Hemoglobinúria

Paroxística Noturna

Daniella Gregolin Marrese

daniellagmarrese@gmail.com
 Hemoglobinúria Paroxística Noturna
(HPN) - Fisiopatologia
• HPN é causada pela expansão clonal não-maligna de
uma ou mais células-tronco hematopoéticas que
adquiriram mutação(ões) somática(s) no gene da
fosfaditilinositolglicana classe-A (phosphatidyl
inositol glycan-class A, PIG-A), localizado no
cromossomo X.

• Estas mutações resultam no bloqueio precoce da

síntese de âncoras de glicosil-fosfaditilinositol (GPI),
responsáveis por manter aderidas
à membrana plasmática dezenas
de proteínas com funções específicas.
Hemoglobinúria Paroxística Noturna
(HPN) - Fisiopatologia
• A falência em sintetizar uma molécula madura
de GPI gera ausência de todas as proteínas de
superfície normalmente ancoradas por ela.
• Consequentemente, as células sanguíneas
advindas do clone HPN têm algum grau de
deficiência destas proteínas, que pode ser
parcial (células HPN tipo II, com cerca de 10% da
expressão normal) ou total (células HPN tipo III,
com ausência completa da proteína)
Hemoglobinúria Paroxística Noturna
(HPN) - Fisiopatologia
HPN - Fisiopatologia
- Dentro destas proteínas encontram- se:
o inibidor de lise reativa da membrana MIRL
(CD59)
fator acelerador da degradação do complemento
DAF (CD55)

Uma vez que a célula tronco hematopoiética

adquira uma das centenas de mutações no gene
PIG-A, todas as células daquele clone serão
deficientes em proteínas ancoradas pela GPI
HPN - Fisiopatologia
INIBIDORES FISIOLÓGICOS DA ATIVAÇÃO DO
COMPLEMENTO

• As hemácias são mais sensíveis a ação lítica,

produzindo hemólise e ativação plaquetária
entre outros efeitos
HPN - Fisiopatologia
• O sistema complemento consiste em mais de 20
proteínas séricas que interagem em sequências
precisas de ativação enzimática e ligação à
membrana celular, gerando produtos com
propriedades imunoprotetoras, imunorregulatórias,
pró-inflamatórias e citolíticas. Pode ser ativado por
três vias: via clássica, via da lecitina e via
alternativa.
• Células HPN são vulneráveis à ativação do
complemento por qualquer das três vias; como a
via alternativa mantém um estado de ativação
baixa, porém contínua, isto explica porque os
pacientes com HPN têm hemólise crônica contínua.
HPN - Fisiopatologia
• A ausência de CD59 na superfície dos
eritrócitos os torna susceptíveis à lise
mediada pelo complexo de complemento
terminal, o que explica a hemólise
intravascular crônica com exacerbações,
manifestação clínica primária da doença.

Das duas proteínas, CD59 é a mais importante

na proteção contra lise celular mediada por
complemento.
HPN - Fisiopatologia
• O óxido nítrico (NO) é o maior regulador da fisiologia
vascular, e muitas das manifestações clínicas da HPN são
facilmente explicadas pela depleção tecidual de NO.
Normalmente, a óxido nítrico sintetase do endotélio utiliza
oxigênio e arginina para produzir NO. Este age na parede
vascular para manter tônus e limitar ativação plaquetária.
Hemoglobina livre tem enorme afinidade pelo NO e o retira
de circulação.
• Na HPN, a falência em regular o complemento na superfície
eritrocítica leva à ampla hemólise intravascular, com
liberação de grandes quantidades de hemoglobina livre e
arginase eritrocitária no plasma, que depletam o NO e
também a arginina, substrato para a sua síntese.
HPN - Fisiopatologia
• Depleção tecidual de NO se manifesta clinicamente
como astenia, dor abdominal, espasmo esofagiano,
disfagia, impotência sexual masculina e possivelmente
trombose. Todas estas manifestações clínicas são mais
comuns no paciente com grandes populações de clone
HPN. Em contraste com o conhecimento abundante em
relação à hemólise, pouco se sabe sobre o mecanismo
fisiopatológico da trombofilia. Apesar de o mecanismo
não estar completamente esclarecido, hemólise foi
implicada na inicialização de ativação e agregação
plaquetárias.
HPN - Fisiopatologia
• A ativação do complemento induz alteração das
membranas de eritrócitos com formação de
microvesículas, o que potencialmente contribui para a
trombogênese. A ausência de proteínas normalmente
ancoradas pela GPI também pode contribuir para o
aumento de incidência de trombose.
• Na HPN, a hematopoese ineficaz é secundária à redução
da produção de células sanguíneas por hipoplasia
medular. Sabe-se que estes pacientes estão sob risco
aumentado de desenvolverem anemia aplásica, e
porcentagem significativa dos pacientes com diagnóstico
estabelecido de anemia aplásica podem ser portadores
de clones de HPN sem manifestações clínicas.
HPN - Fisiopatologia
• Anemia aplásica é considerada doença imunomediada,
com destruição ativa das células-tronco
hematopoéticas por linfócitos T autorreativos. Existe
evidência experimental que células deficientes de
proteínas ancoradas pela GPI sejam mais resistentes ao
ataque de células NK e linfócitos T, o que daria ao clone
HPN uma vantagem adaptativa, num contexto de
destruição imunomediada de células-tronco normais.
• A relação fisiopatológica definitiva entre estas duas
doenças ainda não está bem determinada, mas
acredita-se que os processos envolvidos no
desenvolvimento de ambas as doenças sejam
semelhante
HPN - Histórico
• Relatos em 1793, porém a descrição da doença como síndrome
clínica foi feita apenas em 1882 por Paul Strubing.
• O epônimo síndrome de MarchiafavaMicheli caiu em desuso pelo
relato tardio e pequena contribuição destes autores para o
entendimento da doença.
• O termo hemoglobinúria paroxística noturna refere-se à descrição
de destruição de eritrócitos com liberação de hemoglobina na
urina, notada principalmente por coloração marrom-escura na
primeira urina da manhã.
• O termo “noturna” se refere à crença inicial de que a hemólise seria
desencadeada por acidose durante o sono; esta ativaria o
complemento, que destruiria eritrócitos com membrana celular
desprotegida. Sabe-se hoje que a hemólise acontece durante todo
o dia, mas a observação de hemoglobinúria ocorre pela manhã por
causa do aumento da concentração urinária durante a noite.
HPN – Incidência
• Qualquer idade

• Sua incidência não é totalmente conhecida, não só pela sua

raridade como pela dificuldade diagnóstica que ela impõe

• Maior incidência na terceira década de vida

• Prevalência de 2 a 6 por milhão

• Proporção entre gêneros: aproximadamente 50%

• Taxa de mortalidade pode atingir 35% cinco anos após o

diagnóstico
HPN - Clínica
Caracteriza-se por:
• Hemólise intravascular
• Citopenias no sangue periférico (tendência a
anemia e trombose)
• Insuficiência medular
• Órgãos implicados: fígado, rim, SNC, pulmão e
ou coração
HPN - Clínica
• Consequência direta da hemólise e sequestro
de óxido nítrico pela hemoglobina livre
intravascular.
• Depleção de óxido nítrico produz:
- Vasoconstrição periférica
- Disfagia, disfuncão erétil, dores abdominais,
dor toráxica e frequentemente astenia profunda
HPN - Clínica
Trombose – principal causa de morte

Principalmente venosas

- Hipertensão pulmonar

- Insuficiência renal crônica

HPN - Classificação
Esquema que considera as circunstâncias clínicas
em que o clone da HPN é identificado, proposto
pelo International PNH Interest Group:

3) HPN Clássica – grandes clones e hemólise

intravascular

2) HPN na situação de outra desordem medular

(Anemia Aplásica ou SMD)

1) HPN subclínica – pequenos clones são

detectados na ausência de hemólise
HPN - Diagnóstico
• Classicamente ensaio de lise com soro
acidificado – ativação do complemento (Teste
de Ham)

• Teste da sensibilidade à lise por complemento

• Gold Standard – Citometria de fluxo

HPN - Diagnóstico
• A citometria de fluxo avalia a expressão de proteínas
ancoradas pela GPI com alta sensibilidade e especificidade

• Recomendável utilizar pelo menos dois anticorpos

monoclonais, direcionadas contra duas proteínas ancoradas
pela GPI diferentes, em pelo menos duas linhagens celulares

• Transfusões recentes não alteram o diagnóstico, tendo em

vista que podem ser avaliados granulócitos e monócitos,
células que não têm sua meia-vida alterada por transfusões
ou pela presença da mutação

• A porcentagem de células com deficiência de proteínas GPI-

ancoradas é reflexo direto do tamanho do clone HPN
HPN – Citometria de fluxo
A seleção de antígenos relevantes que são avaliados e
as células em que estão expressos, estão representados
na tabela:
HPN – Citometria de fluxo
• A abordagem inicial na citometria foi através
da avaliação de CD55 e CD59 devido serem os
primeiros antígenos reportados por ser
regularmente perdidos nas células vermelhas,
leucócitos e plaquetas nos pacientes HPN
• Com o contínuo desenvolvimentos de novos
anticorpos monoclonais um espectro de
outros epítopos ligados a GPI podem agora ser
analisados
HPN – Citometria de fluxo
- Novo método - aerolisina fluorescente (FLAER) - proteína
derivada de toxinas bacterianas que se liga diretamente à
âncora de GPI, mas não às proteínas ligadas à membrana
celular por essa âncora, como ocorre com outros reagentes
usados no diagnóstico da HPN.
- Possível identificar até uma célula derivada de um clone
HPN, dentre 10.000 células normais, enquanto os testes
convencionais, com anticorpos monoclonais apenas para os
antígenos CD55 e CD59, têm um limite de sensibilidade de, no
máximo, 1%.
- Permite o diagnóstico de pequenos clones HPN em outras
síndromes de falência medular em que a presença desses
clones pode ter significado clínico, como ocorre na SMD
hipoplástica e na anemia aplásica.
HPN – Citometria de fluxo
• Indicações para o screening

1)Hemólise intravascular com hemoglobinúria

2)Trombose envolvendo locais atípicos:
a) Veias esplênicas, hepáticas, portais
b) Veias dérmicas
c) Veias cerebrais
3)Deficiência medular com:
a) Hipoplasia medular
b) Displasia unilinhagem
c) Citopenias periféricas sem causa aparente
HPN – Citometria de fluxo
• O sangue periférico é o material mais apropriado
para o diagnóstico de HPN por ser facilmente
obtido, proporcionando um número de tipos de
células para análise
• Na medula a maturação dependente da
expressão de antígenos, particularmente CD16 e
CD15, pode prejudicar a análise do clone
• A expressão de CD55 parece aumentar
sequencialmente com a maturaçao na medula de
precursores mielóides.
HPN – Citometria de fluxo
• Material para análise: sangue periférico fresco.
Coletado em até 48 horas (EDTA)
• Adquirir pelo menos 50.000 eventos em cada
linhagem. Nos casos de pequenos clones, adquirir
a maior quantidade de eventos possível
• Marcação sugerida:
• Tubo de hemácias: CD55 e CD59
• Tubo de granulócitos: FLAER, CD33, CD15, CD45,
CD61, CD24, CD14
HPN – Citometria de fluxo
- Análise da população de eritrócitos
As hemácias são facilmente avaliadas e os
antígenos frequentemente estudados são CD55
e CD59.
As células podem apresentar expressão normal
(tipo I), deficiência parcial (tipo II) ou deficiência
completa (tipo III)
HPN – Citometria de fluxo
HPN – Citometria de fluxo
HPN – Citometria de fluxo
• A proporção relativa de cada população
deficiente pode ser quantificada – relevância para
as características representadas e para potenciais
consequências clínicas futuras da doença para o
paciente.
• Todos os pacientes com HPN hemolítica
apresentam o tipo III.
• Pacientes HPN hipoplásticos são mais suscetíveis
para apresentar populações pequenas tipo III e
são muito menos inclinados para hemólise.
HPN – Citometria de fluxo
• O tipo II apresenta alguma preservação de CD55
e CD59, e a hemólise, se presente, tende ser
amena.
• O risco de complicações trombóticas está
relacionada ao tamanho do clone. Para cada 10%
de alteração no tamanho total do clone, o risco
de trombose aumenta por um ratio de 1.64,
sendo a trombose a maior causa de morte por
HPN.
HPN – Citometria de fluxo
HPN – Citometria de fluxo
• O tamanho da população anormal de
hemácias, é sempre menor que o
quantificado nos granulócitos na HPN
hemolítica devido a perda preferencial das
hemácias suscetíveis através da hemólise
mediada pelo complemento.
• A diferença nas populações deficientes
quando comparadas hemácias e granulócitos
pode ser de mais de 3 vezes.
HPN – Citometria de fluxo
- Análise da população de granulócitos:
Assim como na série vermelha, é recomendado
que a deficiência de mais de um antígeno seja
demonstrada.
Os granulócitos podem ser selecionados usando
a estratégia FSC/SSC ou CD15, CD33 ou CD45
versus SSC, por exemplo, previamente para
analisar a potencial deficiência antigênica.
HPN – Citometria de fluxo
HPN – Citometria de fluxo
HPN – Citometria de fluxo
• É importante não usar um antígeno que seja
ligado a GPI no gate de seleção dos
neutrófilos.
• Atenção aos neutrófilos hipogranulares que
podem ser encontrados na SMD.
• CD16, CD24, CD55, CD59 e CD66 são
apropriados para o screening de HPN nos
granulócitos.
HPN – Citometria de fluxo
• O uso combinado de FLAER com CD16, CD24
ou CD66 também é muito indicado que
produz tipicamente uma população
homogênea e definida, permitindo uma
maior acurácia na quantificação do clone
HPN – Citometria de fluxo
HPN – Citometria de fluxo
HPN – Citometria de fluxo
- Análise da população de monócitos:
Menos frequente no screening de HPN (análise de
neutrófilos.)
Os monócitos podem ser selecionados usando a
estratégia CD33, CD64, ou CD4 versus SSC. O CD14 não
pode ser usado para definir linhagem por ser ligado a GPI,
mas fornece boa discriminação do clone HPN, uma vez
que os monócitos sejam bem selecionados.
Uma combinação de CD45, CD33, CD24 e FLAER permite
um screening simultâneo do sangue periférico de
granulócitos e monócitos em um tubo
HPN – Citometria de fluxo
- Os monócitos devem ser a opção de célula no
screening nas circunstâncias:
• Pacientes com severa neutropenia
• Eosinofilia relativa (CD13+CD16-)
• Desvio a esquerda (CD13+CD16fraco)
HPN – Citometria de fluxo
- Análise da população de linfócitos:
A análise de linfócitos e células NK não é
rotineiramente recomendada. Linfócitos são células
com maior sobrevida e em pacientes que adquirem
o clone HPN, isto pode levar um tempo para chegar
a ser evidente na população linfocitária.
O clone pode ainda ser detectado em linfócitos
após remissão da doença e quando o clone de
granulócitos não esta mais presente
HPN – Citometria de fluxo
- Análise da população de plaquetas:
Como a trombose é a maior característica da
HPN, a análise de plaquetas é indicada.
O clone HPN tem sido identificado nas plaquetas
e seu tamanho parece estar correlacionado com
os granulócitos, mas as plaquetas são difíceis de
manipular quando comparadas aos leucócitos
ou eritrócitos e atualmente não fornece
nenhum diagnóstico adicional.
HPN e SMD
• O clone da HPN não é infrequente em
pacientes com insuficiência medular devido a
SMD e pode ser encontrado em até 18% dos
casos.
• Tal como na Anemia aplásica, eles podem
prosperar devido a carência da imuno
vigilância em um ambiente medular
ineficiente
 HPN e SMD
Este exemplo mostra um
pequeno clone HPN
Identificado em um
paciente com SMD com
tranfusão
de plaquetas.
HPN e SMD
• Estudos evidenciam que pacientes com o clone HPN
parecem ter uma doença com um comportamento
mais favorável em termos do subtipo de SMD (todos
com anemia refratária), risco de progressão para
leucemia aguda, prevalência de anormalidades
citogenéticas e resposta a ciclosporina.
• Outros estudos encontraram populações de HPN em
um grupo mais favorável de pacientes com Anemia
refratária, mas destacaram as dificuldades técnicas
devido a intrínsica alteração na expressão antigênica na
SMD e a hipo-granulação neutrofílica influenciando a
acurácia da seleção das populações, dificultando a
interpretação.
HPN - Tratamento
- Ferro - perda constante de ferro na urina
(hemossiderinúria e hemoglobinúria). Assim,
muitas vezes é necessária a reposição deste
elemento, já que a deficiência de ferro limita a
eritropoese
- Folato - que são espoliados pela eritropoese
aumentada secundária à hemólise crônica. A
associação entre hemólise contínua e hematopoese
ineficaz pode levar à dependência transfusional.
HPN - Tratamento
- Anticoagulação - indicada profilaticamente para
pacientes com grandes clones e outros fatores de
risco para complicações trombóticas. Por outro
lado, pacientes que já apresentaram um evento
tromboembólico deverão ser anticoagulados por
toda a vida
- Transplante de medula ou tratamento
imunossupressor - Em pacientes com anemia
aplásica grave e sintomas mais relacionados a esta
doença que à própria HPN
HPN - Tratamento
- O único tratamento curativo para HPN é o
transplante de medula, porém este está
associado a morbimortalidade considerável
- Atualmente indica-se transplante apenas
para os pacientes com fatores de risco para
pior evolução de doença e morte,
especialmente nos casos de síndromes de
falência medular com citopenias graves
HPN - Tratamento
- Eculizumab - Trata-se de um anticorpo
monoclonal humanizado que bloqueia a
ativação do complemento terminal no nível C5 e
previne a formação de C5a e o complexo de
ataque à membrana C5.
HPN - Considerações finais
• Apesar da alta sensibilidade e especificidade da
citometria de fluxo no diagnóstico da HPN, e da
disponibilidade de novos anticorpos, existe ainda
a necessidade de um consenso para uma melhor
abordagem
• O guideline de Borowitz tenha clarificado
algumas situações, não existe um consenso real
sobre o que constitui um clone significante,
embora a maioria concorde que 1% seria um
cutoff razoável
HPN - Considerações finais
• A alta sensibilidade dos protocolos de citometria
para o clone HPN estão ainda em
desenvolvimento, sendo ainda necessário
estabelecer a exata significância de um valor
mínimo para as populações encontradas
• A padronização da metodologia é de extrema
importância uma vez que a HPN é uma doença
rara e a quantificação do tamanho e a natureza
do clone tem considerável impacto clínico
HPN - Considerações finais
Tendo em vista os avanços recentes no entendimento da
doença, sua alta morbimortalidade e a disponibilidade de
tratamentos eficazes, inclusive com potencial de cura, é
fundamental que os médicos pensem neste diagnóstico
Pacientes que devem ser submetidos à pesquisa para
HPN:
• anemia hemolítica adquirida
• Coombs-negativo
• tromboses inexplicadas especialmente em sítios pouco
comuns
• citopenias e síndromes de falência medular, disfagia,
odinofagia, dores abdominais e impotência sexual
masculina sem causa aparente
Obrigada!