UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

DISCIPLINA: Genética Molecular PROFº. Ronan Xavier.

Leonny da Silva Santos - 200811134

Pesquisa complementar

O que é a PCR?
Em 1985, foi descrita a metodologia da reação em cadeia da polimerase (PCR,
de polymerase chain reaction). Seu idealizador, Kary Mullis, recebeu, por isso, o
Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1993. A sigla como demonstrada, significa
"polymerase chain reaction", que em português seria reação em cadeia da polimerase.
Então, a base da técnica é a ação in vitro da DNA ´polimerase. Para compreendermos
como funciona a técnica, que é na verdade bem simples, precisamos recordar que, para
iniciar a síntese de uma fita nova, a DNA polimerase precisa de um primer (de RNA ou
de DNA), de um DNA molde e de precursores de síntese de DNA, coletivamente
chamados dNTPs (desoxinucleotídeos tri-fostato, i.e., dATP, dTTP, dCTP e TGTP).
A idéia de Mullis era simples. Adicionava-se ao tubo de ensaio um pouco de
DNA contendo o trecho que queria amplificar, os dNTPs, a DNA pol e dois primers de
DNA feitos em laboratório, um hibridizando numa fita e "apontando" para o outro, que
hibridizava com a outra fita e "apontava" para o primeiro. A distância entre os sítios de
pareamento dos dois primers não podia ser muito grande, e foram escolhidos para testes
trechos com menos de 1000 pb. Com todos os reagentes no tubo, a reação era
inicialmente aquecida a 94 oC, para que todas as fitas de DNA se desnaturassem. Em
seguida a temperatura era reduzida para permitir o pareamento dos primers, em geral
para 50 oC. Por fim, a temperatura era reduzida ainda mais, até 37 oC, para que a DNA
polimerase de E. coli pudesse trabalhar e estender duas fitas simples de DNA, uma a
partir de cada primer, duplicando, assim, a sequência alvo escolhida. Ao se repetir o
ciclo os primers encontrariam agora dois alvos cada um, a partir do primeiro alvo
replicado: um no DNA original e outro na cópia recém sintetizada, gerando, por sua
vez, ao fim do novo ciclo, 4 cópias do alvo. É claro que a repetição do processo geraria
um número de cópias do alvo que se elevaria exponencialmente, com base 2.
Na verdade, a coisa não foi tão fácil assim: a DNA pol era termoinstável (como
a maioria das proteínas dos seres vivos) e se inativava irreversivelmente a 94oC. Era
preciso adicionar mais DNApol no tubo a cada ciclo de extensão. Além disso, a baixa
temperatura de funcionamento da DNApol de E. coli propiciava o aparecimento de
pareamentos espúrios (sem sentido, errôneos) no sistema, gerando ao final produtos de
PCR inesperados.
A solução foi encontrada logo: a DNA pol de E. coli foi substituída por uma
DNA polimerase de um microrganismo termo-tolerante, o Thermus aquaticus. A
enzima foi batizada de Taq polimerase e permitiu, finalmente, que o PCR se tornasse
uma ferramenta extraordinariamente útil na genética molecular. Que propriedades têm a
Taq polimerase que a fazem tão útil? Ela é termoestável e sua temperatura ótima de
funcionamento é 72 oC. Com isto três problemas ficaram automaticamente resolvidos:
a) não havia mais necessidade de adicionar enzima no tubo a cada ciclo.
b) a menor temperatura do ciclo era a de hibridização, que podia ser mantida acima de
50 oC, evitando hibridizações espúrias.
c) o DNA molde não se renaturava por completo, permitindo uma rápida desnaturação
ao se iniciar um novo ciclo.
Os eventos ligados às três temperaturas mencionadas, 94 oC, 50 oC e 72 oC, estão
esquematizados na figura abaixo. Observe que, a 94 oC, os primers e as fitas simples de
DNA alvo estão misturados, mas não podem parear. Quando a temperatura é reduzida
os primers rapidamente alcançam seus sítios de complementariedade, pois são
moléculas pequenas e, portanto, muito móveis, e porque estão em concentração muito
mais elevada que o DNA alvo. O DNA molde tende a renaturar, mas logo a temperatura
é novamente elevada para 72 oC, que permite a extensão das novas fitas a partir dos
primers, sem desparear os primers outra vez. Por fim, a temperatura volta a 94 oC, que
desnatura todas as fitas, inclusive as recém sintetizadas, recomeçando o processo.

Figura 1. Eventos relacionados às três temperaturas básicas da PCR: Desnaturação a 94 oC,

pareamento dos primers a 50 oC e extensão de novas fitas a 72 oC, supondo neste caso que a
enzima empregada seja a Taq polimerase ou outra DNA polimerase termo-estável.
O processo descrito acima gera dois tipos de fitas simples: uma de comprimento
variável, obtida a partir de um primer que tenha hibridizado com a fita de DNA original
(em geral um longo fragmento de DNA obtido diretamente de um ser vivo ou de um
vírus ou plasmídeo), e outra, de comprimento determinado, que é obtida sempre que um
DNA previamente copiado é empregado como molde em sua síntese.
Esta situação está claramente representada na figura abaixo, que mostra os três
primeiros ciclos de uma PCR. Observe que a fita estendida a partir de um primer
hibridizado com o DNA molde original não tem comprimento fixo, porque o molde é
muito longo. Seu comprimento final vai ser determinado pelo instante em que o primer
hibridizar com o sítio de complementariedade e pela tempo de extensão total, à
temperatura de 72 oC. As duas primeiras fitas estendidas estão indicadas com a letra e à
sua direita. Já as fitas que são produzidas a partir de primers que hibridizaram em fitas
previamente copiadas têm fatalmente ser comprimento definido, já que inicia, no primer
e terminam ao fim do DNA molde, que é exatamente a e extremidade 5´do primer já
incorporado na fita molde. As fitas de comprimento definido aumentam de número
exponencialmente, formando aos poucos um imenso número d fita duplas de
comprimento definido, enquanto as fitas estendidas aumento linearmente (duas a cada
ciclo, por alvo). Uma inspeção da figura a seguir esclarecerá o leitor sobre esta questão.
Figura 2. Produção de novas fitas a partir de um DNA alvo pela PCR. Após hibridização dos
primers a 56 oC, as fitas novas são sintetizadas a 72 oC, dando origem a fragmentos estendidos
(indicados no primeiro ciclo pela letra e) e fragmentos amplificados (contornados em amarelo).
Os fragmentos amplificados acumulam exponencialmente na reação.
A visualização dos produtos de uma reação de PCR costuma ser feita através do
uso da eletroforese em gel. Pode-se usar um gel de poliacrilamida, que corre
verticalmente, e corar as bandas de DNA com nitrato de prata ou se pode optar por
correr um gel horizontal de agarose e visualizar as bandas por transiluminação UV,
"corando" previamente o DNA com brometo de etídio (esta substância se intercala entre
as fitas de DNA e nestas condições absorve o UV e fluoresce com cor alaranjada). O
produto de PCR será sempre um DNA fita dupla e o que distingue um do outro, no gel,
será apenas o comprimento relativo. Esta situação está representada no esquema da
figura seguinte.

Figura 3. Visualização
de três reações de PCR.
Em a e b dois produtos
são gerados, a partir de
dois pares de primers
diferentes. Os dois
produtos têm
comprimentos de 400 e
360 pb. A migração das
bandas na eletroforese é
de cima para baixo. O
fragmento menor migra
mais rápido e produz a banda em vermelho. O maior se desloca mais lentamente no gel e produz
a banda em verde. A coluna c é um controle negativo, essencial em qualquer reação de PCR. A
coluna d mostra os marcadores de peso molecular (neste caso, uma escada de DNA - DNA
ladder - de 100 pb). Na transiluminação ou na coloração por prata, evidentemente, todas as
bandas têm a mesma cor.
 Figura 4. Imagem obtida de um gel de agarose
mostrando bandas correspondentes a produtos de PCR
com diferentes comprimentos (número total de pares
de bases) (colunas 2 a 5). Na coluna 1 estão os
marcadores de peso molecular, fragmentos de DNA
fita dupla de comprimento conhecido, obtidos por
digestão por enzima de restrição de um DNA
conhecido ou sintetizados por máquinas. A coluna 6 é
um controle negativo e a pequena banda difusa no fim
do gel é apenas a fronteira da eletroforese.

RAPD - uma PCR com um primer só...e amplificando qualquer DNA!

Uma limitação séria na PCR convencional é a necessidade de se conhecer
previamente a sequência que se quer amplificar ou, pelo menos, suas extremidades, para
que se possa sintetizar os primers a elas complementares. Se, contudo, baixarmos a
temperatura de hibridização (pareamento) para menos de 45 oC, poderemos fazer com
que os primers hibridizem com baixa especificidade em muitos sítios do DNA. Em
verdade, não precisamos sequer de dois primers, basta um.
Uma PCR feita com um só primer e empregando uma temperatura de
hibridização (pareamento ou annealing) de 45 oC ou inferior gera, muitas vezes, um
número considerável de bandas em muitos diferentes DNAs, através do pareamento
com baixa estringência do primer (em geral ele também, pequeno, com 10 a 15 bases, o
que facilita os pareamentos). O curioso é que, se repetirmos o experimento nas mesmas
condições experimentais, obteremos as mesmas bandas mais uma vez. As bandas, então,
não são uma amplificação completamente aleatória de trechos de DNA, mas sim de
trechos flanqueados por sequências que pareiam com o primer com baixa estringência, o
que é muito diferente. Apesar disso, a técnica de PCR descrita aqui ganhou o nome de
RAPD: de fato é rápida, mas o nome - randomly amplified polymorphic DNA - DNA
polimórfico amplificado aleatoriamente - dá margem a certa confusão. Se, por um lado,
o pareamento não é aleatório completamente, por outro a existência das sequências com
homologia é de fato aleatória, pois não sabemos de antemão se um DNA terá regiões
com complementariedade para o primer escolhido.
Idealmente um RAPD deve gerar um número de bandas superior a 4, e estas
bandas devem ser polimórficas (isto é, com diferentes migrações) para indivíduos
diferentes, ao menos entr grupos distintos. Isto, contudo, nem sempre ocorre. Ainda
assim, o RAPD é uma técnica extremamente poderosa porque os marcadores são
bastante polimórficos e porque se pode testar um grande número de primers em cada
situação. Além disso, a técnica é rápida e de baixo custo.

Uso do PCR: Eis os principais!

PCR na investigação de Paternidade
Uma das aplicações mais conhecidas da PCR é a investigação de paternidade.
Técnicas bioquímicas ou moleculares (voltadas ao DNA) já existiam muito antes da
descoberta da PCR, mas foi com o desenvolvimento de sistemas diagnósticos baseados
em PCR que a investigação de paternidade alcançou o mercado com mais abrangência,
pela redução dos custos do exame e democratização dos reagentes (pode-se realizar o
teste sem pagar royalties).
Quando um STR - small tandem repeats e sua amplificação por PCR é analisado
em gel de agarose, duas bandas serão visíveis se o indivíduo for heterozigoto para
aquele STR. No caso de investigação de paternidade, o filho de um casal deve herdar
um cromossoma do pai e outro da mãe. Isto que dizer que, para um sistema qualquer, o
filho terá um STR (e uma banda) materno e outro paterno. A figura abaixo retrata a
situação onde um casal avalia a paternidade de dois meninos. O primeiro (Fo.1) tem
claramente uma banda de origem materna e a segunda banda está na mesma altura da
banda paterna. Portanto, o marido não pode ser excluído de ser o pai. No segundo caso,
contudo, a criança tem uma banda materna mas nenhuma que corresponda a alguma
banda paterna. Esta situação exclui o marido de ser pai do segundo filho (Fo. 2).

Fig. 5. Representação
esquemática de um gel
representando o resultado de um
sistema de STR para investigação
de paternidade. A primeira
coluna tem marcadores alélicos
padrão, equivalentes aos
marcadores de peso molecular.
As colunas 2, 3, 4 e 5 mostram o
resultado da amplificação de um
sistema para o suposto pai, a mãe
e dois filhos. A banda materna de
cada filho está indicada e a banda
paterna de um deles está
contornada com uma elipse. O
teste exclui o suposto pai da
paternidade do segundo filho.

PCR na investigação de crimes

Outro campo fértil para o uso da PCR é a criminalística. A possibilidade de
amplificar um pequeno trecho de DNA milhões de vezes permite, em muitos casos,
amplificar de uma pequena amostra biológica (mancha de sangue, bulbo de cabelo,
fragmentos de pele), mesmo em um estado de conservação, suficiente DNA para uma
análise de STRs como a descrita acima. Um caso clássico é a investigação da
procedência de uma mancha de sangue no casaco da vítima (ou resto de pele sob as
unhas da vítima). Supondo, para fins deste exemplo, que o material não contivesse
restos de células da própria vítima, o procedimento para análise do caso estaria em
conformidade com o mostrado na figura abaixo.
Observe que, neste caso, cada suspeito aparece, para cada sistema com duas
bandas (aparecerá apenas uma se o indivíduo for "homozigoto" para aquele STR). Na
amostra as duas bandas do suspeito 2 estão claramente visíveis. O suspeito um tem
apenas uma banda, a outra portanto o exclui de ser a fonte da amostra. O teste exclui
dois indivíduos, mas não prova, como na paternidade, que o outro é o "dono" da
amostra. A inclusão do resultado de 5 a 8 sistemas eleva a probabilbidade de não
exclusão (como no caso de paternidade) para 99,99999999%. Isto quer dizer que não
podemos excluir o suspeito dois com uma margem de acerto de 99,99999999%.

Fig. 6. Representação esquemática de

um gel representando o resultado de um
sistema de STR para investigação
criminal. Três suspeitos estão sendo
investigados e uma amostra de sangue
está disponível. A primeira coluna tem
marcadores alélicos padrão, equivalentes
aos marcadores de peso molecular. As
colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da
amplificação de um sistema para os
possíveis criminosos. A coluna 5 mostra
o resultado do mesmo sistema para a
amostra. O padrão de duas bandas é
idêntico ao do suspeito 2 e exclui os
demais.

Enfim, as aplicações forenses (na justiça) da PCR são ilimitadas.

PCR no diagnóstico de enfermidades genéticas e na identificação de

portadores sãos de alelos mutantes.
Doenças genéticas podem, algumas vezes, ser difíceis de diagnosticar.
Adicionalmente, no aconselhamento genético de casais é importante determinar
inequivocamente se um indivíduo é portador de um alelo mutante (portador são). A
identificação de mutações em genes pode ser feita também por PCR, em geral com a
manipulação posterior do produto de amplificação.

Referência Eletrônica:

Portal de informação em genética e biologia molecular e áreas afins: PCR - Uma

técnica de mil e uma utilidades. UFPE. <http://www.ufpe.br/biolmol/aula7_PCR-
RAPD-aplicar.htm> Acesso em 31 de abril de 2011, as 17h30min.