Departamento de Engenharia de Materiais e de Bioprocessos

EQ 883
Cinética das reações celulares
PARTE 2

Profa. Dra. Lucimara Gaziola de la Torre

Abril de 2020

EFEITO DAS CONDIÇÕES AMBIENTAIS NI CRESCIMENTO CELULAR

Nesta etapa, será estudado o efeito de outros parâmetros além da concentração de substrato, no
crescimento celular e na síntese de produto.

Os principais parâmetros são:

- Temperatura (que afeta diretamente a cinética e morte celular);

- pH do meio de cultivo (que afeta as condições e as atividades de manutenção da célula para

manter-se viável;

- Oxigênio dissolvido – que afeta diretamente as células aeróbicas, facultativas e células animais.

Efeito das Condições Ambientais na Cinética do

Crescimento Microbiano

Fatores que podem afetar o crescimento microbiano:

- Temperatura

- pH
Para microrganismos
- Concentração de O2 dissolvido
aeróbios e facultativos

Exemplo de biorreator no qual estão instalados vários dispositivos de

monitoramento e controle das condições ambientais:
HyPerforma Single-Use Fermentor
https://www.youtube.com/watch?v=0K1fFaD8K8w

Para saber mais sobre biorreatores em escala piloto e seu sistema de monitoramento e controle de pH e
temperatura, acesse o link:

1
https://www.youtube.com/watch?v=0K1fFaD8K8w

EFEITO DA TEMPERATURA

Já é de conhecimento que cada tipo de célula possui uma temperatura ótima de crescimento.

Veja abaixo a classificação abaixo:

Efeito da Temperatura

Classificação dos organismos

de acordo com o ótimo de T

Grupo Mínimo Ótimo Máximo

Termófilos 40 a 45 C 55 a 75 C 60 a 80 C
Mesófilos 10 a 15 C 30 a 45 C 35 a 47 C
Psicrófilos - 5 a 5 C 15 a 18 C 19 a 22 C

Com a elevação de temperatura, dois fenômenos podem ocorrer simultaneamente: o

crescimento e morte celular. Por um lado, o aumento de temperatura em direção à temperatura ótima
favorece o crescimento e ultrapassando essa temperatura ótima, a morte celular pode começar a
prevalecer.
Identificar a condição de máximo crescimento é importante, mas da mesma forma que
apresentado para o caso das enzimas, o Tótimo está muito próximo do limite que a célula suporta até
que a morte celular prevaleça.
Compreender a cinética de morte celular permite estabelecer protocolos de esterilização,
importantes para serem executados com as matérias primas e também com os reatores e
equipamentos.
Para compreender esta cinética, podemos definir uma velocidade específica de crescimento
LÍQUIDA (µLIQ), que leva em consideração o crescimento (µ) e a morte celular (kd) (d – vem de “death”):

Dependendo dos limites de temperatura, um fenômeno prevalece frente ao outro.

Dependendo da condição estudada, como em casos de modelagem de biorreatores envolvendo células,
ambos os fenômenos precisam ser considerados e entram na equação de projeto.
Assim, a cinética de crescimento e morte celular deve ser conhecida.
Em um sistema operando em regime batelada, podemos expressar o aumento da concentração
biomassa (X) em função de µ e kd:

2
 Efeito da Temperatura

39
42 33
Com o aumento da temperatura
em direção à T ótima de
k (h-1)

37 23
21 crescimento, a taxa de
47
30 crescimento dobra para a
23
19
17
elevação de cada 10 C.
15
48
13,5

1000/T (K)

Acima da T ótima, a taxa de crescimento diminui e a

morte térmica pode ocorrer:

dX ( - k’d) X
dt X – células viáveis

Pode haver queda na

concentração de células viáveis
com o aumento da
temperatura

Além de expressar em concentração de biomassa (X), também podemos expressar em termos de

número de células:

(sempre certifique-se da consistência das unidades!!)

Em temperaturas muito elevadas: morte celular > crescimento.

Portanto há queda de concentração de células viáveis.

Tanto µ como kd possuem comportamento em função da temperatura que segue o modelo de

Arrenhius:

3
 Efeito da Temperatura

Muito acima da T ótima ocorre uma diminuição na

concentração de células viáveis

 e k variam com a T de acordo com a equação de Arrhenius:

 = A e-Ea/RT

k’d = A’ e-Ed/RT

Ea: energia de ativação para o crescimento (10 a 20 kcal/mol)

Ed: energia de ativação para a morte térmica (60 a 80 kcal/mol)

Morte térmica é mais sensível às mudanças de temperatura, pelo maior valore da energia de ativação.

A temperatura também afeta dos coeficientes de rendimento.

Em alguns casos, quanto maior a temperatura, maior ms (coeficiente específico de manutenção

referente ao consumo de substrato) (existe uma energia de ativação de aproximadamente 15-20
kcal/mol).

Efeito da Temperatura

A morte térmica é mais sensível à temperatura

que o crescimento celular

A temperatura ótima para o crescimento celular

pode não coincidir com a temperatura ótima
para a formação do produto

O efeito ta temperatura também pode ser notado na síntese de produtos. Como exemplo, pode-se citar
a síntese de vacina recombinante contra a raiva (identificada como rRVGP – o r minúsculo índica que é
uma proteína recombinante, isto é, produzida a partir de outra célula na qual seria norlmalmente
produzida):

4
 Efeito da Temperatura

rRVGP (ng/mL)
 A temperatura afetou
significativamente a
formação do produto

 rRVGP: recombinant
rabies virus glycoprotein

Viabilidade celular (%)

S2 (cel/mL)
Linha contínua

Linha tracejada
Biorreator Wave

Sistema de controle e
monitoramento
Tempo (h)

DECARLI et al. Drosophila S2 cell culture in a Wave bioreactor: potential for Plataforma de operação, bolsa
scaling up the production of the recombinant rabies virus glycoprotein. descartável e sensores de pH,
Applied Microbiology and Biotechnology. 2018 temperatura e oxigênio dissolvido

Neste exemplo, foi utilizado um reator do tipo “onda”, que é uma bolsa que fica em uma
plataforma oscilante, para favorecer a mistura. Foi utilzado célula de inseto (drosófila) modificada para a
expressão da proteína recombinante, que será o antígeno para ser utilizado como vacina (rRVGP).

Diferentes temperaturas foram testadas, podendo avaliar o perfil de concentração de células,

viabilidade celular e a formação da rRVGP. Se vocês observarem com critério, perceberão que para
temperatura de 28oC é evidente a diferença de expressão da rRVGP, chegando em níveis de
concentração maiores. Observe também que faixa de variação de temperatura não foi tão grande.

EFEITO DO pH

Efeito do pH

Valores de pH ótimo usuais:

Organismo Faixa de pH ótimo

Bactérias 3 a 8
Leveduras 3 a 6
Bolores 3 a 7
Células vegetais 5 a 6
Células animais 6,5 a 7,5

Faixa aceitável para variações de pH:

1 a 2 unidades acima ou abaixo do pH ótimo

O pH afeta diretamente a atividade enzimática e portanto afeta a taxa de crescimento celular.

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Muitos organismos possuem mecanismos para manter o pH intracelular em nível constante na presença
de flutuações do pH do meio. Quando o pH difere do pH ótimo, os custos energéticos para as atividades
de manutenção aumentam.

Quando a fonte de nitrogênio é amônia, ocorre liberação de H+ no meio e portanto há um abaixameno

do pH.

Quando nitrato é a fonte de nitrogênio, H+ é consumido do meio para reduzir o nitrato a amônia e,
portanto o pH aumenta.

CO2 também pode alterar o pH do meio.

Desta forma, torna-se necessário controlar o pH do meio, pela adição de tampão ou de sistemas de
controle.

Efeito do pH

Alguns organismos possuem meios de

manter o pH intracelular relativamente
constante quando o pH do ambiente flutua

Aumento na energia de manutenção requerida

O pH ótimo de crescimento pode diferir do pH

ótimo de formação do produto de interesse

EFEITO DO OXIGÊNIO

O oxigênio também é um substrato importante e deve sempre ser analisado com critério em cultivos
aeróbicos.

Existe uma demanda de oxigênio requisitada pelas células aeróbicas, traduzida na taxa de utilização de
oxigênio (OUR ou Qo). Esta taxa refere-se à velocidade de consumo de oxigênio realizada pelas células.

Por outro lado, o oxigênio deve ser suprido e uma taxa de transferência de oxigênio (OTR). Neste caso,
aspectos de transferência de massa são importantíssimos, pois a solubilidade do oxigênio em meio
líquido é baixíssima. Normalmente, os processos fermentativos ocorrem em batelada para a fase
líquida. Como a solubilidade de oxigênio é baixa na fase líquida, é impossível realizar um cultivo

6
totalmente em batelada para o oxigênio. Assim, gás é constantemente borbulhado na fase líquida, que
contém as células.

Observe que se o ar borbulhado no fermentador não estiver saturado com água, haverá alteração de
volume líquido no reator!!

Transferência de massa Demanda da célula

da fase gasosa para a (OUR)
fase líquida (OTR)

Fonte: https://www.gelifesciences.com/en/us/solutions/bioprocessing/knowledge-center/7-factors-that-
affect-oxygen-transfer-to-cells-in-bioreactors

Desta forma, se a transferência de massa, traduzida na taxa de suprimento (OTR) não for suficiente para
atender a demanda de consumo de oxigênio pelas células (OUR), haverá limitação no crescimento das
células aeróbicas. Neste caso, o oxigênio pode se tornar o substrato limitante, seguindo o mesmo
comportamento visto anteriormente para qualquer outro substrato.

Além disso, dependendo da fase de crescimento que as células se encontram, a demanda de oxigênio
muda. Veja a figura abaixo:

7
Fonte: https://www.gelifesciences.com/en/us/solutions/bioprocessing/knowledge-center/7-factors-that-
affect-oxygen-transfer-to-cells-in-bioreactors

Efeito da Concentração de O2 Dissolvido

Suprimento x Demanda de O2

OTR: Oxigen transfer rate

OUR: Oxigen utilization rate
https://www.gelifesciences.com/en/us/solution
s/bioprocessing/knowledge-center/7-factors-
that-affect-oxygen-transfer-to-cells-in-
bioreactors

Efeito no crescimento celular

Vamos fazer a análise em duas etapas: (i) demanda (OUR) e (ii) suprimento de oxigênio (OTR):

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Demanda de oxigênio pelas células (OUR ou ):

Diversos fatores influenciam na demanda de oxigênio: tipo de célula, fonte de carbono, fase de
crescimento.

Em cultura conduzida em batelada, o consumo de oxigênio pelas células não é constante e varia com o
tempo: o número de células e fase de cultivo. Normalmente a taxa de consumo de oxigênio alcança um
máximo nos estágios iniciais da fermentação quando a célula está na fase de crescimento exponencial.

Se o número de células aumenta ao longo de uma cultura em batelada  a demanda por O2 também
aumenta.

Desta forma, a taxa de consumo de oxigênio (Qo ou OUR) é proporcional ao número de células:

A taxa específica de consumo de oxigênio por célula como qo:

Esta definição também é válida para um sistema batelada:

X é a concentração de células (gramas céluals/ L)

Qo – taxa de consumo de oxigênio [ g de O2/L.s ]

qo – taxa específica de consumo de oxigênio [ g O2/g células.s ]

Outros exemplos de unidades destes parâmetros podem ser visualizados na figura abaixo:

Demanda de O2 no Caldo de Fermentação

Taxa de Consumo de Oxigênio (OUR):

X
OUR  q O2 X  (2)
YX/O 2

onde:
qO2 = taxa específica de consumo de O2 (mgO2/g peso seco células h)
YX/O2 = coeficiente de rendimento do O2 (gpeso seco células/g O2)
X = concentração de células (gpeso seco células/L)

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A escolha do substrato pode alterar a demanda de oxigênio. Um exemplo é o metabolismo da glicose.
Neste caso, como o metabolismo é mais rápido, há um maior consumo de O2 (maior taxa de consumo de
O2).

Podemos também definir a taxa de consumo de oxigênio a partir do conceito de rendimento:

Como mencionamos antes, o consumo de oxigênio depende da fase de crescimento em que as células
se encontram. Da mesma forma, pode-se avaliar a velocidade específica de consumo de oxigênio ao
longo do tempo de fermentação:

Variação da taxa específica de consumo de oxigênio (qo) e da biomassa

durante uma cultura em batelada

qo depende:
-da natureza bioquímica
do organismo
- do ambiente nutritivo
- da fase de crescimento
celular

Tipicamente a demanda específica de oxidegênio passa por um máximo

nas fase inicial do crescimento exponencial

Monitorar a taxa específica de consumo de oxigênio torna-se importante para estabelecer o tempo de
processo fermentativo crítico em que não pode haver falta no suprimento de oxigênio (isso irá
determinar aspectos de engenharia do biorreator).

Como mencionado anteriormente, o oxigênio disponível pode se tornar o substrato limitante caso o
fornecimento de O2 não seja apropriado. Assim, pode-se identificar a concentração crítica de oxigênio
dissolvido, onde para concentrações maiores não há limitação de crescimento. Observe a figura abaixo:

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 O que ocorre se o nível de oxigênio dissolvido cai para um
limite crítico?

O2 torna-se um fator limitante

Acima da CO2 crítica:crescimento
qo
é independente da CAL

É dependente
-Região crítica onde há limitação de O2 Nesta
do tipo de
- Dependência aproximadamente linear situação o
células com a concetração de O2 (cinética 1a ordem)
oxigênio se
torna o
CO2 crítica Concentração de oxigênio dissolvido, CAL
substrato
O que fazer para para eliminar as limitações de oxigênio? limitante

O que ocorre se o nível de oxigênio dissolvido cai abaixo da concentração crítica (CO2critica)?
(pense antes de continuar a ler)
Haverá limitação no aumento do número de células (crescimento celular).

O que fazer para eliminar as limitações de oxigênio?

(pense antes de continuar a ler)
Resposta:
Manter a concentração de O2 sempre acima da concentração crítica.

O valor exato de Ccrítico é específico para cada tipo de organismo e das condições ambientais e nutricionai
(em média é 5 a 10% da concentração de saturação).

Sob o ponto de vista dos requisitos da célula, a demanda de oxigênio depende de fatores como:

- tipo de célula;

- fase do cultivo celular;

- natureza da fonte de carbono utilizada.

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 Fatores que afetam a demanda de oxigênio

A taxa de consumo de oxigênio pelas células determina a

taxa na qual o O2 deve ser transferido do gás para o líquido

Fatores que influenciam a demanda de oxigênio:

- Tipo de célula e de metabolismo celular

- Fase na qual a célula se encontra
- Natureza da fonte de carbono no meio de cultura

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Suprimento de oxigênio para as células:

A análise do suprimento de oxigênio está associada ao conceito de transferência de massa entre fases. O
suprimento de oxigênio ocorre normalmente pelo borbulhamento de ar no caldo de fermentação
(normalmente pelo fundo do biorreator). A partir daí, enquanto a bolha de ar atravessa o meio de
fermentação estará ocorrendo transferência de massa da fase gasosa para a fase líquida. Somente
oxigênio dissolvido na fase líquida estará disponível para as células.

Como a solubilidade do oxigênio é baixa na fase líquida, a taxa de transferência de massa pode se tornar
um fator limitante. Esta baixa solubilidade indica que a força motriz para a transferência de massa é
baixa:

(Lembre-se que é a maior concentração de O2 no meio líquido – concentração de saturação)

Efeito da Concentração de O2 Dissolvido

C*AL ou [O.D.]saturação à 25 C e 1 atm
em água  7 ppm
soluções aquosas  10 ppm

Culturas aeróbicas consomem rapidamente o O2

Necessidade de suprir O2 constantemente  Borbulhamento de ar

ar enriquecido com O2

(C*AL - CAL)  diferença é sempre muito pequena

Necessidade de projeto de biorreatores que considerem condições

ótimas de TM

Relembrando o conceito de transferência de massa entre fases, existem diversas etapas que são
resistências. Veja os slides abaixo:

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 Efeito da Concentração de O2 Dissolvido
• Processo de transferência de massa entre a fase gasosa e a
célula dispersa no meio de cultura

Películas estagnadas Reação bioquímica

3 8
bolha 1 4 6
7
de gás célula
5
2
Interface gás-líquido

• Aspectos de transferência de massa (TM) devem ser

levados em consideração!!!
• Limitações de TM devem ser eliminadas para evitar que
o O2 não seja o substrato limitante

 À medida que aumenta a distância entre os reagentes e sítios das reações, a TM ganha maior
influência e controla a taxa de conversão.
 Se a TM de oxigênio é lenta, a taxa de metabolismo celular (demanda de oxigênio pelas células)
se torna dependente da taxa de fornecimento de O2 da fase gasosa  limitação da taxa de
conversão biológica, isto é, pode limitar o crescimento.
 O2 é um componente crítico para a fermentação aeróbia, pois sua solubilidade parcial na água
torna-se um limitante Necessidade de se estudar a TM de O2 através das interfaces gás-
líquido.

Resistências associadas à dissolução e ao consumo de O 2

Películas estagnadas Reação bioquímica

3 8
bolha 1 4 6
7
de gás célula
5
2
Interface gás-líquido

Transferência de O2:

1. Película gasosa estagnada

2. Resistência na interface gás-líquido
3. Película líquida estagnada ao redor da bolha de gás (dominante)
4. Resistência à difusão do O2 até as células

Consumo de O2:
5. Película líquida em torno da célula
6. Resistência imposta pela membrana celular
7. Resistência à difusão do O2 no citoplasma
8. Velocidade de consumo de O2 (dominante)

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Revisão de TM entre fases (considerando interfaces):

são exemplos
gmol A/m3s de unidades
m/s m2/m3 mol/m3 típicas

NA= taxa volumétrica de TM do componente A (gmol A/m3s)

k= coeficiente convectivo de TM (m/s)

a= área disponível para TM/volume (m2/m3)

CA0= Concentração de A no seio da solução (bulk) (mol/m3)

CAi= Concentração de A na interface (mol/m3)

Podemos também escrever:

Onde Rm é a resistência à TM

k  reflete a contribuição de TM de todos os processos no sistema (que afetam a camada limite). Este
parâmetro depende da geometria, fluxos e propriedades dos fluidos. Deve ser medido
experimentalmente!

Conceitualmente a transferência de massa entre fases é exemplificada através da seguinte figura:

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 TRANSERÊNCIA DE MASSA GÁS – LÍQUIDO

Transferência de Massa Gás-Líquido

Sentido da TM de O2
Fase gasosa Filme gasoso Filme líquido Fase líquida
homogênea estagnado estagnado homogênea

CAG
CAGi

CALi
Fronteira entre
as fases CAL

Filme que causa Filme que causa

resistência na fase gás resistência na fase líquida
CAG: concentração de O2 na fase gasosa CAL: concentração de O2 na fase líquida
CAGi: concentração de O2 na interface CALi: concentração de O2 na interface

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RESUMO DOS PRINCIPAIS ASPECTOS DE TRANSFERÊNICA DE MASSA ENTRE FASES:

17
18
19
RELAÇÃO ENTRE OS COEFICIENTES LOCAIS E GLOBAIS DE TRANSFERÊNCIA DE MASSA:

Fazendo A=O2

Transferência de massa G L

Assumindo que A é transferido da fase gás para a fase líquida – sem acúmulo – o que sai de uma fase
entra para a outra:

Onde

NA = Taxa de transferência de massa do componente A

kG= Coeficiente de TM de A na fase gás

kL= Coeficiente de TM de A na fase líquida

a = área de transferência de massa (interface)

Temos que elimimar CALi e CAGi da equação.

Considerando o equilíbrio na interface (soluções diluídas – não há resistência à TM na interface):

ou

m = fator de distribuição (ou coeficiente de partição)

As equações podem ser trabalhadas para obter:

Podemos definir o coeficiente global de TM na fase gasosa:

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Portanto a taxa de TM pode ser expressa :

Importante:

mCAL =C*AG  C*AG é a concentração de A na fase gasosa em equilíbrio com o CAL

 C*AL é a concentração de A na fase líquida em equilíbrio com o CAG (É A PRÓPRIA

CONCENTRAÇÃO DE SATURAÇÃO)

Considerando que o O2 (A) é pouco solúvel na fase líquida  A resistência a TM nesta fase é a limitante:

Portanto:

Esta equação pode ser utilizada para obtenção da taxa de transferência de oxigênio o gás para o
líquido!!

C*AL

o é a concentração de oxigênio no caldo de fermentação em equilíbrio com a fase gasosa

o é conhecido como SOLUBILIDADE DO OXIGÊNIO NO CALDO.
o É a concentração máxima concentração de O2 possível no caldo de fermentação.

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(C*AL – CAL) :

 é a força motriz para a transferência de oxigênio

 diferença entre o máximo possível e a concentração de oxigênio atual.

a (área interfacial/volume)

 difícil de ser obtida experimentalmente

Suprimento de O2 no Caldo de Fermentação

Taxa de transferência de O2 do gás para a fase líquida:

NA = kL a (C*AL – CAL)

Força motriz para TM

onde:

kL = coeficiente de transferência de O2 da fase líquida (cm/h)

a = área interfacial gás-líquido (cm2/cm3) Alterando-se o diâmetro da bo-

lha, altera-se a área interfacial
C*AL = [O.D.]saturação ou conc. em equilíbrio com o gás (mg/mL)

CAL = concentração de O2 no meio (mg/mL)

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