoggy Agitar bem Nelson (mL) a 530 nm
(mL) (mL) Agitar (mL) e levar ao (mL)
bem e banho-
B1 2,3 0,2 - 1,0 1,0 5,5
levar ao maria
1 1,8 0,2 0,5 banho- 1,0 fervente 1,0 5,5
B2 2,1 0,4 - maria 1,0 1,0 5,5
2 1,6 0,4 0,5 por 15 1,0 (100C) por 1,0 5,5
min. 10 min
B3 1,7 0,8 - 1,0 1,0 5,5
A 37oC
3 1,2 0,8 0,5 1,0 1,0 5,5
B4 0,9 1,6 - 1,0 1,0 5,5
4 0,4 1,6 0,5 1,0 1,0 5,5
B5 0,5 2,0 - 1,0 1,0 5,5
5 0 2,0 0,5 1,0 1,0 5,5

Relatório da Prática 6: Enzimas

Componentes do Grupo:

1) Preencher a tabela com os resultados da curva padrão:

 Tubos Concentração ABS Coeficiente
de glicose (530 nm) angular ()
(mg/mL)
B
1
2
3
4
5

2) Calcular o coeficiente angular médio (médio) da curva padrão

3) Determinar a concentração da amostra desconhecida utilizando os dados de

absorbância (A) e coeficiente angular médio (médio).

4) Construir um gráfico com as concentrações de caseína na abscissa (mg/mL) e as

leituras de absorvância, na ordenada

5) Para calcular a concentração de sacarose (M), preencher a tabela:

Volume de Concentração
sacarose de sacarose
0,4 M (M)
(mL)
1 0,2
2 0,4
3 0,8
4 1,6
5 2,0

6) Para calcular a atividade enzimática, preencher a tabela

Abs530nm Concentração Atividade

(E-B) de glicose enzimática
(mg/mL) (mg/mL/min)

1
2
3
 4
5

7) Construir um gráfico com as concentrações de sacarose na abscissa (M) e as

atividades enzimáticas (mg/mL/min), na ordenada (Gráfico de Michaelis-Menten)

8) Para calcular os valores de duplo recíproco, preencher a tabela

tubo 1/[sacarose] 1/atividade

1
2
3
4
5

9) Construir um gráfico com os valores inversos das concentrações de sacarose na

abscissa (1/[sacarose]) e os valores inversos das atividades enzimáticas (1/V) na
ordenada (Gráfico de Lineweaver-Burk)

10) Calcule a constante de Michaelis e a velocidade máxima da enzima

ANÁLISE QUALITATIVA DE CARBOIDRATOS

1. Objetivo Geral:
Caracterizar grupos de glicídios a partir de suas propriedades químicas.

2. Princípio do experimento:
Propriedades Químicas dos carboidratos
 Diferentemente dos aminoácidos que apresentam reações específicas baseadas
principalmente na natureza química de seu radical, os carboidratos apresentam
estruturas muito parecidas entre si o que os torna quase impossíveis de identificá-los.
Neste caso o que se faz é caracterizar grupos de carboidratos utilizando suas
propriedades químicas comuns.
As reações mais utilizadas na prática estão baseadas em 2 dessas propriedades:/
1) Desidratação de carboidratos por ácidos fortes
Hexoses e pentoses colocadas nestas condições são desidratadas,
respectivamente a hidroximetilfurfural e furfural; estes compostos são capazes de se
condensar com substâncias fenólicas, com aminas aromáticas, tiocompostos, uréia. Os
complexos formados são, algumas vezes, coloridos e utilizados para a caracterização
de certos grupos glicídicos. Neste caso, situam-se:
A) Reação de antrona
Teste geral de glicídios
O reagente de antrona contém antranol em meio de H 2SO4 concentrado. O calor
liberado pela diluição do H2SO4 é suficiente para que a reação ocorra. No caso de oligo
e polissacarídeos, o ácido atua como catalisador de hidrólise convertendo-se a
monossacarídeos (hexoses e pentoses) e também como agente desidratante levando a
formação de hidroximetilfurfural e furfural que, em presença de antranol, dão produtos
de condensação coloridos.

H O OH
H C C H H
O +
OH H H C C OH
O
OH OH
hidroximetilfurfural antranol

H H
Complexo H C C OH
verde azulado OH
O
OH

O hidroximetilfurfural proveniente da desidratação de hexoses

produz uma substância de coloração verde azulada relativamente estável enquanto que
o furfural proveniente da desidratação de pentoses fornece um produto de cor análoga,
mas que em alguns minutos se torna vermelho-amarelada ou rubi.
O teste de antrona é muito sensível e pode ser usado, quando modificado, para a
quantificação de glicídios.
B) Reação de Seliwanoff
Teste de diferenciação entre aldoses e cetose
 A reação é feita com resorcinol em meio de HCl à quente. As cetohexoses dão
um produto de coloração vermelha que se desenvolve rapidamente; as aldohexoses
correspondentes reagem mais lentamente. Durante o tempo em que cetohexoses são
desidratadas e reagem com o resorcinol fornecendo o produto, as aldohexoses
fornecem apenas um produto levemente rosa.

OH
HOH2C O H HOH2C O

H OH H CH2OH COH
+
H2O
OH
H OH H H
hidroximetilfurfural resorcinol
cetohexose

Produto de coloração
vermelha

C) Reação de Bial
Teste para a identificação de pentoses e certos ácidos urônicos (galacturônico,
glicurônico e outros) que se decompõem durante o aquecimento em presença de H+,
formando pentoses.
O reagente consiste de orcinol em meio de HCl concentrado e em presença de
íons Fe+3. O furfural proveniente da desidratação de pentoses quando aquecido em
presença do reagente de Bial fornece uma cor verde. O hidroximetilfurfural (hexoses)
reage formando um produto diferente que oscila entre amarelo e marrom.

H H H O CH3
OH C C OH
COH
H C H H C COH +
OH OH 2H2O HO OH
H H
pentose furfural orcinol

Produto de coloração
O teste de Bial foi modificado a permitir quantificarverde
pentoses, trioses e o ácido 5-
cetoaldônico. As cetoheptoses fornecem produtos de coloração púrpura, as
cetohexoses e metilpentoses formam inicialmente um produto de cor laranja que em
repouso, posteriormente, precipita apresentando uma cor verde.

2) Poder redutor
Os açucares contêm grupos aldeídos e cetonas capazes de reduzir sais de metais
pesados; desses os sais mais usados são dos de Cu+2.
 O princípio fundamental de todos os procedimentos analíticos que utilizam Cu +2 é
sua dissolução em meio alcalino em presença de ácidos orgânicos (como ácido cítrico
e o ácido tartárico) capazes de formarem complexos. Também podem ser empregados
outros ácidos orgânicos como EDTA, ácido láctico, ácido trihidroxiglutárico ou ácido
sacárico.
A reação de formação do complexo ocorre em geral em meio fortemente alcalino
e isto promove profundas modificações na estrutura do açúcar. Os açucares apresentam
um poder redutor diferente sobre o íon Cu+2. Isso significa que dois tipos de hexoses em
uma mesma concentração fornecem quantidades diferentes de óxido cuproso (produto
final da reação). A quantidade de íons cobre reduzida pelos diferentes glicídios é função
do pH, da temperatura, da concentração e dos tipos de glicídios e íons orgânicos
complexantes.
Há diversos métodos para a determinação de teor de Cu2O, os mais utilizados para
a determinação em material biológico, são os colorimétricos que utilizam o Cu 2O
dissolvido em excesso de reagentes como fosfomolibdato, fosfotungstato ou arsênio-
molibdato, formando um complexo azul. Dentre os testes baseados em poder redutor
de glicídio destacam-se:
A) Teste de Benedict
Teste geral de glicídio redutores.
O reagente consiste de uma única solução onde estão presentes íons Cu+2, citrato
e carbonato de sódio. A reação é complexa e influenciada por uma série de fatores
podendo ser esquematizada por:

Cu+2 + glicídio Composto oxidado + Cu2O

(precipitado vermelho)
B) Teste de Barfoed modificado
Teste de diferenciação entre monossacarídeos e dissacarídeos redutores
A reação é feita usando-se acetato de cobre em meio de ácido láctico (reagente
de Barfoed) a quente e por 30 segundos; o produto formado nesta primeira etapa é
posteriormente revelado com solução de fosfomolibdato. Só monossacarídeos formam
produto de cor azul. A adição de ácido fosfomolíbdico leva a formação de um complexo
corado de azul intenso.

Cu+2 + glicídio Composto oxidado + Cu2O

H3PO4 . 12 MoO3

Complexo
de cor azul
 I. TESTE DE BENEDICT:
1. Objetivo:
Identificar se amostra apresenta açúcar redutor (monossacarídeos e
dissacarídeos) em sua composição.

2. Procedimento:
Tubos H2 O Amostras Reagente de Resultados
(mL) (mL) Benedict
(mL)
B 0,2 ----- 1,0
glicose 0,1 M ----- 0,2 1,0
celulose 0,1 M ----- 0,2 1,0
Legenda: B (Branco – ÁGUA);

• Aquecer em banho fervente (100°C) por 5 minutos

Resultados: No teste é considerado positivo se houver formação de precipitado

VERMELHO

II. TESTE DE SELLIWANOFF

1. Objetivo:
Identificar se a amostra é uma aldose ou uma cetose. A reação é positiva
para cetoses. Aldoses também reagem, no entanto, de forma muito mais lenta do
que as cetoses.

2. Procedimento:
Tubos H2 O Amostras Reagente de Resultados
(mL) (mL) Selliwanoff
(mL)
B 0,2 ----- 1,0

frutose 0,1 M ----- 0,2 1,0

arabinose 0,1 M ----- 0,2 1,0
 Legenda: B (Branco – ÁGUA);

• Aquecer em banho fervente (100°C) por 3 minutos

teste é considerado positivo se apresentar cor VERMELHO

III. TESTE DO IODO

1. Objetivos:
O objetivo do teste é permitir que o aluno seja capaz de identificar uma amostra
contendo o polissacarídeo amido.
2. Procedimento:
H2 O Amostras LUGOL
Tubos (mL) (mL) (gotas) Resultados
B 2,0 ----- 1,0
amido 1% ----- 2,0 1,0
celulose 1% ----- 2,0 1,0
Legenda: B (Branco – ÁGUA);

No teste é considerado positivo se apresentar cor AZUL ESCURO ou

ROXO

IV. TESTE DE BARFOED MODIFICADO:

1. Objetivos:
Diferenciar monossacarídeos redutores de dissacarídeos redutores.

2. Procedimento:
Tubos H2 O Amostras Reagente Reagente
Aquecer
(mL) (mL) de Barfoed Fosfomobdílico Resultados
os tubos
(mL) (mL)
em banho
B 0,2 ----- 1,0 0,5
fervente
dextrose 0,1 M ----- 0,2 1,0 0,5
(100oC)
lactose 0,1 M ----- 0,2 1,0 0,5
arabinose 0,1 M ------ 0,2 1,0 por 30 0,5
segundos
Legenda: B (Branco – ÁGUA);

No teste é considerado positivo (monossacarídeos) se apresentar cor

azul escura

Relatório da Prática 7: Carboidratos

Componentes do Grupo:
 1) Preencha a tabela com os resultados obtidos na aula prática

Método Amostra Resultado

BENEDICT Glicose
Celulose
SELLIWANOFF Arabinose
Frutose
IODO (LUGOL) Celulose
Amido
BARFOED Dextrose
Arabinose
Lactose

2) O que é um açúcar redutor? Por que você obteve os resultados no teste de

Benedict? Desenhe a glicose e a sacarose

3) O que é uma aldose e uma cetose? Desenhe as duas estruturas utilizadas no

seu experimento.

4) Por que o lugol só cora um dos carboidratos do seu teste? Quais as diferenças
estruturais entre as duas amostras?

5) Quais os carboidratos que o teste de Barfoed será positivo? E quais os

carboidratos darão negativo? Quais as diferenças estruturais entre os
carboidratos utilizados no teste? Desenhe as estruturas.

CARACTERIZAÇÃO DE TRIACILGLICERÓIS
1. Objetivos
Caracterizar as propriedades físico-químicas de triacilgliceróis (ésteres de ácidos
graxos); as reações de hidrólise ácida e alcalina (saponificação); o poder dos
detergentes de sabões solúveis.
2. Procedimento

1) Teste de saponificação (preparo de sabão)

Princípio do experimento
O teste da saponificação identifica a presença de ácido graxo. Para isso
colocamos a amostra (1) na presença de uma base como solução alcoólica de hidróxido
de potássio (KOH) 10% (2).

O produto final da saponificação é uma molécula anfipática, com uma "cabeça"

polar (COO- K+) e uma cauda apolar formada pelo radical "R" (4). Quando em meio
aquoso, moléculas anfipáticas tendem a se agrupar formando estruturas esferóides, as
micelas. Este é o princípio da limpeza de gorduras produzida pelo sabão.

Em um tubo de ensaio e adicione os reagentes conforme a tabela a seguir:

Reativos Tubo 1
Óleo Vegetal 15 gotas
Sol. Alcoólica KOH a 10% 5,0 mL

• Aquecer cautelosamente em banho-maria fervente (100°C) durante 20 minutos;

Deixe esfriar
• Coloque 5 gotas da solução obtida em um tubo de ensaio.
• Acrescente 2,0 mL de água e agite.
• Anote os resultados
Precipitação de ácidos graxos
• Coloque 5 gotas da solução obtida no teste de saponificação em um tubo de
ensaio;
• Acrescente 2 mL de água e agite
• Adicione 2 gotas de ácido acético concentrado, lentamente;
• Anote os resultados
 1) Solubilidade
• Numere três tubos de ensaio e adicione os reagentes conforme a tabela abaixo:
Reativos Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Água 1 mL ------- -------
Etanol ------ 1 mL -------
Acetona ------- ------- 1 mL
Óleo de soja 1 mL 1mL 1mL

• Agite vigorosamente os tubos

• Deixe em repouso.
• Anote os resultados

2) Emulsão

Principio do Experimento:

Emulsões são dispersões coloidais formadas por uma fase dividida designada
de interna, dispersa ou descontínua e por uma fase que rodeia as gotículas designada
de eterna, dispersante ou contínua. Além desses dois componentes, existe um terceiro
designado agente emulsivo, o qual contribui para tornar a emulsão mais estável, pois
se interpõe entre as fases, dispersa e dispersante, retardando assim a sua separação.
Desta forma, emulsões são sistemas termodinamicamente instáveis sendo necessário
um considerável aporte de energia para obtê-las, geralmente energia mecânica
De acordo com a hidrofilia ou lipofilia da fase dispersante, estes sistemas
classificam-se em óleo em água (o/A) ou água em óleo (A/O). A figura a seguir mostra
diferentes tipos de emulsão.
 • Numere dois tubos de ensaio e adicione os reagentes conforme a tabela a
seguir:
Reativos Tubo 1 Tubo 2
Óleo de soja 5 gotas 5 gotas
Água 5 mL -
Na2CO3 - 5 mL

• Agitar e verificar a formação da emulsão;

• Verificar o tempo de duração da emulsão em cada um dos tubos.
• Anote os resultados

Determinação do grau de saturação dos ácidos graxos (Teste do Iodo)

Principio do Experimento:

Este teste identifica a presença de ácido graxo insaturado. Ocorre uma reação de
halogenação, em que o iodo reage com as duplas ligações do ácido graxo insaturado.

Se houver dupla ligação, o iodo será consumido e a coloração característica da

solução de iodo diminuirá de intensidade.

• Numere três tubos de ensaio e adicione os reagentes conforme a tabela a

seguir:

Reativos Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Óleo de soja 1 mL - -
Óleo de coco - 1 mL -
Clorofórmio 2ml 2 mL 2 mL
Sol. Iodo 1% (lugol) 5 gotas 5 gotas 5 gotas

• Agitar vigorosamente e observar a coloração avermelhada;

 • Deixar em repouso na estante;
• Acompanhar a descoloração da solução

Relatório da Prática 8: Lipídios

Componentes do Grupo:

1) Esquematize os resultados do teste de solubilidade de lipídios:

 2) Explique os resultados obtidos no teste de solubilidade
3) Descreva os resultados do teste de emulsão:

Amostra Aspecto da amostra Tempo de emulsão

Óleo + água

Óleo + Na2CO3

4) Quais os produtos da hidrólise alcalina de um triglicerídeo (reação de

saponificação)?
5) Após um teste de saponificação, observou-se formação de bolhas. O que se
pode concluir? Explique.
6) O que aconteceu após a adição de ácido acético a solução saponificada?
7) O que caracteriza o teste do iodo como positivo? Faça um esquema da reação.
8) Por que o teste do iodo é capaz de identificar ácidos graxos insaturados?

FERMENTAÇÃO

1. Objetivo Geral:
Observar a respiração de células de leveduras Sacharomyces cerevisae
incubadas em diferentes condições.

2. Princípio de Experimento
 Fermentação é um processo de obtenção de energia a partir da oxidação de
compostos orgânicos utilizando um aceptor de elétrons endógeno. Desta forma, na
fermentação ocorre oxidação parcial dos compostos orgânicos, que podem ser
açúcares, proteínas, ácidos, entre outros. Como o processo é parcial, há apenas uma
pequena fração de energia liberada. Nas fermentações, o ATP é gerado a partir da
fosforilação em nível de substrato.
Praticamente todas as células conhecidas metabolizam glicose e várias hexoses
através da via glicolítica. Esta via metabólica é composta de uma sequência de 10
reações catalisadas por diferentes enzimas e resumidamente, é a via de conversão de
glicose em piruvato. Seus produtos finais, além do piruvato, são duas molécula de ATP
e duas moléculas de NAD reduzido.
Via glicolítica
O ATP produzido na via glicolítica será rapidamente utilizado nos processos
celulares que demandam energia, sendo convertidos em ADP + Pi, substratos
necessários para a via glicolítica. O NAD reduzido deve ser re-oxidado a NAD+ para que
a via glicolítica possa continuar operando. Depois de produzido, o piruvato pode ter os
seguintes destinos

Glicose
2 ATP
2 piruvato
34 ATP 2 ATP

Respiração aeróbica Fermentação

Ciclo de Krebs
Cadeia transportadora
Alcoólica Láctica

A fermentação difere da respiração celular, pois nesta última o aceptor de

elétrons é exógeno (exemplo, oxigênio) e sua captação é realizada via uma cadeia
transportadora de elétrons. Dessa forma, após a quebra da glicose, originando piruvato,
este pode ser convertido a outro composto orgânico. Por esse motivo, a fermentação é
um processo que não depende do ciclo de Krebs, ou da cadeia transportadora de
elétrons. Neste tipo de reação, os elétrons são transferidos das coenzimas reduzidas
(NADH, NADPH e FADH2) ao piruvato ou derivados, regenerando-os para novos ciclos
de glicólise.
 A fermentação não precisa necessariamente ocorrer em ambiente anaeróbico
(sem oxigênio). Mesmo em presença de grandes quantidades de oxigênio, leveduras
preferencialmente realizam a fermentação em detrimento a fosforilação oxdativa.
Carboidratos são os substratos mais comuns da fermentação. Os dois principais tipos
de fermentação são a alcoólica e a láctica, mas vários microrganismos utilizam a
fermentação produzindo compostos diferentes como o ácido butírico e acetona.
Fermentação alcoólica (leveduras e algumas espécies de bactérias):
A quebra do piruvato leva a produção de etanol e dióxido de carbono.
É um tipo importante de processo para a fabricação de pães, cerveja e vinho.

Fermentação láctica
A quebra do piruvato leva a formação de ácido láctico.
Ocorre em músculos de animais quando há necessidade de geração de energia
rápida. Em repouso a célula muscular produz um excesso de ATP, que transmite sua
energia para outro composto, a creatina fosfato, que é mais estável permanecendo por
mais tempo armazenada na célula. Em uma contração, este composto cede energia
para produção de ATP.

Ocorre também em bactérias (como lactobacilos) e alguns fungos. Bactérias que

convertem lactose em ácido láctico dão o sabor característico dos iogurtes. Estas
bactérias podem ser classificadas como homofermentativas (produzem apenas lactato)
ou heterofermentativas (produzem além do lactato, outros produtos como dióxido de
carbono e acetato, ácido fórmico).
Existem vários outros tipos de fermentação, além da alcoólica e da láctica que
são observados em diferentes microrganismos:
 • Propiônica: produtos finais: ácido propiônico, ácido acético e CO 2
(Propionibacterium, Veillonella).
• Acetona-Butírica: ácido butírico, acetona, butanol, isopropanol, ácido acético,
ácido fórmico, etanol, H2 e CO2 (Clostridium, Eubacterium, Bacillus).
• Acética: acético, glucônico (Acetobacter).
• Aerogenes-coli-tífico: Fórmico, acético, lático, succínico, etanol, 2,3-
butilenoglicol, H2 e CO2 (Escherichia, Enterobacter, Salmonella).

3. Procedimento
Experimento1 (E1):
Grupo 1: carbodrato: glicose
• Preparar os erlenmeyer como a tabela abaixo.
Tubo DEX GLIC Sc (g) H2 O
20% 20% (mL)
(mL) (mL)
1 --- 5 2,5 20
2 5 --- 2,5 20

• Fechar os erlenmeyers com os balões de borracha vedando bem a boca do vidro

• Colocar os erlenmeyers contendo a levedura+carboidrato no banho-maria a
37ºC por 30 min, agitando sempre.

Grupo 2: carbodrato: amido

• Preparar os erlenmeyer como a tabela abaixo.
Tubo DEX AM Sc (g) H2 O
20% 20% (mL)
(mL) (mL)
1 --- 5 2,5 20
2 5 --- 2,5 20
• Fechar os erlenmeyers com os balões de borracha vedando bem a boca do vidro
• Colocar os erlenmeyers contendo a levedura+carboidrato no banho-maria a
37ºC por 30 min, agitando sempre.

Grupo 3: carbodrato: sacarose

• Preparar os erlenmeyer como a tabela abaixo.
 Tubo DEX SAC Sc (g) H2 O
20% 20% (mL)
(mL) (mL)
1 --- 5 2,5 20
2 5 --- 2,5 20

• Fechar os erlenmeyers com os balões de borracha vedando bem a boca do vidro

• Colocar os erlenmeyers contendo a levedura+carboidrato no banho-maria a
37ºC por 30 min, agitando sempre.

Grupo 4: carbodrato: frutose

• Preparar os erlenmeyer como a tabela abaixo.
Tubo DEX FRU Sc (g) H2 O
20% 20% (mL)
(mL) (mL)
1 --- 5 2,5 20
2 5 --- 2,5 20

• Fechar os erlenmeyers com os balões de borracha vedando bem a boca do vidro

• Colocar os erlenmeyers contendo a levedura+carboidrato no banho-maria a
37ºC por 30 min, agitando sempre.

Experimento 2 (E2):
• Após o experimento anterior (E1), retirar os balões dos erlenmeyers com
cuidado, fechando a boca dos balões para impedir a saída de gás do seu interior;
• Prender os balões a erlenmeyrs contendo 10 mL de água e agitar de forma que
a água entre no balão;
• acrescentar 5 gotas de fenolftaleína;
• Titular contra NaOH 0,1N.
• Anotar o volume gasto na bureta após viragem de incolor para rosa;
Relatório da Prática : Fermentação

Componentes do Grupo:

1) Escreva os resultados referentes ao seu grupo, preechendo a tabela a seguir:

No. carboidrato Houve fermentação?

 1

2) Por que vocês obtiveram esses resultados?

3) Por que o(s) balão(ões) inflou(aram)?
4) Qual o papel da fenolftaleína no experimento?
5) Escreva os valores de NaOH adicionado e quanto de carboidrato foi produzido
(utilize a equação abaixo)

Conc (M) = Vol(mL)NaOH x 0,001

No. carboidrato Volume de NaOH Concentração de

(mL) carboidrato (M)
1

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUíMICA
SETOR DE BIOQUÍMICA
Bioquímica Experimental

Reagentes

REAGENTES E SOLUÇÕES
1. Espectrofotometria
• Azul de metileno, alaranjado de metila, violeta cristal e vermelho de metila,
soluções 1 mg% (0,001%):
Dissolver 0,001 g do corante em 100 mL de água destilada (usar um balão
volumétrico).
2. Titulação de aminoácidos
 • Indicador universal;
Laranja de metila .......................... 0,05 g
Vermelho de metila ...................... 0,15 g
Azul de bromotimol ..................... 0,30 g
Fenolftaleína ................................. 0,35 g
Álcool etilíco ................................. 1 L
3. Aminoácidos
• Ninhidrina 0,25%
Pesar 0,25 g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 100 mL.
• Alanina 0,1 M
Pesar 0,890 g de L-alanina dissolver em água destilada. Completar com água q.s.p 100
mL.
• α- naftol 0,4%
Pesar 0,4 g de α-naftol, dissolver em etanol e completar o volume até 100 mL.
Hidróxido de Sódio 2 M
Pesar 80 g de hidróxido de sódio (NaOH) em um bécher de plástico e dissolver em água
destilada com o uso do banho de gelo até avolumar para balão de 1000 mL.
• Hipoclorito de sódio 0,5%
Pesar 0,5 g de hipoclorito de sódio (NaClO), dissolver em etanol e completar o volume
até 100 mL.
• HNO3 concentrado
• Solução A: NaNO2
• Solução B: ácido sulfanílico em HCl
• Solução 1: Solução A + solução B (esta solução deve ser mantida gelada)
• Solução 2: Solução de Na2CO3
• P-dimetilamino benzaldeído em HCl (OBS: Preparar na hora).
• Nitroprussiato de sódio em meio amoniacal:
Dissolver 15 g de nitroprussiato de sódio (Na 2[Fe(CN)5NO]. H2O) em 50 ml de H2SO4
2N, adicionar 950 ml de metanol e 100 ml de amônia 20%. Filtrar, se necessário.

4. Proteínas
• Reagente de Biureto:
Dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sódio e potássio
(C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de água;
Adicionar 300 mL de NaOH 10%;
Adicionar água destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de solução.
Conservar a temperatura ambiente protegido da luz.
• Solução padrão de caseína 1% (10 mg/mL):
Pesar 1g de caseína, dissolver com aproximadamente 70mL de água destilada e depois
adicionar hidróxido de sódio 1M até a solução tornar-se límpida e completar o volume
para 100mL. Aliquotar em frações de 10 mL e conservar a –20oC.

5. Enzimas
• Reativo de Somoggy
Dissolver 28 g de fosfato dissódico anidro (Na 2HPO4) e 40 g de tartarato duplo
de sódio e potássio (C4H4O6NaK) em 500 mL de água destilada; adicionar 100 mL
de hidróxido de sódio (NaOH) 1 M, dissolver 8 g de sulfato de cobre cristalizado em
80 mL de água destilada e adicionar lentamente com agitação. Após, acrescentar
180 g de sulfato de sódio anidro (Na2SO4), homogeneizar e completar o volume para
1000 mL em um balão volumétrico. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar se
necessário. Manter em frasco âmbar.
• Reativo de Nelson
Dissolver 50 g de molibdato de amônio [(NH 4) MoO4] em 800 mL de água
destilada; adicionar 52 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado lentamente com
agitação. Após, dissolver 3 g de arseniato de sódio (Na 2HAsO4.7H2O) em 50 mL de
água destilada, adicionar à solução acima e homogeneizar. Completar o volume para
1000 mL em um balão volumétrico. Deixar em repouso por 2 dias, manter em frasco
âmbar.
• Glicose 0,02% (0,2 mg/mL)
Pesar 0,02 g de glicose, dissolver em água destilada e completar o volume para
100 mL em um balão volumétrico.

6. Carboidratos
• Reativo Benedict
Pesar 17,3 g de sulfato de cobre (CuSO4 . 5H2O), 173 g de citrato de sódio (Na3C6H5O7), 100
g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3), dissolver em água destilada e completar o volume para
1000 mL em um balão volumétrico.
• Reativo Seliwanoff
Dissolver 0,5 g de resorcinol (C6H6O2) em 1000 mL de ácido clorídrico (HCl) 6M.
• Ácido clorídrico 6 M (utilizar banho de gelo)
 Adicionar aproximadamente 350 mL de água destilada em um balão volumétrico de
1000 mL e em banho de gelo adicionar 510 mL de ácido clorídrico (HCl) P.A
cuidadosamente e depois avolumar.
• Lugol (KI -I2)
Pesar 5 g de iodo (I2) e 10 g de iodeto de potássio (KI), dissolver em água destilada e
completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico.
• Reativo Barfoed Modificado:
Dissolver 48 g de acetato cúprico em 900 mL de água destilada quente, adicionar
lentamente 50 mL de ácido lático (C 3H6O3) 8,5%. Resfriar e completar o volume para 1000 mL
em um balão volumétrico. Filtrar se necessário.
• Reagente Fosfomolídico:
Dissolver 150 g de ácido molíbdico (H 2MoO4) e 75 g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3) em
500 mL de água destilada quente com agitação. Aquecer até ebulição. Filtrar.
Adicionar 300 mL de ácido fosfórico (H 3PO4) 85%. Completar o volume para 1000 mL em um
balão volumétrico.

7. Lipídios
Potassa alcoólica 40%
o Pesar 40g de hidróxido de potássio (KOH), dissolver em aproximadamente 50
mL de etanol e avolumar para uma proveta de 100mL com água.

8. Fermentação
• Carboidratos 20% (0,2 mg/mL)
Pesar 20 g do carboidrato (glicose, amido, sacarose, frutose ou dextrose),
dissolver em água destilada e completar o volume para 100 mL em um balão
volumétrico.