Cromatografia

Cromatografia
Licenciatura em Farmácia
Química Analítica em Farmácia II, 2º ano
Ana Paula Fonseca
SUMÁRIO
7.CROMATOGRAFIA
7.1. Princípios básicos
7.2. Cromatografia líquida
7.2.1. Em papel
7.2.2. Em camada fina (TLC)
7.2.3. Em coluna
7.2.3.1. Líquido-líquido
7.2.3.2. Líquido-sólido
2
3
Cromatografia – Origens
Botânico Russo, Foi o fundador
Mikhail Tswet da cromatografia
(1872-1919)
Foi durante as suas

pesquisas sobre a clorofila
Surgiu com designações,

tais como:
Método cromatográfico
Cromatograma
3
4
Cromatografia – Princípios Básicos

 A cromatografia
- técnica da química analítica
- utilizada para a separação de misturas
- baseando-se no princípio de adsorção seletiva
 Tswett separou pigmentos de

plantas (clorofilas)
adicionou um extrato de folhas verdes em éter de

petróleo sobre uma coluna com carbonato de cálcio
em pó num tubo de vidro vertical
4
5

 Enquanto a solução desceu
através da coluna
os componentes individuais da
mistura migraram para baixo em
taxas diferentes de velocidade
apresentando-se a coluna marcada

com gradientes horizontais de cores
a este gradiente chama-se

cromatograma
5
6

não designa um único método
mas um conjunto de métodos
afins de separação
AFINAL DO QUE
SE TRATA?
Processo físico de separação:

os componentes a separar
distribuem-se entre duas fases
móvel estacionária
Gasosa, líquida ou Sólido ou líquido

um fluído disposto sobre um
supercrítico suporte sólido
6
7

A separação
resulta das diferenças de

velocidades dos componentes
arrastados pelo solvente móvel
As diferenças nas
velocidades
Devem-se às diferentes interacções dos

componentes da mistura com a fase
estacionária
7
8
Viajam no ar
Flores
Comparando a
nossa mistura a um FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA
conjunto de
As abelhas separam-se das
abelhas e moscas
moscas, pois têm maior
afinidade para as flores
A separação deve-se à existência de uma (fase estacionária)
diferença de afinidade entre o analito, a
fase móvel e a fase estacionária
8
9
A separação entre os
diferentes componentes da
mistura vai acentuando-se ao
longo do tempo
E pode dever-se a diferentes

mecanismos de distribuição
9
10
Cromatografia – Classificação dos Métodos Cromatográficos

Podemos definir os tipos
de cromatografia O sistema
cromatográfico
- cromatografia líquida
Baseada em - cromatografia gasosa
termos físicos
- cromatografia de fluídos
supercríticos
- cromatografia em coluna O mecanismo de
- cromatografia planar distribuição
- cromatografia de adsorção
- cromatografia de partição
- cromatografia de troca iónica
- cromatografia de exclusão molecular
- cromatografia de afinidade
10
11
Cromatografia – Classificação em termos físicos
Baseada em
termos físicos
Cromatografia planar
- a fase estacionária encontra-se disposta num prato fino ou nos

interstícios de uma papel, onde a fase móvel se move através da
fase estacionária por acção capilar ou por influência da gravidade
Ex: cromatografia papel ou cromatografia camada fina (TLC)
Cromatografia em coluna
- a fase estacionária encontra-se num tubo de pequeno diâmetro por

onde a fase móvel passa através de uma pressão
Ex: cromatografia gasosa (GC) ou cromatografia líquida de alta pressão (HPLC)
11
12
Cromatografia – Classificação mecanismos de distribuição
As separações ocorrem através de interações electroestáticas e forças de Van

Der Waals entre a fase estacionária (sólida) e a fase móvel (líquida ou gasosa)
Fase
estacionária
sílica, alumina
Fase Móvel
12
13
As separações baseiam-se nas diferenças de solubilidade dos componentes

na fase estacionária (líquida) e na fase móvel (líquida)
Fase normal: Fase reversa:

F. estacionária: polar F. estacionária: apolar
F. móvel: apolar F. móvel: polar
Fase
estacionária
Fase Móvel
13
14
As separações baseiam-se no equilíbrio de troca iónica entre a

fase estacionária (trocadora de iões) e a fase móvel
• Fortemente catiónica (sulfónico)

• Fortemente aniónica (amina quater.)
Fase
• Fracamente catiónicas (carboxílico)
estacionária
• Fracamente aniónicas (amina prim.)
14
15
As separações devem-se à existência de diferenças em

relação ao tamanho da molécula
15
16
Cromatografia – Classificação sistema cromatográfico

O sistema
cromatográfico
•atende apenas à natureza física da fase móvel:
Cromatografia Líquida
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Fluídos
supercríticos
fluido comprimido a uma pressão superior à

crítica (cromatografia de fluido, gasosa de
alta pressão ou gasosa densa)
16
17
Cromatografia – Classificação sistema cromatográfico

Estes tipos de cromatografia podem ser subclassificados segundo a natureza da
fase estacionária
Fase Fase Técnica Processo

estacionária móvel cromatográfica Cromatográfico
Adsorção
Camada fina Troca iónica
Líquida Coluna
Sólida Exclusão molecular
Gás Coluna Adsorção
Papel
Líquida Camada fina Partição
Líquida Coluna
Gás Coluna Partição
17
18
Utiliza-se a designação de cromatografia líquida em oposição à gasosa
quando a fase móvel é líquida
- distribuído sobre uma superfície plana:

Cromatografia líquida plana
O suporte sólido Ex: papel e camada fina
- no interior de uma coluna:

Cromatografia líquida em coluna
18
19
Diferenças importantes entre a cromatografia plana e a de coluna, para

além da distribuição da fase estacionária
 O fluxo da fase móvel:

cromatografia plana – por capilaridade
cromatografia em coluna – por acção da força da gravidade
 Reprodutibilidade:
cromatografia plana – inferior reprodutibilidade
cromatografia em coluna – maior reprodutibilidade
19
20
Cromatografia líquida Cromatografia líquida

plana em coluna
• Líquido – Líquido
• Em papel • Líquido – Sólido
• Em camada fina - TLC • Troca iónica
• Exclusão molecular
20
21
Cromatografia Líquida Plana
 O fluxo da fase móvel dá-se por ação capilar
 O solvente móvel deve ser escolhido de modo que as constantes

de partição dos solutos entre a fase estacionária e a móvel
sejam diferentes entre si e > 1
Conc. de soluto na fase estacionária
Cs >1
KD =
CM
Conc. de soluto na fase móvel
 A deteção das zonas pode realizar-se por: observação da sua

cor, por absorção e ou transmissão visível e UV ou por
fluorescência
21
22
Cromatografia em papel
fase estacionária: é um líquido – água adsorvida à superfície do papel

fase móvel: é um líquido – a acetona, álcool ou mistura de solventes orgânicos
1. A mistura de materiais é 2. A extremidade do papel 3. À medida que o solvente,

colocada na parte inferior é colocada na fase líquida contendo o soluto flúi através
móvel, que sobe no papel
de um papel por atracção capilar do papel
4. dá-se a partição entre a

fase móvel (orgânica) e a
fase estacionária (aquosa)
22
23
Com o fluxo contínuo o efeito desta partição

do solvente entre as fases
possibilita a transferência do soluto do

ponto de partida, para um ponto localizado
a alguma distância do local de aplicação
23
24
Os componentes da mistura que não são fortemente atraídos para o papel:

- movem-se para cima com o líquido
Os que são mais fortemente atraídos pelo papel:
- mover-se-ão mais lentamente
provocando a sua separação
24
25
 Após a aplicação da amostra numa das extremidades do papel, este é

colocado numa câmara cromatográfica que já contém o eluente
 O desenvolvimento do cromatograma pode ocorrer em vários sentidos:
- Ascendente
- Descendente
- Espiral
- Circular
25
26
Descendente
Ascendente
Horizontal
Horizontal radial Espiral
26
27
 Quando a cromatografia unidimensional não é satisfatória recorre-se à

bidimensional, recorrendo-se a um outro solvente
Frente do solvente 2
Frente do Frente do
solvente solvente 1
Cromatografia Cromatografia Cromatografia

unidimensional bidimensional (1ª Etapa) bidimensional (2ª Etapa)
Comparação de dois cromatogramas da mesma mistura,

obtidos por cromatografia unidimensional e bidimensional.
27
28
Cromatografia em camada fina
fase estacionária: é um sólido – gel de sílica, alumina ou um determinado tipo de

celulose
colocada num material de suporte (normalmente vidro) sobre o qual se

espalha de forma uniforme, fazendo uma camada fina
amostra: é colocada sobre a fase estacionária próximo a uma das extremidades da

placa
fase móvel: é um líquido – solvente apropriado escolhido de acordo com a amostra
a extremidade da placa que contém a amostra é colocada em contacto

com o solvente de eluição numa câmara de cromatografia
28
29

O solvente sobe por capilaridade pela fase estacionária
levando os componentes a serem separados
cada molécula da mistura desloca-

se a uma velocidade diferente
sobre a fase estacionária
E estará a uma distância

específica de um ponto de origem,
quando cessar o fluxo de solvente
Factor de retenção
(RF)
29
30
COMO SE
CALCULA O RF?
D2
D1
A B C D
RF = Dist. amostra A (D1)

Dist. do solvente (D2)
30
31
Para que serve?
Uma conhecida (padrão)

Duas amostras
Uma desconhecida (amostra)
Analisadas sob
condições idênticas
Se forem iguais
terão o mesmo
valor de RF
31
32
Princípio básico dos processos cromatográficos:

Uma diferença de RF  considerado prova que as amostras são
diferentes
Valores idênticos  são apenas um indício que podem ser iguais, no
entanto duas estruturas diferentes podem apresentar o mesmo RF,
sob determinadas condições
Actualmente já existem no mercado placas de camada fina com a

fase sólida distribuída (pre-coated):
- mais fácil a utilização deste tipo de cromatografia
- mais dispendiosa
32
33
Cromatografia Líquida em Coluna
Cromatografia Líquido-Líquido em Coluna

fase estacionária: é um líquido
imiscíveis ou fracamente miscíveis
fase móvel: é um líquido
a separação de solutos resulta da

existência de diferentes constantes de
partição entre as duas fases
Cromatografia Líquido-Sólido em Coluna
fase estacionária: é um sólido o processo predominante de distribuição

dos solutos entre as fases é
fase móvel: é um líquido tradicionalmente a adsorção
33
34
 É realizada numa coluna
 fase estacionária: enchimento sólido ou uma fase líquida
 fase móvel: líquida
 O movimento da fase líquida ao longo da coluna pode ocorrer por

acção da gravidade ou sob pressão (HPLC)
 As colunas podem ser construídas a partir de tubos de vidro

(buretas de borossilicatos), ou tubos de aço inoxidável adquiridas
comercialmente
34
35
A- Enchimento
B, B’- Camisa e líquido
termostatizado
C- Embolo ajustável
E- Anel de vedação em O
F- Superfície porosa
G- Capilar
Coluna cromatográfica para fluxo descendente ou ascendente

35
36
Fase móvel
Mistura a separar
Enchimento da
coluna (fase Separação de
estacionária) componentes
Algodão e areia
Passo 1 Passo 2 Passo 3
36
37

A amostra é colocada no topo da
coluna (to)
A separação deve-se ao facto de

os componentas (A+B) migrarem a
velocidades diferentes
Através da adição contínua de

solvente à coluna – eluição
A taxa à qual o soluto migra pela

coluna vai depender da fracção de
tempo que este passa na fase móvel
37
38
Cromatografia Líquida em Coluna Solutos fortemente

retidos pela fase
estacionária
Passam menos tempo

na fase móvel
Componente B
Solutos fracamente
retidos pela fase
estacionária
Passam mais tempo na

fase móvel sendo os
primeiros a sair da coluna
Componente A
38
39
As diferenças na taxa à qual

o soluto migra pela coluna
Origina a separação dos

componentes da mistura em
bandas ou zonas, localizadas
ao longo da coluna
Chegando ao detector
separadamente no tempo
39
40
Cromatografia Líquida em Coluna A amostra contendo o analito é

aplicada no topo da coluna
Sendo o seu tamanho significativamente

mais pequeno do que qualquer das
restante zonas da coluna
Mesmo a que atinge o

detector
Este alargamento
da banda
Provoca a diluição do
analito ao longo da coluna
São necessários detectores mais sensíveis, do que os que

seriam se não tivéssemos o processo de separação
40
41

O detector responde à
concentração do soluto
Se este for colocado no final da coluna e

se o sinal for representado em função do
tempo (ou volume adicionado)
Obtemos uma série de picos
Cromatograma
Útil quer em termos qualitativos

quer em termos quantitativos
41
42

A posição no eixo
dos xx
Pode servir para identificar os

componentes
A área dos picos
Fornece uma medição

quantitativa da quantidade de
cada componente na amostra
42
43
Cromatografia Líquida em Coluna t1 t3
Concentração
B B
A A
Distância de migração
A espécie B é retida
mais fortemente
O movimento pela coluna a baixo

aumenta a distância entre as duas zonas
do analito
Ocorre um alargamento de ambas as zonas, diminuindo a

eficiência da coluna como instrumento separativo
43
44
Cromatografia líquida de alta pressão (HPLC)
Trata-se de uma cromatografia

em que a fase móvel é liquida
Utiliza-se a alta pressão para forçar a fase

móvel (líquida) a passar através da coluna que
contém quantidades mínimas de amostra
O HPLC, distingue-se das outras técnicas:

- não apenas pela diferença de pressão
- mas também pelo facto de utilizar colunas com enchimento de partículas
de dimensões reduzidas
44
45
Cromatografia Gasosa em Coluna
agrupam-se todos os métodos cromatográficos, nos quais

 a fase móvel é um gás quimicamente inerte (hidrogénio ou
azoto)
 fase estacionária: poderá ser um sólido ou um líquido
 os componentes da mistura analisada, são transportados pela fase móvel,
na forma de gás ou vapor
 Utiliza-se este tipo de cromatografia quando se pretendem determinar os

componentes voláteis de uma mistura
 técnica cromatográfica de coluna
 o eluente é um gás (gás arrastador) que atravessa, sob pressão, a coluna (a
qual contém a fase estacionária sólida ou líquida) arrastando consigo a amostra
em estudo
45
46
Cromatografia – Análises qualitativas e quantitativas
A cromatografia pode  Análises qualitativas

ser utilizada para:
 Análises quantitativas
Determinações qualitativas:
•Utilização de padrões para comparação
•Mesmas condições
Determinações quantitativas:
• Curvas de calibração
• Adição de padrão
46
47
Qualitativa
x x x x x x
Identificação Pureza Ausência
Quantitativa Preparativa
x x x x
47
48
Cromatografia – Análises qualitativas e quantitativas
Determinações qualitativas
Determinações quantitativas
48
Cromatografia
Fundamentos
49
50
Cromatografia – Fundamentos Teóricos
Baseia-se no facto dos componentes

Cromatografia
da mistura “migrarem” a diferentes
velocidades
Interacção de forma
diferente com a fase
estacionária
Skoog, “Principles of Instrumental Analysis” – Capítulo 26

50
51
Cromatografia – Fundamentos Teóricos
Cromatograma
Gráfico que mostra a resposta

(detector) em função do tempo de
eluição (processo de passagem do
líquido/gás através da coluna)
Informação contida:
- tempo de retenção (identificação do
composto): tempo necessário para o
analito, depois de injectado, percorrer
a coluna e chegar ao detector
- intensidade do sinal (área ou altura)
51
52
Cromatografia – Coeficiente de Partilha, KD

A velocidade de migração depende da afinidade que o analito tem para
cada uma das fases
Coeficiente de
partilha KD:
nS Vm CS KD Baixo ---- maioritariamente

KD   KD 
nm VS Cm fase móvel
Velocidade de migração
superior à dos compostos com
Parâmetro específico de uma dada KD alto
combinação de fase estacionária/fase
móvel (a um dado valor de T)
52
53
Cromatografia – Coeficiente de Capacidade, k’

Coeficiente de É largamente utilizado para descrever a taxa de
capacidade, k’: migração dos solutos em colunas
k 'VM
K D  k ' KD 
VS
Coeficiente de  Razão da fase: é específica para uma dada

coluna com um dado r e df
capacidade
r
 Raio da coluna
2d f
Diâmetro do filme
Influência nos tempos

de retenção
53
54
Cromatografia – tempo de retenção, tR
Tempo de retenção, tR: Tempo que um determinado composto leva a percorrer

a coluna até chegar ao detetor
tR
tM – tempo morto: tempo que uma espécie

tM t’R não retida demora a chegar ao detector
t’R – tempo de retenção ajustado: tempo que

uma espécie passa na fase estacionária
t=0 t  tR  tM
'
R
54
55
Cromatografia – tempo de retenção, tR

Tempo de retenção, tr:
Os valores de tM e t’r são proporcionais às quantidades
de composto na fase móvel e estacionária, assim pode
t R'  t R  t M demonstrar-se que:
t R  t M t R'
tR Coeficiente de
capacidade
k' 
tM tM
tM t’R
Considerando as expressões anteriores:

r
K D  k ' 
2d f
t=0
É óbvia a influência de KD, r e df sobre o tempo de retenção
Se aumentarmos o raio da coluna o tempo de retenção diminui

55
56
Cromatografia – Largura do sinal cromatográfico, W
Para uma boa separação cromatográfica é necessário que as bandas

cromatográficas se mantenham o mais estreitas possível durante a sua
passagem na coluna
A banda cromatográfica tende

alargar naturalmente devido a
Wh vários factores
Wb E torna-se um aspecto chave em cromatografia

reduzir o mais possível o seu alargamento
56
57
Cromatografia – Largura do sinal cromatográfico, W

Admitindo que a distribuição de concentrações do soluto na banda
cromatográfica é Gaussiana:
O pico cromatográfico não é mais que uma representação dessa distribuição

e pode ser tratado matematicamente como uma curva de Gauss
O soluto ao mover-se ao longo da coluna

tende a ter uma forma gaussiana com
Wi= 2
desvio-padrão, 
(ponto de
inflexão)
Wh= 2.354
(meia altura) Que corresponde a
aproximadamente 34% da área
sobre a curva
Wb= 4
57
58
Cromatografia – Eficiência da coluna

Conceito de Prato Teórico
(Princípio da destilação fraccionada)
Os compostos evoluem ao longo da coluna

estabelecendo 1 equilíbrio em cada prato
A eficiência da coluna depende do número de pratos:

“em cada prato é estabelecido um equilíbrio”
A mistura é progressivamente enriquecida no

composto mais volátil
58
59
Cromatografia – Eficiência Separativa

Na coluna cromatográfica:
(em cada prato é estabelecido um equilíbrio)
Dois termos relacionados são largamente utilizados como medidas

quantitativas da eficiência de uma coluna cromatográfica:
 altura do prato teórico, H
 número de pratos teóricos, N
59
60
Cromatografia – Eficiência Separativa

Comprimento da
coluna
L
N (cm)
H
A eficiência aumenta com: aumento de N

diminuição de H
60
61
Cromatografia – Equação de Van Deemter

A separação de substâncias na coluna depende de uma séries de
parâmetros da própria coluna (A-C) e da velocidade do gás (), que
afectam o valor de H
Equação de Van Deemter
 A – Difusão tumultuosa
B
H  A  C  B – Difusão Longitudinal
  C – Resistência à transferência de massa
Altura do
Velocidade linear
prato teórico
da fase móvel
(cm/s)
61
62

A – Difusão tumultuosa (Eddy)
Resulta da capacidade das moléculas do mesmo

analito percorrerem percursos diferentes entre dois
pontos equidistantes
Logo, o tempo de residência de moléculas da

mesma espécie é também variável
chegando ao final da coluna (detector) num

dado intervalo de tempo
alargamento da banda
62
63

A difusão de Eddy é directamente proporcional

 ao diâmetro das partículas do empacotamento da coluna
 ao empacotamento deficiente
Origina caminhos diferentes percorridos pelas

partículas, originando tempos diferentes até
chegarem ao detector
alargamento da banda
63
64

Este factor é pouco importante nas colunas de

alta resolução modernas
Especialmente em colunas capilares
Para estes casos temos a equação de Golay
B
H  C

64
65

B – Difusão Longitudinal
Mede o alargamento do pico resultante da difusão

das moléculas da zona da banda com maior
concentração para as zonas de menor concentração
B  2 DG Onde DG é o
coeficiente de difusão
do gás (fase móvel)
O efeito aumenta com o aumento do coeficiente de difusão do gás
65
66

B – Difusão Longitudinal
A difusão longitudinal é inversamente proporcional à

velocidade da fase móvel
Quando a velocidade da fase móvel é grande, o

tempo que o analito passa na coluna é menor
Assim, a difusão do centro da banda para as

pontas tem menor tempo para ocorrer
Este efeito é muito menos pronunciado na cromatografia líquida, do que na gasosa

Coef. difusão dos líquidos  ordem de grandeza inferior à dos gases
Em alguns líquidos B/ = 0
66
67

C – Resistência à transferência de massa
Mede o efeito do transporte contínuo do soluto pelo gás de arraste sem que
ocorra o estabelecimento do equilíbrio KD
Quanto maior a velocidade da fase móvel menor é

o tempo para que se estabeleça o equilíbrio
Logo maior o alargamento do pico
O aumento destes parâmetros

Dois parâmetros importantes:
provocam um aumento de C
 a espessura do filme (fase estacionária)
 diâmetro interno do capilar
Aumento de H e diminuição da
eficiência separativa (N)
67
68
Cromatografia – Optimização da performance da coluna

Optimização de H
Pretende obter-se um valor de
H mínimo
B
H  A  C
 Não se deve trabalhar em zonas
de velocidades da fase móvel
H muito baixas
C
Pois pequenas variações de
A
velocidade origina grandes
B/ variações na eficiência
Necessário atingir um compromisso entre a velocidade da fase móvel e H
68
69
Cromatografia – Determinação de H e/ou N

O número de pratos teóricos pode ser determinado através do tempo
de retenção e da largura do pico
Número de Pratos:
2 2
 tR   tR 
 
N  16    5.54 
 Wb   Wh 
A eficiência aumenta com:

 aumento de N
Obtenção de um pico mais

estreito
69
70

A eficiência da coluna reflecte-se na largura dos picos cromatográficos
Sendo que a largura pode ser
expressa em termos de 
A variância por unidade de comprimento é usada como

medida de eficiência da coluna:
Prato teórico: Comprimento de coluna que contém

a fracção de analito retida entre L e L + 
L-  L+ 
H 2
L
 o cálculo de H em função de L e  (cm) nem L

sempre é fácil
Det.
Geralmente calcula-se através de N

70
71

Valores específicos para um dado composto ou

grupo de compostos
Nas mesmas condições de análise
71
72
Cromatografia – Resolução
A resolução Rs de uma coluna fornece-nos um valor quantitativo
relacionado com a habilidade de separação de dois compostos
Para que dois compostos se separem, os seus tempos de retenção

têm de ser diferentes, ou seja:
A retenção relativa AB deve ser diferente de 1
t 'R ( B )
 A, B  Mas A,B não tem em conta a largura
t ' R ( A) dos picos cromatográficos
Geralmente usa-se a
Resolução
72
73
definição:
Largura da Largura do
base do pico pico a meia
altura
73
74
Factores que afectam a resolução
Variação em N
N – número de pratos teóricos
N    1  k 'B   – retenção relativa dos 2 picos
R   
4    1  k ' B  k’B – coeficiente de capacidade
componente B
De forma a aumentar a resolução, é necessário L

N (cm)
aumentar N… aumentado L H
Este aumento vai influenciar o tempo de análise
Assim, podemos tentar diminuir H
Problema: Conseguir separar com a máxima resolução e no mínimo tempo

74
75
Cromatografia – Análise qualitativa
Análise qualitativa
CROMATOGRAFIA:
Análise quantitativa
75
76
Cromatografia – Análise qualitativa

Numa análise qualitativa, para a identificação do componente em

estudo podemos utilizar alguns parâmetros:
 o volume de retenção, Vr: volume de gás arrastador necessário para

eluir uma partícula do soluto da coluna
 tempo de retenção, tr: tempo correspondente à definição anterior
Medindo estes valores e comparando-os com os

tempos de retenção de compostos conhecidos
(padrões), pode identificar-se o soluto em estudo
76
77
Cromatografia – Análise quantitativa

Numa análise quantitativa, consideram-se os dados obtidos diretamente

de um cromatograma: a área ou a altura dos picos cromatográficos
 de um modo geral, a quantidade de um componente é proporcional à

área do seu pico, e não à sua altura  recorre-se a métodos de medida
de área
Porém, esta área não fornece indicação Necessário uso de padrões e

da quantidade ou concentração do de estabelece uma relação
soluto correspondente entre a concentração e a área
77
Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Coimbra
Rua 5 de Outubro
S. Martinho do Bispo
Apartado 7006
3040-854 Coimbra
Email: Paula_Fonseca@estescoimbra.pt
Web: www.estescoimbra.pt
Telefone: [+351] 239 802 430
78

Cromatografia

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Surgiu com designações,

Cromatografia – Princípios Básicos

 Tswett separou pigmentos de

adicionou um extrato de folhas verdes em éter de

Cromatografia – Princípios Básicos

apresentando-se a coluna marcada

a este gradiente chama-se

Cromatografia – Princípios Básicos

Processo físico de separação:

Gasosa, líquida ou Sólido ou líquido

Cromatografia – Princípios Básicos

resulta das diferenças de

Devem-se às diferentes interacções dos

Cromatografia – Princípios Básicos

Cromatografia – Princípios Básicos

E pode dever-se a diferentes

Cromatografia – Classificação dos Métodos Cromatográficos

Cromatografia – Classificação em termos físicos

- a fase estacionária encontra-se disposta num prato fino ou nos

Ex: cromatografia papel ou cromatografia camada fina (TLC)

- a fase estacionária encontra-se num tubo de pequeno diâmetro por

Cromatografia – Classificação mecanismos de distribuição

As separações ocorrem através de interações electroestáticas e forças de Van

Cromatografia – Classificação mecanismos de distribuição

As separações baseiam-se nas diferenças de solubilidade dos componentes

Fase normal: Fase reversa:

Cromatografia – Classificação mecanismos de distribuição

As separações baseiam-se no equilíbrio de troca iónica entre a

• Fortemente catiónica (sulfónico)

Cromatografia – Classificação mecanismos de distribuição

As separações devem-se à existência de diferenças em

Cromatografia – Classificação sistema cromatográfico

•atende apenas à natureza física da fase móvel:

fluido comprimido a uma pressão superior à

Cromatografia – Classificação sistema cromatográfico

Fase Fase Técnica Processo

Gás Coluna Adsorção

Gás Coluna Partição

Utiliza-se a designação de cromatografia líquida em oposição à gasosa

quando a fase móvel é líquida

- distribuído sobre uma superfície plana:

- no interior de uma coluna:

Diferenças importantes entre a cromatografia plana e a de coluna, para

 O fluxo da fase móvel:

Cromatografia líquida Cromatografia líquida

Cromatografia Líquida Plana

 O fluxo da fase móvel dá-se por ação capilar

 O solvente móvel deve ser escolhido de modo que as constantes

 A deteção das zonas pode realizar-se por: observação da sua

Cromatografia Líquida Plana

fase estacionária: é um líquido – água adsorvida à superfície do papel

1. A mistura de materiais é 2. A extremidade do papel 3. À medida que o solvente,

4. dá-se a partição entre a

Cromatografia Líquida Plana

Com o fluxo contínuo o efeito desta partição

possibilita a transferência do soluto do

Cromatografia Líquida Plana

Os componentes da mistura que não são fortemente atraídos para o papel:

provocando a sua separação

Cromatografia Líquida Plana

 Após a aplicação da amostra numa das extremidades do papel, este é

 Quando a cromatografia unidimensional não é satisfatória recorre-se à