Detecção de leveduras clinicamente relevantes no sangue: avaliação de métodos de extração e amplificação de RNA 311

ARTIGO ORIGINAL

Detecção de leveduras clinicamente relevantes no sangue:

avaliação de métodos de extração e amplificação de RNA
Detection of clinically relevant yeast in blood: evaluation of methods for RNA extraction and
amplification
Fátima de Melo Azevedo1, Patrícia Severino2, Vanda Dolabela de Magalhães3

ABSTRACT
Objectives: To evaluate different methods of extraction and
purification of RNA from yeast in blood samples to be used in
molecular-based diagnosis. Methods: Different combinations of
commercially available kits were tested with blood samples
artificially inoculated with yeast cultures. Results: Qiagen kits
performed better when compared to other commercial kits both
for RNA extraction and one-step RT-PCR. Conclusions: Kits using a
hot-start approach are better; the choice of kits has an important
impact on the final result of a test.
Keywords: Yeast, molecular-based diagnosis, RNA extraction, RT-
PCR
RESUMO
Objetivos: Avaliar diferentes métodos de extração e purificação
de RNA de leveduras em amostras de sangue, para uso em
diagnóstico molecular. Métodos: Diferentes combinações de kits
comerciais foram testadas com amostras de sangue
artificialmente inoculadas com culturas de levedura. Resultados:
Os kits da Qiagen apresentaram os melhores resultados quando
comparados com os demais kits comerciais, tanto para extração
quanto para RT-PCR em etapa única. Conclusões: Kits que utilizam
“hot-start” são melhores e a escolha do kit adequado tem grande
importância no resultado final de um teste.
Descritores: Levedura, diagnóstico molecular, extração de RNA,
RT-PCR
INTRODUÇÃO
Os avanços da medicina levaram ao prolongamento da
sobrevida de pacientes imunocomprometidos e ao
aumento da importância das infecções oportunistas por
fungos(1-2). Candida é a levedura oportunista mais comum
e causa infecções graves, caracterizadas por taxas de
mortalidade elevadas. Os agentes antifúngicos são
particularmente tóxicos para as células humanas e o uso
de tais fármacos tem de obedecer a critérios rígidos.
Todavia, uma terapia antifúngica precoce e agressiva que
leve em conta o agente etiológico envolvido pode
melhorar o prognóstico(3-4). As técnicas de laboratório
convencionais para identificação de leveduras
(características de cultura, bioquímicas, fisiológicas e
morfológicas) têm um tempo de liberação (“turnaround
time”) longo. Nessas condições, ferramentas mais rápidas
e mais sensíveis, de base molecular, são de grande valor.
Uma maior sensibilidade pode ser alcançada usando-se
RNA ribossômico como molde em ensaios de
amplificação, já que ele abrange 90% do RNA total das
células. Ao se utilizar o RNA como alvo, é necessário
fazer primeiro a transcrição reversa deste RNA em cDNA
(DNA complementar), o qual será utilizado como molde
para amplificação (PCR). A fim de obter resultados
consistentes, são eliminadas as substâncias inibidoras que
interferem nessas técnicas e que costumam estar presentes

1
Doutora. Centro de Pesquisa Experimental. Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein - São Paulo (SP).
2
Mestre. Centro de Pesquisa Experimental. Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein - São Paulo (SP).
3
Doutora. Centro de Pesquisa Experimental. Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein - São Paulo (SP).
Endereço para correspondência: Fátima de Melo Azevedo - Centro de Pesquisa Experimental, Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein. Av. Albert Einstein, 627 - CEP 05651-901 - São Paulo
(SP), Brasil - Tel.: (5511) 3747-1431 - Fax: (5511) 3747-0208 - e.mail fmazev@einstein.br - Apoio FAPESP 00/14545-9
Recebido em 10 de maio de 2004 – Aceito em 12 de agosto de 2004

einstein. 2004; 2(4):311-3

312 Azevedo FM, Severino P, Magalhães VD
em amostras biológicas. Portanto, a extração e a purifica-
ção de ácidos nucléicos são pontos fundamentais no
diagnóstico baseado em técnicas moleculares.
Neste trabalho, comparamos diferentes métodos de
extração de RNA de células de leveduras inoculadas em
sangue e diferentes reagentes para amplificação enzimática.
Foram avaliados protocolos de obtenção de protoplastos
publicados e quatro kits comerciais de extração de RNA. O
RNA extraído em cada um dos procedimentos foi testado
no formato RT-PCR em etapa única, utilizando-se quatro
kits e um conjunto de “primers” direcionados para 18S
rRNA. Esta metodologia foi aplicada a cinco diferentes
espécies de Candida artificialmente inoculadas em sangue.
MÉTODOS
Linhagens e condições de cultivo
As leveduras foram cultivadas em YPD (0,5% extrato de
levedura, 1% peptona e 2% glicose) a 30°C e 150 rpm.
Foram isoladas de pacientes Candida albicans, C. glabrata,
C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis, identificadas pelo
Laboratório Clínico pelo sistema Vitek e confirmadas por
meio cromogênico (CHROMOagar, Probac) e por
seqüenciamento de 18S. As recomendações do fabricante
(DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing kit –
Amersham Biosciences) foram seguidas durante o
seqüenciamento e utilizadas nos “primers” descritos(5).
Inoculação das amostras de sangue
Amostras de sangue de culturas negativas que seriam
descartadas foram gentilmente cedidas pelo Laboratório
Clínico, sem identificação dos pacientes. O sangue foi
inoculado com diferentes concentrações de leveduras
cultivadas, estimadas por espectrofotometria (600 nm) e
contagem de células em câmara de Neubauer.
Preparação de protoplastos a partir de amostras de
sangue inoculado
As células sangüíneas foram rompidas em tampão de lise (10
mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, proteinase K 0,05% e
Tween 20 0,05%) a 55oC, por 30 minutos. Os fragmentos foram
lavados com tampão de lise sem proteinase K e centrifugados
a 10.000 g por 8 minutos at 20oC, até a clarificação das amostras.
A seguir, a suspensão remanescente foi tratada com
NaOH a 95°C, por 10 minutos e, para a preparação dos
protoplastos, foi utilizada uma solução de Zymoliase
0,1% e b-mercaptoetanol 1%, por uma hora, a 37oC.
Extração de RNA de protoplastos e RT-PCR
Foram seguidas rigorosamente as recomendações dos diversos
kits de extração de RNA: “Purescript Yeast and Gram-Positive
Bacteria Kit” (Gentra), “High Pure RNA Isolation Kit”
(Roche), “RNeasy Kit” (Qiagen) e Trizol (Invitrogen). O kit
da Gentra utiliza um detergente para romper os protoplastos,
ao passo que os outros kits usam um agente caotrópico, um
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sal de guanidina. Para a etapa de purificação, a Gentra usa
“salting out”, e o Trizol tem fenol em sua composição. Os
outros dois kits apresentam algumas variações menores, mas
ambos utilizam colunas para a purificação do RNA. A coluna
da Qiagen exclui o RNA de tamanho pequeno, com menos
de 200 bases, eliminando 15 a 20% do 5.8S e tRNA. Também
testamos kits para RT-PCR da Invitrogen (SuperScript One-
Step RT-PCR with Platinum Taq), Applied Biosystems (EZ
rTth RNA PCR Kit), Qiagen (Qiagen OneStep RT-PCR) e
Roche (C. Therm. Polymerase One-Step RT-PCR System).
Os primers e as condições dos ciclos de PCR foram descritos
previamente(5). Utilizamos 30 pmol de cada “primer” em um
volume de 50 µl para RT-PCR. Também foi realizado PCR
comum para verificar a ausência de DNA nas amostras de
RNA extraído.
RESULTADOS
Considerando que um teste diagnóstico tem o objetivo de
alcançar boa sensibilidade e reprodutibilidade, foram
avaliados diferentes métodos de obtenção e amplificação
de ácidos nucléicos de patógenos em amostras clínicas.
Amostras de sangue inoculadas artificialmente com culturas
de leveduras foram submetidas a dois protocolos previa-
mente descritos para descartar células humanas e gerar proto-
plastos de fungos(5-6). A seguir, os protoplastos obtidos foram
rompidos e o DNA foi precipitado e suspendido novamente
em água. Antes da análise, as culturas de leveduras foram
equalizadas por meio de curvas de crescimento e contagem
de células de leveduras em câmara de Neubauer.
Depois de obtidos os protoplastos, os quatro kits comer-
ciais foram avaliados quanto à extração de RNA. Embora
o protocolo da Qiagen afirme eliminar o DNA através da
coluna e o ensaio da Roche inclua uma etapa de DNAse,
todas as amostras extraídas com qualquer um dos quatro
kits apresentaram resultados positivos no PCR comum,
indicando a presença de DNA residual nas amostras.
Em seguida, o RNA de fungo extraído, obtido com
cada um dos kits de extração, foi usado para transcrição
reversa e amplificação, utilizando-se quatro kits comerciais
diferentes. O kit da Qiagen tem duas transcriptases reversas
que apresentam atividade específica para concentrações
alta e baixa de RNA. A DNA-polimerase usada para a
amplificação é uma enzima “hot-start”, ou seja, é inativa
durante a etapa de transcrição. O kit da Invitrogen também
tem uma enzima “hot-start”, uma polimerase Platinum Taq,
cujo sítio ativo é bloqueado por um anticorpo durante o
processamento do RNA. Uma polimerase termoestável é
utilizada na etapa de transcrição reversa do kit da Roche,
seguida pela polimerização típica por PCR, orientada por
uma segunda enzima presente na reação. O quarto kit
testado foi adquirido da Applied Biosystems e utiliza uma
única enzima que faz tanto a transcrição reversa como a
amplificação. Todos os ensaios, inclusive os protocolos para
obtenção de protoplastos, foram realizados em duplicata,
a fim de determinar sua reprodutibilidade; os resultados
estão apresentados na Tabela 1. O RNA extraído com o kit
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da Gentra não mostrou amplificação em nenhum dos como Candida e com “primers” panfúngicos universais, como
ensaios de RT-PCR, embora o controle positivo estivesse aqueles direcionados para regiões conservadas, tais como o
amplificado (cultura de levedura pura); os resultados não rRNA, uma possível fonte de contaminação cruzada(9).
foram incluídos na tabela. O kit de RT-PCR da Qiagen foi Os nossos resultados sugerem que kits que usam
o único que conseguiu amplificar todas as amostras, inde- metodologia “hot-start” são melhores do que aqueles que
pendentemente do método de extração de RNA usado. permitem polimerização a temperaturas mais baixas. Esta
característica é especialmente importante em ensaios de
Tabela 1. Comparação entre diferentes combinações de kits para extração quantificação de RNA, nos quais o número inicial de moldes
e RT-PCR de RNA para uso em diagnóstico de fungos
(cDNA) tem de corresponder à carga de RNA real(10).
Kit de RT-PCR
Isolados Extração INVITROGEN APPLIED QIAGEN ROCHE
Kits RT-PCR RT-PCR RT-PCR RT-PCR CONCLUSÕES
CA QIAGEN +/+* -/+ +/+ -/- De um modo geral, kits que usam metodologia “hot-start”
ROCHE -/- -/- +/+ -/- (Invitrogen e Qiagen) tiveram desempenho melhor do
TRIZOL +/+ -/- +/+ -/-
CG QIAGEN +/+ -/- +/+ +/-
que aqueles que permitem que a polimerase inicie sua
ROCHE -/- -/- +/+ -/- ação durante a etapa de transcrição reversa. Os nossos
TRIZOL +/- +/+ +/+ -/- resultados revelaram um desempenho melhor do kit da
CK QIAGEN +/+ -/- +/+ -/- Qiagen, tanto em relação à extração de RNA como ao
ROCHE +/- -/- +/+ -/-
TRIZOL +/+ -/- +/+ -/-
ensaio de RT-PCR, e mostraram a importância de se
CP QIAGEN +/+ -/- +/+ -/- escolher o kit apropriado para o diagnóstico molecular.
ROCHE -/- -/- +/+ -/-
TRIZOL -/- -/- +/+ -/-
CT QIAGEN +/+ -/- +/+ -/-
REFERÊNCIAS
ROCHE -/- -/- +/+ -/- 1. Peccin MS. Questionário específico para sintomas de joelho “Lysholm Knee
TRIZOL -/+ -/- +/+ -/- scoring scale” - tradução e validação para a língua portuguesa [tese]. São
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einstein. 2004; 2(4):311-3