UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS FÍSICAS E MATEMÁTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Maitê Perin

DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO POR ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO

ATÔMICA COM GERAÇÃO DE VAPOR FRIO E METODOLOGIA DE
FRACIONAMENTO EM AMOSTRAS DE ANCHOVAS ADQUIRIDAS NA REGIÃO
DA GRANDE FLORIANÓPOLIS.

Florianópolis
2019
 Maitê Perin

DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO POR ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO

ATÔMICA COM GERAÇÃO DE VAPOR FRIO E METODOLOGIA DE
FRACIONAMENTO EM AMOSTRAS DE ANCHOVAS ADQUIRIDAS NA REGIÃO
DA GRANDE FLORIANÓPOLIS.

Dissertação submetido(a) ao Programa de Pós-

Graduação em Química da Universidade Federal
de Santa Catarina para a obtenção do título de
Mestre em Química.
Orientadora: Profª. Drª. Tatiane de Andrade
Maranhão
Coorientadora: Profª. Drª. Alcíbia Helena de
Azevedo Maia

Florianópolis
2019
 Maitê Perin

DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO POR ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO

ATÔMICA COM GERAÇÃO DE VAPOR FRIO E METODOLOGIA DE
FRACIONAMENTO EM AMOSTRAS DE ANCHOVAS ADQUIRIDAS NA REGIÃO
DA GRANDE FLORIANÓPOLIS.

O presente trabalho em nível de mestrado foi avaliado e aprovado por banca

examinadora composta pelos seguintes membros:

Prof. Luiz Augusto dos Santos Madureira, Dr.

Universidade Federal de Santa Catarina

Prof.(a) Juliana Leonel , Dr(a).

Universidade Federal de Santa Catarina

Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi
julgado adequado para obtenção do título de mestre em química.
Marcus Cesar Mandolesi Sa:
Marcus Cesar 05306896855
Mandolesi Sa: I am approving this document
Florianopolis/SC
____________________________
05306896855 2019-12-30 19:55:03

Prof. Marcus César Mandolesi Sá, Dr.

Coordenador do Programa
Tatiane de Andrade Assinado de forma digital por
Maranhao:00763832 Tatiane de Andrade
Maranhao:00763832456
____________________________
456 Dados: 2019.12.31 16:12:09 -02'00'

Prof.(a) Tatiane de Andrade Maranhão, Dr(a).

Orientador(a)
Documento assinado digitalmente
Alcibia Helena de Azevedo Maia
Data: 30/12/2019 10:43:25-0300
____________________________
CPF: 520.435.099-34

Prof.(a) Alcíbia Helena de Azevedo Maia, Dr(a).

Coorientador(a)

Florianópolis, 18 de Dezembro de 2019.

 AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por ser suporte para todos os momentos de

minha vida.
A minha professora orientadora Tatiane por aceitar prontamente meu projeto
e pelos inúmeros ensinamentos.
A minha coorientadora e chefe Alcíbia pelo suporte diário e paciência
dedicada a mim neste período. Agradeço por compreender e auxiliar na conciliação
de meu trabalho e estudo, sempre me incentivando a ir além.
Aos meus professores durante essa caminhada: Luciano Vitalli, Daniel
Borges, Rosely Peralta, Hernan Terenze, Eduardo Carasek, Giovanni Caramori por
me ensinarem não somente química, mas por transmitirem seus conhecimentos de
vida.
Aos meus amigos e colegas do LPTox: Ana, Bruna, Amanda, Emanuela,
Prof Claudia, Prof Elisa, pela parceria e ajuda durante os experimentos.
Ao meu marido por compreender os meus momentos de ausência.
Ao centro de ciências da saúde por disponibilizar o espaço para execução
de meu trabalho.

Muito Obrigada!!
―Não se deve ir atrás de objetivos fáceis, é preciso buscar o que só pode ser
alcançado por meio dos maiores esforços‖. (Albert Einstein)
 RESUMO

A toxicidade associada ao mercúrio (Hg) para a saúde humana é bastante

conhecida e representa uma ameaça em especial para o desenvolvimento de fetos e
para crianças no início da vida. O Hg existe em várias formas no ambiente:
elementar (Hg0, ou metálico); inorgânico (Hg-i) e orgânico (Hg-o) que têm diferentes
efeitos tóxicos, afetando principalmente o sistema nervoso, digestivo e imunológico.
Devido à sua elevada bioacumulação e conseqüente biomagnificação, o Hg-o
se encontra na cadeia alimentar com uma concentração maior em algumas espécies
de peixes do que no ambiente aquático. Este trabalho visou quantificar o Hg em
amostras de anchovas da região da grande Florianópolis e através de métodos de
fracionamento estimar a concentração de frações de Hg-i e Hg-o utilizando
espectrometria de absorção atômica com geração de vapor frio (CV-AAS). Todas as
análises foram realizadas utilizando NaBH4 como agente redutor e HCl como agente
carreador. Os parâmetros otimizados para análise foram: 0,25 % m/v de NaBH 4
estabilizado com 0,10 % m/v de NaOH e HCl 10 % v/v. Para o preparo de amostra
foi retirada da anchova o tecido muscular e o mesmo foi cortado em pequenos
pedaços em placa de vidro com o auxílio de uma faca de plástico e seco em estufa a
40°C por 48h. Em seguida o tecido de anchova foi macerado em almofariz. A análise
de mercúrio total (Hg-t) foi realizada através de digestão assistida por forno micro-
ondas com utilização de HNO3 e H2O2 como auxiliares na decomposição da matéria
orgânica. A oxidação total do Hg foi feita com KMnO 4 0,1 % m/v e 0,05 % m/v de
cloridrato de hidroxilamina foi utilizado para retirar a coloração da reação. Para o
fracionamento de Hg-i foi avaliada a extração com HCl e L-Cisteína. Para a extração
com L-Cisteína ferramentas quimiométricas foram usadas para otimização do
método de extração de Hg-i. A extração de Hg-i foi alcançada, sem interconversão
das espécies, usando 2,0 % m/v de L-cisteína e 30 min de aquecimento à 80°C. A
fração de Hg-o foi obtida por diferença entre o Hg-t e Hg-i. Após otimizado o método
foi validado utilizando os materiais de referência certificado TORT-2 e DORM-3. O
método desenvolvido neste trabalho foi aplicado em 12 amostras de anchovas
adquiridas em mercados da região da grande Florianópolis para quantificação de
Hg-t, Hg-i e Hg-o. A aplicação do método mostrou que 75 % das anchovas
analisadas estão com quantidades de Hg-t abaixo de 0,6 µg/g, 16,7 % estão na faixa
de 0,61 a 0,9 µg/g e apena 8,33 % está na faixa de 1,21 a 1,5 µg/g que ultrapassa o
limite máximo permitido pela ANVISA. No entanto, a maior parte, 96% destes
valores, está relacionado à fração de Hg-o, o que chama atenção devido ao superior
potencial tóxico desta fração.

Palavras-chave: Mercúrio. Anchova. Fracionamento.

 ABSTRACT

Mercury (Hg) toxicity to human health is well known and poses a particular threat to
the development of fetuses and children early in life. Hg exists in various forms in the
environment: elemental (Hg0, or metallic); inorganic (Hg-i) and organic (Hg-o) which
have different toxic effects, mainly affecting the nervous, digestive and immune
systems. Due to its high bioaccumulation and consequent biomagnification, Hg-o is
found in the food chain with a higher concentration in some fish species than in the
aquatic environment. This work aimed to quantify Hg in bluefish samples from the
Florianópolis region and through fractionation methods to estimate the concentration
of Hg-i and Hg-o fractions using cold vapor generation atomic absorption
spectrometry (CV-AAS). All analyzes were performed using NaBH4 as reducing
agent and HCl as carrier. The optimized parameters for analysis were: 0.25% w/v
NaBH4 stabilized with 0.10% w/v NaOH and 10% v/v HCl. For sample preparation,
muscle tissue was removed from the bluefish and cut into small pieces on a glass
plate with the aid of a plastic knife and oven dried at 40 °C for 48h. Then the bluefish
tissue was macerated in mortar. Analysis of total mercury (Hg-t) was performed by
microwave assisted digestion using HNO3 and H2O2 as auxiliaries in the
decomposition of organic matter. Total oxidation of Hg was done with 0.1% m/v
KMnO4 and 0.05% w/v hydroxylamine hydrochloride was used to remove the reaction
color. For Hg-i fractionation, extraction with HCl and L-cysteine was evaluated. For L-
cysteine extraction chemometric tools were used to optimize the Hg-i extraction
method. Hg-i extraction was achieved without species interconversion using 2.0 %
w/v L-cysteine and 30 min heating at 80°C. The Hg-o fraction was obtained by
difference between Hg-t and Hg-i. Once optimized the method was validated using
TORT-2 and DORM-3 certified reference materials. The method developed in this
work was applied to 12 samples of bluefish acquired in markets of the greater
Florianópolis region to quantify Hg-t, Hg-i and Hg-o. The application of the method
showed that 75 % of the bluefish analyzed had Hg-t amounts below 0.6 µg/g, 16.7 %
were in the range of 0.61 to 0.9 µg/g and only 8.33 % is in the range of 1.21 to 1.5
µg/g that exceeds the maximum limit allowed by ANVISA. However, most of these
values, 96%, are related to the Hg-o fraction, which draws attention due to the higher
toxic potential of this fraction.

Keywords: Mercury. Bluefish. Fractionation.

 LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Ciclo biogeoquímico do Hg. ....................................................................... 18

Figura 2- Esquema de bioacumulação e biomagnificação. ....................................... 19
Figura 3 - Anchova (Pomatomus saltatrix). ............................................................... 21
Figura 4 - Esquema de funcionamento de geração de vapor frio - CV-AAS. ............ 26
Figura 5 - Exemplares de anchova: (a) amostra dividida em postas; (b) Posta
selecionada logo após a cabeça. .............................................................................. 39
Figura 6 - Etapas do processo de preparo de amostra: (a) Tecido de peixe úmido
cortado em placa de Petri; (b) Tecido de peixe após secagem em estufa; (c) fibras
após amostra peneirada; (d) amostra do tecido em pó. ............................................ 40
Figura 7 - Efeito da concentração de HCl com 1 % m/v NaBH4 e 0,25 % m/v de
NaOH. ....................................................................................................................... 41
Figura 8 - Efeito da concentração do NaBH4, com NaOH 0,25 % m/v e HCl 10 % v/v.
.................................................................................................................................. 42
Figura 9 - Efeito da concentração do NaOH, com NaBH4 1 % m/v e HCl 10 % v/v .. 43
Figura 10 - Efeito da concentração de KMnO4. ......................................................... 44
Figura 11 - Soluções de otimização para KMnO4 em tecido de peixe. ...................... 45
Figura 12 - Curva de recuperação do Hg-o considerando o uso de 5 mL de solução
de HCl em diferentes concentrações sob a massa de 150 mg de CRM (TORT-2). . 48
Figura 13 - Comparação de diferentes massas e uso de antiespumante. ................ 51
Figura 14 - Diagrama de pareto para o primeiro planejamento 24-1. ......................... 52
Figura 15 - Diagrama de paretos para segundo planejamento 24-1. .......................... 55
Figura 16 – Superfície resposta 3D das variáveis concentração de L-Cys e
temperatura de extração. Considerando 100 mg de amostra ,10 min US e 30 min de
tempo de aquecimento. ............................................................................................. 57
Figura 17 – Curvas de contorno das variáveis concentração de L-Cys e temperatura
de extração. Considerando 100 mg de amostra ,10 min US e 30 min de tempo de
aquecimento. ............................................................................................................. 57
Figura 18 - Concentração de Hg-t em 12 amostras de Anchova............................... 62
Figura 19 - Fração de Hg-o em relação ao Hg-t. ....................................................... 62
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Condições operacionais para análise de Hg por CV-AAS. ...................... 31

Tabela 2- Programação de potência para digestão por micro-ondas. ...................... 34
Tabela 3- Primeira matriz de planejamento fatorial 24-1. ........................................... 37
Tabela 4 - Segunda matriz de planejamento fatorial 24-1. ......................................... 37
Tabela 5 - Matriz do planejamento Doehlert. ............................................................ 38
Tabela 6 - Teste de recuperação para Hg-t determinado em amostra de tecido de
peixe. Média dos valores ± SD, n=6. ........................................................................ 47
Tabela 7 - Primeiro planejamento fatorial 24-1 executado e suas respectivas
respostas. Planejamento executado com tempo de US de 5 min. ............................ 52
Tabela 8 - Segundo planejamento fatorial 24-1 executado e suas respectivas
respostas, com massa fixa de 100 mg...................................................................... 54
Tabela 10- Teste de recuperação para Hg-i determinado em amostra de tecido de
peixe. Média dos valores (SD), n=2. ......................................................................... 58
Tabela 11- Parâmetros de mérito obtidos para as curvas de calibração de Hg(II). .. 59
Tabela 12- Testes de recuperação de Hg-t e Hg-i para materiais certificados, média
(DP), aplicado limite de confiança de 95% com n = 2. .............................................. 60
Tabela 13 – Resultados para Hg-t, Hg-i e Hg-o em amostras de tecido muscular de
Anchova em peso seco, média ±DP, n=3. ................................................................ 61
Tabela 14- Comparação entre médias de Hg-t em outros trabalhos da literatura em
relação a este trabalho. ............................................................................................ 63
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAS – Espectrometria de absorção atômica, do inglês Atomic Absorption

Spectrometry

AED – Detecção de emissões atômicas, do inglês Atomic Emission Detection

AFS – Espectrometria de fluorescência atômica, do inglês Atomic Fluorescence

Spectroscopy

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CV-AAS – Espectrometria de absorção atômica com geração de vapor frio, do inglês

Cold Vapor Atomic Absorption Spectrometry

CRM – Material de referência certificado, do inglês Certificate Reference Material

DP – Desvio Padrão

ECD – Detector de captura de elétrons, do inglês Electron Capture Detector

EFSA - European Food Safety Authority

FDA - Food and Drug Administration

GC – Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography

Hg – Mercúrio, do grego latinizado hydrargyrum

Hg-i – Mercúrio Inorgânico

Hg-o – Mercúrio Orgânico

Hg-t – Mercúrio Total

HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, do inglês High Performance Liquid

Chromatography

IC - Cromatografia iônica, do inglês Ionic Chromatography

IUPAC - International Union for Pure and Applied Chemistry

ICP-MS – Espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado, do inglês
Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry

LOD – Limite de Detecção, do inglês Limit of Detection

LOQ – Limite de Quantificação, do inglês Limit of Quantification

m/v – Massa/volume

MeHg – Metilmercúrio

MIP-AES – Espectrometria de emissão atômica de plasma induzida por micro-ondas,

do inglês Microwave-Induced Plasma Atomic Emission Spectrometry

r² – Coeficiente de determinação

r – Coeficiente de correlação

v/v – volume/volume
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................ 17
2.1 MERCÚRIO .............................................................................................................. 17

2.2 CICLO DO MERCÚRIO NO AMBIENTE ............................................................. 18

2.3 ANCHOVA ................................................................................................................ 21

2.4 PREPARO DE AMOSTRAS – TECIDO muscular ............................................. 22

2.5 MÉTODOS DE quantificação para mercúrio ....................................................... 25

3. OBJETIVOS ................................................................................................. 28
3.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................................. 28

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 28

4. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 29

4.1 MATERIAIS .............................................................................................................. 29

4.1.1 Instrumentação ........................................................................................... 29

4.1.2 Reagentes e soluções ................................................................................ 29

4.1.3 Amostras ..................................................................................................... 30

4.2 Procedimento experimental ................................................................................... 30

4.2.1 Otimização das condições do método ..................................................... 30

4.2.1.1 Otimização dos parâmetros do CV-AAS....................................................... 30

4.2.1.2 Efeito da concentração de HCl ..................................................................... 31

4.2.1.3 Efeito da concentração do NaOH ................................................................. 31

4.2.1.4 Efeito da concentração do NaBH4 ................................................................ 32

4.2.1.5 Efeito da concentração do KMnO4................................................................ 32

4.2.2 Preparo de Amostras ................................................................................. 33

4.2.2.1 Análise de Hg-t ............................................................................................. 34

4.2.2.2 Análise de Hg-i e Hg-o.................................................................................. 35

4.2.3 Parâmetros de mérito ................................................................................. 38

4.2.4 Aplicação do método proposto em amostras de anchova ..................... 39

4.2.5 Programas utilizados na análise dos dados ............................................ 40

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 40

5.1 OTIMIZAÇÃO DOS REAGENTES DA REAÇÃO DE GERAÇÃO DE VAPOR
FRIO DE MERCÚRIO .............................................................................................40

5.1.1 Efeito da concentração de HCl ................................................................. 40

5.1.2 Efeito da concentração do NaBH4 ............................................................ 42

5.1.3 Efeito da concentração do NaOH ............................................................. 43

5.2 EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE KMnO4........................................................44

5.3 FRACIONAMENTO DE MERCÚRIO ....................................................................45

5.3.1 Análise de Hg-t ........................................................................................... 45

5.3.2 Análise de Hg-i e Hg-o ............................................................................... 47

5.4 PARÂMETROS DE MÉRITO .................................................................................59

5.5 APLICAÇÃO DO MÉTODO EM AMOSTRAS DE ANCHOVA..........................60

6. CONCLUSÃO .............................................................................................. 65
REFERÊNCIAS ........................................................................................................67
 15

1. INTRODUÇÃO

A toxicidade associada ao Hg para a saúde humana é bastante conhecida e

representa uma ameaça particular para o desenvolvimento de crianças no útero e no
início da vida. O Hg existe em várias formas: elementar (ou metálico); inorgânico
(por exemplo, Hg2+); e orgânico (por exemplo, metil e etilmercúrio), que têm
diferentes efeitos tóxicos, afetando principalmente o sistema nervoso, digestivo e
imunológico, tem afinidade por órgãos como pulmões, rins, pele e olhos
(WHO,2016).
O metilmercúrio (MeHg) é um composto orgânico altamente tóxico. Quase
todas as pessoas no mundo têm pelo menos vestígios de MeHg em seuorganismo,
refletindo sua presença no meio ambiente. Majoritariamente a exposição ao MeHg
ocorre através do consumo de frutos do mar, em especial peixe e marisco, que
contêm concentrações mais elevadas de MeHg (US EPA, 2016).
As emissões de Hg no ambiente resultam principalmente da atividade humana,
particularmente de usinas a carvão, sistemas de aquecimento residencial,
incineradores de resíduos e como resultado da mineração de Hg, ouro e outros
metais. Uma vez no ar, por exemplo, o Hg eventualmente se instala em corpos
d’água, tais como lagos e córregos, ou no solo, onde pode ser lixiviado pela
água. Os microrganismos em corpos d'água podem transformá-lo em MeHg, onde
se acumula em peixes e mariscos compondo ciclos de bioacumulação e
biomagnificação. As concentrações de MeHg em peixes e mariscos depende: do
alimento que ingerem, temperatura da água, se típicos de água doce ou salgada,
longevidade, e do nível trófico. Em um dado corpo de água, as maiores
concentrações de MeHg são geralmente encontradas em peixes do topo da cadeia
trófica que se alimentam de peixes menores, estando assim associado ao efeito de
biomagnificação do ciclo do Hg (US EPA, 2016).
Após a ingestão de frutos do mar, o MeHg é facilmente absorvido pelos
tecidos devido a sua característica lipossolúvel sendo este encontrado no
organismo principalmente na forma de complexo com a cisteína livre, podendo
também se ligar a grupamentos sulfidrila e com proteínas e peptídeos que
 16

contenham esses aminoácidos. Por esta razão, aliada ao fato da sua forte ligação às
proteínas, o MeHg não é facilmente eliminado do organismo. Além disso, sabe-se
que muitos dos efeitos tóxicos do MeHg são mediados pela interação com enzimas
que possuem funções vitais, como aquelas envolvidas na regulação antioxidante
(SILVA; BARBOSA; SCARANO, 2012).
Sendo assim, este trabalho traz a proposta de avaliar a quantidade de Hg
em amostras de anchovas da região da grande Florianópolis e consequentemente o
o potencial de exposição humana às espécies orgânicas de Hg, uma vez que existe
um alto consumo deste tipo de alimentação por se tratar de região litorânea, onde a
cultura da pesca é evidenciada pelas várias colônias de pescadores.
 17

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 MERCÚRIO

O Hg é um metal encontrado naturalmente na crosta terrestre, ocorrendo no

ar, no solo e na água. Este metal assume diversas formas químicas, que podem ser
divididas nas seguintes categorias: Hg metálico ou elementar (Hg0), mercúrio
inorgânico (Hg-i), principalmente na forma de sais mercúricos (HgCl2, HgS) e
mercurosos (Hg2Cl2), e mercúrio orgânico (Hg-o), ligado a radicais de carbono
(CH3Hg+, (CH3)2Hg e CH3CH2Hg+) ((MICARONI, 2000).O Hg é liberado para o
ambiente a partir de fontes e processos naturais e como resultado das atividades
humanas (processos antropogênicos). Entre as fontes naturais estão o desgaste
natural das rochas contendo Hg, permitindo que o Hg escape e seja levado para o ar
e consequentemente lagos e rios. Os vulcões são exemplos de fonte de emissão
natural que quando entram em erupção pontualmente atuam emitindo e liberando
Hg. A atividade geotérmica também pode tirar Hg do subterrâneo e emiti-lo para a
atmosfera e até liberá-lo para os oceanos profundos (UNEP, 2013).
As atividades antropogênicas de liberação de Hg no ambiente ocorrem
através de indústrias que queimam combustíveis fósseis, produção eletrolítica de
cloro-soda, produção de acetaldeído, incineradores de lixo, polpa de papel, tintas,
pesticidas, fungicidas, lâmpadas de vapor de Hg, baterias, produtos odontológicos,
amalgamação de Hg em extração de ouro, entre outros (MICARONI, 2000).
Uma vez presente no ambiente, o Hg envolve-se em ciclos entre o ar, terra e
água até que seja eventualmente removido do sistema através de aterramento em
sedimentos oceânicos profundos ou sedimentos de lagos,através de aprisionamento
em compostos minerais estáveis (LACERDA; SANTOS; MARINS, 2007).
O MeHg por sua vez é a forma mais tóxica e bioacumulável de Hg
apresentando maior risco para a saúde humana e a vida selvagem. É formado
principalmente em ambientes aquáticos através de processos microbianos naturais
(BECKERS; RINKLEBE, 2017).
 18

2.2 CICLO DO MERCÚRIO NO AMBIENTE

O ciclo biogeoquímico do Hg e suas espécies químicas (figura 1), se resume

na interconversão nos sistemas atmosféricos e aquáticos; uma pequena parte do
Hg(0) que atinge a atmosfera é convertido em espécies solúveis em água (Hg(II)) as
quais podem ser reemitidas para a atmosfera como Hg(0) por volatilização natural na
interface ar/água e outra parte sofre deposição no sedimento (HgS). Na atmosfera o
Hg(0) pode ficar retido por um longo período; consequentemente, este composto
pode ser transportado através de grandes distâncias (MICARONI, 2000).

Figura 1- Ciclo biogeoquímico do Hg.

Fonte: Adaptado de PNAS, 2007.

O Hg-i, liberado nas formas metálica ou gasosa, pode originar compostos

organometálicos como o dimetilmercúrio ((CH3)2Hg) e o íon MeHg (CH3Hg+), sendo
essas as formas de contaminação mais tóxicas (LEOPOLD; FOULKES;
WORSFOLD, 2010). A síntese do MeHg a partir do Hg(II) é mediada por diversos
tipos de microrganismos presentes em sistemas aquáticos. Em certas bacias
hidrográficas, a produção e a disponibilidade de MeHg são maiores, mesmo não
havendo fontes próximas de liberação de Hg. Isso se dá em águas que apresentam
uma natureza ácida, pois são ricas em matéria orgânica dissolvida e são pobres em
nutrientes. Dessa forma, a água poderia funcionar como uma espécie de reator
 19

biogeoquímico, aumentando consideravelmente a concentração e a atividade tóxica

do agente contaminante (ROSA; MESSIAS; AMBROZINI, 2003).
Uma vez formado, o MeHg entra na cadeia alimentar através da rápida
difusão e forte ligação com as proteínas da biota aquática, atingindo sua
concentração máxima em tecidos de peixes do topo da cadeia alimentar aquática
devido à bioacumulação e consequente biomagnificação (figura 2).

Figura 2- Esquema de bioacumulação e biomagnificação.

Fonte: Adaptada World Wide Fund for Nature (WWF).

Devido à sua elevada bioacumulação, que é a capacidade do contaminante

se pré-concentrar em um organismo, o MeHg se encontra na cadeia alimentar com
uma concentração maior em algumas espécies de peixes do que no ambiente
aquático. As concentrações de Hg aumentam nos organismos vivos à medida que
ele percorre a cadeia alimentar e passa a se acumular no nível trófico mais elevado.
Este processo é conhecido como biomagnificação. Como exemplo, peixes
predadores podem ter até 106 vezes concentrações de Hg mais elevadas do que a
água do ambiente, sendo que até 95 % deste Hg esta na forma de MeHg
(LEOPOLD; FOULKES; WORSFOLD, 2010).
Os principais fatores que afetam os níveis de MeHg em peixes são
dieta/nível trófico da espécie, idade do peixe, atividade microbiana, concentração de
Hg na camada superior do sedimento local, conteúdo de carbono orgânico
 20

dissolvido, salinidade, temperatura da água, pH e potencial redox (MICARONI,

2000).
Os humanos são expostos ao Hg(0) principalmente por inalação e ao MeHg
principalmente por ingestão. Para a maioria das pessoas, o maior problema é com
MeHg para o qual a exposição mais significativa vem do hábito de comer
peixe. Existe uma grande variação na quantidade de peixes que as pessoas
consomem, bem como nas concentrações de Hg em diferentes tipos de peixes
(GOCHFELD, 2003).
Em geral, a exposição ao Hg-o pode causar danos cerebrais a um feto em
desenvolvimento. Estudos epidemiológicos também sugerem que a exposição pré-
natal ao MeHg pode afetar o desenvolvimento neurológico de crianças (HACON et
al., 2000). Por esta razão, a Comissão Europeia recomenda que as mulheres
grávidas, mulheres amamentando e crianças, limitem o consumo de peixe de maior
porte, os quais possuem maiores teores de MeHg (EFSA, 2004).
O modo mais comum por meio do qual a natureza transforma o MeHg em
uma forma menos tóxica é através da ação da luz solar. Quando o MeHg é ligado à
matéria orgânica dissolvida, como plantas ou animais decompostos, a luz do sol
quebra a moléculas. Um estudo feito por Zhang e Hsu-Kim (2010), demonstraram
que as taxas de fotodecomposição do MeHg que são relativamente rápidas nos
lagos de água doce são mais lentas em águas marinhas, isto se deve ao fato de que
na água do mar, o MeHg permanece fortemente ligado ao cloreto, não sendo
degradado com facilidade pela luz solar (FAPESP, 2010).
Lavoie et al (2018) combinou dados sobre a quantidade de Hg, vindo da
pesca nos oceanos e mares de 1950 a 2014 e o consumo semanal de peixes e
frutos do mar pelas populações de 175 países entre 1961 e 2011. Ele constatou que
o aumento da pesca em alto mar de peixes predadores aumentou a taxa de Hg
consumido pela população em 30kmol neste período. Dos 175 países avaliados,
38% das populações foram expostas a doses de MeHg acima dos limites
governamentais.
Diante destes estudos ressalta-se a importância do direcionamento de novas
pesquisas para controle de Hg também em águas salgadas e animais marinhos. Até
hoje, a maior parte dos esforços tem sido direcionada à presença do metal em água
doce.
 21

2.3 ANCHOVA

A anchova, também conhecida como Bluefish, nome científico Pomatomus

saltatrix, pertencente à família Pomatomidae, é um peixe marinho e de escamas; o
corpo é alongado, fusiforme e comprimido; a cabeça é grande e a boca larga com a
mandíbula saliente; os dentes são afiados (figura 3). A coloração é azulada no dorso
e prateada nos flancos e ventre. A dimensão máxima observada é de 120 cm e 14
kg, mas o tamanho comum está entre 20 e 60 cm (AMBIENTE BRASIL, 2019).

Figura 3 - Anchova (Pomatomus saltatrix).

Fonte: FAO, 2019.

É uma espécie pelágica, isto é, vive em mar aberto em profundidades de até

200 m, e costuma se aproximar da costa nos meses de inverno, época em que
forma cardumes. Os indivíduos jovens formam grandes cardumes, mas, à medida
que crescem, tendem a se isolar. Na época reprodutiva, os cardumes migram para o
alto mar, para fora da plataforma continental, onde desovam. As anchovas
frequentam as águas agitadas das regiões mais profundas dos costões rochosos
que se projetam para dentro do mar, onde fica a espera das presas. É um predador
voraz poderoso e veloz, frequentemente atacando cardumes de tainha ou outros
peixes, sendo a destruição de números aparentemente muito superiores às suas
necessidades alimentares, ataca inclusive indivíduos da mesma espécie (FAO,
2019).
É um dos peixes marinhos mais procurados pelos pescadores esportivos, e
também tem importância comercial. São encontradas em mares tropicais e
subtropicais. No oceano Atlântico Ocidental e Oriental, no Mediterrâneo e Mar
 22

Negro, no Oceano Índico ocidental e oriental e no Pacífico centro ocidental. No Brasil

encontra-se em praticamente todo litoral nas regiões Norte, Nordeste, Sudeste e Sul,
mas é mais comum do litoral do Rio de Janeiro a Santa Catarina (FAO, 2019).
Por ser um peixe predador e de grande porte, a anchova tem grandes
chances de sofrer os processos de bioacumulação e biomagnificação do Hg.

2.4PREPARO DE AMOSTRAS – TECIDO MUSCULAR

O Hg pode ser quantificado em diferentes matrizes, entre elas destaca-se o

tecido muscular de peixes (TORRES; FRESCURA; CURTIUS, 2009; MORGANO et
al., 2011; ZMOZINSKI et al., 2014; FERREIRA et al., 2015; ÇAYLAK et al.,2019). A
composição dos tecidos é bastante complexa, por ser uma matriz constituída, por
exemplo, de lipídios, fibras de tecido conjuntivo, vasos sanguíneos, nervos, entre
outros (SANTOS, 2007). Assim, é necessário que haja um criterioso tratamento
prévio desta amostra para que se tenha um livre acesso ao elemento que se deseja
quantificar.
O preparo de amostras é uma das primeiras etapas em uma análise e a que
demanda mais tempo. São necessários tratamentos adequados que permitam a
quantificação dos analitos de interesse. A umidade de uma amostra pode muitas
vezes ser o primeiro critério de avaliação no preparo de amostra. É comum secar a
amostra como primeira etapa do preparo a qual se pretende submeter o tecido,
visando a determinação do analito de interesse. A etapa de secagem até massa
constante é comum para amostras sólidas que apresentem água em quantidade
variável e em forma não determinada. Materiais biológicos são, em geral, secos em
estufa com circulação forçada de ar a 60 – 65° C (MARKERT, 1995; KRUG, 2006).
Após a secagem é necessário obter amostras homogêneas através da
moagem garantindo partículas do mesmo tamanho para a análise, mantendo assim
a sua representatividade. A moagem pode ser promovida de diversas maneiras,
como o esmagamento entre duas superfícies, fricção contra uma superfície,
alteração e fragilização da estrutura. A moagem grosseira (partículas com até. 5
mm) é comumente empregada como uma pré-moagem para a maioria das amostras.
Dentre os moinhos para essa finalidade, destacam-se o liquidificador, os
processadores e o moinho de facas. No caso da moagem fina pode-se empregar o
 23

moinho de disco e o almofariz, enquanto que para a moagem extra-fina pode-se

utilizar o moinho de bolas, o moinho vibracional, o moinho de jato de ar e o moinho
criogênico. (KRUG, 2006)
Para determinação de elementos individuais em amostras de natureza
orgânica é necessária a transformação dos elementos de interesse da matriz
orgânica em uma forma inorgânica simples. Em tecidos biológicos, determinados
elementos traço estão presentes em formas químicas diversas; algumas não
mostram qualquer sinal durante as medidas, enquanto outras fornecem sinais com
diferentes intensidades. A decomposição/abertura transforma o analito em uma
forma química simples, com uma resposta uniforme. A maneira de se decompor a
amostra para a análise depende da sua natureza, do elemento a ser determinado e
sua concentração, do método de análise, e da precisão e exatidão desejada. Na
maioria dos casos, após decomposições químicas drásticas que levam à destruição
completa da matriz, os elementos de interesse ficam dissolvidos em uma solução
aquosa. Freqüentemente ocorre a oxidação da matriz, convertendo-se carbono em
CO2, hidrogênio em H2O, nitrogênio ou óxidos de nitrogênio em N2. Os outros
elementos permanecem em formas inorgânicas convenientes para análise
(MAGALHÃES et al., 2006).
Assim, a maneira de se decompor uma amostra para a análise pode ser
utilizando técnicas de mineralização que compreendem basicamente duas
possibilidades:
Via seca - Necessita de altas temperaturas e do oxigênio como agente
oxidante para auxiliar a queima da matéria orgânica. Podem-se utilizar reagentes
oxidantes auxiliares, como por exemplo, o nitrato de magnésio, adicionados na
forma de reagentes sólidos, com a finalidade de acelerar a oxidação para prevenir a
volatilização de determinados compostos. Neste processo se houver uma limitação
da quantidade de oxigênio, alguns íons metálicos podem ser reduzidos a elementos
(MOREAU; SIQUEIRA, 2008).
Via úmida - Envolve o emprego de reagentes líquidos, ácidos fortes, como
agentes oxidantes, bem como a utilização de outros compostos adjuvantes (agentes
solubilizantes e neutralizantes), que possam facilitar a transformação da matéria
 24

orgânica presente na matriz. Eles podem ser usados isoladamente ou em

combinações. Ao se tratar a amostra com ácido, podem surgir produtos de hidrólise,
inclusive alguns apresentando características de volatilidade. Esse processo pode
ser feito em sistemas abertos ou fechados, com ou sem aquecimento. Um exemplo
de aquecimento é o uso do forno digestor de amostras por micro-ondas. Porém, a
natureza do composto de interesse deve ser sempre considerada (KRUG, 2006;
MOREAU; SIQUEIRA, 2008).
Os procedimentos de decomposição auxiliados por micro-ondas são uma
alternativa interessante. A utilização de recipientes de Teflon, completamente
transparente às energias de micro-ondas e hermeticamente fechados, possibilita
reter os elementos de interesse analítico em solução, geralmente ácida. Ácidos
minerais, como HNO3, HCl, H2SO4 e HF, absorvem as energias eletromagnética
muito facilmente e convertem em energia térmica. Como o sistema é fechado a
pressão é elevada dentro do frasco reacional e os ácidos entram em ebulição em
temperaturas menores, levando à completa solubilização das amostras (BASTOS,
1997).
Na decomposição de amostras empregando radiação micro-ondas o tipo de
ácido, assim como sua quantidade, são importantes parâmetros a serem
considerados, seja por razões de segurança ou mesmo de eficiência de digestão.
Ácido nítrico é o mais utilizado, normalmente adicionado na forma concentrada,
sendo indicado para a decomposição de amostras orgânicas, dependendo dos
teores da matriz da amostra. Além do ácido nítrico, peróxido de hidrogênio, H2O2
30%, m/v é normalmente utilizado como agente oxidante auxiliar durante a
decomposição assistida por radiação micro-ondas (KINGSTON; HASWALL, 1997).
Com todos os avanços na área de analítica na temática de preparo de
amostras, muitos métodos foram desenvolvidos visando atender aos sistemas de
introdução de amostras de técnicas analíticas, majoritariamente voltados para
introdução de amostras líquidas. No entanto, a digestão ácida auxiliada por micro-
ondas para amostras biológicas, é considerada um procedimento capaz de
decompor todas as espécies orgânicas em inorgânicas, sendo primordial em estudos
que necessitem realizar a especiação e fracionamento das espécies de Hg para
maior compreensão da exposição.
 25

2.5 MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO PARA MERCÚRIO

Os compostos químicos que diferem na composição isotópica, conformação,

oxidação ou estado eletrônico, ou na natureza de seus substituintes complexos ou
ligados covalentemente, podem ser considerados como espécies químicas distintas.
As metodologias de especiação ou fracionamento permitem identificar ou quantificar
essas espécies químicas em diferentes matrizes. Especiação é definida pela
International Union for Pure and Applied Chemistry (IUPAC) como sendo a atividade
analítica de identificação e / ou medição das quantidades de uma ou mais espécies
químicas individuais de uma amostra e o fracionamento como o processo de
classificação de um analito ou um grupo de analitos de uma determinada amostra de
acordo com as propriedades físicas ou químicas (TEMPLETON et al., 2000).
A especiação de Hg é geralmente realizada por técnicas de separação
cromatográfica acopladas a diferentes detectores. As técnicas de separação
cromatográfica incluem: cromatografia gasosa (GC), cromatografia líquida (HPLC) e
cromatografia iónica (IC). Os detectores mais comumente usados são:
espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS),
espectroscopia de absorção atômica (AAS), espectrometria de fluorescência atômica
(AFS), detector de captura de elétrons (ECD), espectrometria de emissão atômica de
plasma induzida por micro-ondas (MIP-AES), detecção de emissões atômicas (AED)
(CHIOU; JIANG; DANADURAI, 2001; NEVADO et al., 2005). O fracionamento por
sua vez utiliza abordagens alternativas, procedimentos que são baseadas em
extrações sequenciais e lixiviação para fornecer informações sobre solubilidade e
reatividade do Hg (HOVART; GIBICAR, 2005).
A AAS é uma técnica já consolidada e comumente empregada para a
determinação de metais traço nas mais diversas amostras. A técnica utiliza
basicamente o princípio de que átomos livres (estado gasoso) gerados em um
atomizador são capazes de absorver radiação de frequência específica que é
emitida por uma fonte espectral, diferenciando o sinal de absorção atômica do sinal
de absorção de fundo; a quantificação obedece desta forma, os princípios da lei de
Beer (BORGES et al., 2005). A AAS pode ser associada a diversos tipos de
 26

atomizadores, unidade responsável pela geração de elementos no estado vapor. Os

mais amplamente conhecidos são a chama, forno de grafite e gerador de hidretos.
Para o mercúrio, o vapor frio (CV) é amplamente utilizado, já que este metal
apresenta alta volatilidade na forma elementar vaporizando a temperatura ambiente
não sendo exigida fonte externa de calor para gerar átomos de Hg no estado vapor.
(WELZ; SPERLING, 2005; MARTINS, 2007).
Na técnica com geração de CV AAS (figura 4), os íons Hg(II) contidos na
amostra digerida são introduzidos por injeção em fluxo, impulsionados por uma
bomba peristáltica e direcionados ao copo reacional onde se juntará a solução
redutora e uma solução ácida, sendo então reduzido a Hg(0) pela solução redutora.
O gás (argônio) é então borbulhado através da solução para carregar o vapor
resultante contendo Hg por um tubo para a cela de quartzo posicionada frente ao
feixe de radiação. A radiação da linha de uma lâmpada de cátodo oco de Hg de
253,7 nm passa através das janelas de quartzo da cela de quartzo contendo o vapor
carregado e aprisionado. A absorbância obtida pelo espectrofotômetro é diretamente
proporcional à concentração de Hg na cela, que por sua vez é proporcional à
concentração de Hg na amostra (CHEN et al., 2002; GUILHEN; PIRES; DANTAS,
2010).

Figura 4 - Esquema de funcionamento de geração de vapor frio - CV-AAS.

®
Fonte: Adaptado do manual de operações da Thermo Scientific

Para a determinação de ambos, Hg total (Hg-t) e Hg-i, foi utilizada neste

trabalho a técnica de CV-AAS. Para a determinação de Hg-t a digestão de amostras
 27

assistida por micro-ondas foi o método selecionado, permitindo determinar a

concentração total de Hg usando as mesmas condições de geração de vapor frio
empregadas para determinação de Hg-i. Além disso, uma estimativa da
concentração de Hg-o pode ser obtida com a diferença entre as concentrações de
Hg-t e Hg-i através da metodologia de fracionamento proposta, utilizando a técnica
de extração sólido-líquido.
A ferramenta quimiométrica, metodologia de superfície de resposta, foi
utilizada para escolha das condições de extração do Hg-i. As superfícies
representam uma boa maneira de ilustrar graficamente a relação entre diferentes
variáveis experimentais e as respostas, oferecendo informações sobre o
comportamento das variáveis na região estudada.
 28

3.OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Quantificar o mercúrio em amostras de anchovas da região da grande

Florianópolis e através de métodos de fracionamento estimar a concentração de
frações de Hg-i e Hg-o utilizando espectrometria de absorção atômica com geração
de vapor frio (CV-AAS);

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar diferentes concentrações dos reagentes envolvidos na reação de

geração de vapor frio de Hg para padrões aquosos e amostras;

Quantificar Hg total em amostras de anchova através do uso de

metodologia de preparo de amostras já consolidada na literatura;

Avaliar a digestão auxiliada por micro-ondas das amostras de tecidos de

anchova para determinação de Hg total;

Realizar a extração de Hg-i nas amostras de tecido de anchova para

avaliação da metodologia de fracionamento de Hg;

 Estimar parâmetros de mérito e checar a exatidão e precisão do método

proposto;

Adquirir exemplares de anchovas em diferentes localidades nas regiões da

grande Florianópolis para determinação de Hg total e das frações de Hg;
 29

4.MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 MATERIAIS

4.1.1 Instrumentação

Todo o trabalho foi executado utilizando Espectrofotômetro de Absorção

Atômica, modelo ICE 3000 SERIES acoplado ao acessório VP 100 para geração de
vapor frio e hidretos ambos da empresa Thermo SCIENTIFIC® (Massachusetts,
EUA). Para o preparo de amostras foram utilizados estufa da empresa Binder® ED53
(Tuttlingen, Alemanha), balança analítica de precisão da Exacta (São Paulo, Brasil),
agitador de tubos AP56 tipo vórtex da Phoenix® (São Paulo, Brasil), banho de
ultrassom MaxClean 1450A da Unique® (São Paulo, Brasil), centrífuga Excelsa® II da
Fanem® (São Paulo, Brasil), banho para tubos B11D da Micronal® (São Paulo,
Brasil) e sistema digestor de amostra por micro-ondas DGT 100 Plus da Provecto
Analítica (São Paulo, Brasil).

4.1.2 Reagentes e soluções

Foram utilizadas borohidreto de sódio 98% (NaBH4), hidróxido de sódio PA

(NaOH), peróxido de hidrogênio supra puro 30-32% (H2O2), cloridrato de
hidroxilamina 99,9%, L(+) cisteína cloridrato 98,5% (L-Cys) da marca Vetec© (Rio de
Janeiro, Brasil), ácido clorídrico 36,5-38% (HCl) e ácido nítrico 69-70% (HNO3) da
J.T.Baker® (Gliwice, Polônia), solução padrão de Hg 1g/L em HNO3 1% da Specsol®
(São Paulo, Brasil), permanganato de potássio (KMnO4) e solução de tensoativo
concentrado a 10% Extran® da Merck© (Darmstadt, Alemanha). Materiais de
referência certificado TORT-2 (hepatopancreas de lagosta) e DORM-3 (músculo de
peixe) da National Research Council (Ottawa, Canadá). Todas as soluções foram
preparadas com água deionizada a 18.2 m em sistema Milli-Q/Millipore
(Massachusetts, EUA).
 30

Para as análises com CV-AAS foi utilizado gás Argônio de alta pureza 5.0 da
Air liquide Brasil, como gás de arraste para carrear os átomos de Hg até a cela de
quartzo.

4.1.3 Amostras

O fruto do mar selecionado para este estudo foi a anchova. Esta escolha foi
baseada no alto consumo deste peixe na região e por se tratar de uma espécie
predadora. As amostras foram coletadas frescas no período de janeiro/2018 a
outubro/2019 no mercado público de Florianópolis e em peixarias de Palhoça.

4.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.2.1 Otimização das condições do método

4.2.1.1 Otimização dos parâmetros do CV-AAS

Visando melhorar as condições analíticas foram otimizados fluxo de gás,

velocidades da bomba peristáltica e fluxo de amostra para o equipamento de vapor
frio. Para esta avaliação foi utilizada uma solução aquosa de 6 g/L de Hg-i e
observou-se as condições que apresentavam melhor sinal analítico para esta
concentração.
O fluxo de gás foi avaliado de 40 a 150 mL/min variando em 10 mL/min
sendo o fluxo de 40 mL/min o que apresentou melhor sinal analítico. Para a
velocidade da bomba peristáltica foram avaliados dois parâmetros: melhor sinal
analítico e menor consumo de amostra, já que a velocidade da bomba peristáltica é
diretamente proporcional ao consumo de amostra, sendo a velocidade selecionada
de 30 rpm. Por fim o fluxo de amostra foi reduzido de 7 mL para 4 mL sem prejuízo
as leituras obtidas. O fluxo das soluções redutora (NaBH4) e carreadora (HCl) não
foram alterados.
Os melhores resultados para as condições operacionais estão descritos na
tabela 1, e foram os utilizados durante todo o trabalho.
 31

Tabela 1 - Condições operacionais para análise de Hg por CV-AAS.

Variáveis Condições de Operação
Lâmpada EDL de Hg
Comprimento de Onda (nm) 253,7
Gás de arraste Argônio
Fluxo do gás (mL/min) 40
Velocidade da bomba peristáltica (rpm) 30
Fluxo solução redutora (mL/min) 0,8
Fluxo solução carreadora (mL/min) 0,8
Fluxo da amostra (mL/min) 4,0
Fonte: a autora.

4.2.1.2 Efeito da concentração de HCl

A solução ácida utilizada foi uma solução de HCl e seu efeito na reação de
redução foi avaliado através de soluções de padrão aquoso de Hg 6 g/L e amostras
enriquecidas com Hg na mesma concentração, fixando a concentração de NaBH4
em 1 % (m/v) e de NaOH em 0,25 % (m/v). A concentração de HCl foi avaliada em
11 concentrações que variaram de 0 a 50 % (v/v). O critério de avaliação utilizado foi
o de maior sinal analítico.

4.2.1.3 Efeito da concentração do NaOH

A solução redutora utilizada foi uma solução de NaBH4 preparada com

adição de NaOH. O efeito da concentração de NaOH nesta solução redutora foi
avaliado através de soluções de padrão aquoso e amostras enriquecidas com 6 g/L
de Hg, fixando a concentração de NaBH4 em 1 % (m/v) e de HCl em 10% (v/v). A
concentração de NaOH foi determinada em 4 concentrações 0, 0,1, 0,25 e 0,5 %
(m/v). O critério de avaliação utilizado foi o de melhor sinal analítico.
 32

4.2.1.4 Efeito da concentração do NaBH4

O efeito da concentração de NaBH4 na solução redutora foi mensurado

através de soluções de padrão aquoso de Hg e amostras enriquecidas com 6 g/L
de Hg, fixando a concentração de NaOH em 0,25 % (m/v) e de HCl em 10 % (v/v). A
concentração de NaBH4 foi avaliada variando-se de 0 a 2,0 % (m/v). O critério de
avaliação utilizado foi o de melhor sinal analítico.

4.2.1.5 Efeito da concentração do KMnO4

Visando garantir a total oxidação do Hg no preparo de amostra para a

determinação de Hg-t, a concentração de KMnO4 foi otimizada (GUILHEN, 2010).
Esta avaliação foi realizada observando-se a coloração da solução após adição de
diferentes concentrações de KMnO4, onde a solução deveria manter-se púrpura para
garantir um excesso de reagente e assim oxidar todo Hg contido na amostra.
Durante a análise foi observada a intensidade do sinal analítico até obtenção do
maior sinal demonstrando a total oxidação do Hg.
Para otimização da concentração de KMnO4 foi gerado um pool, mistura de
várias amostras preparadas em separado no digestor de micro-ondas para obtenção
de um volume maior de solução para as otimizações e para garantir que todas as
soluções tivessem a mesma constituição. Este foi feito para os reagentes usados na
digestão (padrão aquoso) e para a amostra de anchova (matriz) e preparados
conforme descrição a seguir.
Para o pool de reagentes foram adicionados em seis tubos de digestão 5 mL
de HNO3 e 2 mL de H2O2 em cada tubo reacional. Os tubos foram submetidos ao
processo de digestão e ao final as soluções dos seis tubos foram misturadas para
obtenção de um único volume. Para o pool de matriz, foram adicionados em seis
tubos de digestão cerca de 500 mg de tecido de peixe úmido com 5 mL de HNO3 e 2
mL de H2O2. Os tubos foram submetidos ao processo de digestão e ao final as
soluções dos seis tubos foram misturadas para obtenção de um único volume.
Ambos os preparos utilizaram o programa estabelecido para análise de Hg-t, de
acordo com o item 4.2.2.1 que será melhor descrito posteriormente.
 33

Foram então preparadas sete soluções de padrão aquoso contendo 5 mL do

pool de reagentes com adição de 6 g/L de Hg e sete soluções de matriz
enriquecida contendo 5 mL do pool de matriz com adição de 6 g/L de Hg. A estas
soluções foram adicionadas concentrações de KMnO4 que variaram de 0 a 0,4 %
(m/v).
Após aguardar o tempo de 2 min para oxidação com KMnO4, foi adicionado
cloridrato de hidroxilamina 5 % (m/v) na proporção de metade da concentração de
KMnO4 nas soluções de padrão aquoso e de matriz. Esta estratégia visou reduzir o
excesso de permanganato em solução e retirar a coloração da reação, evitando
manchar as conexões do equipamento.

4.2.2 Preparo de Amostras

O primeiro procedimento do preparo de amostras foi realizado de acordo

com outros trabalhos já descritos na literatura para a determinação de Hg em
amostras de tecido de peixe (ORTIZ; ALBARRAN; RICA, 2002; CHEN et al., 2013;
CARRASCO; VASSILEVA, 2014; ÇAYLAK et al., 2019). Foram retiradas das
amostras de anchova a parte comestível de seus tecidos e os mesmos foram
cortados em pedaços bem pequenos em placa de vidro com o auxílio de uma faca
de plástico para evitar contaminação com outros metais (KRUG, 2006). As amostras
foram armazenadas em frascos de polipropileno, identificadas e congeladas para
posterior retirada das alíquotas e análise de Hg.
Na metodologia de análise de Hg-t foi observada falta de reprodutibilidade
quando utilizadas amostras úmidas demonstrando falta de homogeneidade. Em
relação ao método de extração de Hg-i com L-Cisteína os tecidos úmidos
proporcionaram a formação de muita espuma durante a reação de geração de vapor
de Hg. Sendo assim adotou-se que antes da digestão (preparo para determinação
de Hg-t) e das extrações (determinação de Hg-i) as amostras de tecido de peixe
seriam secas em placa de vidro em estufa a 40°C por 48h (RIO-SEGADE;
BENDICHO, 1999; ORTIZ; ALBARRAN; RICA, 2002).
 34

Foi realizada a comparação entre o tecido de peixe úmido e o tecido de

peixe seco. Esta avaliação foi feita para identificar possíveis perdas de Hg
considerando uma redução de 75 % de peso durante a secagem. A perda de Hg-t
durante a secagem foi avaliada pesando-se 500 mg de duas amostras, uma úmida e
outra seca, sendo as amostras submetidas ao programa de digestão para Hg-t e
quantificação conforme descrito no item 4.2.2.1.

4.2.2.1 Análise de Hg-t

Cerca de 250 mg de amostra seca foi pesada em tubo digestor de teflon e

adicionados 5 mL de HNO3 concentrado e 2 mL de H2O2. Os tubos foram lacrados e
submetidos ao processo de digestão realizado em micro-ondas, utilizando o
programa sugerido pelo manual do equipamento para digestão de peixe seco e
também pela literatura (TEODORO, 2007), conforme tabela 2:

Tabela 2- Programação de potência para digestão por micro-ondas.

Etapas Tempo (min) Potência (W)

1 06 450
2 04 650
3 06 850
4 04 000
5 05 800
Fonte: TEODORO, 2007.

Após a digestão os frascos foram resfriados a temperatura ambiente por no

mínimo 1h para posterior abertura. As amostras digeridas foram então transferidas
para balões de vidro adicionando-se cerca de 30 mL de H2O Milli-Q e KMnO4 5 %
(m/v) até a solução permanecer púrpura pelo tempo mínimo de 2 min e na
concentração máxima de 0,4 % (m/v), conforme otimização, garantindo assim a total
oxidação do Hg. Após este tempo foi adicionado 500 μL de cloridrato de
hidroxilamina 5 % (m/v) para retirar a coloração da reação, e a amostra foi então
diluída com H2O Milli-Q até volume de 50 mL.
Para avaliar a eficiência desta digestão foram realizados testes de adição e
recuperação de Hg em amostras de tecido de peixe. Duas amostras de tecido de
 35

peixe seco foram analisadas com adição de padrões 1 µg/L de Hg2+ e 1µg/L de
MeHg para avaliação de recuperação de Hg-t.
O teste de adição e recuperação, em que se adiciona sobre a amostra a ser
digerida, uma quantidade de padrão, a amostra é analisada com e sem adição de
padrão, sendo a percentagem de recuperação obtida considerando a equação 1:

%REC = [(AmostraEnriquecida – Amostra)/ Conc.Add] x 100 (1)

4.2.2.2 Análise de Hg-i e Hg-o

Através da metodologia de fracionamento foram testados dois métodos de

extração para a separação do Hg-i: a lixiviação ácida utilizando uma solução de HCl
(RIO-SEGADE; BENDICHO, 1998, ORTIZ; ALBARRAN; RICA, 2002; KAERCHER et
al., 2005, ÇAYLAK et al, 2019) e a extração com L-Cisteína (PEDROSO, 2005;
HIGHT; CHENG, 2006; REYES el al., 2008; SOARES, 2012; CHEN el al., 2013;
SCHMIDT et al., 2013). Para isto foram otimizadas as concentrações de HCl e L-
Cisteína para realizar a extração. O Hg-i foi quantificado nas amostras tratadas por
CV-AAS utilizando uma curva de calibração externa a partir de padrão de Hg2+. As
análises foram realizadas em triplicata para cada amostra. O Hg-o foi obtido através
da subtração da concentração do Hg-t menos a concentração do Hg-i, equação 2.

[Hg-o] = [Hg-t] – [Hg-i] (2)

O procedimento de extração foi realizado pesando-se as amostras em

frascos de polipropileno de 15 mL e em seguida foram adicionados 5 mL de solução
extratora. As soluções foram submetidas à vórtex por 10 segundos para
homogeneização e em seguida colocadas em banho de ultrassom por cerca de 10
minutos. Após este período as soluções foram centrifugadas a 3500 rpm por 10 min
e o sobrenadante foi transferido e avolumado com H2O Milli-Q em balão de 50 mL.
No início dos experimentos foi realizada em temperatura ambiente uma
avaliação preliminar da concentração da solução extratora de HCl variando de 0 a 7
 36

mol/L. Foram pesados cerca de 150 mg de CRM (TORT-2) em frascos de

polipropileno de 15 mL e em seguida foram adicionados 5 mL de ácido clorídrico nas
concentrações de estudo. Quanto à concentração de L-Cisteína para extração,
informa-se que esta variável não foi avaliada de início, utilizando-se uma solução de
1 % (m/v), conforme constatado por meio de revisão da literatura (HIGHT; CHENG,
2006; REYES et al., 2008). O procedimento para extração se deu conforme
mencionado anteriormente.
Com a obtenção das concentrações preliminares das soluções extratoras,
iniciou-se uma avaliação com as amostras de tecido de peixe. Cerca de 500 mg das
amostras secas foram pesadas em frascos de polipropileno de 15 mL e em seguida
foram submetidas ao procedimento de extração como descrito anteriormente. Nesta
etapa avaliou-se o efeito da temperatura na extração utilizando banhos térmicos. As
soluções foram colocadas em banho maria por 15 min nas temperaturas de 20 a
80°C. Em seguida as soluções foram centrifugadas a 3500 rpm por 10 min e o
sobrenadante foi transferido e avolumado com água Mili-Q em balão de 50 mL.
A partir dos testes preliminares foi verificado que a L-cisteína foi o melhor
meio extrator apesar de a reação gerar espuma. Desta forma, somente a eficiência
de extração de Hg-i das amostras de peixe em meio extrator de L-cisteína foi
otimizada.

Otimização da extração de Hg-i com L-Cisteína

Devido à presença de grande quantidade de espuma no copo reacional

durante a reação de geração de vapor frio quando se utilizou L-cisteína como agente
extrator, foi necessário avaliar a massa de amostra e a adição de antiespumante.
Para isso realizou-se testes com duas massas diferentes de tecido de peixe seco
(250 e 500 mg). As amostras foram submetidas à extração com 5 mL de L-Cisteína
na concentração de 1 % m/v conforme procedimento do item 4.2.2.2.
As análises foram realizadas sem adição de antiespumante e logo em
seguida foi adicionada uma gota de antiespumante e feita nova leitura.
Após esta avaliação, a extração das espécies de Hg com L-Cisteína foi
otimizada com o auxílio da metodologia de superfície de resposta, onde foi aplicada
uma estratégia de planejamentos fatoriais sequenciais. Inicialmente foi realizada
 37

uma triagem das variáveis através de um planejamento fatorial fracionado de dois

níveis, 24-1, onde foram selecionadas as variáveis significativas na recuperação do
analito.
O planejamento fatorial 24-1 foi composto de 11 experimentos, sendo 8
combinações de fatores e 3 avaliações do ponto central (tabela 3). O volume de
solução extratora foi de 5 mL e este valor não foi alterado em todo o estudo.

4-1
Tabela 3- Primeira matriz de planejamento fatorial 2 .

Níveis
Fatores/Variáveis
-1 0 1
Massa de amostra (mg) 50 100 150
Concentração L-Cys (% m/v) 0,5 1 1,5
Temperatura de Extração (°C) 40 60 80
Tempo de aquecimento (min) 30 60 90
Fonte: a autora.

Um segundo planejamento foi proposto incluindo a variável tempo de

ultrassom e aumentando a faixa de temperatura de extração, com massa fixa de
amostra em 100 mg. Este planejamento também foi composto de 11 experimentos,
sendo oito combinações de fatores e três avaliações do ponto central (tabela 4).

4-1
Tabela 4 - Segunda matriz de planejamento fatorial 2 .

Níveis
Fatores/Variáveis
-1 0 1
Concentração L-Cys (% m/v) 0,5 1 1,5
Tempo de Ultrassom (min) 0 5 10
Temperatura de Extração (°C) 20 50 80
Tempo de aquecimento (min) 30 60 90
Fonte: a autora.

Após a definição das variáveis significativas foi aplicado o método de

planejamento hexagonal com dois fatores (Doehlert), onde as demais variáveis
foram fixadas (tabela 5).
 38

Tabela 5 - Matriz do planejamento Doehlert.

Níveis
Fatores/Variáveis
-1,0 -0,866 -0,5 0 0,5 0,866 1
Concentração L-Cys (% m/v) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Temperatura de Extração (°C) 20 50 80
Fonte: a autora.

Para verificar a eficiência da extração realizou-se a análise de adição e

recuperação de Hg-i em duas amostras de peixe enriquecidas com padrões 1 µg/L
de Hg2+ e 1 µg/L MeHg.

4.2.3 Parâmetros de mérito

Para as condições otimizadas foram avaliados o limite de detecção (LOD) e

limite de quantificação (LOQ). Duas curvas analíticas foram construídas na faixa
linear de 0,05 a 6,0 µg/L, sendo uma preparada com 1 % de HNO3 e 0,1 % de
KMnO4 (Hg-t) e outra em 0,25 % de L-Cisteína (Hg-i) (LI et al., 2005). Em seguida
foram feitas 15 leituras do branco e calculou-se o desvio padrão (DP) dos mesmos.
Os valores para LOD e LOQ foram calculados para ambas as curvas como segue:

LOD = 3,3 x DP / coef. Angular

LOQ = 10 x DP / coef. Angular

Para avaliação das curvas de calibração usando meio de HNO3 ou L-cisteína

foi utilizado o teste t para análise da significância, de acordo com a equação 3.

t = x1-x2 / Sx1x2 . Raiz (2/n) (3)

Onde: x1 = média do coef. angular curva HNO3

x2 = média do coef. angular curva L-Cys
S x1x2 = DP corrigido
n= tamanho da amostra
 39

A validação do método proposto para extração de Hg-t e Hg-i foi realizada

utilizando os CRMs TORT-2 (hepatopâncreas de lagosta) e DORM-3 (músculo de
cação).
Para Hg-t e Hg-i a avaliação se deu de acordo com a proximidade do valor
mensurado em concordância com o valor certificado. Hg-o foi quantificado por
diferença entre Hg-t e Hg-i.

4.2.4 Aplicação do método proposto em amostras de anchova

Após validação do método, o mesmo foi aplicado em 12 amostras de

anchova adquiridas em mercados locais.
Os exemplares de anchova possuíam na faixa de 30 a 40 cm com pesos que
variaram de 700 a 1100g. As anchovas foram divididas em postas e a posta
selecionada para estudo foi a logo após a cabeça (figura 5).

Figura 5 - Exemplares de anchova: (a) amostra dividida em postas; (b) Posta selecionada logo após a
cabeça.

(a) (b)
Fonte: a autora.

Desta posta foi retirado somente o tecido muscular, sendo este cortado em
pedaços menores com o auxílio de uma faca plástica, colocado em placa de Petri
(figura 6a) em seguida foi submetido a secagem em estufa a 40°C durante 48h
(figura 6b). Após este período as amostras foram maceradas em gral de porcelana e
peneiradas para retirar as fibras (figura 6c) e proporcionar uma amostra em pó
homogênea (figura 6d).
 40

Figura 6 - Etapas do processo de preparo de amostra: (a) Tecido de peixe úmido cortado em placa de
Petri; (b) Tecido de peixe após secagem em estufa; (c) fibras após amostra peneirada; (d) amostra do
tecido em pó.

(a) (b) (c) (d)

Fonte: a autora.

As análises de cada amostra foram realizadas em triplicata, sendo leituras

de Hg-t e Hg-i feitas no mesmo dia. Para quantificação de Hg-o foi utilizada a média
das quantificações obtidas para Hg-t subtraindo a média das quantificações obtidas
para Hg-i.

4.2.5 Programas utilizados na análise dos dados

Para a análise dos dados gerados nos experimentos de otimização e

aplicação do método desenvolvido neste trabalho foram utilizados os seguintes
programas: Microsoft Excel 2010, STATISTICA, Origin 7 e GraphPad Prism 6.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1OTIMIZAÇÃO DOS REAGENTES DA REAÇÃO DE GERAÇÃO DE VAPOR FRIO

DE MERCÚRIO

5.1.1 Efeito da concentração de HCl

Durante a análise, a solução contendo íons Hg2+ é introduzida por injeção em

fluxo e direcionada ao compartimento de reação, onde será reduzido o Hg0 pela
solução redutora de NaBH4 (% m/v) e uma solução carreadora de HCl (% v/v).
A reação de hidrólise do NaBH4 em meio aquoso é normalmente catalisada
por um ácido (equação 4) (D’ULIVO, 2010). Portanto, a concentração de HCl
adicionado ao copo reacional foi otimizada para a obtenção de uma melhor
sensibilidade.
 41

[BH4]- + H3O++ 2H2O → H3BO3 + 4H2 (4)

O efeito da concentração da solução ácida nesta reação foi avaliado para

amostra digerida enriquecida e padrão aquoso, ambos na concentração de 6 µg/L de
Hg, fixando em 1 % m/v a concentração de NaBH4 com 0,25 % m/v de NaOH (figura
7).

Figura 7 - Efeito da concentração de HCl com 1 % m/v NaBH4 e 0,25 % m/v de NaOH.

Fonte: a autora.

Pode-se observar que para as baixas concentrações de ácido há uma

diferença considerável no comportamento observado para padrão e para a amostra
associado à influência da concentração de HCl. Para o padrão aquoso permite-se
considerar que o comportamento para todos as concentrações de HCl avaliadas foi
praticamente constante. No entanto para a amostra enriquecida observa-se que
conforme a concentração de HCl aumenta a intensidade de sinal para o Hg na
presença da matriz também aumenta até aproximadamente 5 % m/v de HCl. Acima
desta concentração o comportamento para amostra assim como para o padrão,
mantêm-se praticamente constante. Logo, acima de 5 % m/v de HCl há
concentração suficiente para que ocorra a redução total do Hg2+ a Hg0 .
 42

Sabe-se que a adição de um excesso de HCl pode induzir a formação de um

excesso de H2, resultando na diluição do vapor do analito com consequente redução
do sinal analítico (DITTERT et al., 2007). Ressalta-se também que baixas
concentrações podem prejudicar a redução do Hg-i, conforme equação 4. Diante
disso, a concentração de 10 % m/v de HCl foi a concentração otimizada para as
análises posteriores.

5.1.2 Efeito da concentração do NaBH4

O efeito do agente redutor foi avaliado variando de 0 a 2,0 % m/v da

concentração de NaBH4 com 0,25 % m/v de NaOH e fixando o HCl em 10 % v/v
conforme otimizado anteriormente (figura 8). Os resultados obtidos apresentaram
boa correlação com o comportamento já reportado na literatura (TAO; WILLIE;
STURGEON, 1998; KAERCHER et al., 2005; TORRES; FRESCURA; CURTIUS,
2009).
Figura 8 - Efeito da concentração do NaBH4, com NaOH 0,25 % m/v e HCl 10 % v/v.

Fonte: a autora.

Os perfis das curvas obtidas mostram comportamento similar entre padrão e

amostra. Ambas têm um perfil crescente alcançando um máximo em 0,25 % m/v que
permanece até 1,0 % m/v, quando a intensidade do sinal começa a diminuir. Para o
padrão aquoso, a mínima concentração de NaBH4 proporcionou um elevado
 43

acréscimo na intensidade de sinal. O mesmo não foi observado para a amostra,

possivelmente explicado pela presença da matriz que com o uso do KMnO4, mesmo
na ausência de agente redutor, apresentou elevada intensidade de sinal. A
concentração selecionada para este trabalho foi a de 0,25 % m/v de NaBH4, sendo
esta a que apresentou melhor sinal analítico tanto para amostra quanto para o
padrão aquoso, ou seja, é a concentração suficiente para garantir a redução de todo
o Hg2+ a Hg0 (equação 5) (D’ULIVO, 2010).

nHg2+ + [BH4]- → HgH2 → nHg0 + H2 (5)

5.1.3 Efeito da concentração do NaOH

A função do NaOH é a estabilização da solução de NaBH 4 evitando que

ocorra a hidrólise ácida em solução aquosa (YAN; NI, 1994; STURGEON; MESTER,
2002). Para avaliar esta concentração foram selecionadas uma faixa de 0 a 0,5 %
(m/v) de NaOH fixando em 1 % (m/v) de NaBH4 e 10 % (v/v) de HCl (figura 9).

Figura 9 - Efeito da concentração do NaOH, com NaBH4 1 % m/v e HCl 10 % v/v

Fonte: a autora.
Observa-se que tanto para o padrão aquoso quanto para a amostra, o sinal
não apresentou diferença de intensidade em diferentes concentrações de NaOH.
 44

Esse achado demonstra a sua função de apenas estabilizar o NaBH4, não

participando da análise do Hg. Sendo assim, fixou-se a concentração mínima de
0,10 % m/v de NaOH, apenas para garantir a estabilidade da solução de NaBH4.

5.2 EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE KMnO4

Os valores obtidos na avaliação do efeito da concentração de KMnO 4

encontram-se na Figura 10. Observa-se que até 0,1 % m/v de KMnO4 o sinal
analítico é crescente para padrão aquoso e para amostra enriquecida. e mantêm-se
constante a partir de 0,1 % m/v. Isso caracteriza total oxidação do Hg contido nas
soluções, conforme outros trabalhos da literatura (TAO; WILLIE; STURGEON, 1998;
RODRIGUES et al., 2009). Também foi possível verificar que no intervalo de 0,1 a
0,4 % m/v de adição de KMnO4 não há interferência no sinal analítico.

Figura 10 - Efeito da concentração de KMnO4.

Fonte: a autora.

Reforça-se também que após adição de 0,1 % m/v de KMnO4 as soluções

se mantiveram com coloração púrpura. (figura 11), caracterizando um excesso de
KMnO4 que garante a total oxidação do Hg (GUILHEN; PIRES; DANTAS, 2010).
Sendo assim, fixou-se o valor de 0,1 % m/v de KMnO4 para as análises seguintes
mantendo-se a observação da coloração púrpura. O sistema de introdução de
 45

amostra no AAS é em fluxo sendo composto por uma série de sistemas em linha,
composto por tubos tipo tygon que poderiam ficar coloridos com a introdução de
amostras contendo KMnO4. Diante do exposto, passado o tempo de reação, optou-
se por adicionar cloridrato de hidroxilamina (0,05% m/v) para reagir com o excesso
de permanganato, evitando assim a formação de dióxido de manganês (MnO 2).

Figura 11 - Soluções de otimização para KMnO4 em tecido de peixe.

Fonte: a autora.

5.3 FRACIONAMENTO DE MERCÚRIO

O fracionamento de Hg foi realizado com análises de Hg-t e extrações de

Hg-i utilizando amostras de tecido de anchova preparadas conforme item 4.2.2. A
obtenção da fração de Hg-o foi obtida através da subtração de Hg-t e Hg-i.

5.3.1 Análise de Hg-t

O tipo de ácido assim como sua quantidade são parâmetros importantes

quando se emprega radiação micro-ondas. O uso de ácidos concentrados em
sistemas fechados pode causar danos ao equipamento e até apresentar perigo de
explosão decorrente dos seus vapores do ácido quando reagem com os vapores
orgânicos da amostra (KRUG, 2006). O HNO3 é uma boa opção e o mais utilizado
para a decomposição de amostras biológicas/orgânicas. Além do HNO3, o uso de
H2O2 como agente oxidante auxilia durante a decomposição assistida por micro-
ondas (KINGSTON; HASWALL, 1997).
 46

Uma das vantagens do uso de H2O2 em meio ácido, se comparado com

outros agentes oxidantes, é que sua decomposição gera somente moléculas de
água como produto. (equação 6), aumentando assim seu poder de oxidação
(HAYNES, 2017).

H2O2 + 2H+ + 2e- ⇆ 2H2O E0 = 1.78 V (6)

O emprego desta mistura de HNO3 e H2O2 mostrou-se eficiente na

decomposição da matéria orgânica quando se trata de tecido muscular de peixe.
Além disso, levando em consideração que o branco analítico é o mais afetado na
etapa de preparo de amostras por causa dos riscos de perdas do analito e/ou
contaminação, as análises de Hg-t apresentaram baixos valores de brancos de
reagentes quando utilizou-se esta mistura.
Nos primeiros experimentos empregando amostra de peixe úmido foi
observada falta de reprodutibilidade, proveniente da falta de homogeneidade da
amostra. Para tornar a amostras mais homogêneas e aumentar a precisão do
método, as mesmas foram submetidas ao processo de secagem.
Para verificar se a secagem poderia ocasionar perdas de Hg por
volatilização, foi realizada a determinação de Hg-t em amostras de tecido de peixe
úmidas em comparação com a mesma amostra submetida ao processo de secagem
em estufa considerando uma redução de 75 % de peso durante a secagem
(SEIXAS, 2004). Esta possível perda de Hg durante a secagem foi avaliada
pesando-se 500 mg da amostra úmida e da amostra seca, sendo ambas submetidas
ao processo de digestão.
Para essa análise foi observada a formação de grande quantidade de
NO/NO2 proveniente da decomposição de grande quantidade de matéria orgânica na
amostra seca. A formação desses gases proporcionou a perda de Hg por
volatilização, cerca de 60 % se comparada ao tecido de peixe úmido. Assim
considerando o teor médio de carbono de 52 % em tecido de peixe (KRUG, 2006),
foi necessário ajustar a massa de amostra para metade do valor inicial, 250 mg, e
realizar novamente a comparação com o tecido úmido. Com isso foi possível
diminuir a formação de gás NO/NO2 na digestão e minimizar as perdas por
volatilização. Ressalta-se que o uso de amostras secas que são finamente moídas
 47

são mais homogêneas, podendo ser subdivididas, mantendo a representatividade se

cuidadosamente misturadas (KRUG, 2006).
Para verificar a eficiência da digestão foram avaliadas duas amostras de
peixes digeridas com e sem adição de Hg2+ (Hg-i) e MeHg (Hg-o) (tabela 6).

Tabela 6 - Teste de recuperação para Hg-t determinado em amostra de tecido de peixe. Média dos
valores ± SD, n=6.
Amostra não
Hg-i Hg-o (MeHg) Hg-t Obtido
Amostras enriquecida % Rec
Add (μg/L) Add (μg/L) (μg/L)
(Hg-t) (μg/L)
1 2,05  0,01 1 1 4,31  0,004 113
2 3,11 0,007 1 1 5,12  0,02 101
Fonte: a autora

Pode-se observar por meio das amostras sem enriquecimento que as

mesmas já apresentavam algum teor de Hg. Sendo assim, todo Hg adicionado
somado ao Hg proveniente da própria amostra pôde ser recuperado com até 113 %
de eficiência utilizando o método proposto. Estes resultados evidenciam a
capacidade de decomposição da matriz e conversão das espécies de Hg à Hg-i pelo
processo de digestão ácida auxiliada por micro-ondas. Com base nestes resultados
como procedimento otimizado optou-se por secar a 40°C por 48h os tecidos de
peixe como pré-preparo das amostras reais de tecido de peixe.

5.3.2 Análise de Hg-i e Hg-o

Na literatura são relatados vários procedimentos e técnicas analíticas

quando se trata da determinação de Hg-i e MeHg em matrizes biológicas, contudo, o
desenvolvimento destes métodos para quantificação de MeHg em amostras
biológicas não é tão simples, devido aos problemas relacionados à extração do
analito da amostra e ao método de quantificação final empregado (FARIAS;
FÁVARO; VASCONCELLOS, 2009). É importante ressaltar que o método proposto
 48

deve ser capaz de separar as frações de Hg sem modificar a identidade das

espécies ao longo do processo.
Para o fracionamento do Hg-o geralmente utiliza-se uma etapa de separação
ou extração, antes de sua quantificação. A quantificação de Hg-o pode ser realizada
por diferença do Hg-t e do Hg-i, mesmo os solventes extratores não sendo seletivos
para as espécies de Hg. Quando utiliza-se como agente redutor o NaBH4, somente o
Hg-i é quantificado, já que o Hg-o que pode estar contido na solução não será
reduzido a Hg0 e sim, por exemplo no caso do MeHg, será reduzido a MeHgH que é
volátil mas não será detectado por AAS (KAECHER et al., 2005; D’ULIVO, 2010).
Para a extração de Hg-i são sugeridos diversos procedimentos que envolvem, por
exemplo, a digestão alcalina (CARRASCO; VASSILEVA, 2014), extração com
solventes orgânicos e/ou inorgânicos (BATISTA et al., 2011, TORRES et al., 2005),
troca iônica (FARIAS; FÁVARO; VASCONCELLOS, 2009), extração enzimática ou
extração assistida por micro-ondas (REYES et al., 2008).
A utilização de HCl como agente extrator é bastante difundida na literatura
com resultados promissores e recuperações satisfatórias com uso de soluções
diluídas do ácido (ÇAYLAK et al., 2019; FARIAS; FÁVARO; VASCONCELLOS,
2009; VALLANT; KADMAR; GOESSLER, 2007; KAERCHER et al., 2005). Para este
estudo foi avaliado o uso de HCl como agente extrator utilizando-se a amostra de
referencia certificada TORT-2 em diferentes concentrações de ácido (figura 12).

Figura 12 - Curva de recuperação do Hg-o considerando o uso de 5 mL de solução de HCl em

diferentes concentrações sob a massa de 150 mg de CRM (TORT-2).

100

80
% Recuperação

60

40

20

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
-1
[HCl] mol.L

Fonte: a autora.
 49

De acordo com a curva obtida não houve extração significativa quando se

utilizou concentrações abaixo de 1M. Já após esta concentração ocorreu um
aumento gradativo, conforme aumenta a concentração de HCl atingindo um patamar
máximo de extração na concentração de 7 M, com um valor de 93% de
concordância para MeHg, considerando o valor certificado do CRM. Este valor foi
obtido pela subtração do valor encontrado para Hg-i do valor de Hg-t determinado
com a digestão ácida auxiliada por micro-ondas para o CRM. Optou-se por avaliar o
valor de concentração de MeHg do CRM para avaliar a possibilidade de
interconversão das espécies. O valor alto de concordância indica que não foi
observada interconversão no processo de extração com HCl. Este resultado está de
acordo com outros trabalhos encontrados na literatura (RIO-SEGADE; BENDICHO,
1999; ORTIZ; ALBARRAN; RICA, 2002). Informa-se que não foram utilizados valores
maiores de concentração de HCl para garantir que não houvesse conversão das
espécies de Hg.
Após os resultados promissores com as amostras certificadas, foram
realizadas diversas análises de adição e recuperação de Hg-i utilizando a matriz de
tecido de peixe anchova selecionada para este trabalho. Os resultados obtidos não
foram satisfatórios com recuperações que não ultrapassaram a faixa de 30 a 50 %,
mesmo com temperaturas de até 80°C durante a extração, tendo eficiência menor
do que o obtido por Ortiz, Albarran e Rica (2002) 97 ± 5% e Reyes e colaboradores
(2008) 80 ± 9%, e mesma eficiência se comparado as recuperações de 46 % de Hg-i
obtidas por Zmozinski e colaboradores (2014). Essa pouca eficiência de extração do
Hg-i pelo HCl pode ter ocorrido devido a forte interação que o Hg2+ adicionado tem
por grupamentos sulfidrila (-SH) de aminoácidos como a cisteína e a metionina
presente nas proteínas da amostra (HOVART; GIBICAR, 2005). Sendo assim optou-
se pela utilização de outro solvente extrator que tivesse maior interação com o Hg.
O uso de reagentes sulfurados como a L-cisteína (SARZANINI, 1994;
REYES et al., 2008; SCHMIDT et al., 2013), o tiossulfato de sódio (HOLAK, 1982), o
dodecil sulfato de sódio (SDS) (ORTIZ; ALBARRAN; RICA, 2002) e o 2-
mercaptoetanol (CARNEADO et al., 2015; VACCHINA et al., 2017) também são
relatados como usados para a extração de Hg. A grande afinidade do Hg2+ com o
 50

enxofre presente nestes compostos promove a extração das espécies de Hg da

matriz da amostra.
Como segunda opção de agente extrator optou-se pelo uso de L-cisteína por
se tratar do mesmo aminoácido que liga a forma química primária de CH3Hg+ no
músculo dos peixes como um composto CH3Hg–cisteína (REYES et al., 2008). A
eficiência de sua extração também é bastante reportada na literatura, utilizando uma
concentração de 1 % m/v. Hight e Cheng (2006), alcançaram uma recuperação de
94–97% para Hg-i, enquanto Reyes e colaboradores (2008) conseguiram uma
recuperação de 95 % em amostras de peixe e Pilz (2009) chegou a valores de
recuperação na faixa de 89-109 % para Hg-i em amostras de cogumelos.
Nas primeiras análises dos tecidos úmidos utilizando o método de extração
de Hg-i com L-Cisteína ocorreu a formação de muita espuma durante a reação de
geração de vapor de Hg, então se optou pela utilização de amostras secas também
nesta análise.
Na avaliação das extrações utilizando L-Cisteína também foi adotado o
método de adição e recuperação de Hg2+ em amostras de tecido de peixe (figura
13). Nos primeiros experimentos utilizando uma massa de 500 mg de amostra de
tecido de peixe seco foram possíveis recuperações de Hg2+ na faixa de 75%. Essa
baixa recuperação pode ser explicada devido a formação de espuma proveniente da
rápida reação da amostra biológica com NaBH4 e HCl. Como a espuma é um
interferente cinético na geração de vapor de Hg (TAKASE et al., 2002), ocorreu a
diminuição do sinal analítico. Para corrigir esta interferência houve a necessidade de
diminuição da massa de amostra de 500 mg para 250 mg, já que a adição de
antiespumante também diminui o sinal analítico (SOARES, 2012). Após este ajuste,
foram obtidos resultados de 82 % quando utilizado banho a 60°C por 1 hora durante
a extração sem considerar o uso de antiespumante uma vez que o problema de
formação de espuma foi controlado com a diminuição de massa de tecido.
 51

Figura 13 - Comparação de diferentes massas e uso de antiespumante.

100 S e m a n tie s p u m a n te

C o m a n t ie s p u m a n t e

R e c u p e ra ç ã o H g , % 80

60

40

20

0
250 500
M assa, m g

Fonte: a autora.

Com a necessidade de otimizar e identificar quais variáveis poderiam

influenciar significativamente durante a extração de Hg-i (Hg2+) considerando que o
Hg-o presente não seja extraído nem interconvertido utilizando L-cisteína como meio
extrator, foi feito um planejamento experimental de dois níveis para triar a
significância das variáveis. Foi utilizado um planejamento fatorial fracionado 24-1, de
forma que no primeiro planejamento foram avaliadas as variáveis Massa de amostra
(Massa), Temperatura de extração (T°C), Tempo de Aquecimento e concentração de
L-cisteína ([L-Cys]). Ressalta-se que foi necessário novo ajuste de massas devido à
formação de espuma na reação. Com isso as massas foram reduzidas a um valor
máximo de 150 mg. Os níveis avaliados encontram-se descritos no Item 4.2.2.2. As
respostas obtidas foram normalizadas (absorvância integrada dividida pela massa
usada no experimento) para que não houvesse falsas interpretações quanto ao
procedimento de extração associado às massas crescentes (tabela 7).
 52

4-1
Tabela 7 - Primeiro planejamento fatorial 2 executado e suas respectivas respostas. Planejamento
executado com tempo de US de 5 min.

Variáveis Absorvância
integrada
Experimento L-Cys Tempo normalizada,
Massa (mg) T °C s/g
(% m/v) (min)
Hg-i
1 50 0,5 40 30 0,1627
2 150 0,5 40 90 0,0710
3 50 1,5 40 90 0,1773
4 150 1,5 40 30 0,0676
5 50 0,5 80 90 0,1890
6 150 0,5 80 30 0,0850
7 50 1,5 80 30 0,2766
8 150 1,5 80 90 0,0789
9 100 1 60 60 0,1123
10 100 1 60 60 0,0919
11 100 1 60 60 0,0843
Fonte: a autora.

O resultado obtido através de um planejamento de dois níveis é comumente

um gráfico de pareto (figura 14). .

4-1
Figura 14 - Diagrama de pareto para o primeiro planejamento 2 .

Fonte: a autora.
 53

Analisando o diagrama é possível observar que a única variável que

apresentou influência significativa, representada pela barra que ultrapassa a linha
tracejada para função p=0,05 (95% de confiança), na extração da fração de Hg-i foi
a massa de amostra. Seu valor de efeito negativo indica que quantidades menores
de massa apresentaram uma melhor extração do Hg-i. Considerando a massa de 50
mg sugerida no planejamento observou-se que devido a quantidade de Hg-i
presente em amostras de tecido de peixe geralmente apresentarem valores muito
baixos em relação ao Hg-t, essa massa poderia não apresentar valores
quantificáveis com o método proposto. Sendo assim utilizou-se a massa logo acima
no valor de 100 mg onde considerou-se que mesmo em menores concentrações o
Hg-i poderia ser quantificado. As demais variáveis não apresentaram influências
significativas, mas o efeito positivo da temperatura de extração e da concentração de
L-Cys indica que temperaturas maiores e maior concentração de L-Cys, favorecem a
extração. Para a variável tempo de extração, com um efeito negativo no diagrama, é
sugerido que tempos menores favorecem a extração. As interações entre as
variáveis não apresentaram significância.
O tempo necessário para alcançar a extração total sólido-líquido depende da
interação analito-matriz, composição do meio líquido e do tipo de dispositivo
ultrassônico que está sendo utilizado. O tempo necessário para a extração total do
analito com banho ultrassônico é mais dependente da matriz do que com o uso de
sonda ultrassônica, mas, como regra geral, quanto mais "inorgânica" for a matriz,
mais tempo será necessário (CAPELO; MADURO; VILHENA, 2005).
Em geral, observa-se que a agitação ultrassônica diminui o tempo de
extração e a concentração de solventes, quando comparada aos métodos de
agitação manual ou agitação por efeito vórtex frequentemente utilizados em
laboratório. Entretanto, a extração quantitativa depende fortemente da interação dos
analitos com a matriz. Assim, embora os métodos assistidos por ultrassom sejam
promissores, é recomendável que as variáveis que influenciam na extração dos
analitos sejam avaliadas em diferentes tipos de amostras antes da utilização deste
método (CAPELO; MADURO; VILHENA, 2005).
 54

Diante do exposto e tendo em vista a utilização de banho ultrassônico na

extração com L-Cisteína, sentiu-se a necessidade de avaliar a significância do tempo
de ultrassom como variável. Para isto foi realizado um novo planejamento fatorial
fracionário 24-1 incluindo a variável Tempo de Ultrassom (Tempo US) e fixando a
massa de amostra em 100 mg. Neste novo planejamento novamente considerou-se
como resposta a absorvância integrada normalizada pelas massas usadas em cada
experimento (tabela 8).

4-1
Tabela 8 - Segundo planejamento fatorial 2 executado e suas respectivas respostas, com massa
fixa de 100 mg.

Variáveis Absorvância
integrada
Experimento L-Cys Tempo US Tempo de normalizada,
T °C s/g
(% m/v) (min) aquecimento (min)
Hg-i
1 0,5 0 20 30 0,1097
2 1,5 0 20 90 0,1447
3 0,5 10 20 90 0,0892
4 1,5 10 20 30 0,1440
5 0,5 0 80 90 0,1188
6 1,5 0 80 30 0,1223
7 0,5 10 80 30 0,1128
8 1,5 10 80 90 0,1430
9 1 5 50 60 0,1140
10 1 5 50 60 0,1025
11 1 5 50 60 0,0959
Fonte: a autora.

Abaixo o gráfico de paretos obtido para este novo planejamento (figura 15).
 55

4-1
Figura 15 - Diagrama de paretos para segundo planejamento 2 .

Fonte: a autora.

Observando o diagrama de paretos da figura 15, nota-se que a única

variável que apresentou significância nos experimentos realizados foi a
concentração de L-Cys. Seu efeito positivo indica que maiores concentrações de L-
Cys favorecem a extração do analito. A curvatura não foi significativa indicando que
os níveis escolhidos estão distantes de uma condição que favoreça máxima
resposta, fazendo-se necessário mudar os níveis num planejamento subsequente.
Para a variável temperatura de extração, foi obtido o mesmo efeito positivo do
planejamento anterior, indicando que maiores temperaturas são necessárias para
uma melhor extração. Neste estudo o tempo de aquecimento apresentou menor
influência durante a extração e o seu efeito passou a ser positivo indicando que
maior tempo é necessário para a extração. O tempo de ultrassom não foi
significativo e observou-se um efeito negativo muito baixo não apresentando
influencia durante os experimentos. A metodologia de superfície de resposta foi
escolhida considerando a variável mais significativa, concentração de L-Cys, e a
variável temperatura, por sua interação com a L-Cys ser o segundo fator individual
com maior valor de efeito. Foi utilizado o planejamento hexagonal com dois fatores
(Doehlert), onde as variáveis selecionadas foram a concentração de L-Cys ([L-Cys]),
 56

avaliada em cinco níveis e a temperatura de extração (T°C), avaliada em três níveis.

Os experimentos consideraram o tempo de aquecimento de 30 min para todos os
experimentos e o tempo de US a 10 min. Mesmo sem influência significativa optou-
se por continuar com a etapa de US por 10 min apenas para garantir uma mistura
homogênea da amostra na solução extratora. A seleção da temperatura como
parâmetro a ser avaliado se deu pela necessidade de se definir a melhor
temperatura para realizar o experimento. A massa foi fixada conforme experimentos
anteriores em 100 mg. A tabela 9 apresenta os experimentos executados e suas
respostas obtidas através da absorbância corrigida pela massa pesada que gerou a
resposta integrada.

Tabela 9 - Planejamento Doehlert executado e suas respectivas respostas, considerando o uso de

100 mg de amostra ,10 min US e 30 min de tempo de aquecimento.

Variáveis Absorvância
integrada
Experimento L-Cys
T °C normalizada,
(% m/v) s/g
1 0,5 50 0,0905
2 1,0 20 0,0820
3 2,0 20 0,1326
4 2,5 50 0,0928
5 2,0 80 0,1552
6 1,0 80 0,0927
7 1,5 50 0,1241
8 1,5 50 0,1223
9 1,5 50 0,1078
Fonte: a autora.

A partir dos experimentos utilizando o método de planejamento Doehlert, foi

gerada uma superfície de resposta em formato 3D (figura 16) e em formato de
curvas de contorno (figura 17).
 57

Figura 16 – Superfície resposta 3D das variáveis concentração de L-Cys e temperatura de extração.

Considerando 100 mg de amostra ,10 min US e 30 min de tempo de aquecimento.

Fonte: a autora.

Figura 17 – Curvas de contorno das variáveis concentração de L-Cys e temperatura de extração.

Considerando 100 mg de amostra ,10 min US e 30 min de tempo de aquecimento.

Fonte: a autora.

Observando as superfícies de resposta fica mais evidente a influência da

temperatura durante a extração. Temperaturas elevadas na faixa de 80-90 °C
facilitam a liberação do Hg-i para o solvente extrator. Uma concentração de 2,0 %
de L-Cys é o ideal para se obter respostas máximas, maior intensidade de sinal para
o Hg-i nas condições deste estudo. Esta influência pode ser melhor observada na
 58

superfície de curvas de contorno (figura 18). Sendo assim, a condição ótima de

extração de Hg-i foi considerada para 100 mg de amostra seca, usar 5 mL de L-Cys
a 2,0 % m/v , 10 min de US e aquecimento por 30 min à 80°C.
Após avaliar as variáveis significativas e definir a proposta de método para o
fracionamento de Hg2+ em amostras de tecido de peixe utilizando L-Cys, foram
realizados testes de adição e recuperação de Hg2+ e MeHg para avaliar a eficiência
da extração e a conversão das espécies. Os resultados destes experimentos
encontram-se na Tabela 10.

Tabela 10- Teste de recuperação para Hg-i determinado em amostra de tecido de peixe. Média dos
valores (SD), n=2.
Amostra não Hg-i Add Hg-o Add Hg-i Obtido
Amostras % Rec
enriquecida (μg/L) (μg/L) (μg/L) (μg/L)

1 <0,07 1 1 0,910,01 91
2 <0,07 1 1 0,98 0,01 98
Fonte: a autora.

Deve-se dar atenção especial ao processo de extração para preservar a

integridade das formas químicas originais e evitar a transformação de espécies
(REYES et al., 2008). Neste estudo pode-se observar que com o método de
extração otimizado (0,2 % m/v de L-Cys e 80°C por 30 min) não houve
interconversão das espécies durante a extração do Hg-i e MeHg adicionados. O Hg-i
foi recuperado com uma taxa de 98%. Também foi observado que a quantidade de
Hg-i presente nas amostras está em níveis muito baixos, muitas vezes abaixo do
LOQ do método. Isso se deve ao fato de que a maior parte do Hg absorvido pelos
peixes já está possivelmente na forma orgânica, devido a metilação sofrida pelo Hg-i
através das plantas, bactérias e substâncias húmicas presentes na água
(BECKERS; RINKLEBE, 2017). Em peixes predadores, como é o caso da anchova
utilizada neste estudo, devido a biomagnificação, a fração de MeHg do Hg-t pode ser
elevada (SENN et al., 2010).
 59

5.4 PARÂMETROS DE MÉRITO

Para avaliação dos parâmetros de mérito foram construídas duas curvas de

calibração, uma em HNO3 1 % (v/v) com adição de KMnO4 0,1 % (m/v) e outra de L-
Cys 0,25 % (m/v) na faixa de concentração de 0,05 a 6 µg/L. Foram feitas 15 leituras
do branco e calculado o DP destas leituras, no qual o valor de 0,0001 foi
determinado para ambas as curvas. O cálculo do LOD e o LOQ foram determinados
utilizando as fórmulas descritas no item 4.2.6. Ambas as curvas apresentaram boa
linearidade e uma relação muito forte entre a concentração e o sinal analítico (tabela
11).

Tabela 11- Parâmetros de mérito obtidos para as curvas de calibração de Hg(II).

Coef. Coef. LOD LOD LOQ LOQ

Curva
Correlação Angular (μg/L) (µg/g) (μg/L) (µg/g)

HNO3 1% + KMnO4 0,1% 0,9998 0,01417 0,02 0,01 0,07 0,03

L-Cys 0,25% 0,9995 0,01527 0,02 0,01 0,07 0,03

Fonte: a autora.

O teste t student foi realizado para avaliar a diferença entre as curvas em

diferentes meios. O valor obtido para o teste t foi de 1,18 < 1,943 (p<0,05), que é o
valor para seis graus de liberdade, sendo n=4 (quatro curvas) e 2n-2=6, portanto,
considerou-se que não existe diferença significativa entre as curvas.
Durante os experimentos foi observado efeito de memória quando utilizou-se
a curva feita em HNO3 1 % (v/v). O efeito de memória é possivelmente decorrente da
retenção de Hg nas paredes do tubo reacional (LI et al., 2005) e foi verificado
através do aumento do sinal analítico e do coeficiente angular das curvas de
calibração. Devido a este fator optou-se pela utilização da curva em L-Cys 0,25 %
(m/v) por não ser observada a ocorrência do efeito de memória. A curva foi então
ajustada de acordo com o LOD e o LOQ obtidos, sendo o ponto mais baixo ajustado
para o valor logo acima do LOQ, 0,1 µg/L, até a concentração de 6 µg/L.
Estes valores foram selecionados levando em consideração a faixa média de
concentrações encontradas em tecido de peixes segundo a FDA e o limite máximo
 60

de Hg em alimentos determinado pela ANVISA para peixes predadores, que é de 1

mg/Kg (ANVISA, 2013).
Os métodos propostos para quantificação de Hg-t e Hg-i, após serem
otimizados, foram validados utilizando os CRMs TORT-2 e DORM-3 (tabela 12).

Tabela 12- Testes de recuperação de Hg-t e Hg-i para materiais certificados, média (DP), aplicado
limite de confiança de 95% com n = 2.
CV-AAS Diferença Valor certificado
Amostra Hg-t Hg-i Hg-o Hg-t MeHg
certificada (μg/g) (μg/g) (μg/g) (μg/g) (μg/g)
TORT-2 0,247 0,010 0,0960,017 0,151 0,270 ± 0,06 0,152 ± 0,013
DORM-3 0,4420,017 0,0720,017 0,370 0,382 ± 0,06 0,355 ± 0,056
Fonte: a autora.

Os resultados encontrados para os CRMs demonstram que o método

proposto para análise de Hg-t e Hg-i estão de acordo com o esperado estando os
valores encontrados dentro da faixa de aceitação do DP comparado ao valor
certificado. Observa-se também que o DP do método proposto encontra-se com
valores mais baixos se comparado ao valor certificado. A quantificação da fração de
Hg-o para estas amostras é associado a valores certificados de MeHg, que também
foi obtido por diferença das concentrações de Hg-t e Hg-i, estando o valor
encontrado de acordo com o valor certificado para cada material. Ressalta-se
também que na biota marinha, o Hg-o pode ser considerado como MeHg, com um
erro insignificante (AZERMARD; VASSILEVA, 2015).

5.5 APLICAÇÃO DO MÉTODO EM AMOSTRAS DE ANCHOVA

O método proposto foi aplicado em 12 exemplares de amostra de anchova

adquiridos em mercados locais da grande Florianópolis. As análises de Hg-t e Hg-i
foram realizadas no mesmo dia (tabela 13).
 61

Tabela 13 – Resultados para Hg-t, Hg-i e Hg-o em amostras de tecido muscular de Anchova em peso
seco, média ±DP, n=3.

Amostras Hg-t Hg-i Hg-o

n=3 (μg/g) (μg/g) (μg/g)

1 0,69±0,01 0,058±0,001 0,63±0,02

2 0,65±0,02 0,09±0,03 0,56±0,05
3 0,38±0,01 0,059±0,008 0,321±0,005
4 0,52±0,02 0,09±0,03 0,43±0,05
5 0,34±0,08 0,08±0,01 0,26±0,07
6 0,57±0,02 0,09±0,01 0,482±0,008
7 0,45±0,05 0,09±0,02 0,36±0,03
8 0,56±0,04 0,036±0,004 0,52±0,04
9 0,53±0,03 0,04±0,02 0,49±0,03
10 0,58±0,09 0,03±0,01 0,55±0,09
11 0,50±0,10 0,05±0,01 0,45±0,10
12 1,30±0,19 0,06±0,01 1,23±0,2
Fonte: a autora.

Em geral o valor médio para Hg-t ficou abaixo do limite máximo para
alimentos se considerado o valor de 1 mg/Kg que equivale a 1 µg/g. Apenas uma
amostra ultrapassou este limite. Para Hg-i foram encontradas baixas concentrações
na faixa de 0,03 a 0,1 µg/g em todas as amostras, inclusive na que apresentou maior
teor de Hg-t.
Avaliando as amostras de uma maneira geral, observa-se que nove das
Anchovas analisadas (75 %) estão com quantidades de Hg-t abaixo de 0,6 µg/g,
duas amostras (16,7 %) estão na faixa de 0,61 a 0,9 µg/g e apena uma amostra
(8,33 %) está na faixa de 1,21 a 1,5 µg/g, que ultrapassa o limite máximo permitido
pela ANVISA (figura 18).
 62

Figura 18 - Concentração de Hg-t em 12 amostras de Anchova.

Fonte: a autora.

Para as amostras analisadas a fração de Hg-o em relação ao Hg-i encontra-

se em maior concentração, estando esses resultados de acordo com outros estudos
que demonstram que boa parte do Hg encontrado em peixes marinhos está na forma
de espécies orgânicas, Hg-o (SENN et al., 2010), conforme demonstrado na figura
19.

Figura 19 - Fração de Hg-o em relação ao Hg-t.

Hg-t
Hg-o

Fonte: a autora.

Apenas duas amostras (5 e 7) tem concentrações de Hg-o abaixo de 80 %.

As outras 10 amostras tem frações de Hg-o na faixa de 80 a 95 % do Hg-t. Os
resultados chamam a atenção pelo elevado teor de Hg-o, podendo ser inclusive
majoritariamente associado ao MeHg. Nas amostras analisadas, considerando que
 63

não há valor regulatório para as espécies orgânicas e sabendo do seu maior

potencial tóxico, os resultados deste trabalho servem de alerta para que maior
atenção aos aspectos toxicológicos das espécies e revisão das legislações vigentes
seja iniciada.
Buscando na literatura é possível fazermos uma comparação do valor médio
em µg/g de peso úmido encontrado para anchovas e comparar com o valor médio
encontrado neste estudo (tabela 14).

Tabela 14- Comparação entre médias de Hg-t em outros trabalhos da literatura em relação a este
trabalho.
Média
n Hg-t (µg/g) Técnica Analítica Cidade (País) Referência
Peso úmido
206 0,350 Analisador de Hg Nova Jersey (EUA) Burger (2009)
9 0,089 CV-AAS PoA/Florianópolis (Brasil) Mirlean et al. (2019)
40 0,370 Analisador de Hg Nova Jersey (EUA) Burger, 2013
Szczeback and
154 0,254 DMA Narragansett Bay (EUA)
Taylor (2011)
Noroeste Oceano
21 0,473 ICP-MS Staudinger (2011)
atlântico
Taylor and
70 0,320 DMA Nova Inglaterra (EUA)
Willianson, 2017
Long Island e
177 0,324 CV-AAS Skineer et al., (2007)
Connecticut
40 0,327 Analisador de Hg Carolina do Norte Cross et al. (2015)
12 0,137 CV-AAS Grande Florianópolis Este estudo (2019)

Pode-se observar que a concentração média de Hg-t encontrada na região

da grande Florianópolis agora considerando a massa úmida, está bem abaixo do
que é encontrado no litoral dos Estados Unidos (EUA) por exemplo. Isso se deve ao
fato dessas regiões dos EUA terem maior quantidade de fontes de emissão de Hg
próximas aos locais de coleta da anchova. Uma possibilidade, se pensarmos no
estado de Santa Catarina, seriam as emissões de Hg provenientes de termoelétricas
 64

que queimam carvão e a região sul do estado conhecida por possuir uma bacia
carbonífera. Esse Hg poderia estar sendo transportado na atmosfera e sofrendo
deposição em regiões oceânicas, o que parece ter uma pequena parcela de
influência na região da grande Florianópolis. No entanto as possíveis fontes de
emissão do Hg capazes de serem responsáveis pela presença de Hg nas anchovas
amostradas são apenas especulativas, para maiores conclusões faz-se necessário
um estudo ambiental interdisciplinar para maior compreensão do fenômeno, e este
trabalho, num primeiro momento, não teve esse objetivo, ficando então como
perspectiva futura do trabalho.
 65

6. CONCLUSÃO
O método proposto para quantificar Hg em amostras de peixe utilizando a CV-
AAS se mostrou bastante eficiente e rápido, permitindo a quantificação de Hg e suas
frações Hg-i e Hg-o em níveis de ppb.
A otimização dos reagentes envolvidos na reação de geração de vapor frio
aumentou a sensibilidade do método permitindo o uso de quantidades adequadas
de reagentes e de amostra.
A quantificação de Hg-t em amostras de peixe foi possível através de
metodologia de preparo de amostra já consolidadas na literatura, utilizando HNO3 e
H2O2 para a digestão em forno micro-ondas e KMnO4 para oxidação total do Hg
após digestão. O nível de recuperação obtido com o método alcançou 113 % do Hg-t
contido e adicionado nas amostras.
A digestão utilizando forno micro-ondas se mostrou bastante eficaz digerindo
por completo a matéria orgânica do tecido de peixe. Para tecidos úmidos é possível
utilizar massas de 500 mg de amostras, já para tecidos secos essa massa tem que
ser reduzida para 250 mg, devido ao excesso de geração de NO/NO2 no tubo
digestor, o que ocasiona perdas consideráveis de Hg por volatilização.
O fracionamento de Hg através da extração de Hg-i foi possível com a extração
sólido-líquido utilizando 2,0% m/v de L-Cys como agente extrator, 10 min de US e
com aquecimento à 80°C por 30 min. Os resultados obtidos para recuperação
alcançaram a marca de 98% para Hg-i, sem gerar interconversão entre as espécies.
Também foi possível quantificar Hg-o pela diferença entre a concentração de Hg-t e
Hg-i.
Os parâmetros de mérito demonstraram que o método possui boa linearidade e
uma correlação muito forte entre a concentração e o sinal analítico obtido. Os LOD
de 0,02 e LOQ de 0,07 ug/L estão em níveis que atendem as concentrações de Hg
encontradas em peixes e aos limites máximos permitidos em alimentos.
Foi observado efeito memória para a curva em meio de HNO 3, por este motivo
a curva em L-Cys foi a selecionada para este trabalho.
 66

A utilização de CRM comprovou a exatidão do método através de resultados

com excelente concordância como valor certificado e com DP baixo caracterizando a
precisão do método.
A aplicação do método otimizado em amostras de anchova comercializadas na
grande Florianópolis comprovou a eficiência da extração de Hg-i e da quantificação
de Hg-t, sendo possível realizar o fracionamento e a quantificação de Hg-o. A fração
de Hg-o encontrada nas amostras de anchova foram muito superiores as de Hg-i,
chegando a frações de 95% do Hg-t, corroborando com os dados da literatura que
demonstram que a fração de Hg-o nesta espécie de peixe pode atingir até 100% do
Hg-t, o que é bastante alarmante quando se considera a ingestão deste peixe.
De forma geral este trabalho é uma contribuição de que é necessária maior
atenção de órgãos fiscalizadores para que as legislações passem a regular valores
para espécies e/ou frações orgânicas de metais em qualquer matéria que esteja
acessível ao consumo humano, tais como peixes.
 67

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