UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ DISCIPLINA: Genética Molecular PROFº. Ronan Xavier.

Leonny da Silva Santos - 200811134 Pesquisa complementar O que é a PCR? Em 1985, foi descrita a metodologia da reação em cadeia da polimerase (PCR, de polymerase chain reaction). Seu idealizador, Kary Mullis, recebeu, por isso, o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1993. A sigla como demonstrada, significa "polymerase chain reaction", que em português seria reação em cadeia da polimerase. Então, a base da técnica é a ação in vitro da DNA ´polimerase. Para compreendermos como funciona a técnica, que é na verdade bem simples, precisamos recordar que, para iniciar a síntese de uma fita nova, a DNA polimerase precisa de um primer (de RNA ou de DNA), de um DNA molde e de precursores de síntese de DNA, coletivamente chamados dNTPs (desoxinucleotídeos tri-fostato, i.e., dATP, dTTP, dCTP e TGTP). A idéia de Mullis era simples. Adicionava-se ao tubo de ensaio um pouco de DNA contendo o trecho que queria amplificar, os dNTPs, a DNA pol e dois primers de DNA feitos em laboratório, um hibridizando numa fita e "apontando" para o outro, que hibridizava com a outra fita e "apontava" para o primeiro. A distância entre os sítios de pareamento dos dois primers não podia ser muito grande, e foram escolhidos para testes trechos com menos de 1000 pb. Com todos os reagentes no tubo, a reação era inicialmente aquecida a 94 oC, para que todas as fitas de DNA se desnaturassem. Em seguida a temperatura era reduzida para permitir o pareamento dos primers, em geral para 50 oC. Por fim, a temperatura era reduzida ainda mais, até 37 oC, para que a DNA polimerase de E. coli pudesse trabalhar e estender duas fitas simples de DNA, uma a partir de cada primer, duplicando, assim, a sequência alvo escolhida. Ao se repetir o ciclo os primers encontrariam agora dois alvos cada um, a partir do primeiro alvo replicado: um no DNA original e outro na cópia recém sintetizada, gerando, por sua vez, ao fim do novo ciclo, 4 cópias do alvo. É claro que a repetição do processo geraria um número de cópias do alvo que se elevaria exponencialmente, com base 2. Na verdade, a coisa não foi tão fácil assim: a DNA pol era termoinstável (como a maioria das proteínas dos seres vivos) e se inativava irreversivelmente a 94oC. Era preciso adicionar mais DNApol no tubo a cada ciclo de extensão. Além disso, a baixa temperatura de funcionamento da DNApol de E. coli propiciava o aparecimento de pareamentos espúrios (sem sentido, errôneos) no sistema, gerando ao final produtos de PCR inesperados. A solução foi encontrada logo: a DNA pol de E. coli foi substituída por uma DNA polimerase de um microrganismo termo-tolerante, o Thermus aquaticus. A enzima foi batizada de Taq polimerase e permitiu, finalmente, que o PCR se tornasse uma ferramenta extraordinariamente útil na genética molecular. Que propriedades têm a Taq polimerase que a fazem tão útil? Ela é termoestável e sua temperatura ótima de funcionamento é 72 oC. Com isto três problemas ficaram automaticamente resolvidos: a) não havia mais necessidade de adicionar enzima no tubo a cada ciclo.

mas não podem parear. Já as fitas que são produzidas a partir de primers que hibridizaram em fitas previamente copiadas têm fatalmente ser comprimento definido. Observe que. Figura 1. a 94 oC. por alvo). O DNA molde tende a renaturar. Eventos relacionados às três temperaturas básicas da PCR: Desnaturação a 94 oC. os primers e as fitas simples de DNA alvo estão misturados. sem desparear os primers outra vez. a temperatura volta a 94 oC. que podia ser mantida acima de 50 oC. Os eventos ligados às três temperaturas mencionadas. e outra. As duas primeiras fitas estendidas estão indicadas com a letra e à sua direita. 94 oC. pareamento dos primers a 50 oC e extensão de novas fitas a 72 oC. e porque estão em concentração muito mais elevada que o DNA alvo. Esta situação está claramente representada na figura abaixo. à temperatura de 72 oC. permitindo uma rápida desnaturação ao se iniciar um novo ciclo. . estão esquematizados na figura abaixo. Quando a temperatura é reduzida os primers rapidamente alcançam seus sítios de complementariedade. recomeçando o processo. que é obtida sempre que um DNA previamente copiado é empregado como molde em sua síntese. inclusive as recém sintetizadas. As fitas de comprimento definido aumentam de número exponencialmente. Observe que a fita estendida a partir de um primer hibridizado com o DNA molde original não tem comprimento fixo. evitando hibridizações espúrias. de comprimento determinado. Por fim. portanto. O processo descrito acima gera dois tipos de fitas simples: uma de comprimento variável. enquanto as fitas estendidas aumento linearmente (duas a cada ciclo. obtida a partir de um primer que tenha hibridizado com a fita de DNA original (em geral um longo fragmento de DNA obtido diretamente de um ser vivo ou de um vírus ou plasmídeo). no primer e terminam ao fim do DNA molde.b) a menor temperatura do ciclo era a de hibridização. mas logo a temperatura é novamente elevada para 72 oC. c) o DNA molde não se renaturava por completo. porque o molde é muito longo. que desnatura todas as fitas. formando aos poucos um imenso número d fita duplas de comprimento definido. pois são moléculas pequenas e. que permite a extensão das novas fitas a partir dos primers. muito móveis. que mostra os três primeiros ciclos de uma PCR. supondo neste caso que a enzima empregada seja a Taq polimerase ou outra DNA polimerase termo-estável. Uma inspeção da figura a seguir esclarecerá o leitor sobre esta questão. já que inicia. 50 oC e 72 oC. Seu comprimento final vai ser determinado pelo instante em que o primer hibridizar com o sítio de complementariedade e pela tempo de extensão total. que é exatamente a e extremidade 5´do primer já incorporado na fita molde.

será apenas o comprimento relativo. a partir de dois pares de primers diferentes. Figura 3. no gel. essencial em qualquer reação de PCR. todas as bandas têm a mesma cor. Esta situação está representada no esquema da figura seguinte. e corar as bandas de DNA com nitrato de prata ou se pode optar por correr um gel horizontal de agarose e visualizar as bandas por transiluminação UV. A migração das bandas na eletroforese é de cima para baixo. evidentemente. A coluna c é um controle negativo. Os fragmentos amplificados acumulam exponencialmente na reação. "corando" previamente o DNA com brometo de etídio (esta substância se intercala entre as fitas de DNA e nestas condições absorve o UV e fluoresce com cor alaranjada). Visualização de três reações de PCR. uma escada de DNA . que corre verticalmente.Figura 2. A coluna d mostra os marcadores de peso molecular (neste caso.DNA ladder . Produção de novas fitas a partir de um DNA alvo pela PCR. Após hibridização dos primers a 56 oC. Pode-se usar um gel de poliacrilamida. O fragmento menor migra mais rápido e produz a banda em vermelho. as fitas novas são sintetizadas a 72 oC. . O maior se desloca mais lentamente no gel e produz a banda em verde. dando origem a fragmentos estendidos (indicados no primeiro ciclo pela letra e) e fragmentos amplificados (contornados em amarelo). Na transiluminação ou na coloração por prata. Em a e b dois produtos são gerados. Os dois produtos têm comprimentos de 400 e 360 pb.de 100 pb). O produto de PCR será sempre um DNA fita dupla e o que distingue um do outro. A visualização dos produtos de uma reação de PCR costuma ser feita através do uso da eletroforese em gel.

e amplificando qualquer DNA! Uma limitação séria na PCR convencional é a necessidade de se conhecer previamente a sequência que se quer amplificar ou. se repetirmos o experimento nas mesmas condições experimentais. a técnica de PCR descrita aqui ganhou o nome de RAPD: de fato é rápida. um número considerável de bandas em muitos diferentes DNAs.. com diferentes migrações) para indivíduos diferentes. As bandas. O curioso é que. nem sempre ocorre. Se. e estas bandas devem ser polimórficas (isto é. fragmentos de DNA fita dupla de comprimento conhecido.uma PCR com um primer só. poderemos fazer com que os primers hibridizem com baixa especificidade em muitos sítios do DNA. Na coluna 1 estão os marcadores de peso molecular. obtidos por digestão por enzima de restrição de um DNA conhecido ou sintetizados por máquinas. Idealmente um RAPD deve gerar um número de bandas superior a 4. por um lado.. contudo.DNA polimórfico amplificado aleatoriamente . o RAPD é uma técnica extremamente poderosa porque os marcadores são bastante polimórficos e porque se pode testar um grande número de primers em cada situação. Técnicas bioquímicas ou moleculares (voltadas ao DNA) já existiam muito antes da .dá margem a certa confusão. ao menos entr grupos distintos. para que se possa sintetizar os primers a elas complementares. Uso do PCR: Eis os principais! PCR na investigação de Paternidade Uma das aplicações mais conhecidas da PCR é a investigação de paternidade. pois não sabemos de antemão se um DNA terá regiões com complementariedade para o primer escolhido. a técnica é rápida e de baixo custo. o pareamento não é aleatório completamente. mas sim de trechos flanqueados por sequências que pareiam com o primer com baixa estringência. Imagem obtida de um gel de agarose mostrando bandas correspondentes a produtos de PCR com diferentes comprimentos (número total de pares de bases) (colunas 2 a 5). RAPD . suas extremidades. Apesar disso. A coluna 6 é um controle negativo e a pequena banda difusa no fim do gel é apenas a fronteira da eletroforese. mas o nome . não precisamos sequer de dois primers. então. não são uma amplificação completamente aleatória de trechos de DNA. pelo menos. por outro a existência das sequências com homologia é de fato aleatória. obteremos as mesmas bandas mais uma vez. Isto. Em verdade. contudo.Figura 4. Ainda assim. muitas vezes. Se. o que é muito diferente.randomly amplified polymorphic DNA . pequeno. basta um. Além disso. com 10 a 15 bases. através do pareamento com baixa estringência do primer (em geral ele também. baixarmos a temperatura de hibridização (pareamento) para menos de 45 oC. o que facilita os pareamentos). Uma PCR feita com um só primer e empregando uma temperatura de hibridização (pareamento ou annealing) de 45 oC ou inferior gera.

Observe que. para cada sistema com duas bandas (aparecerá apenas uma se o indivíduo for "homozigoto" para aquele STR). neste caso.small tandem repeats e sua amplificação por PCR é analisado em gel de agarose. No segundo caso. mas foi com o desenvolvimento de sistemas diagnósticos baseados em PCR que a investigação de paternidade alcançou o mercado com mais abrangência. cada suspeito aparece. 2). No caso de investigação de paternidade. fragmentos de pele). o filho de um casal deve herdar um cromossoma do pai e outro da mãe. duas bandas serão visíveis se o indivíduo for heterozigoto para aquele STR. Supondo. 3. a mãe e dois filhos. pela redução dos custos do exame e democratização dos reagentes (pode-se realizar o teste sem pagar royalties). que o material não contivesse restos de células da própria vítima. As colunas 2. suficiente DNA para uma análise de STRs como a descrita acima. Isto que dizer que. o filho terá um STR (e uma banda) materno e outro paterno. 5. equivalentes aos marcadores de peso molecular. A possibilidade de amplificar um pequeno trecho de DNA milhões de vezes permite. amplificar de uma pequena amostra biológica (mancha de sangue. mesmo em um estado de conservação. A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão. bulbo de cabelo. O primeiro (Fo. A figura abaixo retrata a situação onde um casal avalia a paternidade de dois meninos. Esta situação exclui o marido de ser pai do segundo filho (Fo. Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigação de paternidade. o procedimento para análise do caso estaria em conformidade com o mostrado na figura abaixo. 4 e 5 mostram o resultado da amplificação de um sistema para o suposto pai. O teste exclui o suposto pai da paternidade do segundo filho. o marido não pode ser excluído de ser o pai. Quando um STR .1) tem claramente uma banda de origem materna e a segunda banda está na mesma altura da banda paterna. a criança tem uma banda materna mas nenhuma que corresponda a alguma banda paterna. A banda materna de cada filho está indicada e a banda paterna de um deles está contornada com uma elipse. Portanto. para fins deste exemplo. contudo. Um caso clássico é a investigação da procedência de uma mancha de sangue no casaco da vítima (ou resto de pele sob as unhas da vítima). para um sistema qualquer. em muitos casos. Fig.descoberta da PCR. PCR na investigação de crimes Outro campo fértil para o uso da PCR é a criminalística. Na .

mas não prova. UFPE. <http://www.br/biolmol/aula7_PCRRAPD-aplicar. Fig. Isto quer dizer que não podemos excluir o suspeito dois com uma margem de acerto de 99. Referência Eletrônica: Portal de informação em genética e biologia molecular e áreas afins: PCR .99999999%. As colunas 2. equivalentes aos marcadores de peso molecular. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a amostra. a outra portanto o exclui de ser a fonte da amostra. PCR no diagnóstico de enfermidades genéticas e na identificação de portadores sãos de alelos mutantes. as 17h30min. Enfim. como na paternidade. Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigação criminal. O suspeito um tem apenas uma banda.99999999%.amostra as duas bandas do suspeito 2 estão claramente visíveis. que o outro é o "dono" da amostra. ser difíceis de diagnosticar. em geral com a manipulação posterior do produto de amplificação. A inclusão do resultado de 5 a 8 sistemas eleva a probabilbidade de não exclusão (como no caso de paternidade) para 99. O teste exclui dois indivíduos.Uma técnica de mil e uma utilidades. Adicionalmente. Doenças genéticas podem. as aplicações forenses (na justiça) da PCR são ilimitadas. A identificação de mutações em genes pode ser feita também por PCR. A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão. . Três suspeitos estão sendo investigados e uma amostra de sangue está disponível. 6. algumas vezes. no aconselhamento genético de casais é importante determinar inequivocamente se um indivíduo é portador de um alelo mutante (portador são). 3 e 4 mostram o resultado da amplificação de um sistema para os possíveis criminosos.htm> Acesso em 31 de abril de 2011. O padrão de duas bandas é idêntico ao do suspeito 2 e exclui os demais.ufpe.

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