Hibridação Inespecífica Entre Diversas Espécies de Saccharomyces - Uma Solução Biotecnológica Combinada para Fermentações de Vinho Com Baixa Temperatura e Com Nitrogênio Limitado - ScienceDirect

23/09/2019 Hibridação inespecífica entre diversas espécies de Saccharomyces: uma solução biotecnológica combinada para fermentações de…
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Revistas e Livros Marleson Tavares
Revista Internacional de Microbiologia de Alimentos

Volume 310 , 16 de novembro de 2019 , 108331
Hibridação inespecífica entre diversas espécies de

Saccharomyces : Uma solução biotecnológica combinada para
fermentações de vinho com baixa temperatura e com
nitrogênio limitado
Ying Su uma, Amparo Gamero um , b, María Eugenia Rodríguez c , d, Christian Ariel Lopes c , d, Amparo Querol a, José
Manuel Guillamón um
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https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2019.108331 Obtenha direitos e conteúdo
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• Híbridos entre S. cerevisiae e cepas criotolerantes com baixa demanda de
nitrogênio foram construídos.
• Os híbridos apresentaram boa adaptação a diferentes condições de fermentação,

com altas taxas de fermentação.
• As fontes de nitrogênio foram consumidas mais rapidamente pelos híbridos

durante a fermentação.
• Os híbridos produziram compostos mais voláteis que aumentam a intensidade e

a complexidade do aroma.
Abstrato
A falta de barreira pré-zigótica no gênero Saccharomyces facilita a construção de híbridos
interespecíficos artificiais entre diferentes espécies de Saccharomyces . Os híbridos que mantêm
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160519302612?via%3Dihub 1/36
os recursos interessantes das linhagens parentais foram aplicados na indústria para muitos
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fins benéficos. Dois dosCompartilhar
problemas mais Exportação
importantes enfrentados pelos fabricantes de vinho é
a deficiência de nitrogênio no mosto de uvas e a fermentação a baixa temperatura. Em nosso
estudo, os híbridos foram construídos com o uso de S. eubayanus criotolerante com baixa
demanda de nitrogênio , de cepas de S. uvarum e de S. cerevisiae. A capacidade de fermentação
das linhagens híbridas foi testada em quatro condições combinando duas temperaturas, 12 ° C
e 28 ° C, e duas concentrações de nitrogênio, 60 mg / L e 300 mg / L. As linhagens híbridas
obtiveram caracteres combinados de ambas as linhagens parentais e conferiram melhores
taxas de fermentação em condições de baixa temperatura ou baixo nitrogênio. As linhagens
híbridas também produziram maiores quantidades de ésteres de acetato e álcoois superiores, o
que aumenta a intensidade e a complexidade do aroma no vinho. As fontes de nitrogênio
foram consumidas mais rapidamente pelas linhagens híbridas, o que permite maior
capacidade de competição em condições de deficiência de nitrogênio. Portanto, a hibridação
interespecífica entre cepas criotolerantes com baixa demanda de nitrogênio e S. cerevisiae é
uma solução potencial para fermentações de baixa temperatura ou baixo nitrogênio.
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Palavras-chave
S. cerevisiae; S. Eubayanus; S. uvarum; Hibridização; Exigência de nitrogênio;
Temperatura
1 . Introdução
O nitrogênio é um dos nutrientes substanciais para leveduras que regula a formação de
biomassa e a atividade de fermentação e fornece precursores importantes para compostos
relacionados ao aroma do vinho, como álcoois superiores, ésteres e ácidos graxos voláteis (
Bely et al., 1990 ; Bisson, 1991 ; Swiegers et al., 2005 ). Falta de azoto é uma das principais
causas de fermentação do vinho lento ou preso e H 2 a produção de S ( Bell e Henschke, 2005 ;
Giudici e Kunkee, 1994 ). Embora o nitrogênio tenha um papel significativo nos processos de
fermentação e nos caracteres sensoriais do vinho, a deficiência de nitrogênio assimilável por
levedura (YAN) no mosto de uvas foi bem identificada em muitas regiões vinícolas da Europa e
em outras partes do mundo (Butzke, 1998 ; Hagen et al., 2008 ; Henschke e Jiranek, 1993 ;
Nicolini et al., 2004 ). Muitos estudos revelaram que são necessários pelo menos 140 mg / L de
YAN para atingir a secura completa do vinho ( Bely et al., 1990 , Mendes-Ferreira et al., 2004 ).
Tecnicamente falando, é necessária uma concentração maior de YAN para combinar com uma
concentração maior de açúcar no mosto de uvas. A adição de nitrogênio ao mosto de uvas pode
ser uma solução, mas geralmente é difícil de manusear. Adições excessivas de nitrogênio
podem levar à presença de nitrogênio residual não assimilado no final da fermentação, o que
leva à instabilidade microbiana e ao acúmulo de carbamato de etila no vinho ( Ough e
Amerine, 1988) Portanto, é de muito interesse desenvolver linhagens de leveduras com menor
necessidadeBaixar Compartilhar
de nitrogênio para concluir Exportação
as fermentações.
O gênero Saccharomyces tem sido utilizado como paradigma ideal para hibridizações. Apesar de
oito espécies identificadas ( S. cerevisiae , S. paradoxus , S. mikatae , S. kudriavzevii , S. arboricola , S.
uvarum , S. eubayanus e S. jurei ) serem altamente divergentes nas seqüências de nucleotídeos,
elas mal mostram barreiras pré-zigóticas, o que lhes permite acasalar e formar diplóides
viáveis ( Morales e Dujon, 2012 ). Híbridos naturais foram isolados a partir de diferentes
processos de fermentação. A levedura de cerveja mais conhecida, S. pastorianusé um híbrido
natural entre S. cerevisiae e S. eubayanus ( Gibson e Liti, 2015 ). Além disso, S. cerevisiae x S.
uvarum , S. cerevisiae x S. kudriavzevii e até híbrido triplo S. cerevisiae x S. kudriavzevii x S. uvarum,
foram isolados de vinho, cidra e cerveja ( Antunovics et al., 2005 ; González et al., 2006 ;
Krogerus et al., 2018 ; Le Jeune et al., 2007 ; Lopandic et al., 2007 ; Masneuf et al., 1998) A
hibridação interespecífica pode ser uma estratégia de evolução para melhor adaptação ao
ambiente ou também pode ser resultado da domesticação. Além dos híbridos naturais, a
hibridação artificial pode ser usada como uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento
de linhagens de leveduras com méritos desejáveis para usos industriais. Muitas cepas híbridas
foram construídas em laboratórios para combinar atributos benéficos, como tolerância ao
estresse, produção de aroma, taxa de fermentação, utilização de açúcar etc. (revisado por
Bisson, 2017 ; Lopandic, 2018 ; Sipiczki, 2018 ; Sipiczki, 2019 ; Steensels et al., 2014) Esses
híbridos artificiais, juntamente com os híbridos interespecíficos naturais, não apenas possuem
os caracteres de ambos os pais, mas também demonstram desempenho superior em muitos
casos ( García-Ríos et al., 2019 ; Krogerus et al., 2017 ; Pérez-Través et al. , 2015 ; Sipiczki, 2008 ).
Alguns deles foram utilizados com sucesso na indústria de alimentos e bebidas à base de
fermentação. Um exemplo é um híbrido desenvolvido em nosso laboratório entre S. cerevisiae e
a cepa comercial S. uvarum Velluto BMV 58 (Lallemand Inc.) para melhorar a tolerância ao
etanol de S. uvarum, que foi comercializada como Velluto Evolution (Lallemand Inc.).
A fermentação em temperaturas mais baixas está se tornando cada vez mais popular porque os
compostos voláteis podem ser melhor preservados e, portanto, fornece notas mais frutadas e
frescas ao vinho ( Molina et al., 2007 ). No entanto, a temperatura fria é uma das principais
tensões para S. cerevisiae , que influencia amplamente a taxa de fermentação. S. eubayanus e S.
uvarum são duas das espécies mais aplicadas para hibridação artificial. Sua natureza criofílica
bem conhecida favorece a exigência de fermentação a baixa temperatura. As cepas de S. uvarum
foram isoladas como a cepa dominante em diferentes ambientes de fermentação, incluindo
vinho, cidra e maçã chicha (revisado por Rodríguez et al., 2016) Esta espécie, juntamente com S.
cerevisiae , é capaz de tolerar diferentes condições de estresse e permite que a fermentação do
vinho termine ( Alonso-del-Real et al., 2017b ). Fisiologicamente, S. uvarum produz menos
ácidos acéticos e etanol, mas mais glicerol que S. cerevisiae ( Castellari et al., 1994 ; Masneuf-
Pomarède et al., 2010 ). Em particular, esta espécie produz mais 2-feniletanol e acetato de 2-
feniletil, que conferem ao vinho um agradável odor de rosa ( González Flores et al., 2017 ;
Masneuf-Pomarède et al., 2010 ; Stribny et al., 2015 ) . S. eubayanusfoi isolado e identificado por
Libkind et al. (2011) da Patagônia. Após sua identificação, foi isolado em vários locais da
América do Norte ( Peris et al., 2014 ), China ( Bing et al., 2014 ) e Nova Zelândia ( Gayevskiy e
Goddard, 2016 ) e também de outros substratos e locais na Patagônia ( Rodríguez et al., 2014 ).
No entanto,Baixar
ainda não Compartilhar
foi obtido isoladoExportação
da Europa. Um grande interesse de pesquisa foi
demonstrado em S. eubayanus após sua identificação. Atualmente, a cerveja fermentada apenas
por S. eubayanus pode ser encontrada no mercado.
Vários estudos já construíram híbridos entre S. cerevisiae e S. eubayanus , S. uvarum com o

objetivo de melhorar o caráter criofílico de S. cerevisiae ( Diderich et al., 2018 ; García-Ríos et
al., 2019 ; Hebly et al., 2015 ; Kishimoto, 1994 ; Magalhães et al., 2017 ; Origone et al., 2018 ;
Rainieri et al., 1998 ; Zambonelli et al., 1997 ). No entanto, até agora, a hibridação não foi usada
para melhorar os requisitos de nitrogênio de uma levedura de vinho. Em nosso estudo
anterior ( Su et al., 2019), comparamos os requerimentos de nitrogênio das linhagens
patagônicas de S. eubayanus e S. uvarum com S. cerevisiae , realizando experimentos de
fermentação e crescimento com diferentes concentrações de nitrogênio e diversas
temperaturas. Nossos resultados revelaram que ambas as espécies, especialmente as linhagens
de S. eubayanus , têm necessidades de nitrogênio relativamente menores que a linhagem de
controle de S. cerevisiae . Portanto, a combinação de duas características enológicas
interessantes, tolerância ao frio e exigências de baixo nitrogênio, em S. eubayanus e S. uvarum
torna essas duas espécies candidatas ideais para hibridizar com S. cerevisiae. Assim, o objetivo
do nosso estudo foi melhorar a atividade de fermentação da levedura a baixa temperatura e
uma concentração limitada de nitrogênio através da construção de híbridos entre S. cerevisiae e
cepas criotolerantes de S. eubayanus e S. uvarum com baixa demanda de nitrogênio e exigentes
em nitrogênio . De fato, uma fermentação a baixa temperatura e com nitrogênio limitado é
uma situação muito desafiadora para leveduras de vinho. Ambas as condições produzem
efeitos metabólicos e transcricionais semelhantes, diminuindo o rendimento de biomassa e a
taxa de fermentação durante a fermentação do vinho ( Beltran et al., 2007 ; Pizarro et al., 2008 ).
Estratégias diferentes para a construção de híbridos artificiais, incluindo fusão de

protoplastos, acasalamento raro, acasalamento de esporos a esporos, acasalamento em massa
etc. foram bem-sucedidas (revisadas por Morales e Dujon, 2012 ; Sipiczki, 2008 ; Steensels et
al., 2014 ). Neste estudo, aplicamos o método de célula direta ao acasalamento de células, que
simplesmente mistura culturas celulares de dois pais haplóides estáveis selecionados. Essa
abordagem não é usada regularmente para desenvolver novos híbridos de levedura, devido à
natureza homotálica da maioria das linhagens industriais, tornando-as inadequadas para essa
abordagem. No entanto, cepas homotálicas seriam favoráveis a essa abordagem após a
interrupção genética do gene da endonuclease HO , um gene responsável pela troca do tipo de
acasalamento (Katz Ezov et al., 2010 ), tornando essas linhagens adequadas para experimentos
de acasalamento célula a célula ( Steensels et al., 2014 ). Apesar de isso exigir uma
transformação genética, o que implica que o híbrido resultante é classificado como OGM,
usamos esse método de hibridação direta e rápida. Nosso objetivo foi obter uma prova de
conceito de que a hibridação de S. cerevisiae com S. eubayanus e S. uvarumfoi um método viável
para obter cepas com bom desempenho de fermentação em baixa temperatura e condições
limitadas a nitrogênio. Os híbridos construídos foram avaliados através da fermentação sob
quatro condições diferentes, combinando duas temperaturas e duas concentrações de
nitrogênio. Foi determinado o metabolito da fermentação e a produção de compostos voláteis
por diferentes linhagens de leveduras. A assimilação de nitrogênio durante a fermentação foi

monitoradaBaixar Compartilhar
durante todo Exportação
o processo de fermentação.
2 . materiais e métodos
2.1 . Tensões e meios

A cepa NPCC1285 de S. eubayanus ( Se ) foi isolada a partir de sementes de A. araucana e a cepa
NPCC1317 de S. uvarum ( Su ) foi obtida de maçã chichi fermentada, ambas da região da
Patagônia Argentina. Essas cepas foram identificadas como cepas com baixa demanda de
nitrogênio em nosso trabalho anterior ( Su et al., 2019 ) e foram usadas como cepas parentais
criotolerantes. O Lalvin T73 (Lallemand Inc., Montreal, Canadá) foi utilizado como estirpe
parental de S. cerevisiae ( Sc ).
O meio extrato de levedura peptona dextrose (YPD), que contém 20 g / L de glicose, 20 g / L de

peptona e 10 g / L de extrato de levedura, foi utilizado para a propagação da levedura.
As fermentações foram realizadas com mosto de uvas sintético (SM), preparado conforme
descrito por Riou et al. (1997) com algumas modificações. Este meio contém 200 g / L de
açúcar como uma mistura de 50% de glicose e 50% de frutose. As concentrações de ácidos
orgânicos foram as seguintes: 5 g / L de ácido málico, 0,5 g / L de ácido cítrico e 3 g / L de ácido
tartárico. Minerais e vitaminas foram fornecidos na mesma concentração que os descritos por
Su et al. (2019) . A composição das fontes de nitrogênio no SM foi de 40% de cloreto de amônio
e 60% de aminoácidos. A composição dos aminoácidos no estoque de 1L foi de 1,5 g de L-
tirosina, 13,4 g de L-triptofano, 2,5 g de L-isoleucina, 3,4 g de ácido aspártico, 9,2 g de ácido
glutâmico, 28,3 g de L-arginina, 3,7 g de L-leucina, 5,8 g L-treonina, 1,4 g glicina, 38,4 g L-
glutamina, 11,2 g de L-alanina, 3,4 g de L-valina, 2,4 g de L-metionina, 2,9 g de L-fenilalanina,
6 g de L- serina, 2,6 g de L-histidina, 1,3 g de L- lisina, 1,5 g de L-cisteína e 46,1 g de L-prolina,
que correspondiam a 13,75 g / L de nitrogênio assimilável por levedura (YAN é a soma das
concentrações de aminoácidos e amônio, exceto a prolina). O pH final do SM foi ajustado para
3,3 com hidróxido de sódio. Os mostos sintéticos foram esterilizados por filtração através de
filtros de membrana do tamanho de poros de 0,22 μm (Thermo scientific, MA, EUA).
2.2 . Construção de híbridos

Primeiramente, geramos versões haplóides estáveis das linhagens parentais diplóides,
excluindo uma cópia do gene HO, usando os marcadores dominantes de resistência a drogas
nothothricin e hygromycin ( Goldstein e McCusker 1999 ). A deleção de HO foi realizada por
substituição gênica mediada por PCR (método de homologia de flanqueamento curto). A
cassete de deleção foi obtida por PCR utilizando o plasmídeo pAG25 que contém resistência à
nototricina e o plasmídeo pAG32 que contém resistência à higromicina. Ou seja, uma cópia do
gene HO de T73 foi substituída por NatMX6 e os genes HO de S. eubayanus e S. uvarum foram
substituídos por HphMX6. Os iniciadores utilizados para a deleção gênica estão listados na
Tabela Suplementar 1 . A transformação foi realizada pelo método de acetato de lítio ( Gietz e
Schiestl, 2008 ). Os transformantes foram selecionados por resistência à nototricina ou
higromicina, e a integração correta da cassete de deleção foi confirmada por PCR diagnóstico
Baixar a montante
usando os primers Compartilhar Exportação
e a jusante da região deletada ( Tabela Suplementar 1 ).
As cepas parentais diplóides transformadas com sucesso (heterozigotos para HO ) foram

esporuladas em meio acetato (acetato de potássio a 1%, ágar a 2%) por 5 a 7 dias. Os asci foram
digeridos com 0,5 mg / mL de zimolase a 37 ° C por 30 min. As tetrads foram dissecadas
usando um micromanipulador (MSM 400; Singer Instruments, Watchet, Reino Unido) em
placas de agar YPD (2% de peptato de Bacto, 1% de extrato de levedura, 2% de glicose e 2% de
agar). Os clones de esporos viáveis foram então riscados em YPD com placas de nourseotricina
ou ágar higromicina para seleção de clones de esporos de Δ ho . As células haplóides com
resistência à notiotricina ou à higromicina foram novamente verificadas por PCR diagnóstico,
como mencionado acima.
As estirpes haplóides Δ ho de ambos os pais, com tipos de acasalamento opostos, foram

misturadas no mesmo local em meio completo (YPD) e crescidas por 24 h. As células foram
então colhidas, diluídas e plaqueadas em placas YPD contendo higromicina e nourseotricina
para selecionar híbridos diplóides. Esses híbridos foram então confirmados pelo padrão de
restrição Msp I do gene KEL2 ( Pérez-Través et al., 2015 ). Onze híbridos de cada combinação (
Sc x Su e Sc x Se ) foram testados quanto à capacidade de crescimento a 60, 140 e 300 mg / L
YAN, e não foram observadas diferenças significativas entre os diferentes híbridos (dados não
mostrados).
2.3 . Análise da atividade de fermentação

As fermentações foram realizadas em frascos de 100 mL com 80 mL de SM em duas
concentrações de nitrogênio (60 e 300 mg / L YAN) a 12 ° C ou 28 ° C. O SM foi inoculado com
tanto puro e misturar culturas a uma população de 2 x 10 6 culas / mL. As fermentações da
cultura da mistura foram inoculadas com 50% de cada uma das duas cepas testadas. A cinética
de fermentação foi seguida pela medição da redução de densidade do SM. A fermentação foi
considerada finalizada quando a densidade ficou abaixo de 998 g / L ( Gutiérrez et al., 2012 ).
Ao contrário de S. cerevisiae , as estirpes de S. uvarum e S. eubayanus são menos tolerantes ao calor

e são incapazes de formar colônias em placas YPD a 37 ° C. Portanto, nas fermentações de
culturas mistas, a porcentagem de S. cerevisiae foi determinada simplesmente plaqueando a
amostra em duas placas YPD e incubando a 30 ° C e 37 ° C. As unidades formadoras de
colônias (UFC) foram contadas após 2 dias de incubação. O número de UFC nas placas de 37 °
C representa a população de S. cerevisiae e a diferença de UFC entre as duas placas representa a
população de cepas de não- cerevisiae na cultura mista ( Su et al., 2019 ).
2.4 . Análise por HPLC para açúcares residuais e metabólitos da fermentação

No final das fermentações, as amostras foram colhidas e analisadas quanto aos principais
parâmetros químicos do vinho, incluindo glicose, frutose, etanol, glicerol, ácido succínico e
ácido acético. As amostras foram primeiro centrifugadas para remover as células de levedura e
os sobrenadantes foram diluídos 3 vezes com água desionizada para depois serem filtrados
através de filtros de nylon com tamanho de poro de 0,22 μm (Phenomenex, CA, EUA). A HPLC,
equipada com Baixar Compartilhar
um detector Exportação
de índice de refração e um detector UV-Visible, foi usada para a
análise. A fase móvel empregada foi de 1,5 mM de H 2 SO 4 , com um fluxo de 0,6 mL / min. Os
metabólitos foram separados por uma coluna HyperREZ XP Carbohydrate H + 8 mm com
uma temperatura da coluna de 45 ° C (Thermo Scientific, MA, EUA).
2.5 . Análise por HPLC para aminoácidos residuais

A análise dos aminoácidos residuais foi realizada em um último 3000® UPLC (Thermo
Scientific, MA, EUA) equipado com um detector visível UV (Thermo Scientific, MA, EUA). O
método de análise por HPLC é baseado em Gómez-Alonso et al. (2007), mas com algumas
modificações. As amostras de 400 μL foram derivatizadas com 12 μL de
dietiletoximetilenomalonato (DEEMM), juntamente com 300 μL de metanol. As reações foram
realizadas em tubos de ensaio com tampa de rosca em banho ultrassônico por 30 min, seguido
de aquecimento a 80 ° C por 2 h para degradar qualquer excesso de DEEMM. Após
derivatização, as amostras foram filtradas através de filtros de seringa de nylon de 0,22 μm
(Phenomenex, CA, EUA). A separação cromatográfica foi realizada com uma coluna Accucore®
C18 LC (Thermo Scientific, MA, EUA). O gradiente binário foi aplicado (fase A: tampão acetato
25 mM, pH 6,0 e fase B: acetonitrila) a uma taxa de fluxo de 1,2 mL / min e a uma temperatura
da coluna de 30 ° C. O gradiente é mostrado na Tabela Suplementar 2 .
2.6 . Análise de GC para compostos voláteis

Álcoois e ésteres superiores foram analisados pela técnica de microextração em fase sólida
(HS-SPME) usando uma fibra de 100 μm de polimetilsiloxano (PDMS) (Supelco, Sigma-
Aldrich, Madri, Espanha). O método de extração foi o mesmo descrito por Stribny et al. (2016).
Foi adicionada 2-heptanona (0,005%) como um padrão interno. Foi utilizado um cromatógrafo
a gás TRACE GC Ultra® (Thermo Scientific, MA, EUA) com um detector de ionização de
chama (FID), equipado com uma coluna capilar HP-INNOWax 30 m × 0,25 mm, revestida com
uma camada de polietileno reticulado de 0,25 μm glicol (Agilent Technologies, CA, EUA). O
programa de temperatura do forno foi: 5 min a 35 ° C, 2 ° C / min a 150 ° C, 20 ° C / min a 250 °
C e 2 min a 250 ° C. A temperatura do detector permaneceu constante a 300 ° C. Os
cromatógrafos foram analisados pelo programa Chrom Quest. Os compostos voláteis foram
identificados pelo tempo de retenção dos compostos de referência. A quantificação de
compostos voláteis foi determinada usando os gráficos de calibração dos compostos voláteis
padrão correspondentes.
2.7 . Análise estatística

Todas as fermentações foram realizadas em triplicado. A cinética de fermentação foi calculada
ajustando os dados de densidade ao modelo logístico de 4 parâmetros. O tempo necessário
para consumir todos os açúcares (T100) foi extraído dos dados suavizados. A análise de
variância unidirecional (ANOVA) foi realizada com a versão 7.0 do pacote de software Statistica.
O nível estatístico de significância foi estabelecido em p ≤ 0,05 com o teste Tukey HSD. Para a
análise da ordem de captação de nitrogênio, o valor da área sob a curva (AUC) foi calculado
usando o software estatístico R v. 3.0 com o pacote " curva de crescimento" ( Sprouffske, 2018)
Um mapa deBaixar Compartilhar
calor foi plotado Exportação
pelo Mev MultiExperiment Viewer, e o cluster hierárquico foi
baseado em métricas de distância euclidiana. Uma análise de componentes principais (PCA)
foi realizada usando o pacote de software LatentiX 2.12 ( http://www.latentix.com ). Os dados
foram normalizados em escala automática.
3 . Resultados
3.1 . Cinética de fermentação e composição celular na fermentação de culturas

mistas
As fermentações foram realizadas em quatro condições diferentes, com uma combinação de
duas temperaturas, 12 ° C e 28 ° C, e duas concentrações de nitrogênio, 60 mg / L e 300 mg / L
YAN. As linhagens utilizadas nessas fermentações foram as linhagens parentais S. cerevisiae ( Sc
), S. eubayanus ( Se ) e S. uvarum ( Su ) e duas linhagens híbridas, Sc x Se e Sc x Su . Para fins de
comparação, as fermentações em cultura mista entre S. cerevisiae e as cepas parentais
criotolerantes ( Sc + Se e Sc + Su) também foram realizados. Os resultados indicaram que 12 °
C e 60 mg / L YAN formaram uma condição extremamente severa e nenhuma das cepas
testadas ou combinações de cepas foram capazes de concluir a fermentação dentro de 500 h.
No entanto, a menor concentração de açúcar residual foi detectada na fermentação Su , que
foi> 3 vezes menor que a fermentação Sc (21 vs. 75 g / L; Tabela Complementar 3 ). Para as
outras condições de fermentação, o tempo necessário para as diferentes cepas para finalizar a
fermentação (T100) é mostrado na Fig. 1 (A – C). Como esperado, o Sc apresentou um
desempenho tão melhor e gastou menos tempo para terminar as fermentações do que Se e Su,
principalmente nas condições ideais para S. cerevisiae (28 ° C e 300 mg / L YAN). As cepas
criotolerantes realizaram as fermentações mais lentamente. Eles tiveram dificuldades para
esgotar todos os açúcares a 28 ° C e 60 mg / L YAN e> 10 g / L de frutose permaneceram no
mosto ( Tabela Suplementar 3 ). Pelo contrário, as linhagens híbridas exibiram excelente
desempenho fermentativo e até excederam sua linhagem parental Sc , completando
fermentações no menor tempo em todas as condições. O tempo de fermentação das
fermentações de culturas mistas situava-se entre o tempo de Sce cepas criotolerantes. A fim de
determinar a competitividade de cada cepa nas fermentações de culturas mistas, a
porcentagem de cada cepa inoculada também foi monitorada ( Fig. 1 complementar ). Nossos
resultados mostraram que a temperatura influenciou fortemente a imposição de Sc em Se e Su .
Sc foi menos competitivo que as cepas criotolerantes a 12 ° C. Independentemente do teor de
nitrogênio, ao final dessas fermentações a baixa temperatura, a porcentagem de Sc
representava apenas 20 a 30% da população total. Em contraste, a 28 ° C, a porcentagem de Sc
estava em torno de 60% a 80%. Uma alta concentração de nitrogênio também favoreceu a
implementação de Sc, mas a influência não foi tão determinante quanto a temperatura.
1.1 Produção de metabólitos por diferentes fermentações
No final das fermentações, os principais metabólitos foram analisados por HPLC ( Tabela
Suplementar 3 ). Foram calculados os rendimentos de etanol, glicerol e ácidos orgânicos pelo
consumo de açúcar. Não foram observadas diferenças significativas para os rendimentos de

Baixar das condições
etanol na maioria Compartilhar Exportação
de fermentação ( Fig. 2 , Tabela Suplementar 4 ). No entanto,
diferenças significativas foram observadas para os rendimentos de glicerol para as várias
condições testadas. De um modo geral, Sc era um produtor baixo de glicerol, enquanto as
cepas criotolerantes apresentaram os maiores rendimentos de glicerol para todas as condições.
Curiosamente, sob a condição de baixo nitrogênio a 28 ° C, as cepas híbridas alcançaram uma
produção de glicerol significativamente maior do que a sua Sccepa parental (> 2 g / L superior),
mas não foram encontradas diferenças significativas nas fermentações realizadas com 300 mg /
L YAN. A síntese de ácido acético também dependia fortemente de cepas de leveduras. As cepas
híbridas produziram quantidades significativamente menores de ácido acético que o Sc ,
especialmente quando o nitrogênio era limitado no SM. Su foi o menor produtor de ácido
acético em todas as condições. Outro metabólito cuja concentração parecia ser dependente de
nitrogênio foi o ácido succínico. Foi encontrada uma correlação negativa entre a concentração
de nitrogênio e a produção de ácido succínico, com rendimentos mais altos para todas as
cepas quando o nitrogênio era limitado.
3.2 . Quantificação de compostos voláteis

A produção de compostos voláteis foi consideravelmente influenciada pela temperatura de
fermentação, concentração de nitrogênio e linhagens de leveduras ( Tabela Suplementar 5 ). As
concentrações de onze compostos voláteis foram determinadas e classificadas como ésteres de
etila (hexanoato de etila, octanoato de etila, decanoato de etila, succinato de dietila), ésteres de
acetato (acetato de etila, acetato de isoamil, acetato de 2-feniletil) e álcoois superiores
(isobutanol álcool isoamílico, álcool benzílico, 2-feniletanol). As fermentações inacabadas a 12
° C e 60 mg / L de YAN não foram incluídas nas comparações. Fig. 2 complementarmostra a
distribuição desses três grupos de compostos aromáticos de todas as fermentações sob a
mesma condição. Independentemente da cepa inoculada, as fermentações realizadas com
nitrogênio limitado demonstraram produção ligeiramente mais alta de ésteres de acetato e
ésteres etílicos, mas essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Maior produção
de álcoois foi fortemente influenciada pelas condições de fermentação. Uma quantidade muito
maior de álcoois superiores foi produzida quando as fermentações foram realizadas com 60
mg / L YAN, com o dobro da concentração daquela nas fermentações realizadas com 300 mg / L
YAN. Uma PCA foi realizada com os dados de aroma de todas as fermentações ( Fig. 3) Os dois
primeiros componentes principais representaram 65% da variação total. A distribuição
topográfica do PCA mostrou que os fatores ambientais (nitrogênio e temperatura) impactaram
mais fortemente a produção de aroma do que a cepa inoculada, porque todas as cepas foram
agrupadas de acordo com as condições de fermentação. As únicas exceções foram as cepas Se e
Su a 28 ° C / 300 mg / L YAN, agrupadas com as amostras em baixa temperatura, que poderiam
ser interpretadas como conseqüência de sua característica criotolerante. As fermentações
realizadas com a maior concentração de YAN agrupadas principalmente para a maior
produção de alguns ésteres etílicos, acetato de isoamil e álcool benzílico, enquanto as
fermentações realizadas com a menor concentração de YAN se destacaram pela maior
produção de álcoois.
O Se produziu a maior quantidade de ésteres de acetato (principalmente acetato de etila) a 28 °

C e Su exibiuBaixar
o mesmoCompartilhar
comportamento aExportação
12 ° C ( Fig. 4 ; Tabela Suplementar 5 ). Por outro
lado, Sc e híbridos produziram maiores quantidades de ésteres etílicos, principalmente dietil
succinato, do que as cepas parentais criotolerantes a baixa temperatura ou sob condições de
baixo nitrogênio. Diferenças significativas na produção de ésteres foram observadas pelos dois
híbridos: Sc x Se produziu um nível mais alto de ésteres etílicos que Sc x Su ,
independentemente das condições de fermentação. Em relação aos álcoois superiores, Sce as
cepas híbridas foram os melhores produtores a 28 ° C. A 12 ° C, os híbridos também
mantiveram boa produção de álcoois, enquanto a síntese de Sc diminuiu significativamente. A
produção de acetato de 2-feniletil e 2-feniletanol foi maior tanto para as cepas criotolerantes
quanto para híbridas, e a ocorrência foi mais óbvia para as fermentações realizadas em baixa
temperatura ou em uma concentração limitada de YAN ( Tabela Suplementar 5 ). As
fermentações em culturas mistas geralmente deram valores intermediários de produção entre
a cultura pura de Sc e as culturas puras das cepas criotolerantes, mas o comportamento foi
mais irregular, pois dependia principalmente do grau de imposição de cada cepa inoculada (
Fig. 1 ).
3.3 . Ordem de captação de fontes de nitrogênio por linhagens híbridas sob

diferentes condições
A preferência pela fonte de nitrogênio e a ordem de assimilação da fonte de nitrogênio lançam
luz sobre a regulação do metabolismo do nitrogênio por certas espécies de leveduras. Para
explorar a ordem de absorção de nitrogênio pelos híbridos e suas linhagens parentais, o
nitrogênio residual no mosto foi analisado por HPLC durante a fermentação. A porcentagem
de consumo de nitrogênio foi plotada contra o tempo como a curva de consumo de
nitrogênio. A área sob a curva (AUC) forneceu informações abrangentes sobre o horário de
início do consumo, a taxa de consumo e a porcentagem máxima de consumo. Um alto valor de
AUC indica um consumo completo mais rápido de certas fontes de nitrogênio. Por outro lado,
um baixo valor de AUC indica consumo lento ou incompleto (curvas de consumo individuais
são encontradas na Fig. 3 complementar , Fig. 4 complementar), Fig. Complementar 5 , Fig.
Suplementar 6 ). Embora as fermentações sejam realizadas a 12 ° C com 60 mg / L de YAN não
tenham terminado, o consumo de nitrogênio nessas condições foi concluído. Portanto, essa
condição foi incluída para a análise. Para uma visão geral da eficiência do consumo de
nitrogênio, o valor da AUC do consumo total de YAN foi calculado para as diferentes linhagens
e condições ( Fig. 5 ). A taxa de absorção de nitrogênio das linhagens parentais foi claramente
influenciada pela temperatura da fermentação. Sc mostrou a eficiência mais rápida de
consumo de nitrogênio em alta temperatura, enquanto Se e Suconsumiu mais rapidamente
nitrogênio total a 12 ° C. Essas diferenças foram mais pronunciadas com 300 mg / L YAN,
porque todas as cepas esgotaram rapidamente o nitrogênio total nas condições de 60 mg / L
YAN. Vale ressaltar que as cepas híbridas eram mais semelhantes às do progenitor mais apto a
cada temperatura.
Os valores de AUC de 20 fontes individuais de nitrogênio para cada condição de fermentação

também foram calculados e classificados de alto a baixo para indicar a ordem de absorção. As
ordens de classificação foram representadas em um mapa de calor com agrupamento

hierárquico Baixar Compartilhar
( Fig. 6 ). Foram obtidos três Exportação
grupos principais (CA) que, como na produção de
aroma (PCA; Fig. 3 ), foram determinados principalmente pelas condições de fermentação.
Mais uma vez, a exceção veio dos pais Se e Su a 28 ° C e 300 mg / L YAN, que foram agrupados
no cluster C (12 ° C e 300 mg / L de YAN). Outra exceção interessante foi o Sc parental e os dois
híbridos a 28 ° C e 300 mg / L de YAN, que não foram incluídos em nenhum desses grupos
principais e representaram as três condições com menor tempo de fermentação.
Transferir imagem em alta resolução (114KB) Download da imagem em tamanho real
Fig. 1 . AC . Tempo (horas) necessário para consumir 100% (T100) do teor de açúcar no mosto
sintético com 12 ° C 300 mg / L YAN, 28 ° C 60 mg / L YAN e 28 ° C 300 mg / L YAN. As letras
no topo das barras indicam os grupos de diferenças significativas (teste HSD Tukey p ≤ 0,05).
Baixar dosCompartilhar
Fig. 2 . Rendimento Exportação
principais metabólitos etanol, glicerol, ácido succínico e ácido acético,
no final das fermentações. 60YAN e 300YAN indicam que a concentração de nitrogênio
assimilável foi de 60 mg / L e 300 mg / L, respectivamente. Diferentes deformações são
representadas por diferentes barras coloridas.
Fig. 3 . O gráfico de PCA dos compostos voláteis produzidos por diferentes cepas sob três
condições de fermentação. Pontuações representam fermentações. As cargas indicam
diferentes compostos voláteis.
Fig. 4 . Produção (mg / L) de ésteres acetato, ésteres etílicos e álcoois superiores por diferentes
linhagens sob três condições de fermentação.
Fig. 5 . O valor da AUC do consumo total de nitrogênio para as diferentes linhagens sob cada
condição de fermentação. A AUC fornece as informações resumidas da porcentagem máxima
de consumo de YAN durante o intervalo de tempo analisado.
Fig. 6 . O mapa de calor da ordem de consumo de diferentes fontes de nitrogênio com um

cluster hierárquico calculado pela distância euclidiana. O esquema de cores de verde para
amarelo indica a ordem de consumo de 1 a 20. (Para interpretação das referências a cores nesta
legenda da figura, o leitor é consultado na versão web deste artigo.)
Fig. 7 . A ordem de absorção de diferentes fontes de nitrogênio em quatro condições de

fermentação. A classificação é baseada nos valores da AUC. Um número mais baixo no ranking
representa o consumo precoce; um número de classificação mais alto indica consumo tardio.
O esquema de cores de amarelo para verde representa a classificação de baixa para alta,
respectivamente. (Para interpretação das referências a cores nesta legenda da figura, o leitor é
consultado na versão web deste artigo.)
Dois grupos principais foram obtidos quando esse agrupamento hierárquico foi aplicado aos
19 aminoácidos individuais e ao cloreto de amônio ( Fig. 6 ). Independentemente das
condições de fermentação, o cluster verde reuniu os aminoácidos mais rapidamente
consumidos (os quadrados mais verdes) e o cluster amarelo agrupou todos os aminoácidos de
uma absorção retardada (os quadrados mais amarelos). Os quadrados pretos representam os
aminoácidos do consumo intermediário. Uma ordem de consumo mais detalhada para cada
fonte individual de nitrogênio para as diferentes cepas e condições de fermentação é
encontrada na Fig. 7 . Conforme relatado para outros S. cerevisiaeLys foi praticamente o
primeiro aminoácido a ser consumido por todas as cepas e condições de fermentação, seguido
por outros aminoácidos que foram consumidos precocemente, por exemplo, Ile, His, Asp, Leu,
Arg, Ser e Thr. Por fim, Pro, Cys, Glu, Ala e Gly estavam entre os últimos aminoácidos
consumidos. Nesta visão geral do consumo individual de fontes de nitrogênio, vale a pena
mencionar algumas especificidades de deformação. As maiores diferenças entre as cepas foram
detectadas a 28 ° C e 300 mg / L YAN, pois o nitrogênio total foi rapidamente esgotado nas
fermentações limitadoras de nitrogênio. Sc foi a cepa que consumiu mais nitrogênio que
esgotou todas as fontes de nitrogênio dentro de 30 horas, exceto prolina e cisteína ( Fig. 4 ). As
linhagens híbridas apresentaram perfis de consumo semelhantes aos de Sc, e quase todas as
fontes foram esgotadas. Por outro lado, Se e Su consumiram nitrogênio mais lentamente que
Sc , com muitas fontes residuais de nitrogênio após 30 h de fermentação. Como esperado, a
concentração de nitrogênio e a temperatura de fermentação condicionaram claramente o

Baixar dos aminoácidos
perfil de absorção Compartilhar nas diferentes
Exportaçãolinhagens. As cepas criotolerantes
consumiram Arg mais rapidamente nas fermentações limitadoras de nitrogênio do que em
300 mg / L de YAN. O consumo de Trp realizado por todas as cepas a 12 ° C foi muito mais
lento que o de 28 ° C. Suconsumiu Asp mais rapidamente do que as outras cepas a 12 ° C. Uma
descoberta notável foi a preferência pelo consumo de Phe pelas cepas criotolerantes e híbridas.
Em todas as estirpes, Tyr foi consumido muito rapidamente a 12 ° C com 300 mg / L YAN ( Fig.
7 ).
4 . Discussão
4.1 . Vantagem da hibridação interespecífica para adaptação de linhagens de

leveduras a diferentes ambientes de fermentação
A hibridação inespecífica no gênero Saccharomyces foi aplicada com sucesso para a melhoria da
linhagem de leveduras. As linhagens foram cruzadas para obter híbridos robustos que
apresentavam diferentes características favoráveis das linhagens parentais. As cepas híbridas
entre S. cerevisiae e as cepas criotolerantes com baixa demanda de nitrogênio selecionadas de S.
eubayanus e S. uvarum ( Su et al., 2019 ), foram construídas aqui. Esses híbridos mostraram boa
adaptação a diferentes condições de fermentação e superaram suas linhagens parentais em
termos de taxa de fermentação. O fenômeno em que os híbridos possuíam superioridade
fenotípica sobre as cepas dos pais foi relatado anteriormente e é conhecido como heterose ou
vigor híbrido (Lippman e Zamir, 2007 ; revisado por Steensels et al., 2014 ). O processo híbrido
fornece uma vantagem heterozigótica para proteger contra alelos recessivos deletérios e
fornece plasticidade genética para se adaptar a condições ambientais variáveis. Além da
hibridação, a inoculação co- ou seqüencial de cepas não- Saccharomyces ou Saccharomyces non-
cerevisiae também foi sugerida como uma prática enológica com múltiplos objetivos, como
aumentar a complexidade do aroma, diminuir o teor de etanol e aumentar o glicerol no vinho
( Alonso-del -Real et al., 2017a ; Jolly et al., 2014 ; Padilla et al., 2017 ; Zhang et al., 2018) Para
fins de comparação, as fermentações de culturas mistas também foram incluídas aqui. Como
em nosso trabalho anterior ( Su et al., 2019 ), observamos que a população de diferentes cepas
foi fortemente influenciada pela temperatura de fermentação e pela concentração de
nitrogênio. A baixa temperatura favoreceu o crescimento de S. eubayanus e S. uvarum ,
enquanto a alta temperatura deu origem a S. cerevisiaedominando na fermentação,
especialmente em alta concentração de nitrogênio. De um modo geral, o comportamento de
fermentação em cultura mista foi semelhante ao das cepas com maior capacidade de carga.
Também foi observado o nível intermediário de produção de metabólitos entre as duas
linhagens na fermentação em cultura mista. Embora a fermentação em cultura mista
melhorasse a taxa de fermentação em condições abaixo do ideal, elas não eram tão eficientes
quanto as linhagens híbridas. Para aplicações na indústria, a instabilidade da inoculação co-
ou seqüencial pode ser mais difícil de gerenciar e a qualidade do vinho pode ser difícil de
prever. Portanto, a hibridação interespecífica poderia ser uma alternativa melhor para
melhorar a capacidade de fermentação da levedura.
4.2 . Influência das condições de fermentação no metabolismo da levedura

As condições de fermentação têm grande impacto no metabolismo da levedura. A combinação
de duas temperaturas e duas concentrações de YAN foi aplicada no presente estudo para
explorar o comportamento das linhagens híbridas. A ANOVA fatorial ilustrou que a
temperatura de fermentação, a concentração inicial de nitrogênio, as cepas e a combinação de
diferentes fatores impactaram significativamente a maioria dos metabólitos aqui analisados (
Tabela Suplementar 6 ). Especificamente, a disponibilidade de nitrogênio influenciou
fortemente a produção de ácido succínico. Uma quantidade> 2 vezes maior de ácido succínico
foi produzida quando as fermentações foram realizadas em uma menor concentração de
nitrogênio. Rollero et al. (2015)analisaram os efeitos combinados de nitrogênio, lipídios e
temperatura na produção de metabólitos fermentativos. Correspondentemente, eles também
apontaram que a produção de ácido succínico era regulada negativamente pela concentração
inicial de nitrogênio. O possível mecanismo envolvido foi explicado por Camarasa et al. (2003)
: quando o nitrogênio é limitado nos meios, menos glutamato é produzido a partir de α-
cetoglutarato. Portanto, a síntese de ácido succínico atua como uma válvula de segurança (
Rollero et al., 2015) que direciona o pool de α-cetoglutarato acumulado para o ciclo do TCA.
Assim, as fermentações com nitrogênio limitado podem potencialmente contribuir para a
acidificação biológica, um processo muito desejável, se levarmos em conta a atual queda na
acidez titulável ou o aumento do pH nos mostos e vinhos das uvas como conseqüência das
mudanças climáticas ( Jones et al. 2005 ). O rendimento do ácido acético é um fator substancial
da qualidade do vinho, pois confere sabor desagradável. Nossos resultados demonstraram que
as cepas híbridas produziram significativamente menos ácido acético que o Sc , especialmente
quando o nitrogênio foi limitado no SM . Esta característica pode ser herdada de linhagens
parentais criotolerantes como S. uvarum e S. eubayanusproduziu níveis mais baixos de ácido
acético. Em geral, a produção de ácido acético foi bastante alta em nosso estudo, o que pode
ser devido à ausência de lipídios em nossa SM. Como descrito anteriormente ( Beltran et al.,
2008 ; Rollero et al., 2015 ), a produção de ácido acético é amplamente influenciada pela
concentração lipídica e mais ácido acético é liberado pela levedura no SM do que na uva
natural, devido à diferença de concentração lipídica ( Beltran et al., 2008 ).
A produção de compostos voláteis também foi fortemente impactada pelas condições de

fermentação. A maior quantidade de compostos voláteis foi geralmente produzida quando as
fermentações foram realizadas a 28 ° C com 60 mg / L YAN. Anteriormente, vários autores (
Beltran et al., 2007 ; Carrau et al., 2008 ; Rollero et al., 2015 ) demonstraram a relação negativa
entre concentração de nitrogênio e maior produção de álcoois. A maior quantidade de síntese
mais alta de álcoois sob condições limitadas de nitrogênio pode ser devida principalmente à
síntese de novo de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAAs) através da via anabólica (revisado
por Stewart, 2017) Em nosso estudo, houve maior produção apenas para álcoois mais altos,
mas também para ésteres etílicos e ésteres acetato em baixas concentrações de nitrogênio.
Curiosamente, acetato de etila e succinato de dietila foram dois compostos com a maior
contribuição para a concentração de ésteres de acetato e ésteres de etila, respectivamente. A
produção desses dois compostos foi maior quando o nitrogênio foi limitado e correspondia à
produção muito grande de ácidos succínico e acético. Sem considerar o acetato de etila e o
succinato de dietila, foi observada uma correlação positiva entre a produção de ésteres de
Baixarde etila
acetato e ésteres Compartilhar
e a concentraçãoExportação
de nitrogênio ( Fig. 7 ), o que concorda com a
conclusão de vários estudos anteriores ( Mouret et al., 2014a ; Rollero et al. al., 2015)
Normalmente, a fermentação a baixa temperatura tem sido aplicada para conservar melhor os
aromas ( Beltran et al., 2002 ; Gamero et al., 2013 ; Molina et al., 2007 ; Torija et al., 2003 ). No
entanto, Mouret et al., 2014a , Mouret et al., 2014b mencionaram a possível influência
superestimada da temperatura na síntese de ésteres. Nossos resultados ilustram que a
concentração inicial de nitrogênio, em vez da temperatura, parece impactar mais fortemente a
formação de compostos voláteis. No entanto, como as fermentações realizadas a 12 ° C e 60 mg
/ L YAN não terminaram, essa evidência pode não ser suficiente para chegar a essa conclusão.
Comparando com S. cerevisiae , as linhagens parentais criotolerantes produziram maiores

quantidades de ésteres de acetato e menores quantidades de ésteres de etila e álcoois
superiores. Entre os ésteres de acetato, foi detectada uma quantidade maior de acetato de etila,
o que confere aos vinhos um sabor estranho semelhante ao solvente. Por esse motivo, as cepas
de S. eubayanus e S. uvarum utilizadas em nosso estudo podem não ser cepas perfeitas para
fermentações de cultura pura em termos de caráter sensorial. Entretanto, as linhagens
híbridas, principalmente Sc x Se, produziu maiores quantidades de ésteres etílicos e álcoois
superiores. Estes compostos são altamente desejáveis no vinho porque são os principais
doadores de aromas frutados e florais. Além disso, a maior produção de acetato de 2-feniletil e
2-feniletanol pelas cepas híbridas proporcionou ao vinho um agradável odor de rosa, o que
aumentou a complexidade do aroma.
4.3 . Exigência de nitrogênio e utilização sequencial por linhagens híbridas

Em nosso trabalho anterior ( Su et al., 2019 ), fermentações de competição foram realizadas
entre S. cerevisiae e as cepas criotolerantes em baixas concentrações de nitrogênio. O resultado
revelou que as cepas criotolerantes selecionadas superaram S. cerevisiaeem baixas
concentrações de nitrogênio, com temperatura de fermentação não superior a 20 ° C. No
entanto, as cepas criotolerantes apresentaram baixa capacidade de fermentação a 28 ° C. As
cepas híbridas demonstraram excelente comportamento de fermentação a 28 ° C com apenas
60 mg / L YAN, enquanto as cepas parentais criotolerantes não conseguiram esgotar todos os
açúcares fermentáveis sob a mesma condição. Durante as fermentações, as fontes de
nitrogênio foram consumidas mais rapidamente pelas linhagens híbridas do que pelas
linhagens parentais, o que indica melhor capacidade de competir na absorção dos principais
nutrientes. Sob a condição de limitação de nitrogênio, essa estratégia poderia garantir um
tamanho ótimo de população.
Para S. cerevisiae , a ordem de captação da fonte de nitrogênio é regulada principalmente pela

repressão ao catabolito de nitrogênio (NCR) e pelo mecanismo Ssy1p-Ptr3p-Ssy5 (SPS). Como
S. eubayanus e S. uvarum estão filogeneticamente relacionados a S. cerevisiae , também é
esperado um sistema de regulação semelhante. Ordem semelhante de captação de fontes de
nitrogênio foi observada entre S. cerevisiae, estirpes criotolerantes e estirpes híbridas. Em nosso
estudo, as fermentações foram realizadas nas mesmas condições e agrupadas no mapa de calor
da ordem de absorção de nitrogênio. Portanto, em vez de linhagens de leveduras, as condições
de fermentação influenciaram mais substancialmente a ordem de absorção da fonte de

Baixar Compartilhar
nitrogênio. Notavelmente, a fenilalaninaExportação
foi consumida relativamente mais rapidamente pelas
linhagens de S. eubayanus , S. uvarum e híbridas, que corresponderam a maiores produções de
2-feniletanol e acetato de 2-feniletil por essas linhagens pela via de Ehrlich.
5 . Conclusões
Pela primeira vez, este trabalho utilizou cepas criotolerantes com baixa demanda de nitrogênio
para construção híbrida com S. cerevisiae. As linhagens híbridas obtidas apresentaram boa
adaptação às condições de fermentação a baixa temperatura e baixo nitrogênio e melhor
desempenho de fermentação que as linhagens parentais. Uma alta velocidade de fermentação
não apenas economiza tempo e energia para as vinícolas, mas também evita a contaminação
por microorganismos indesejáveis durante a fermentação. As cepas híbridas são muito
promissoras para a realização de fermentações sob condições estressantes. Estamos bem
cientes de que nossas linhagens construídas são geneticamente modificadas e não podem ser
usadas diretamente na indústria. No entanto, como resultado dessas descobertas preliminares,
estamos construindo cepas não-OGM aplicando a auxotrofia natural e a temperatura como
marcadores de seleção, conforme relatado anteriormente por Magalhães et al. (2017). Devido à
instabilidade inerente aos híbridos de levedura interespecíficos, os híbridos construídos serão
submetidos a um processo de estabilização genômica após várias gerações de propagação
vegetativa. Esse processo de estabilização pode ser explorado para a obtenção de segregantes
(híbridos evoluídos) que apresentam uma alta gama de fenótipos ( Sipiczki, 2018 ).
A seguir estão os dados suplementares relacionados a este artigo.
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Tabela Suplementar 1 . Os iniciadores utilizados para a deleção do gene HO.
Download da documento do Word (12KB) Ajuda do
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Tabela Suplementar 2 . Gradiente de eluente para a determinação por HPLC de

aminoácidos.
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Tabela Suplementar 3 . Composição química do mosto sintético no final da

fermentação em g / L (letras diferentes indicam diferenças significativas, teste Tukey
HSD p ≤ 0,05).
Download da documentação do Word (18KB) Ajuda com arquivos docx
Tabela Suplementar 4 . O rendimento da produção de metabólitos no final da

fermentação (g / g de açúcar ) (letras diferentes indicam diferenças significativas, teste
Tukey HSD p ≤ 0,05).
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Tabela Suplementar
Baixar 5 . Concentração
Compartilhar de compostos voláteis em mg / L (letras
Exportação
diferentes indicam diferenças significativas, teste Tukey HSD p ≤ 0,05).
com arquivos docx
Tabela Suplementar 6 . ANOVA fatorial de compostos voláteis.
Transferir imagem em alta resolução (65 KB) Download da imagem em tamanho real
Fig. 1 complementar . Percentual de S. cerevisiae na cultura mista ao final das fermentações. As

barras azuis representam a cultura mista de S. cerevisiae e S. eubayanus ; as barras verdes
representam a cultura mista de S. cerevisiae e S. uvarum . 60YAN e 300YAN indicam que a
concentração de nitrogênio assimilável foi de 60 mg / L e 300 mg / L, respectivamente.

Fig. 2 complementar . Os gráficos de caixa representam a distribuição da produção dos ésteres

acetato, ésteres etílicos e álcoois superiores de três condições de fermentação.
Fig. 3 complementar . As curvas de consumo de nitrogênio das fermentações realizadas a 28 °

C e 60 mg / L YAN.
Fig. 4 complementar . As curvas de consumo de nitrogênio das fermentações realizadas a 28 °

C e 300 mg / L YAN.
Baixar
Fig. 5 complementar Compartilhar
. As Exportação
curvas de consumo de nitrogênio das fermentações realizadas a 12 °
C e 60 mg / L YAN.
Fig. 6 complementar . As curvas de consumo de nitrogênio das fermentações foram realizadas

a 12 ° C e 300 mg / L YAN.
Fig. 7 complementar . A distribuição da produção de ésteres de acetato sem acetato de etila e

ésteres de etila sem succinato de dietila por diferentes cepas sob três condições de
fermentação.
Reconhecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Subsídio de Cooperação Internacional I-LINK2014 0946 do
Conselho Superior de Investigações Científicas (CSIC) para JMG, PICT 2015-1198 da ANPCyT ,
PIP 2015-555 da CONICET e PI04-A128 da Universidade Nacional del Comahue (Argentina)
para CAL. YS agradece à Generalitat Valenciana por conceder sua bolsa de doutorado.
Declaração de interesse concorrente

Os autores declaram que não há interesses concorrentes em relação à publicação deste artigo.
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Referências
Alonso-del-Real et al., 2017a J. Alonso-del-Real , A. Contreras-Ruiz , GL Castiglioni , E. Barrio
, A. Querol
O uso de populações mistas de Saccharomyces cerevisiae e S. kudriavzevii para reduzir o
teor de etanol no vinho: aeração limitada, proporções de inóculo e inoculação
seqüencial
Frente. Microbiol. , 8 ( 2017 ) , 10.3389 / fmicb.2017.02087
Google Scholar
Alonso-del-Real et al., 2017b J. Alonso-del-Real , M. Lairón-Peris , E. Barrio , A. Querol

Efeito da temperatura na prevalência de espécies de Saccharomyces non cerevisiae contra
uma cepa de vinho de S. cerevisiae na fermentação do vinho: competição, aptidão
fisiológica e influência na composição final do vinho
Frente. Microbiol. , 8 ( 2017 ) , 10.3389 / fmicb.2017.00150
Google Scholar
Antunovics et al., 2005 Z. Antunovics , HV Nguyen , C. Gaillardin , M. Sipiczki Estabilização

gradual do genoma por redução progressiva do genoma de Saccharomyces uvarum em
um híbrido interespecífico com Saccharomyces cerevisiae
FEMS Yeast Res. , 5 ( 2005 ) , pp. 1141 - 1150 , 10.1016 / j.femsyr.2005.04.008
Download do artigo PDF CrossRef View Record no Scopus
Google Scholar
Bell e Henschke, 2005 SJ Bell , PA Henschke

Implicações da nutrição de nitrogênio para uvas, fermentação e vinho
Aust. J. Res. , 11 ( 2005 ) , pp. 242 - 295 , 10.1111 / j.1755-0238.2005.tb00028.x
CrossRef Ver registro no Scopus Google Scholar
Beltran et al., 2002

G. Beltran , MJ Torija , M. Novo , N. Ferrer , M. Poblet , JM Guillamón , N. Rozès , A.

Mas Baixar Compartilhar Exportação
Análise de populações de leveduras durante a fermentação alcoólica: um estudo de
acompanhamento de seis anos
Syst. Appl. Microbiol. , 25 ( 2002 ) , pp. 287 - 293 , 10.1078 / 0723-2020-00097
Download do artigo PDF CrossRef View Record no Scopus
Google Scholar
Beltran et al., 2007 G. Beltran , N. Rozés , A. Mas , JM Guillamón

Efeito da fermentação a baixa temperatura no metabolismo do nitrogênio da levedura
( 2007 ) , pp. 809 - 815 , 10.1007 / s11274-006-9302-6
CrossRef Ver registro no Scopus Google Scholar
Beltran et al., 2008 G. Beltran , M. Novo , JM Guillamón , A. Mas , N. Rozès

Efeito da temperatura de fermentação e do meio de cultura na composição lipídica da
levedura e nos compostos voláteis do vinho
Int. J. Food Microbiol., 121 (2008), pp. 169-177, 10.1016/j.ijfoodmicro.2007.11.030
Article Download PDF View Record in Scopus Google Scholar
Bely et al., 1990 M. Bely, J.M. Sablayrolles, P. Barre

Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation
in oenological conditions
J. Ferment. Bioeng., 70 (1990), pp. 246-252, 10.1016/0922-338X(90)90057-4
Bing et al., 2014 J. Bing, P.J. Han, W.Q. Liu, Q.M. Wang, F.Y. Bai
Evidence for a far east Asian origin of lager beer yeast
Curr. Biol., 24 (2014), pp. R380-R381, 10.1016/j.cub.2014.04.031
Bisson, 1991 L.F. Bisson

Influence of nitrogen on yeast and fermentation of grapes In: Proceedings of the
International Symposium on nitrogen in grapes and wine
American Society for Enology and Viticulture, Davis, CA. Seattle, USA (1991), pp. 78-89
Google Scholar
Butzke, 1998 C.E. Butzke

Survey of yeast assimilable nitrogen status in musts from California, Oregon, and
Washington
Am. J. Enol. Vitic., 49 (1998), pp. 220-224
View Record in Scopus Google Scholar
Camarasa et al., 2003 C. Camarasa, J.P. Grivet, S. Dequin

Investigation by 13C-NMR and tricarboxylic acid (TCA) deletion mutant analysis of
pathways of succinate formation in Saccharomyces cerevisiae during anaerobic
fermentation
Baixar
Microbiology, Compartilhar
149 Exportação
(2003), pp. 2669-2678, 10.1099/mic.0.26007-0
Carrau et al., 2008 F.M. Carrau, K. Medina, L. Farina, E. Boido, P.A. Henschke, E. Dellacassa
Production of fermentation aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae wine yeasts:
effects of yeast assimilable nitrogen on two model strains
FEMS Yeast Res., 8 (2008), pp. 1196-1207, 10.1111/j.1567-1364.2008.00412.x
CrossRef View Record in Scopus Google Scholar
Castellari et al., 1994 L. Castellari, M. Ferruzzi, A. Magrini, P. Giudici, P. Passarelli, C.

Zambonelli
Unbalanced wine fermentation by cryotolerant vs. non-cryotolerant Saccharomyces
strains
Vitis, 33 (1994), pp. 49-52
Diderich et al., 2018 J.A. Diderich, S.M. Weening, M. Van Den Broek, J.T. Pronk, J.M.G. Daran
Selection of Pof- saccharomyces eubayanus variants for the construction of S. cerevisiae ×
S. eubayanus hybrids with reduced 4-vinyl guaiacol formation
Front. Microbiol., 9 (2018), pp. 1-17, 10.3389/fmicb.2018.01640
Google Scholar
Gamero et al., 2013 A. Gamero, J. Tronchoni, A. Querol, C. Belloch

Production of aroma compounds by cryotolerant Saccharomyces species and hybrids at
low and moderate fermentation temperatures
J. Appl. Microbiol., 114 (2013), pp. 1405-1414, 10.1111/jam.12126
García-Ríos et al., 2019 E. García-Ríos, A. Guillén, R. De la Cerda, L. Pérez-través, A. Querol,

J.M. Guillamón
Improving the Cryotolerance of Wine Yeast by Interspecific Hybridization in the
Genus Saccharomyces
vol. 9 (2019), pp. 1-12, 10.3389/fmicb.2018.03232
Gayevskiy and Goddard, 2016 V. Gayevskiy, M.R. Goddard

Saccharomyces eubayanus and Saccharomyces arboricola reside in North Island native
New Zealand forests
Environ. Microbiol., 18 (2016), pp. 1137-1147, 10.1111/1462-2920.13107
Gibson and Liti, 2015 B. Gibson, G. Liti

Saccharomyces pastorianus: genomic insights inspiring innovation for industry
Yeast, 32 (2015), pp. 17-27, 10.1002/yea.3033
R.D. Gietz, R.H. Schiestl

Gietz and Schiestl,
Baixar 2008
Compartilhar
High-efficiencyExportação
yeast transformation using the LiAc/SS carrier
DNA/PEG method
Nat. Protoc., 2 (2008), pp. 31-35, 10.1038/nprot.2007.13
Google Scholar
Giudici and Kunkee, 1994 P. Giudici, R.E. Kunkee

The effect of nitrogen deficiency and sulfur-containing amino acids on the reduction
of sulfate to hydrogen sulfide by wine yeasts
Am. J. Enol. Vitic., 45 (1994), pp. 107-112
Goldstein and McCusker, 1999 A.L. Goldstein, J.H. McCusker

Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces
cerevisiae
Yeast, 15 (1999), pp. 1541-1553, 10.1002/(SICI)1097-0061
(199910)15:14<1541::AID-YEA476>3.0.CO;2-K
Gómez-Alonso et al., 2007 S. Gómez-Alonso, I. Hermosín-Gutiérrez, E. García-Romero

Simultaneous HPLC analysis of biogenic amines, amino acids, and ammonium ion as
aminoenone derivatives in wine and beer samples
J. Agric. Food Chem., 55 (2007), pp. 608-613, 10.1021/jf062820m
González Flores et al., 2017 M. González Flores, M.E. Rodríguez, J.M. Oteiza, R.J. Barbagelata,
C.A. Lopes
Physiological characterization of Saccharomyces uvarum and Saccharomyces eubayanus
from Patagonia and their potential for cidermaking
González et al., 2006 S.S. González, E. Barrio, J. Gafner, A. Querol

Natural hybrids from Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus and
Saccharomyces kudriavzevii in wine fermentations
Gutiérrez et al., 2012 A. Gutiérrez, R. Chiva, M. Sancho, G. Beltran, F.N. Arroyo-López, J.M.
Guillamón
Nitrogen requirements of commercial wine yeast strains during fermentation of a
synthetic grape must
Food Microbiol., 31 (2012), pp. 25-32, 10.1016/j.fm.2012.02.012
Hagen et al., 2008 K.M. Hagen, M. Keller, C.G. Edwards

Survey of biotin, pantothenic acid, and assimilable nitrogen in winegrapes from the
Baixar
Pacific NorthwestCompartilhar Exportação
Am. J. Enol. Vitic., 59 (2008), pp. 432-436
Hebly et al., 2015 Hebly, M., Brickwedde, A., Bolat, I., Driessen, M.R.M., Hulster, E.A.F. De,
Broek, M. Van Den, Pronk, J.T., Geertman, J., Daran, J., Daran-lapujade, P., 2015. S.
cerevisiae × S. eubayanus interspecific hybrid: the best of both worlds and beyond.
FEMS Yeast Res. 15, fov005. doi:https://doi.org/10.1093/femsyr/fov005.
Google Scholar
Henschke and Jiranek, 1993 P.A. Henschke, V. Jiranek

Yeast: metabolism of nitrogen compounds
Wine Microbiology and Biotechnology (1993), pp. 77-164, 10.1089/end.2014.0018
Google Scholar
Jolly et al., 2014 N.P. Jolly, C. Varela, I.S. Pretorius

Not your ordinary yeast: non-Saccharomyces yeasts in wine production uncovered
FEMS Yeast Res., 14 (2014), pp. 215-237, 10.1111/1567-1364.12111
Jones et al., 2005 G.V. Jones, M.A. White, O.R. Cooper, K. Storchmann
Climate change and global wine quality
Clim. Chang., 73 (2005), pp. 319-343, 10.1007/s10584-005-4704-2
Katz Ezov et al., 2010 T. Katz Ezov, S.L. Chang, Z. Frenkel, A.V. Segrè, M. Bahalul, A.W. Murray,
J.Y. Leu, A. Korol, Y. Kashi
Heterothallism in Saccharomyces cerevisiae isolates from nature: Effect of HO locus
on the mode of reproduction
Mol. Ecol., 19 (2010), pp. 121-131, 10.1111/j.1365-294X.2009.04436.x
Kishimoto, 1994 M. Kishimoto

Fermentation characteristics of hybrids between the cryophilic wine yeast
Saccharomyces bayanus and the mesophilic wine yeast Saccharomyces cerevisiae
J. Ferment. Bioeng., 77 (1994), pp. 432-435, 10.1016/0922-338X(94)90019-1
Krogerus et al., 2017 K. Krogerus, F. Magalhães, V. Vidgren, B. Gibson

Novel brewing yeast hybrids: creation and application
Appl. Microbiol. Biotechnol., 101 (2017), pp. 65-78, 10.1007/s00253-016-8007-5
Krogerus et al., 2018 K. Krogerus, R. Preiss, B. Gibson
A unique Saccharomyces cerevisiae × Saccharomyces uvarum hybrid isolated from

Baixar farmhouse
Norwegian Compartilhar Exportação and reconstruction
beer: characterization
Le Jeune et al., 2007 C. Le Jeune, M. Lollier, C. Demuyter, C. Erny, J.L. Legras, M. Aigle, I.
Masneuf-Pomarède
Characterization of natural hybrids of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces
bayanus var
uvarum. FEMS Yeast Res., 7 (2007), pp. 540-549, 10.1111/j.1567-1364.2007.00207.x
CrossRef Google Scholar
Libkind et al., 2011 D. Libkind, C.T. Hittinger, E. Valério, C. Gonçalves, J. Dover, M. Johnston,
P. Gonçalves, J.P. Sampaio
Microbe domestication and the identification of the wild genetic stock of lager-brewing
yeast
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 108 (2011), pp. 14539-14544, 10.1073/pnas.1105430108
Lippman and Zamir, 2007 Z.B. Lippman, D. Zamir

Heterosis: revisiting the magic
Trends Genet., 23 (2007), pp. 60-66, 10.1016/j.tig.2006.12.006
Lopandic, 2018 K. Lopandic

Saccharomyces interspecies hybrids as model organisms for studying yeast adaptation
to stressful environments
Yeast, 35 (2018), pp. 21-38, 10.1002/yea.3294
Lopandic et al., 2007 K. Lopandic, H. Gangl, E. Wallner, G. Tscheik, G. Leitner, A. Querol, N.

Borth, M. Breitenbach, H. Prillinger, W. Tiefenbrunner
Genetically different wine yeasts isolated from Austrian vine-growing regions influence
wine aroma differently and contain putative hybrids between Saccharomyces cerevisiae
and Saccharomyces kudriavzevii
Magalhães et al., 2017 F. Magalhães, K. Krogerus, V. Vidgren, M. Sandell, B. Gibson

Improved cider fermentation performance and quality with newly generated
Saccharomyces cerevisiae × Saccharomyces eubayanus hybrids
J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2017), 10.1007/s10295-017-1947-7
Google Scholar
Masneuf et al., 1998 I. Masneuf, J. Hansen, C. Groth, J. Piskur
New hybrids between Saccharomyces sensu stricto yeast species found among wine and
ciderBaixar Compartilhar
production strains Exportação
Appl. Environ. Microbiol., 64 (1998), pp. 3887-3892
Masneuf-Pomarède et al., 2010 I. Masneuf-Pomarède, M. Bely, P. Marullo, A. Lonvaud-Funel,

D. Dubourdieu
Reassessment of phenotypic traits for Saccharomyces bayanus var. uvarum wine yeast
strains
Mendes-Ferreira et al., 2004 A. Mendes-Ferreira, A. Mendes-Faia, C. Leão

Growth and fermentation patterns of Saccharomyces cerevisiae under different
ammonium concentrations and its implications in winemaking industry
J. Appl. Microbiol., 97 (2004), pp. 540-545, 10.1111/j.1365-2672.2004.02331.x
Molina et al., 2007 A.M. Molina, J.H. Swiegers, C. Varela, I.S. Pretorius, E. Agosin
Influence of wine fermentation temperature on the synthesis of yeast-derived volatile
aroma compounds
Morales and Dujon, 2012 L. Morales, B. Dujon

Evolutionary role of interspecies hybridization and genetic exchanges in yeasts
Microbiol. Mol. Biol. Rev., 76 (2012), pp. 721-739, 10.1128/MMBR.00022-12
Mouret et al., 2014a J.R. Mouret, C. Camarasa, M. Angenieux, E. Aguera, M. Perez, V. Farines,
J.M. Sablayrolles
Kinetic analysis and gas-liquid balances of the production of fermentative aromas
during winemaking fermentations: effect of assimilable nitrogen and temperature
Food Res. Int., 62 (2014), pp. 1-10, 10.1016/j.foodres.2014.02.044
Mouret et al., 2014b J.R. Mouret, M. Perez, M. Angenieux, P. Nicolle, V. Farines, J.M.
Sablayrolles
Online-based kinetic analysis of higher alcohol and ester synthesis during winemaking
fermentations
Food Bioprocess Technol., 7 (2014), pp. 1235-1245, 10.1007/s11947-013-1089-5
Nicolini et al., 2004 G. Nicolini, R. Larcher, G. Versini

Status of yeast assimilable nitrogen in Italian grape musts and effects of variety,
ripening and vintage
Vitis - J. Grapevine Res., 43 (2004), pp. 89-96

View Baixar Compartilhar
Record in Scopus Exportação
Google Scholar
Origone et al., 2018 A.C. Origone, M.E. Rodríguez, J.M. Oteiza, A. Querol, C.A. Lopes
Saccharomyces cerevisiae × Saccharomyces uvarum hybrids generated under different
conditions share similar winemaking features
Yeast, 35 (2018), pp. 157-171, 10.1002/yea.3295
Ough and Amerine, 1988 C.S. Ough, M.A. Amerine

Methods for Analysis of Musts and Wines
(2nd edition), Wiley-Interscience, New York (1988), pp. 172-195
Google Scholar
Padilla et al., 2017 B. Padilla, L. Zulian, À. Ferreres, R. Pastor, B. Esteve-Zarzoso, G. Beltran, A.

Mas
Sequential inoculation of native non-Saccharomyces and Saccharomyces cerevisiae strains
for wine making
Pérez-Través et al., 2015 L. Pérez-Través, C.A. Lopes, R. González, E. Barrio, A. Querol

Physiological and genomic characterisation of Saccharomyces cerevisiae hybrids with
improved fermentation performance and mannoprotein release capacity
Peris et al., 2014 D. Peris, K. Sylvester, D. Libkind, P. Gonçalves, J.P. Sampaio, W.G. Alexander,
C.T. Hittinger
Population structure and reticulate evolution of Saccharomyces eubayanus and its lager-
brewing hybrids
Mol. Ecol., 23 (2014), pp. 2031-2045, 10.1111/mec.12702
Pizarro et al., 2008 F.J. Pizarro, M.C. Jewett, J. Nielsen, E. Agosin

Growth temperature exerts differential physiological and transcriptional responses in
laboratory and wine strains of Saccharomyces cerevisiae
Appl. Environ. Microbiol., 74 (2008), pp. 6358-6368, 10.1128/AEM.00602-08
Rainieri et al., 1998 S. Rainieri, C. Zambonelli, R. Giudici, L. Castellari

Characterisation of thermotolerant Saccharomyces cerevisiae hybrids
Biotechnol. Lett., 20 (1998), pp. 543-547, 10.1023/A:1005389309527
Riou et al., 1997 C. Riou, J.M. Nicaud, P. Barre, C. Gaillardin

Stationary-phase gene expression in Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation

Yeast,Baixar
13 (1997), Compartilhar Exportação
pp. 903-915, 10.1002/(SICI)1097-0061(199708)13:10<903::AID-
YEA145>3.0.CO;2-1
Rodríguez et al., 2014 M.E. Rodríguez, L. Pérez-Través, M.P. Sangorrín, E. Barrio, C.A. Lopes
Saccharomyces eubayanus and Saccharomyces uvarum associated with the fermentation of
Araucaria araucana seeds in Patagonia
FEMS Yeast Res., 14 (2014), pp. 948-965, 10.1111/1567-1364.12183
Rodríguez et al., 2016 M.E. Rodríguez, A.C. Origone, M.G. Flores, C.A. Lopes
Saccharomyces in Traditional and Industrial Fermentations from Patagonia
N. Olivera, D. Libkind, E. Donati (Eds.), Biology and Biotechnology of Patagonian
Microorganisms, Springer, Cham (2016), 10.1007/978-3-319-42801-7_15
Google Scholar
Rollero et al., 2015 S. Rollero, A. Bloem, C. Camarasa, I. Sanchez, A. Ortiz-Julien, J.M.

Sablayrolles, S. Dequin, J.R. Mouret
Combined effects of nutrients and temperature on the production of fermentative
aromas by Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation
Sipiczki, 2008 M. Sipiczki

Interspecies hybridization and recombination in Saccharomyces wine yeasts

Interspecies hybridisation and genome chimerisation in Saccharomyces: combining of
gene pools of species and its biotechnological perspectives
Google Scholar

Yeast two- and three-species hybrids and high-sugar fermentation
Microb. Biotechnol. (2019), 10.1111/1751-7915.13390
Google Scholar
Sprouffske, 2018 K. Sprouffske

growthcurver: Simple Metrics to Summarize Growth Curves. R package version 0.3.0.
(2018)
https://CRAN.R-project.org/package=growthcurver
Google Scholar
Steensels et al., 2014 J. Steensels, T. Snoek, E. Meersman, M.P. Nicolino, K. Voordeckers, K.J.
Baixar
Verstrepen Compartilhar Exportação
Improving industrial yeast strains: exploiting natural and artificial diversity
FEMS Microbiol. Rev., 38 (2014), pp. 947-995, 10.1111/1574-6976.12073
Stewart, 2017 G. Stewart

The production of secondary metabolites with flavour potential during brewing and
distilling wort fermentations
Fermentation, 3 (2017), p. 63, 10.3390/fermentation3040063
Stribny et al., 2015 J. Stribny, A. Gamero, R. Pérez-Torrado, A. Querol

Saccharomyces kudriavzevii and Saccharomyces uvarum differ from Saccharomyces
cerevisiae during the production of aroma-active higher alcohols and acetate esters
using their amino acidic precursors
Stribny et al., 2016 J. Stribny, A. Querol, R. Pérez-Torrado

Differences in enzymatic properties of the Saccharomyces kudriavzevii and
Saccharomyces uvarum alcohol acetyltransferases and their impact on aroma-active
compounds production
Google Scholar
Su et al., 2019 Y. Su, A. Cecilia, M. Eugenia, A. Querol, J. Manuel, C. Ariel

Fermentative behaviour and competition capacity of cryotolerant Saccharomyces species
in different nitrogen conditions
Swiegers et al., 2005 J.H. Swiegers, E.J. Bartowsky, P.A. Henschke, I.S. Pretorius
Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavour
Aust. J. Grape Wine Res., 11 (2005), pp. 139-173, 10.1111/j.1755-0238.2005.tb00285.x
Torija et al., 2003 M.J. Torija, N. Rozès, M. Poblet, J.M. Guillamón, A. Mas
Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces
cerevisiae
Int. J. Food Microbiol., 80 (2003), pp. 47-53, 10.1016/S0168-1605(02)00144-7
Zambonelli et al., 1997 C. Zambonelli, P. Passarelli, S. Rainieri, L. Bertolini, P. Giudici, L.

Castellari
Technological properties and temperature response of interspecific Saccharomyces

Baixar
hybrids Compartilhar Exportação
J. Sci. Food Agric., 74 (1997), pp. 7-12, 10.1002/(SICI)1097-0010(199705)74:1<7::AID-
JSFA753>3.0.CO;2-X
Zhang et al., 2018 BQ Zhang , Y. Luan , CQ Duan , GL Yan

Uso da co-fermentação de Torulaspora delbrueckii com duas cepas de Saccharomyces
cerevisiae com diferentes características aromáticas para melhorar a diversidade do
perfil de aromas do vinho tinto
Frente. Microbiol. , 9 ( 2018 ) , 10,3389 / fmicb.2018.00606
Google Scholar
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Hibridação Inespecífica Entre Diversas Espécies de Saccharomyces - Uma Solução Biotecnológica Combinada para Fermentações de Vinho Com Baixa Temperatura e Com Nitrogênio Limitado - ScienceDirect

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23/09/2019 Hibridação inespecífica entre diversas espécies de Saccharomyces: uma solução biotecnológica combinada para fermentações de…

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Revista Internacional de Microbiologia de Alimentos

Hibridação inespecíﬁca entre diversas espécies de

https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2019.108331 Obtenha direitos e conteúdo

• Os híbridos apresentaram boa adaptação a diferentes condições de fermentação,

• As fontes de nitrogênio foram consumidas mais rapidamente pelos híbridos

• Os híbridos produziram compostos mais voláteis que aumentam a intensidade e

Vários estudos já construíram híbridos entre S. cerevisiae e S. eubayanus , S. uvarum com o

Estratégias diferentes para a construção de híbridos artiﬁciais, incluindo fusão de

por diferentes linhagens de leveduras. A assimilação de nitrogênio durante a fermentação foi

2.1 . Tensões e meios

O meio extrato de levedura peptona dextrose (YPD), que contém 20 g / L de glicose, 20 g / L de

2.2 . Construção de híbridos

As cepas parentais diplóides transformadas com sucesso (heterozigotos para HO ) foram

As estirpes haplóides Δ ho de ambos os pais, com tipos de acasalamento opostos, foram

2.3 . Análise da atividade de fermentação

Ao contrário de S. cerevisiae , as estirpes de S. uvarum e S. eubayanus são menos tolerantes ao calor

2.4 . Análise por HPLC para açúcares residuais e metabólitos da fermentação

2.5 . Análise por HPLC para aminoácidos residuais

2.6 . Análise de GC para compostos voláteis

2.7 . Análise estatística

3.1 . Cinética de fermentação e composição celular na fermentação de culturas

consumo de açúcar. Não foram observadas diferenças signiﬁcativas para os rendimentos de

3.2 . Quantiﬁcação de compostos voláteis

O Se produziu a maior quantidade de ésteres de acetato (principalmente acetato de etila) a 28 °

3.3 . Ordem de captação de fontes de nitrogênio por linhagens híbridas sob

Os valores de AUC de 20 fontes individuais de nitrogênio para cada condição de fermentação

ordens de classiﬁcação foram representadas em um mapa de calor com agrupamento

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Fig. 6 . O mapa de calor da ordem de consumo de diferentes fontes de nitrogênio com um

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Fig. 7 . A ordem de absorção de diferentes fontes de nitrogênio em quatro condições de

concentração de nitrogênio e a temperatura de fermentação condicionaram claramente o

4.1 . Vantagem da hibridação interespecíﬁca para adaptação de linhagens de

4.2 . Inﬂuência das condições de fermentação no metabolismo da levedura

A produção de compostos voláteis também foi fortemente impactada pelas condições de

Comparando com S. cerevisiae , as linhagens parentais criotolerantes produziram maiores

4.3 . Exigência de nitrogênio e utilização sequencial por linhagens híbridas

Para S. cerevisiae , a ordem de captação da fonte de nitrogênio é regulada principalmente pela

de fermentação inﬂuenciaram mais substancialmente a ordem de absorção da fonte de

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Tabela Suplementar 1 . Os iniciadores utilizados para a deleção do gene HO.

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Tabela Suplementar 2 . Gradiente de eluente para a determinação por HPLC de

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Tabela Suplementar 3 . Composição química do mosto sintético no ﬁnal da

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Tabela Suplementar 4 . O rendimento da produção de metabólitos no ﬁnal da