Fonte da imagem: http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2008/08-0147/docs/DN30208.

ppt#269,16,Model of
DNA DNA is Comprised of Four Base Pairs

2
 LOCALIZAÇÃO DO DNA

Fonte da imagem: http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2008/08-0147/docs/DNAF_030208.ppt

Procariontes: o DNA
encontra-se no hialoplasma,
constituindo o nucleóide.

Eucariontes: 99% DNA

encontra-se no núcleo (figura 1).

Figura 1 – Localização do
DNA nas células
eucarióticas

3
Fonte da imagem: http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2008/08-0147/docs/DNAF_030208.ppt

O DNA apresenta três

constituintes fundamentais:

Ácido fosfórico

Pentose – desoxirribose

Bases azotadas:
bases pirimídicas – são bases
#270,17,Deoxyribonucleic Acid (DNA)

de anel simples – citosina e

timina;
bases púricas – bases de anel
duplo – guanina e adenina.

Figura 2 – Estrutura do DNA

4
Fonte da imagem: http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2008/08-0147/docs/DNAF_

As bases nucleotídicas estão

030208.ppt#269,16,Model of DNA DNA is Comprised of Four Base Pairs

dispostas para o interior da

hélice, constituindo os
“degraus da escada”. As bases
encontram-se ligadas entre si
por pontes de hidrogénio.

A “espinha dorsal” do DNA é

constituída por duas cadeias
de moléculas de desoxirribose
e fosfato.

Figura 3 – Estrutura helicoidal do DNA

5
 Gene dominante
Gene recessivo
Homozigótico
Heterozigótico
Mutação
Hereditariedade autossómica dominante
Hereditariedade autossómica recessiva
Engenharia genética ( extração do DNA, PCR, Restrição
enzimática e Electroforese)

6
Fonte da imagem: http://images.encydia.com/thumb/c/cb/EcoRI.gif/300px-EcoRI.gif
7
Fonte da imagem: http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2008/08-0147/docs/DNAF_030208.ppt#274

As enzimas de restrição são

obtidas a partir de bactérias que as
possuem para evitar a proliferação
de vírus invasores (figura 4).
São conhecidas mais de 3000
enzimas de restrição.
O nome da enzima provem do
nome do microorganismo de onde
é proveniente (exemplo Eco RI, é
o nome de uma enzima
proveniente da bactéria Escherichia
,19,DNA Restriction Enzymes

coli).

Figura 4 – Enzima de restrição

8
Fonte da imagem: http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2008/08-0147/docs/DNAF_030208.ppt#275,20

Cada enzima de restrição corta

o DNA numa sequência específica
– local de reconhecimento.
As enzimas de restrição
reconhecem 4 ou 6 pares de
bases de sequências
palindrómicas (no exemplo
GAATTC – figura 5)
Após a restrição do DNA com as
enzimas de restrição, obtêm-se
fragmentos de diferentes
tamanhos. Através da
electroforese é possível a
,Enzyme Site Recognition

separação desses fragmentos de

DNA.

Figura 5 – Restrição de sequência de DNA

10
 Exercício:
A linha que atravessa os pares de base representa os locais de corte se a enzima EcoRI
reconhecer o local GAATTC. As questões que se seguem referem-se a como uma
fragmento de DNA vai ser afectado se uma enzima de restrição cortar o DNA da forma
que se mostra a seguir:

Fonte da imagem:http://www3.bio-rad.com

1. Quantos fragmentos de DNA resultam deste corte?

2. Escreve a sequência base dos fragmentos de DNA em ambos os lados esquerdo e
direito do “corte”
3. Quais as diferenças encontradas nos dois fragmentos?
4. O tamanho dos fragmentos de DNA pode ser expresso pelo número de pares de
base no fragmento. Indica o tamanho dos fragmentos.
a) O fragmento menor tem __________ pares de bases.
b) Qual o comprimento do fragmento maior?
11
Fonte da imagem: http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2008/08-0147/docs/DNAF_
030208.ppt#283,28,Analysis of Stained Gel
12
 ELECTROFORESE

A electroforese consiste em fazer

migrar biomoléculas por uma matriz, sob
a influência de campo magnético,
permitindo separá-las segundo os seus
tamanhos (figura 6).
Permite analisar fragmentos de DNA e
determinar o seu tamanho.
O suporte de separação é a agarose –
um polissacarídeo derivado do agar,
altamente purificado e livre de cargas
(sem sais) e impurezas.

Figura 6 – Tina de electroforese

13
 Pesar 0,4 g de agarose (figura 7) num matraz,
adicionar 50 mL de tampão TAE (1x).

Proceder à sua dissolução no microondas durante

2 minutos (tapar o matraz com película aderente, e
furar a película antes de o levar ao microondas).

Retirar o matraz do microondas com o auxílio de

uma pega, e agitar suavemente, certificando de que
toda a agarose se encontra totalmente dissolvida.

Após solidificação do gel, este é submergido na tina em

tampão de electroforese.
Figura 7 - Agarose
O pente só deve ser retirado do gel quando este estiver
submerso no tampão de electroforese.

14
 Deixar arrefecer até à temperatura
aproximada de 60ºC.

Colocar o pente junto ao eléctrodo negativo

da tina de electroforese.

Verter continuamente o volume de agarose

derretida na tina de electroforese, (evitando
assim a criação de bolhas de ar) de modo a
encher a cavidade central, e a circundar os
dentes do pente (figura 8).

Aguardar a polimerização da agarose

Figura 8 – Gel de agarose
durante cerca de 20 minutos.

15
 As micropipetas são um dos instrumentos mais utilizados nos laboratórios
de biologia molecular.

Antes de pipetar, marcar o volume pretendido, girando o botão, até se

obter no visor o valor pretendido.

De seguida, colocar a respectiva ponta da micropipeta estéril, não tocando

com a mão na ponta.

Pressionar o êmbolo até se atingir a primeira resistência, mergulhar a ponta

no fluído que se pretende pipetar e largar o êmbolo devagar e continuamente.

Expelir o fluído pipetado para o local pretendido, pressionando novamente o

êmbolo até ao fim, ou seja, ultrapassando a segunda resistência, de modo a
garantir que foi eliminado todo o fluído até à última gota.

Retirar a micropipeta, sem largar o êmbolo.

Figura 9 – Micropipeta e ponta
Para descartar a ponta utilizada, pressionar o botão que se localiza atrás do
êmbolo.
 Aplicação das amostras e
separação electroforética

Fonte da imagem: http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/PDF/DiceSG.pdf

O DNA antes de ser colocado no gel
tem que ser tratado com tampão de
amostra: dá cor à amostra, confere
densidade (tem sacarose ou glicerol),
mantém o pH alcalino.
Aspirar na totalidade o conteúdo a
aplicar no gel.
Orientar verticalmente a ponta com a
amostra com o centro do poço e
submergi-la ligeiramente no tampão
(figura 10). Figura 10 – Carregamento dos poços

Expelir suavemente a amostra a qual

cairá directamente no poço devido à
densidade oferecida pelo tampão de
amostra.

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 O DNA é uma molécula com carga negativa, que irá migrar para o pólo positivo da tina
de electroforese (figura 11).
A porosidade da agarose irá oferecer resistência à migração das moléculas – as

Fonte das imagens: http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/PDF/DiceSG.pdf

moléculas maiores irão ficar retardadas em relação às de menores dimensões (figura 12).
O tampão de electroforese fornece condutibilidade eléctrica e mantém o pH que é
necessário para a manutenção da carga e estabilidade das moléculas.

Os fragmentos de DNA
carregados negativamente,
movem-se em direcção ao
eléctrodo positivo

Direcção da migração do DNA

Legenda: 1 - eléctrodos; 2 – gel de agarose, 3 – solução tampão; Fragmentos maiores movem-se mais lentamente através
4 – poços; 5 – tampão de amostra do gel; fragmentos menores movem-se mais depressa

Figura 11 – Migração do DNA Figura 12 – Posição relativa das

moléculas de DNA
Há várias técnicas de coloração para visualizar o
DNA no gel.

Utilização do corante Azure A (figura 13)

Não tóxico nem carcinogénico, mas inflamável;
Pode ser eliminado sem prejuízo para o ambiente;
Adicionado ao gel após separação electroforética;
O DNA aparecerá formando bandas azuis;
Para vermos o gel temos que descolorar o gel que
neste caso se faz lavando várias vezes com água; Figura 13 – Corante Azure A

O gel corado pode ser indefinidamente guardado

a 4ºC.

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 Após removida a solução de TAE da tina, verter cerca de
Fonte da imagem: http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/PDF/DiceSG.pdf

10mL de corante do DNA, Azure A, na superfície do gel

(figura 14).

Retirar o corante da superfície do gel. Lavar o gel com

5ml de etanol a 70%, durante uns segundos.

Eliminar o álcool e lavar o gel com água corrente,

durante 3 ou 4 minutos, não deixando água no gel, para
que não seja removido do gel a totalidade do corante.

Aguardar até que as bandas se tornem visíveis

(figura15).
Figura 14 – Coloração do DNA

Figura 15 – Perfil de DNA

Fonte da imagem: http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2008/08-0147/docs/DNAF_030208.ppt#283,28,Analysis of Stained Gel

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