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COMO AS METODOLOGIAS DE ANÁLISE

GENÉTICA PODEM SER UTILIZADAS PARA A
CONSERVAÇÃO?

UTILIZAÇÃO DOS MARCADORES

GENÉTICOS II 1. Caracterização dos padrões de variabilidade genética
encontrados nas espécies

Compreensão dos processos ecológicos e biogeográficos

Disciplina: envolvidos na origem e manutenção da biodiversidade como
Fundamentos de Genética da Conservação Animal um todo
Prof. Fernando P. Rodrigues

COMO AS METODOLOGIAS DE ANÁLISE

GENÉTICA PODEM SER UTILIZADAS PARA A
Como avaliar a diversidade genética?
CONSERVAÇÃO?

2. Desenvolvimento de ferramentas que auxiliem a conservação Cromossomos

das espécies
Proteínas

DNA
O que conservar?
Onde focar os esforços de conservação?
Como manejar as populações?

NAS AULAS ANTERIORES... IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE

CERVÍDEOS
Grupo Nupecce – Unesp - Jaboticabal

Como avaliar a diversidade genética? Sub-família Odocoileinae

n  Odocoileus
Cromossomos n  Blastocerus
n  Ozotoceros
Proteínas n  Mazama
n  M. gouazoubira
DNA n  M. nemorivaga
n  M. americana
n  M. nana
n  M. bororo

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CLASSIFICAÇÃO POR COMPARAÇÃO CARIOTÍPICA

Mazama gouazoubira Mazama americana

Mazama gouazoubira Mazama americana (2n = 54)
(2n = 70)

Mazama nana
Mazama nana (2n = 40)

Distribuição hipotética de M. americana

M. americana (citótipo Paraná) M. americana (citótipo Rondônia)

(2n = 54) (2n = 42)

M. americana (citótipo Acre) M. americana (citótipo alto Rio Negro)

(2n = 52) (2n = 44)

Descrição de nova espécie: Mazama bororo NAS AULAS ANTERIORES...

Grupo Nupecce – Unesp - Jaboticabal

Como avaliar a diversidade genética?

Cromossomos

Proteínas

DNA

Mazama americana Mazama bororo

(2n = 54) (2n = 34)

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NAS AULAS ANTERIORES... NAS AULAS ANTERIORES...

● Ferramentas utilizadas na prospecção de marcadores moleculares ● Ferramentas utilizadas na prospecção de marcadores moleculares

● Eletroforese ● Eletroforese
● Enzimas de Restrição ● Enzimas de Restrição
● Clonagem ● Clonagem
● PCR ● PCR
● Sequenciamento do DNA ● Sequenciamento do DNA

● Marcadores Moleculares ● Marcadores Moleculares

● Isoenzimas ● Isoenzimas
● RFLP ● RFLP
● Minissatélites ● Minissatélites
● RAPD ● RAPD
● Microssatélites ● Microssatélites
● PCR – RFLP ● PCR – RFLP
● Dados de Seqüência (SNPs) ● Dados de Seqüência (SNPs)

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Etapas da PCR

→ Desenvolvido por Kary Mullis em 1985

→ Permite a obtenção in vitro de milhares de cópias de uma seqüência específica ↑ T (94º C) 1ª Etapa: Desnaturação
do DNA

Reagentes para PCR:

DNA
↓ T (50 - 60º C) 2ª Etapa: Anelamento dos primers
dGTP
dATP
dCTP
dTTP

primers ↑ T (72º C)
3ª Etapa: Extensão
MgCl2
Máquina de PCR
Taq DNA polimerase (Termociclador)

Repetição do ciclo Visualização do produto da PCR

↑ T (94º C)

↓ T (50 - 60º C) Ciclos Cópias

1 2
2 4
4 16
10 1.024
↑ T (72º C)
15 32.768
20 1.048.576
25 33.554.432
1.073.741.82
30
4

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Utilização da PCR para a sexagem de aves Utilização da PCR para a sexagem de aves

ZZ ZW

P2 P8
CHD -Z
Z
W
CHD - W

PCR

Resultado da sexagem realizada em nossa Utilização da PCR para a sexagem de mamíferos

aula prática

Clyomys bishopi

NAS AULAS ANTERIORES... POLIMORFISMO DE DNA AMPLIFICADO AO ACASO - RAPD

● Ferramentas utilizadas na prospecção de marcadores moleculares

● Eletroforese
● Enzimas de Restrição
● Clonagem
● PCR
● Sequenciamento do DNA

● Marcadores Moleculares

● Isoenzimas
● RFLP
● Minissatélites
● RAPD
● Microssatélites
● PCR – RFLP
● Dados de Seqüência (SNPs)

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POLIMORFISMO DE DNA AMPLIFICADO AO ACASO - RAPD ENSAIO RAPD

n  Triagem e seleção dos primers
● Vantagens

Custo: baixo OPB - 19 OPB - 20

Utiliza primers arbitrários
Utiliza quantidades mínimas de DNA

● Desvantagens

Baixa repetibilidade
Dominantes

ENSAIO RAPD ENSAIO RAPD

n  Triagem e seleção dos primers n  Triagem e seleção dos primers
n  Utilização dos primers selecionados no total n  Utilização dos primers selecionados no total
de amostras de amostras
OPB - 20 OPB - 08

ENSAIO RAPD ENSAIO RAPD

n  Triagem e seleção dos primers
n  Utilização dos primers selecionados no total
de amostras
n  Separação dos produtos de amplificação
n  Triagem e seleção dos primers
n  Utilização dos primers selecionados no total
de amostras
n  Separação dos produtos de amplificação
n  Visualização e registro fotográfico do gel de
eletroforese

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ANÁLISE DOS DADOS RAPD Análise da diversidade genética de Ozotoceros

bezoarticus através da utilização de marcadores
RAPD

Distribuição original do Veado-Campeiro, Distribuição atual do Veado-campeiro no Brasil

segundo Ribeiro (1919)

CAPTURA

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Resultados obtidos na triagem dos primers

Kit Nº de primers Nº de primers Nº de primers Total Número total de bandas analisadas:
polimórficos monomórficos sem amplificação 160 ( 10,66 bandas/primer)

B 06 12 02 20
J 03 12 05 20
Número de bandas monomórficas:
K 08 11 01 20 55 (3,66 bandas/primer)

M 11 07 02 20 Números de bandas polimórficas:

Total 28 42 10 80 105 (7,0 bandas/primer)

Número de primers utilizados na análise = 15

Rodrigues et al. (2007)

Diversidade e Estrutura Genética em O. bezoarticus

(Análise RAPD)

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Rodrigues et al. (2007)

Marcadores exclusivos de uma população, mas não

Estrutura genética de fixados:
O. bezoarticus

PNE = 08
Pantanal = 03
(Análise de agrupamento realizada
utilizando-se o método de neighbor-joining)

Marcadores fixados na população, mas não

exclusivos:

PNE = 08
Pantanal = 11

Estrutura genética de Mimagoniates microlepis NAS AULAS ANTERIORES...

● Ferramentas utilizadas na prospecção de marcadores moleculares
AGU

● Eletroforese
● Enzimas de Restrição
PEQ ● Clonagem
● PCR
PIR ● Sequenciamento do DNA
VAR

MER
● Marcadores Moleculares

● Isoenzimas
ACA ● RFLP
● Minissatélites
● RAPD
CAE ITA ● Microssatélites
RIB
● PCR – RFLP
● Dados de Seqüência (SNPs)
MON

MINISSATÉLITES = CTAGCAAATTCATTACA

Sítio de
A1 Restrição
1
A1
Blocos de Seqüências Repetitivas (10 a 100 bp)
1 2 3
A1
2 A1/A1 A1
A2
Jeffreys, 1985 A2 A2

Individualização Humana por DNA (“Fingerprinting”) A3

A2
3
A3

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MINISSATÉLITES MINISSATÉLITES

● Vantagens

Alta variabilidade.
Não é necessário conhecimento prévio
da seqüência de DNA da espécie estudada.

● Desvantagens

Os locos não podem ser identificados.

Dominante.
Requer grande quantidade de DNA.

Avaliação da variabilidade genética de psitacídeos C. spixii: Variabilidade genética

através da análise do DNA fingerprinting

Espécie IUCN CBC

C. spixii extinta na natureza 0,622

A. hyacinthinus vulnerável 0,344

A. ararauna não incluída 0,315 Working Group of Captive Breeding, 1996

A. brasiliensis ameaçada 0,271

Espécie IUCN CBC
A. aestiva não incluída 0,232
Cyanopsitta spixii En 0,622
A. chloroptera não incluída 0,156 A. hyacinthinus Vu 0,344
Caparroz, 1998 A. brasiliensis Am 0,271
Ø  Irmãos = 0,50 A. chloroptera -- 0,156

C. spixii: Manejo reprodutivo em cativeiro NAS AULAS ANTERIORES...

CBC entre casais ● Ferramentas utilizadas na prospecção de marcadores moleculares

2F 18F 5M 3M 6M ● Eletroforese
7F 0,88 0,57 0,60 0,79 0,59 ● Enzimas de Restrição
● Clonagem
2F 0,57 0,60 0,81 0,55 ● PCR
18F 0,35 0,56 0,42 ● Sequenciamento do DNA
5M 0,66 0,77 ● Marcadores Moleculares
3M 0,71
Caparroz et al., 2001 ● Isoenzimas
● RFLP
18F x 5M → CBC = 0,35 ● Minissatélites
● RAPD
2F x 6M → CBC = 0,55 ● Microssatélites
● PCR – RFLP
7F x 3M → CBC = 0,79 ● Dados de Seqüência (SNPs)

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SEQUÊNCIAS DE DNA (Adh – D. melanogaster) PCR - RFLP

Haplótipo Intron 1 Exon 3 Intron 3 Exon 4
Seqüência + comum: A C CCCC G G AAT CTC CACTAG Amplificação do DNA por PCR

S1 • • T T • A CA • TA AC• • • • • • •
S2 • • T T • A CA • TA AA • • • • • • • Corte do fragmento
S3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • A amplificado utilizando Enzimas de Restrição
S4 G T • • • • • • • • • • • • • • • • • A
S5 G T • • • • • • • • • • • • • • • • • •
S6 • • • • • • • • • • • • • • T • T •CA

F1 • • • • • • • • • • • • • GTC TCC•
F2 • • • • • • • • • • • • • GTC TCC•
F3 • • • • • • • • • • • • • GTC TCC•
F4 • • • • • • • • • • • • • GTC TCC•
F5 • • • • A • • •G • • • • GTC TCC•

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

EcoRI

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PCR - RFLP Determinação da área de ocorrência de M. bororo

através da utilização de marcadores PCR-RFLP
Amplificação do DNA por PCR

Duarte 1996

Corte do fragmento Área – Serra do Mar (SE, S)

amplificado utilizando Enzimas de Restrição
Bioma – Mata Atlântica

Separação dos fragmentos por eletroforese

Nova espécie de cervídeo

Mazama bororo

Captura de Mazama bororo no PE Intervales Captura de Mazama bororo no PE Intervales

Desenvolvimento de Marcadores Moleculares para a

Identificação Não-Invasiva (DNA Fecal) de Cervídeos do
Como determinar os locais de ocorrência de M. bororo e Gênero Mazama
realizar estudos genéticos sem precisar capturá-los?

UTILIZAÇÃO DE AMOSTRAS COLETADAS DE FORMA NÃO-INVASIVA

(FEZES)

Mazama gouazoubira Mazama americana Mazama bororo Mazama nana

(2n = 70) (2n = 54) (2n = 34) (2n = 40)

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Desenvolvimento de Marcadores Moleculares para a

Identificação Não-Invasiva (DNA Fecal) de Cervídeos do
Desenvolvimento dos Marcadores
Gênero Mazama Mitocondriais
● Amplificação de um segmento de 480 pb do gene do Citocromo B de 30
amostras de cervídeos do gênero Mazama

● Seqüênciamento dos fragmentos

Mazama gouazoubira Mazama americana Mazama bororo Mazama nana

● Desenvolvimento de primers para Mazama (fragmento de 224pb)

● Identificação de sítios de restrição espécie-específicos

Fezes Extração do DNA PCR-RFLP (mtDNA)
Espécie 1 ACTGGTAGCCCGATCTGTTCGTAGCATAC
Espécie 2 ACTGGTAGCCTGATCTGATCGTATCATAC
Espécie 3 ACTGGTAGCCTGATCTGATCGTAGCATAC

Fezes
Identificação Não-Invasiva de Espécies de Cervídeos
EcoRII do Gênero Mazama

Fezes Extração do DNA PCR-RFLP (mtDNA)

-
PM Sem enzima BstnI SspI SspI AflIII AflIII
DNA SspI
RFLP
250pb Mazama M. americana M. nana
M. nana
200pb M. bororo

PCR 224 pb 150pb

M. gouazoubira M. americana

AflIII
100pb

50pb

Miotto et al. (2007) Braz. J. Biol., 67(4): 963-965

Determinação da Distribuição Geográfica de Mazama Identificação de pumas (Puma concolor) através das fezes:
bororo Através da Análise do DNA Fecal comparação entre os métodos morfológico e molecular

● Diferenciar fezes de Pumas de outros carnívoros

● Análise do DNA fecal (Citocromo b)
● Sequenciamento e análise de agrupamento (neighbor-joining)

Mazama bororo
Mazama nana
Mazama americana
● > 300 amostras de fezes Mazama gouazoubira
● Análise do DNA fecal Limite distribuição
M. bororo
● PCR – RFLP (Cit b)

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OBTENÇÃO DE AMOSTRAS OBTENÇÃO DE AMOSTRAS

● Métodos invasivos ● Métodos pouco invasivos

Tecidos ou sangue Biopsias de pele através do uso de dardos

OBTENÇÃO DE AMOSTRAS OBTENÇÃO DE AMOSTRAS

● Métodos não-invasivos ● Métodos não-invasivos

Fezes Fezes, pêlos

OBTENÇÃO DE AMOSTRAS OBTENÇÃO DE AMOSTRAS

● Métodos não-invasivos ● Métodos não-invasivos

Fezes, pêlos, penas, casca de ovos Fezes, pêlos, penas, casca de ovos, etc...

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UTILIZAÇÃO DE AMOSTRAS OBTIDAS DE ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS

FORMA NÃO-INVASIVA
● Tecidos
● Útil no estudo de: Etanol absoluto

Espécies raras ● Sangue

Estudo de Isoenzimas → Anticoagulante e tampões
Espécies difíceis de observar Estudo do DNA → Anticoagulante ou Etanol absoluto
Espécies difíceis de capturar

● Pêlos e Penas
● Problemas: Armazenados secos, junto com um dessecante
Etanol absoluto
Pouco DNA
Presença de contaminantes e inibidores da PCR ● Fezes
Dificuldades na genotipagem Etanol absoluto
Seco, com um dessecante

UTILIZAÇÃO DE AMOSTRAS OBTIDAS DE

FORMA NÃO-INVASIVA
● Informações que podem ser obtidas:
§ mtDNA (COI, Cit b)

- Identificação da espécie (“DNA barcoding)

- Determinação do local de ocorrência da espécie

§ Microssatélites

- Identificação individual dos animais

Estimativas de tamanho populacional
Relações de parentesco
Paternidade
Diversidade e Estrutura genética, etc

§ Genes ligados aos cromossomos sexuais (Sry, Ube 1Y, G6PD)

- Sexo e proporção sexual

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