Salinidade a longo prazo interrompe a função hepática, saúde intestinal, e guelras estado

antioxidante na tilápia do Nilo estressado com hipóxia

Na aquicultura, os peixes são enfatizados com vários fatores envolvidos em impactar a
taxa de crescimento e o estado de saúde. Embora a tilápia do Nilo possa resistir a
condições de água salobra, o estado de hipóxia pode prejudicar o estado de saúde dos
peixes. A tilápia do Nilo foi exposta à água salina em 0, 10 e 20 por quatro semanas, então
o comportamento de crescimento foi verificado. Os resultados mostraram
significativamente menor taxa de crescimento, utilização de ração e taxa de sobrevivência
quando os peixes permaneceram em 20 por quatro semanas. Em seguida, os peixes foram
subdivididos em seis grupos (delineamento fatorial, 2 3) em condições de normoxia (DO, 6
mg/L) e hipóxia (DO, 1 mg/L) para 24 h. Alta salinidade (10 e 20 ) combinada com
características inflamatórias induzidas por estresse hipóxia nos intestinos, brânquias e
fígados de peixes. As atividades de SOD, CAT e GPX foram aumentadas nos intestinos,
brânquias e fígados de peixes cultivados em 10 e 20 e expostos com estresse por hipóxia.
Peixes cultivados em 20 e estressados com hipóxia apresentaram os maiores níveis de ALT,
AST e ALP (p < 0,05) entre os grupos. Os maiores níveis de transcrição dos genes Il-8, Il-1β,
Ifn-γ, Tnf-α e Caspase-3 e o menor nível do gene Il-10 foram observados em peixes
expostos com 20 e hipóxia. As saídas de Integrated Biomarker Response (IBR) mostraram
diferenças marcadas entre grupos de peixes com valores variados. A menor IBR foi
observada em peixes criados em água doce e normoxia, enquanto a maior IBR foi
observada no grupo de peixes criados em 20 condições e hipóxia (p < 0,05). Estes
resultados confirmam que a tilápia do Nilo pode tolerar 10 em normoxia, mas 20
salinidade combinada com hipóxia resulta em estresse oxidativo, apoptose e
características inflamatórias nos intestinos, brânquias e fígados. Os resultados obtidos
indicam que a hipóxia pode afetar o desempenho da tilápia do Nilo criada em salinidade
salobra ou de alta água, levando a uma grave perda econômica. Novos estudos futuros são
necessários para entender o impacto de diferentes salinidades de água com hipóxia no
curto e longo prazo períodos sobre a Produtividade da tilápia do Nilo.

Introdução.
Dada a necessidade urgente de fontes seguras de proteínas animais, a indústria aquícola
contribui para o fornecimento de produtos do mar saudáveis e sustentáveis (Osmundsen et al.,
2020). A demanda por produtos da aquicultura está aumentando linearmente com o aumento
da população, e a necessidade urgente de intensificar a produção de animais aquáticos
também é necessária (Kwasek et al., 2020). Várias espécies de peixes são validadas para
sistemas de aquicultura intensiva, especialmente tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), para
atender consumidores e produtores (Mengistu et al., 2020). De fato, a tilápia do Nilo é
reconhecida como um "peixe dourado" por sistemas intensivos atribuídos à alta resistência de
estressores induzidos por atributos ambientais da agricultura (David et al., 2015). Estes
incluem hipóxia (Li et al., 2018b; Xia et al., 2018), acúmulo de amônia (Hegazi et al., 2010),
temperatura sub-ideal e sobre-água (Xavier et al., 2020) e salinidade (Caxico Vieira et al., 2018;
El-Leithy et al., 2019; Xu et al., 2018). Embora a tilápia do Nilo seja classificada como espécie
de água doce (de Azevedo et al., 2015), ela pode resistir às condições de água salobra (Durigon
et al., 2020), tornando-a necessária para a aquicultura em países que sofrem com a falta de
recursos de água doce. O fator de salinidade da água está envolvido na regulação da
capacidade de osmorregulação dos peixes e deve ser mantido dentro do valor ideal para o
crescimento normal, metabólico e respostas fisiológicas (Cui et al., 2019; Tseng and Hwang,
2008). A tilápia do Nilo apresentou flutuações n taxa de crescimento e estado fisiológico
quando exposta a diferentes níveis de salinidade, dependendo da duração da exposição (Ni et
al., 2021). A exposição a curto prazo à salinidade aumentou a imunidade e alterou os índices
hematológicos na tilápia do Nilo (Ni et al., 2021). No entanto, na exposição a longo prazo, a
tilápia do Nilo apresentou crescimento prejudicado, imunidade e funções regulatórias do Smo
(Xu et al., 2018). Conseqüentemente, os peixes tiveram a susceptibilidade aumentada à
infecção com invasores patogênicos. Além do impacto da salinidade elevada para a exposição
a longo prazo em tilápia de Nile, a influência da hipóxia não é tentada ainda para o
esclarecimento dos efeitos interativos de ambos os fatores em desempenhos do tilápia.
O estresse por hipóxia é outro fator vital associado ao crescimento de espécies de peixes em
sistemas intensivos (Li et al., 2018b). Refere-se ao nível abaixo do ideal de oxigénio dissolvido
na água de criação e pode variar com base nas espécies de organismos aquáticos e nas
condições de criação. A longo prazo, o estresse por hipóxia afeta negativamente o
desempenho do crescimento dos peixes, prejudicando a função metabólica (Li et al., 2017).
Notavelmente, o estresse por hipóxia causa perturbação na respiração e osmorregulação na
superfície das lamelas dedicadas ao aumento do estresse oxidativo (Sun et al., 2020).
Simultaneamente, a hipóxia induz baixas taxas metabólicas de nutrientes e a utilização da
ração, levando a respostas fisiológicas e imunológicas prejudicadas em peixes (Sheng et al.,
2019). O estresse da hipóxia também diminui a resistência da tilápia do Nilo à infecção por
patógenos e reduz a eficácia das vacinas (Gallage et al., 2016; Wang et al., 2018).
A tilápia do Nilo tem maior tolerância contra a hipóxia e condições de salinidade elevadas do
que outras espécies de peixes, sugerindo tilápias para sistemas intensivos (El-Leithy et al.,
2019; Ishibashi et al., 2002). No entanto, não foram investigados os impactos interativos de
estressores de alta salinidade e hipóxia no desempenho de tilápias do Nilo. Assim, este estudo
aponta uma análise mais detalhada da influência esperada da exposição a longo prazo de alta
salinidade e hipóxia na taxa de crescimento, utilização de ração, respostas oxidativas e
imunológicas.

Materiais e métodos
2.1. Peixes de ensaio, aclimatação e concepção
Os procedimentos de pesquisa relacionados aos peixes foram aprovados pelo Comitê
Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Faculdade de Agricultura da Universidade
Kafrelsheikh, Kafrelsheikh, Egito (Número 12/2021 EC). Tilápias do Nilo (N = 270) saudáveis e
sexadas foram colhidas numa exploração comercial de peixes situada em Kafrelsheikh, no
Egipto, e cuidadosamente transportadas para o laboratório para adaptação. Os peixes foram
recebidos em tanques de plástico de 1000 L equipados com aeração por bomba e preenchidos
com água fresca desclorada. Peixes mantidos por 14 dias, onde a água foi substituída
diariamente por água de cloro livre e ofereceu uma ração flutuante peletada (30% de proteína
bruta, Skretting, Bilbis, Província de El Sharqia, Egito) duas vezes por dia. No final do período
de adaptação, os peixes passaram fome durante 24 horas para serem distribuídos nos tanques
de plástico experimentais (100 L). Quinze peixes com peso inicial individual 15,44 0,56 g foram
estocados em cada tanque preenchido com água desclorada fresca. O ensaio foi realizado com
dezoito tanques de plástico apresentando três grupos ( 6 tanques, triplicados). Os tanques
foram internamente subdivididos em três grupos, e cada grupo (6 tanques) foi fornecido com
água desclorada com 0, 10 e 20 de salinidade. A água de salinidade (10 e 20 ) foi preparada
misturando água doce com sal marinho e mantida em tanques de estoque (1000 L) 24 h antes
de ser adicionada aos tanques experimentais. Os níveis de salinidade da água foram
gradualmente aumentados nos tanques experimentais adicionando solução salina à água a 4
por dia até atingir os níveis de salinidade propostos. Todos os peixes foram mantidos em
condições de normoxia até que a salinidade de água proposta é fixada, em seguida, o ensaio
manteve-se por quatro semanas quando atingindo 0, 10 e 20. Os peixes foram alimentados
com os mesmos pellets flutuantes comerciais utilizados durante o período de adaptação duas
vezes por dia (08:00 e 15:00) a 3% do peso corporal. Os demais pellets foram coletados 1 h
após a alimentação e mantidos no freezer para o cálculo da ração consumida em cada tanque.
A condição de saúde e a atividade dos peixes foram verificadas visualmente pela capacidade
dos peixes de coletar as pelotas e a falta de anormalidades corporais. Os índices de qualidade
da água foram verificados durante o ensaio e registrados valores ótimos, exceto a salinidade
da água. Após quatro semanas, todos os peixes passaram fome por 24 h e no dia seguinte, às
9h, os peixes foram pesados e contados para calcular o seguinte índice:
Ganho de peso (WG, %) = ((peso final (FW, g) peso inicial (IW, g))/IW (g)) 100.
Taxa de crescimento específico (SGR, %/dia) = 100 [ln FW (g) - ln IW (g)]/dias.
Rácio de conversão alimentar (FCR) = alimento consumido (g)/ WG (g).
Sobrevivência (%) = 100 número final/número inicial de peixes.

2.2. Hipoxia contestada

Em seguida, os tanques foram divididos em duas seções: a primeira (= 9 tanques) foi suportada
com aeração contínua usando bombas elétricas para ter o nível ótimo de oxigênio dissolvido
(DO), que é chamado de normoxia (6-7 mg/L). Os nove tanques restantes foram mantidos sem
aeração para condições de hipóxia (1-2 mg/L). Os grupos são água doce e normoxia (S0/DO1),
água doce e hipóxia (S0/DO6), água de salinidade (10 ) e normoxia (S10/DO6), água de
salinidade (10 ) e hipóxia (S10/DO1), água de salinidade (20 ) e normoxia (S20/DO6), água de
salinidade (20 ) e hipóxia (S20/DO1). O teste de hipóxia foi mantido por 24 horas, em seguida,
todos os peixes foram tratados com metanossulfato (MS-222; 25 mg/ L) antes da coleta de
sangue e dissecção. O sangue foi coletado da veia caudal de três peixes por aquário e mantido
coagulado para coleta de soro por centrifugação (1107 g/ 15 min a 4 C). Em seguida, os peixes
foram dissecados, e suas guelras, intestinos e fígados foram separados suavemente e mantidos
em formol 10% até chegar ao laboratório. Ao mesmo tempo, além dos fígados foi mantido em
nitrogênio líquido para extrair mRNA. Outra parte das guelras, intestinos e fígados foi
congelada em - 20 C para a preparação de homogeneizado para medir marcadores de estresse
antioxidante. Os homogeneizados de brânquias, intestinos e fígados foram preparados por
lavagem de intestinos em solução salina fosfato tamponada (PBS) gelada (fosfato de potássio
50 mM, pH 7,5 1 mM EDTA). Os tecidos foram homogeneizados em tampão PBS de 10 dobras
(1 g de tecido, 1:10 w-v) com tubos homogeneizadores de vidro (motor pilão pellet) e
centrifugados a 7871 g por 5 min, e o sobrenadante foi coletado e armazenado em 4 C para
posterior análise.

2.3. Qualidade da água

A qualidade da água foi verificada regularmente durante o ensaio usando Orion Star™ A329
Portable Multiparameter Meter (Thermo Scientific™, Waltham, Massachusetts, EUA ) para
salinidade, temperatura, oxigênio dissolvido e pH. Ao mesmo tempo, os níveis de amônia total
(TAN) foram medidos calorimetricamente usando o método padrão (APHA, 1912).

2.4. Análise bioquímica

Aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (ALP)
foram detectados pelo analisador automático SPIN 800 usando produtos químicos readymade
(kits) fornecidos pela Spinreact Co. Espanha, seguindo as instruções do fabricante. Os níveis de
ALT, AST e ALP no sangue detectados foram expressos em unidades por litro (U/L).
Superóxido dismutase (ng/mL), catalase (Mu/mL) e glutationa peroxidase (μU/mL) nas lamelas,
intestinos e fígados foram medidos usando kits de reagente diagnóstico seguindo as instruções
do fabricante (Cusabio Biotech Co., Ltd.; China). A concentração de malondialdeído (MDA) foi
detectada seguindo Uchiyama e Mihara (1978) e expressa como nmol MDA/g.
Resumidamente, brânquias, intestinos e fígados homogeneizam (10%, p/v) foram misturados
com 1,5 mL de H3PO4 a 1% e 0,5 mL de ácido tiobarbitúrico a 0,6%. Os tubos foram aquecidos
por 60 minutos em um banho de água fervente. Após resfriamento em banho de gelo, foram
adicionados 2 mL de butanol, e o conteúdo foi misturado vigorosamente por 20 s. Após
centrifugação (1107 g, 15 min), a absorvância da camada orgânica foi medida em 520 e 535 nm
usando um espectrômetro (Lambda 2 S, Perkin-Elmer Co., EUA).

2.5. Secções de histomorfologia

As lamelas, hepatopâncreas e intestino foram removidos e lavados com solução salina tampão
fosfato (PBS, pH 7,4) e fixados em formaldeído neutro tamponado por 48 h. Os espécimes fixos
foram processados pela técnica de incorporação de parafina convencional, incluindo a
desidratação através de graus ascendentes de etanol, limpeza em três mudanças de xileno, e
parafina derretida terminou por incorporação em cera de parafina a 65 °C. Quatro cortes de
µm de espessura foram corados por Hematoxilina e Eosina (H e E), conforme descrito
anteriormente por Bancroft e Layton (2013). O exame histopatológico dos tecidos foi realizado
com uma câmera digital (Leica EC3, Leica, Alemanha) conectada a um microscópio (Leica
DM500) e software (Leica LAS EZ).

2.6. QPCR em tempo real

Análise de reação em cadeia de transcrição-polimerase reversa (RT-PCR) da expressão total de
RNA para diferentes genes, e β-actina (como referência interna para normalização de dados de
expressão gênica) foi realizada utilizando-se os primers mostrados na Tabela 1 (Arquivo
suplementar) (Ming et al., 2013; Pang et al., 2013; Qiang et al., 2016; Standen et al., 2016). O
RNA total foi extraído das amostras de fígado utilizando reagentes de Trizol Trizol (intron
Biotechnology, Inc., Seongnam, Coreia) seguindo o protocolo do fabricante. A qualidade do
RNA extraído foi confirmada com eletroforese de 2% de agarose. A qualidade e a quantidade
do RNA extraído foram determinadas por Nanodrop (Quawell, EUA). Foram utilizadas amostras
com 1,8 ou mais RNA A260 / A280. Dois μg de RNA total foram transcritos reversamente
usando um kit de síntese de cDNA (Bioline, Reino Unido) dirigido pelo fabricante.
Amplificações de PCR em tempo real foram realizadas usando o kit Sensifast SYBR Lo-Rox
(Bioline) em 20 misturas de reação μL contendo 2 μL de cDNA, os iniciadores específicos do
gene (0,5 μm cada); e SYBR 10 μL. As condições do ciclo térmico foram desnaturação inicial a
95 C por 10 min, seguida por 40 ciclos a 95 C por 15 s, temperatura de recozimento e 60 C por
1 min. Todos os genes foram testados em triplicatas, e o método de mudança de dobra foi
usado para calcular (2 ΔΔCT) seguindo Livak e Schmittgen (2001).

2.7. Resposta integrada do biomarcador

O Integrated Biomarker Response (IBR) foi avaliado usando os biomarcadores medidos de
tilápia do Nilo expostos com hipersalinidade e estresse por hipóxia. A IBR foi aplicada apenas
para os biomarcadores mostrando diferenças significativas entre os grupos. A IBR foi
determinada seguindo Beliaeff e Burgeot (2002) e Iturburu et al. (2018). Resumidamente,
foram calculados o valor médio (Xi), a média geral (mi) e o desvio padrão (Sdi) para cada
biomarcador em cada condição de exposição. O valor Xi foi então padronizado para obter Yi,
onde Yi = (Xi - mi)/Sdi. Subsequentemente, Zi = Yi ou Zi = Yi foram computados no. O valor
mínimo (mini) de Zi para cada biomarcador foi obtido para cada condição de grupo. Por fim, o
escore S foi calculado como Si = Zi + [mini], onde [mini] é o valor absoluto. Estes valores de S
representam o gradiente de valores para cada biomarcador nas diferentes condições de
exposição, com os valores mais altos correspondendo aos maiores efeitos biológicos. A
resposta integrada do biomarcador para cada condição foi calculada pela seguinte fórmula:
IBR=S1 S22 +S2 S32+. Sn-1 Sn2+Sn S12 em que o escore obtido para cada biomarcador (Si) é
multiplicado com o próximo escore do biomarcador (Si +1), organizado como um conjunto,
dividindo cada cálculo por 2 e somando todos os valores. Vários índices de IBR foram
calculados a partir dos mesmos dados, alterando a ordem dos biomarcadores e utilizando a
mediana de todos os valores do índice como valor final do índice (Devin et al., 2014).

2.8. Análise estatística

O teste de Levene examinou a homogeneidade da variância dos dados para confirmar a
normalidade e a homogeneidade dos dados. Se a homogeneidade da variância pudesse ser
alcançada, os dados eram analisados pelo teste de Duncan. Caso contrário, os dados eram
examinados pelo teste T2 de Tamhane. Todos os dados foram analisados por meio da análise
de variância unidirecional (ANOVA) pelo software SPSS 22.0. As diferenças foram consideradas
significativas em p < 0,05. Quando foram detectadas diferenças significativas, foi utilizado
ANOVA bidirecional para determinar os efeitos da salinidade da água, hipóxia e sua interação
no desempenho da tilápia do Nilo.

Resultados
3.1. Qualidade da água
Antes do estresse por hipóxia, os resultados mostraram condições ótimas de água para o
crescimento normal de tilápias do Nilo, exceto para o nível de salinidade da água que diferiu
significativamente entre os grupos (p < 0,05). Durante quatro semanas, o nível de oxigênio
dissolvido (DO) (6,31 0,24, 6,22 0,13 e 6,17 0,18 mg/L), temperatura (26,54 0,63, 26,77 0,11 e
26,32 0,48 C), pH (6,32 0,31, 6,61 0,44 e 6,35 0,24) e amônia (0,21 0,01, 0,20 0,01 e 0,22 0,01
mg/L) não apresentaram diferenças (Tabela 1). Após estresse por hipóxia, todos os grupos
apresentaram pH de água, temperatura e níveis de amônia ótimos sem diferenças
significativas (p > 0,05) entre os grupos (Tabela 1). Entretanto, os níveis de salinidade diferiram
significativamente entre os grupos e registraram 0,25 0,01, 0,32 0,02, 10,11 0,35, 10,02 0,42,
20,21 0,62 e 20,15 0,53 para os grupos S0/ DO6, S0/DO1, S10/DO6, S10/DO1, S20/DO6 e
S20/DO1, respectivamente (Tabela 1). Enquanto isso, o DO foi significativamente diferente
onde os grupos normoxia tem níveis mais baixos de DO (6,14 0,11, 6,21 0,14 e 6,21 0,42 mg/L)
do que os grupos de hipóxia (1,15 0,01, 1,12 0,11 e 1,21 0,21 mg/L) (p < 0,05). O nível de
salinidade da água, oxigênio e suas interações foram fatores significativos nos níveis de DO e
salinidade (p < 0,05).

3.2. Comportamento em matéria de crescimento

O desempenho de crescimento de tilápias que sofrem de alta salinidade (20 ) durante quatro
semanas mostrou uma redução severa no caso de FBW, WG e SGR (p < 0,05) em comparação
com peixes criados nas condições de água doce (Tabela 2). Além disso, a relação de eficiência
alimentar (FER) foi menor em peixes criados em 20 do que em peixes cultivados em água doce.
A sobrevida foi de 97,78% em condições de água doce, 88,89% no grupo 10 e 82,22% no grupo
20, indicando diferenças significativas entre a água doce e o grupo 20 (Tabela 2).
Curiosamente, os peixes são cultivados em água doce, e 10 grupos não tiveram diferenças
significativas em FBW, SGR, WG, FER e taxa de sobrevivência (p > 0,05).

3.3. Avaliação histopatológica e antioxidante do intestino dos peixes

Hipóxia + salinidade 10 e salinidade 10 grupos apresentaram discreta infiltração linfocítica e
alterações degenerativas nos enterócitos (Fig. 1A e B). Além disso, hipóxia + salinidade 20 e
salinidade 20 grupos expuseram necrose grave nos enterócitos e infiltração linfocítica maciça
(Fig. 1C e D). Do outro lado, hipóxia + grupos de água doce e água doce revelaram arquitetura
intestinal normal com vilosidades normais (Fig. 1E e F).
As amostras de homogeneizado intestinal revelam que a tilápia cresce em meio (10 ) (S10/DO6
e S10/DO1) ou alta salinidade (20 ) (S20/DO6 e S20/DO1) e normoxia (S20/DO6) ou condições
de hipóxia (S20/DO1) apresentaram SOD aumentado, CAT, GPX e MDA (p < 0,05) em
comparação com peixes em água doce em condições de normoxia (S0/DO6) (Fig. 1). Além
disso, os peixes do grupo criado em água doce e hipóxia (S0/DO1) têm maior SOD, CAT, GPX e
MDA (p < 0,05) do que os peixes do grupo S0/ DO6.

3.4. Avaliação histopatológica e antioxidante das guelras dos peixes

O grupo hipoxia + salinidade 10 apresentou congestão severa, descamação epitelial intensiva,
necrose de lamelas secundárias e hipertrofia de células cloreto, e adesão de lamelas
secundárias (Fig. 2A). Além disso, o grupo salinidade 10 revelou necrose de lamelas
secundárias e hipertrofia de células cloreto (Fig. 2B). Além disso, o grupo hipóxia + salinidade
20 expôs necrose excessiva na lamela primária, encurtamento e necrose da lamela secundária
e hipertrofia excessiva de células cloreto com alta infiltração linfocítica (Fig. 2C). Além disso, o
grupo salinidade 20 apresentou telangiectasia da lamela secundária, alterações degenerativas
moderadas na cartilagem da lamela primária, infiltração linfocítica e hipertrofia de células
cloreto (Fig. 2D). Além disso, a hipóxia + grupo de água doce
revelou congestão grave de lamelas secundárias e necrose e perda de lamelas secundárias (Fig.
2E). Por outro lado, o grupo de água doce apresentou arquitetura de brânquias normal com
lamelas primárias e secundárias normais (Fig. 2F).
Após estresse por hipóxia, amostras de guelras homogeneizadas apresentaram maior SOD,
CAT, GPX e MDA (p < 0,05) nos grupos S10/DO6, S10/DO1, S20/DO6 e S20/DO1 do que nos
grupos S0/DO1 e S0/DO6 (p < 0,05) (Fig. 2). Além disso, os peixes do grupo S0/DO1
apresentaram maior SOD, CAT, GPX e MDA (p < 0,05) do que os peixes do grupo S0/DO6 nas
amostras homogenadas brânquias.

3.5. Avaliação histopatológica e antioxidante das hepatopâncreas de peixes

O grupo Hipóxia + Salinidade 10 apresentou congestão vascular grave e alto número de
hepatócitos necróticos. Infiltração linfocítica pode ser observada nas células acinares
pancreáticas (Fig. 3A). Além disso, o grupo salinidade 10 revelou congestão vascular leve e
hepatócitos vacuolizados gordurosos difusos (Fig. 3B). Além disso, hipóxia + salinidade 20
grupos expostos congestão grave de sinusoide no sangue, necrose grave e acini pancreático
estavam congestionados com infiltração linfocítica (Fig. 3C). Além disso, o grupo da salinidade
20 apresentou alto número de núcleos necróticos de hepatócitos e congestão grave de
sinusoide hepático (Fig. 3D). Além disso, o grupo hipóxia + água doce revelou degeneração
gordurosa maciça de hepatócitos e congestão leve de sinusóide hepático (Fig. 3E). No entanto,
o grupo de água doce apresentou arquitetura hepatopancreática normal com cordão hepático
normal e acini do pâncreas exócrino (Fig. 3F).
As amostras de fígado de homogeneizado ilustraram que os peixes dos grupos S20/DO6 e
S20/DO1 apresentaram maior SOD, CAT, GPX e MDA (p < 0,05) do que os demais grupos (Fig.
3). Acentuadamente, os peixes nos grupos S10/DO1, S20/DO6 e S20/DO1 apresentaram SOD,
CAT, GPX e MDA hepáticos mais elevados (p < 0,05) do que os grupos S0/DO6 (Fig. 3).

3.6. Enzimas da função hepática e genes relacionados com a inflamação

Os peixes do grupo S0/DO6 apresentaram os menores níveis séricos de ALT, AST e ALP, mas os
peixes do grupo S20/DO1 apresentaram os maiores níveis de ALT, AST e ALP (p < 0,05) entre os
grupos (Fig. 4A, B, C). Além disso, os peixes do grupo S20/DO6 têm níveis ALT mais elevados (p
< 0,05) do que os grupos S0/DO6, S0/DO1, S10/DO6 e S10/DO1 (Fig. 4A). Não foram
observadas diferenças significativas entre os grupos S0/DO1, S10/DO6 e S10/DO1 em termos
de ALT (p > 0,05). O nível de AST foi maior nos grupos S0/DO1 e S10/DO1 do que no grupo
S0/DO6 sem diferenças com os grupos S20/DO6 e S10/DO6 (p < 0,05) (Fig. 4B). Além disso, o
nível de ALP apresentou valores mais elevados nos grupos S0/DO1, S10/DO6, S10/DO1 e
S20/D6 do que no grupo S0/D6 (p < 0,05) (Fig. 4C).
Os maiores níveis de transcrição dos genes Il-8, Il-1β, Ifn-γ, Tnf-α e Caspase-3 e o menor nível
de transcrição do gene Il-10 foram observados no grupo de peixes expostos com 20 em
condições de hipóxia (Fig. 5). Os grupos de S0/DO6, S0/DO1 e S10/DO6 apresentaram níveis
mais baixos de expressão gênica de Il-8, Il-1β e Tnf-α do que os demais grupos (p < 0,05). A
transcrição de Ifn-γ foi menor no grupo S0/DO6 do que nos grupos S10/ DO1 e S20/DO6,
enquanto o grupo S0/DO6 teve menor Ifn-γ do que o grupo S10/DO1 (p < 0,05) (Fig. 5D). O
nível de Caspase-3 foi significativamente maior nos grupos S10/DO1 e S20/DO6 do que nos
grupos S0/DO6 e S0/DO1 (Fig. 5F). Por outro lado, os grupos S10/DO1 e S20/DO6 tiveram uma
transcrição mais baixa de Il-10 do que os grupos S0/DO6, S0/DO1 e S10/DO6, enquanto os
grupos S0/DO1 e S10/DO6 tiveram menor expressão do gene Il-10 do que o grupo S0/DO6 (Fig.
5E).

3.7. Resposta integrada do biomarcador

A Resposta Biomarcadora Integrada (IBR) de tilápia do Nilo exposta com hipersalinidade e
estressores de hipóxia é determinada, e os resultados. são apresentados na Tabela 3 e na Fig.
6. As saídas da IBR apresentaram diferenças acentuadas entre os grupos de peixes com valores
variados. Os valores de RIB na tilápia do Nilo nos grupos S0/DO6, S0/DO1, S10/DO6, S10/DO1,
S20/DO6 e S20/DO1 são 0,57, 1,68, 1,72, 2,69, 7,24 e 9,23, respectivamente (Tabela 3). A
menor IBR foi observada em peixes criados em água doce e normoxia, enquanto a maior IBR
foi observada no grupo de peixes criados em condições de 20% e hipóxia (p < 0,05).

Discussão
O ambiente aquícola é complexo, com várias características de qualidade da água associadas a
condições agrícolas instáveis (Magouz et al., 2021). Espécies de peixes de água doce serão
afetadas pelo declínio da qualidade da água causado pelo aquecimento global (Li et al., 2021;
Martínez et al., 2021). Há uma chance de espécies de água doce sobreviverem às mudanças
das condições ambientais, incluindo alta salinidade e hipóxia. Da mesma forma, há uma
redução significativa nos desafios de sobrevivência e crescimento devido a danos teciduais e
menor ingestão de alimentos resultantes de condições de agricultura instáveis (Dawood et al.,
2020). Assim, as flutuações na qualidade da água levaram a uma baixa produção e
rentabilidade da piscicultura. Cultivar tilápia em água salobra é uma das opções nas áreas que
sofrem de recursos de água doce. Neste caso, os desempenhos de tilápia podem ser
influenciados, especialmente quando sofrem de outros fatores ambientais (por exemplo,
hipóxia, amônia e temperatura alta) (Abdel-Tawwab et al., 2020; Li et al., 2018b; Xavier et al.,
2020; Xia et al., 2018). Assim, todos os fatores de água devem ser implementados
interativamente para manter a qualidade ideal necessária para o crescimento máximo e
desempenhos de saúde dos peixes. O presente estudo propõe-se compreender os efeitos
interativos de fatores ambientais no setor aquícola que poderiam afetar o crescimento e o
desempenho sanitário das espécies de peixes.
O comportamento de crescimento de espécies de peixes de água doce pode aumentar em
níveis moderados de salinidade devido ao baixo custo osmoregulatório (Martínez et al., 2021).
No entanto, altos níveis de salinidade aumentam a osmorregulação, resultando em altos
custos de energia e, assim, baixas taxas de crescimento (Bœuf e Payan, 2001). A exposição a
longo prazo de animais aquáticos a alta salinidade causa uma redução do comportamento
alimentar, imunossupressão, inflamação e estresse oxidativo. Adequação das condições
ambientais é a principal razão para otimizar o desempenho e a capacidade de sobrevivência
dos peixes (El-Sayed, 2019). Neste estudo, após exposição a longo prazo a alta salinidade, a
tilápia do Nilo teve redução do ganho de peso e da taxa de crescimento, indicando capacidade
de digestão prejudicada. O menor desempenho de crescimento foi observado nos peixes
expostos a 20 , seguido pelos peixes expostos a 10 . No entanto, o peixe nas salinidades de 0 e
10 teve o melhor desempenho de crescimento. Os resultados indicam desempenho de
crescimento reduzido de tilápias do Nilo criadas em alta salinidade. Da mesma forma, El-Leithy
et al. (2019) afirmaram que a tilápia do Nilo cultivada em água com alta salinidade tinha
prejudicado a expressão de genes relacionados ao crescimento (Gh e Igf-1). Além disso, o
robalo europeu (Dicentrarchus labrax) que sofre de alta salinidade (32 ) tinha reduzido o
desempenho de crescimento (Islam et al., 2020). O desempenho de crescimento reduzido é
provavelmente atribuído à diminuição da utilização de ração e digestão no trato intestinal dos
peixes (GIT) (Dawood, 2021). Foi relatado que a alta salinidade causa função de
osmorregulação irregular e consome altos níveis de energia levando à deterioração da taxa
metabólica (Chourasia et al., 2018; Herrera et al., 2009). Concomitantemente, este estudo
mostrou baixa eficiência alimentar em tilápias do Nilo cultivadas em alta salinidade (20%) e
sofriam de hipóxia, explicando o reduzido desempenho de crescimento neste grupo. Outra
razão é que a salinidade resulta em diminuir a atividade das enzimas digestivas e a abundância
de microbiota benéfica no GIT (Barman et al., 2005; Ni et al., 2021; Ringø and Strøm, 1994). A
redução da taxa de crescimento e da utilização da ração também pode estar associada ao
impacto severo da alta salinidade nas características morfológicas intestinais, indicando baixa
absorção e imunidade intestinal local (Tran-Ngoc et al., 2017). As características histológicas
intestinais da tilápia do Nilo criada em alta salinidade (20 ) mostraram uma estrutura de
vilosidades severamente danificada e células epiteliais envolvidas na absorção de nutrientes
digeridos e osmorregulação. Em um sentido semelhante, as características da histomorfologia
intestinal foram prejudicadas quando as tilápias do Nilo são cultivadas em água com alta
salinidade (15 ) (Tran-Ngoc et al., 2017). Tal pode também explicar a deterioração do
crescimento e da eficiência dos alimentos para animais nestes grupos.
A taxa de sobrevivência é geralmente calculada para revelar o efeito das condições ambientais
sobre o estado de saúde dos peixes (Dawood et al., 2021). A qualidade ótima da água permite
que os peixes tenham um bom desempenho e evitem a fraqueza da imunidade e deterioração
do estado fisiológico (Bœuf e Payan, 2001). Os resultados mostram uma baixa taxa de
sobrevivência nos grupos de tilápias do Nilo expostas com 10 e 20 , correlacionadas com
antioxidativo prejudicado, imunidade e tolerância contra o estresse nas condições de teste
atuais (Xu et al., 2018).
As flutuações ambientais estressantes prejudicam a função celular e permitem que os radicais
livres (ROS) oxidam os lipídios e levam à peroxidação lipídica (Lushchak, 2011). De fato, o
estresse oxidativo é o efeito diversificado inicial da alta salinidade e hipóxia em organismos
aquáticos (Zhou et al., 2020). Resulta em activar as enzimas antioxidantes (SOD, CAT, e GPX)
para lidar com o aumento do ROS envolvido em quebrar o ADN e perder funções celulares
(Birnie-Gauvin et al., 2017). Altos níveis de peroxidação lipídica são expressos pelos níveis de
MDA (Mohamed et al., 2021), que também aumenta sob condições estressantes (Sun et al.,
2020). As células danificadas existiram em todos os tecidos do corpo, incluindo brânquias,
intestino e fígado, que têm funções vitais, como respiração, osmorregulação, digestão,
desintoxicação e imunidade (Li et al., 2017; Sun et al., 2020; Xu et al., 2018). Assim, é simples
que o estresse oxidativo é induzido por salinidade alta a curto prazo e hipóxia envolvidos na
ativação de enzimas antioxidantes. O presente estudo revelou aumento de SOD, CAT, GPX e
MDA em tilápias do Nilo expostas a 0, 10 e 20 salinidade e sofrendo de hipóxia. Os resultados
obtidos foram medidos em brânquias, intestinos e fígados, ilustrando diminuição da
osmorregulação, digestão e capacidade de desintoxicação da tilápia do Nilo. Os resultados
concordam com Xavier et al. (2020) e Baldissera et al. (2019), que relataram que a tilápia do
Nilo exposta a alta salinidade ou hipóxia a curto prazo tinha maior capacidade antioxidante.
Além disso, Xu et al. (2018) relataram resultados semelhantes que ilustram que a tilápia do
Nilo exposta a alta salinidade a longo prazo tinha capacidade antioxidante prejudicada. Os
resultados apoiaram firmemente que a exposição a longo prazo a alta salinidade e inflamação
induzida por hipóxia nas guelras, intestinos e fígados levando à indução de antioxidante e
peroxidação lipídica. Este estudo também mostrou aumento de enzimas hepáticas (ALT, AST e
ALP) nos grupos de peixes que sofrem de alta salinidade e hipóxia, o que provavelmente
atribuiu à função hepática danificada como resultado de salinidade e hipóxia (Li et al., 2018b;
Ma et al., 2021). Durante o estresse, os hepatócitos do fígado interrompem e quebram,
levando à secreção excessiva de enzimas hepáticas (Ma et al., 2021). Marcadamente, tilápias
em grupos de alta salinidade e hipóxia tinham características histológicas degeneradas e
anormais no tecido hepático, explicando a função hepática prejudicada.
O estresse oxidativo é um precursor para a inflamação, pró-inflamação e respostas anti-
inflamatórias envolvidas na regulação da imunidade e tolerância contra estressores (Yahfoufi
et al., 2018). Os resultados mostraram que hipersalinidade e hipóxia tinham enzimas
antioxidantes ativadas e aumento da formação de peroxidação lipídica (MDA) dedicada à
superprodução de ERO em todo o corpo (Mohamed et al., 2021). Os homogeneizados de
brânquias, intestinos e fígados foram utilizados para detectar a capacidade antioxidante desses
tecidos devido ao papel vital desses tecidos na regulação da osmorregulação, metabólica,
digestão, imunidade e funções antioxidativas (Li et al., 2018b; Sun et al., 2020). Os resultados
observados mostraram inflamações histológicas graves nestes tecidos em peixes sofridos de
salinidade moderada e alta (10 e 20 ) e hipóxia que foi confirmada pela detecção da
transcrição de inflamatório (Il-8 e Il-1β), pró-inflamatório (Ifn-γ e Tnf-α), anti-inflamatórios (Il-
8) e genes da apoptose (Caspase-3) no tecido hepático (Jia et al., 2019; Sun et al., 2020). Os
resultados observados mostraram inflamações histológicas graves nestes tecidos em peixes
sofridos de salinidade moderada e alta (10 e 20 ) e hipóxia que foi confirmada pela detecção
da transcrição de inflamatório (Il-8 e Il-1β), pró-inflamatório (Ifn-γ e Tnf-α), anti-inflamatórios
(Il-8) e genes da apoptose (Caspase-3) no tecido hepático (Jia et al., 2019; Sun et al., 2020). Os
genes Il-8 e Il-1β atualizados neste estudo sugeriram induzir inflamação no fígado resultante
de alta salinidade e hipóxia e responsável pelo aumento da expressão pró-inflamatória (Ifn-γ e
Tnf-α) genes envolvidos no aumento da imunidade para tolerar o estresse oxidativo-
inflamação induzida (Zhao et al., 2020). Curiosamente, os resultados mostraram baixa
expressão do gene anti-inflamatório (Il-10) nos fígados de tilápia do Nilo que sofrem de
salinidade moderada e alta (10 e 20 ) e hipóxia, mostrando tolerância prejudicada contra
estressores severos de longo prazo. Os resultados concordam com El-Leithy et al. (2019), que
relatou upregulated Il-1β e Il-8 em tilápia do Nilo exposta com alta salinidade e contradiz
Gallage et al. (2016), que declarou downregulated Il-1β em tilápia durante o estresse por
hipóxia.
Durante o estresse, a morte programada das células é regulada pela função chamada
"apoptose", que é uma ferramenta crucial para melhorar a imunidade celular e diminuir a
expressão de genes pró-inflamação para remover as células danificadas resultantes do estresse
(Savill, 1997). A indução de genes relacionados à apoptose (por exemplo, caspase 3) está
correlacionada com estresse oxidativo e inflamação resultante de alta salinidade e hipóxia (Sun
et al., 2020; Zhao et al., 2020). Os resultados mostraram Caspase 3 aumentada significativa no
tecido hepático da tilápia do Nilo exposta com salinidade moderada e alta (10 e 20 ) e hipóxia a
longo prazo. Os resultados são comparáveis com Zhao et al. (2020), que relatou upregulated
Caspase 3 em achigã (Micropterus salmoides) expostos com alta salinidade. Além disso, achigã
teve aumento da transcrição de caspase 3 resultante do estresse por hipóxia (Sun et al., 2020).